Introduction: les progrès thérapeutiques pour la prise en charge du carcinome urothélial de la vessie, ou tumeur de vessie infiltrant le muscle (TVIM), sont faibles depuis deux décennies, notamment sur le plan de la chimiothérapie, tant dans les formes localisées que métastatiques. L'identification de nouveaux biomarqueurs pouvant améliorer la prise en charge et le pronostic des patients apparait indispensable, notamment pour prédire la réponse aux traitements systémiques. Notre travail a cherché : (i) à identifier des facteurs biologiques prédictifs de rechute après les chimiothérapies adjuvantes (CA) utilisées actuellement, (ii) à déterminer si les altérations moléculaires, cibles de nouvelles thérapies, identifiées dans la tumeur vésicale sont conservées dans les métastases.Objectifs:(i) Rechercher une association entre la rechute après CA et l'expression de six biomarqueurs, ERCC1, Emmprin, Survivin, MDR1, p53 et topoisomérase IIα, dans la tumeur vésicale et/ou une métastase ganglionnaire(ii) Etudier l'hétérogénéité des mutations de FGFR3 dans les TVIM localement avancéesMatériels et Méthodes: Une cohorte rétrospective de 226 patients traités par cystectomie et CA, et une collection tumorale d'échantillons représentatifs de la tumeur primitive et d'une métastase ganglionnaire ont été constituées. L'expression des six biomarqueurs a été déterminée en immunohistochimie sur ces échantillons. Le statut mutationnel de FGFR3 a été déterminé en SNaPshot sur 84 paires tumeur primitive/métastase ganglionnaire.Résultats: Les survies observées dans la cohorte étaient proches de celles rapportées dans la littérature pour des patients de mêmes stades. La collection tumorale étudiée semble donc représentative des TVIM traitées en France. Aucun des six biomarqueurs n'était retrouvé comme prédictif de rechute après traitement. Une mutation de FGFR3 était retrouvée dans 4 (4,7%) des 84 échantillons appariés sans aucune discordance entre tumeur primitive et métastase ganglionnaire.Conclusions: L'expression de ces six biomarqueurs étudiés en immunohistochimie n'est pas associée à un risque de rechute après CA. Le statut mutationnel de FGFR3 est conservé au cours de la dissémination métastatique, et ses mutations activatrices sont présentes dans près de 5% des TVIM localement avancées. Leur conservation dans le processus métastatique renforce l'intérêt de l'évaluation de nouvelles thérapies ciblant le récepteur FGFR3 muté. Enfin, il est possible de rechercher cette mutation sur la tumeur vésicale ou une métastase avec la même pertinence. / Introduction: In muscle invasive urothelial carcinoma of the bladder (MI UCB), few progresses have been made in the last two decades, particularly in chemotherapy, both in localized and metastatic setting. The identification of new biomarkers that can improve the management and prognosis of patients appears essential. Such biomarkers will be clinically relevant if they can predict the response to systemic treatments. In this thesis, we studied biomarkers in two ways: (i) to identify predictive factors of relapse after cisplatin-based adjuvant chemotherapy (AC), (ii) to confirm that the molecular alterations targeted by new therapies and identified in bladder tumor are present in metastases.Objectives:(i) To examine the relationship between relapse after AC and expression of six biomarkers, ERCC1, Emmprin, Survivin, MDR1 p53 and topoisomerase IIα, in bladder tumor and / or lymph node metastases.(ii) To study the heterogeneity of FGFR3 mutations in locally advanced MI UCBMaterials and Methods: A retrospective cohort of 226 patients treated with cystectomy and AC, and tumor collection of representative samples of the primary tumor and lymph node metastases were constituted. The expression of six biomarkers was determined by immunohistochemistry on these samples and determined by morphometry. FGFR3 mutation status was determined by SNaPshot in 84 paired primary tumors and positive lymph nodes.Results: Survivals observed in the cohort were similar to those reported in the literature for patients of same stages, with tumor collection being representative of the MI UCB treated in France. None of the six biomarkers was found as an independent predictive factor of relapse after AC. FGFR3 mutation was found in 4 (4.7%) of the 84 paired samples with complete concordance between primary tumor and lymph node metastases.Conclusions: The expression of the six studied biomarkers by immunohistochemistry is not associated with risk of relapse following AC. FGFR3 mutation status is maintained during metastases process, and FGFR3 activating mutations are present in about 5% of locally advanced MI UCB. FGFR3 mutation remains a promising therapeutic target in a low subset of patients, and the evaluation of new therapies targeting the mutated FGFR3 receptor are needed. Finally, search for these mutations either in bladder tumor or in metastasis is relevant.

Alors que le rôle des cellules du système immunitaires innées sur la progression tumorale est l'objet d'une investigation croissante, le rôle des neutrophiles sur la sensibilité à la thérapie n'a pas été précédemment décrit. Jusqu’au présent, nous avons effectué des cocultures de neutrophiles et des différentes lignées cellulaires de lymphome non hodgkinien (LNH) en présence de divers agents cytotoxiques ou des thérapies ciblées. Afin d’évaluer l'effet du traitement sur la prolifération cellulaire et la mort des cellules, des marquages CFSE et DAPI ont été effectués respectivement, en utilisant la cytométrie en flux. Les neutrophiles ainsi que les cellules HL60 différenciées avec des propriétés de neutrophiles, ont atténué la sensibilité de cellules de lymphome à des agents anticancéreux in vitro, à la fois dans les modèles 2D et 3D. L'effet protecteur des neutrophiles a été testée in vivo en injectant des cellules de LNH et des neutrophiles chez des souris SCID/CB17 traités avec vincristine. La coinjection de neutrophiles réduit la sensibilité des cellules LNH à la chimiothérapie. Cet effet protecteur a été validé en utilisant des cellules primaires, purifiée à partir de patients atteints de leucémie lymphoïde chronique, exposés à des agents cytotoxiques ou des agents ciblés en présence de neutrophiles autologues. La protection par les neutrophiles est contact dépendante. Elle est médiée par l'interaction de CD11b et ICAM1, exprimé par les neutrophiles et les lymphocytes B, respectivement, et par la molécule d'adhésion CD44. Elle est également dépendante de Mcl1 et est partiellement abrogée par un composé anti-Mcl1 / While the role of innate immune cells on tumor progression is the object of increasing scrutiny, the role of neutrophils on sensitivity to therapy has not been previously described. To this end, we performed cocultures of freshly purified human neutrophils and different non- Hodgkin lymphoma (NHL) cell lines in the presence of various cytotoxic and targeted agents. CFSE and DAPI assays were performed to assess the therapeutic effect on cell proliferation and cell death, respectively, using flow cytometry. Neutrophils and differentiated HL60 cells with neutrophil-like properties attenuated the sensitivity of lymphoma cells to anti-cancer agents both in 2D and 3D models in vitro. The protective effect of neutrophils was tested in vivo using SCID/CB17 mice inoculated with NHL cells together with neutrophils, and treated with vincristine. The co-inoculation of neutrophils reduced the sensitivity of NHL cells to chemotherapy. Similar findings were made on primary cells, purified from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia, exposed to cytotoxic agents or recently approved targeted agents (ibrutinib and idelalisib) in the presence of autologous neutrophils. Neutrophil-induced protection was dependent on cell-cell contact mediated by the interaction of CD11b and ICAM-1, expressed by neutrophils and B cells respectively, and by the adhesion molecule CD44. This protective effect was Mcl-1-dependent and was partially abrogated by an anti- Mcl-1 compound

Le 5-Fluorouracile (5-FU) est un anti-métabolite intensément utilisé dans les traitements chimio-thérapeutiques de nombreux cancers. Cependant, les mécanismes moléculaires de l'action de cet agent anti-cancer, son impact sur la biologie cellulaire et les processus de résistance restent encore largement à déterminer. Nous avons proposé que le 5-FU, en s'intégrant dans l'ARN induit une altération de la traduction. Dans cette étude, nous avons déterminé pour la lignée de cellules de cancer colorectal HCT116 la dose et le temps de traitement qui induit une modification du comportement cellulaire sans conduire à une mort cellulaire massive. Nous avons ensuite analysé le translatome de ces cellules traitées et celui de cellules non traitées. Pour cela, les fractions cytoplasmiques ont été purifiées et séparées sur gradients de saccharose pour séparer les ARNm qui sont associés aux polysomes de ceux associés aux monosomes et des ARN libres. L'analyse des modifications du translatome induites par le 5-FU montre que cette drogue est capable de stimuler la traduction d'un grand nombre d'ARNm qui codent pour des protéines possédant diverses fonctions. Cette activation traductionnelle est probablement médiée, au moins en partie, par une action du 5-FU sur les microARN. C'est ainsi que nous avons démontré que la stimulation de la traduction de l'ARNm du gène HIVEP2 est un mécanisme dépendant du microARN miR-155 / 5-Fluorouracil (5-FU) is an anti-metabolite intensely used in chemotherapeutic treatments in various cancers. The cellular and molecular mechanisms of action of this anti-cancer agent still remain to be determined. Because 5-FU is incorporated within all classes of RNA, knowledge of the different levels of gene expression regulation affected by 5-FU will help to decipher its mode of action. We hypothesized that the translational control is altered by 5-FU treatment as a consequence of disrupted RNA metabolism. In this study, the colorectal cancer cell line HCT116 has been treated or not by different doses of 5-FU for different periods of time to determine the time and dose window that induces modifications of cell behavior without leading to an extensive cell death. Translational reprogramming was then analyzed during this time and dose window. For this, cytoplasmic fractions were purified and separated through sucrose gradients to distinguish the actively translated mRNAs that are associated with polysomes from the inactive mRNAs associated with monosomes or free mRNAs. A microarray analysis was then performed to identify the mRNAs presented in monosome and polysome fractions with and without treatment. This polysome profiling approach reveals that 5-FU treatment did not turn-off the global translation efficiency, but rather modulates translation efficiency of specific mRNAs. Secondly, more than 640 mRNAs were found to be up-translated following 5-FU treatment. Finally, we have demonstrated that 5-FU induced up-regulation of HIVEP2 by a molecular mechanism involving an action of 5-FU on miR-155

Il existe une littérature abondante sur les mécanismes cellulaires de résistance à la chimiothérapie, décrivant notamment les pompes d’efflux, les modifications des cibles (comme les topoisomérases) ou les altérations de l’apoptose. Peu de publications s’intéressent aux mécanismes de chimiorésistance liée au microenvironnement tumoral. Les agents anticancéreux doivent traverser l’interstitium tumoral pour atteindre toutes les cellules (dont les cellules hypoxiques éloignées des vaisseaux sanguins) à des concentrations suffisantes pour être létales. Les modèles de culture cellulaire en couches multiples ont permis de montrer la faible pénétration des molécules de chimiothérapie. Les techniques d’immunohistochimie permettent une mesure quantitative de la distribution de ces molécules à partir des vaisseaux sanguins. Nous avons évalué la pénétration de plusieurs inhibiteurs de topoisomérases : topotécan, doxorubicine, mitoxantrone et banoxantrone. Nous avons comparé la distribution de ces molécules à travers des tissus sains et des tissus tumoraux, démontrant la pénétration limitée des molécules de chimiothérapie dans les tumeurs. Par contre, nous avons montré que la banoxantrone pénètre rapidement et de façon uniforme. Cette pro-drogue est convertit en AQ4 (un inhibiteur de topoisomérase II ressemblant à la mitoxantrone) en condition d’hypoxie. La mitoxantrone cible les cellules bien oxygénées et AQ4 cible les cellules hypoxiques. Cette combinaison de traitement aboutit à une distribution intratumorale complémentaire et à une amélioration de l’activité antitumorale. Ainsi, optimiser la pénétration des chimiothérapies et/ou cibler spécifiquement les cellules hypoxiques peut contourner la chimiorésistance liée au microenvironnement tumoral. / There is a vast literature about mechanisms that lead to drug resistance of individual cancer cells, including drug export pumps, changes in expression of targets (such as topoisomerases) or alterations in apoptosis. A smaller number of publications has drawn attention to causes of drug resistance that depend on the solid tumour microenvironment. Drugs must penetrate the extra-vascular space to reach all of the cancer cells (including cells far from blood vessels in hypoxic condition) in sufficient concentration to cause lethal toxicity. Model systems such as multilayered cell cultures provide direct evidence of poor drug penetration through tumour tissue. In vivo techniques using quantitative immunohistochemistry allow studying drug distribution as a function of distance from the nearest blood vessel. We have evaluated the penetration of several topoisomerase inhibitors: topotecan, doxorubicine, mitoxantrone and banoxantrone (AQ4N). We have compared the distribution of these drugs through normal and tumour tissue, demonstrating the limited perivascular distribution of conventional chemotherapies in tumour. We have also showed the rapid and uniform penetration of banoxantrone. This pro-drug is reduced to AQ4 (a topoisomérase II inhibitor of similar structure to mitoxantrone) under hypoxic condition. The targeting of mitoxantrone to oxygenated regions and AQ4 to hypoxic tumour regions resulted in effective drug exposure over the entire tumour and increased tumour growth delay compared with either drug alone. Improving drug penetration and/or targeting hypoxic tumour cells may overcome chemoresistance due to the tumour microenvironment.

TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand) est une protéine du système immunitaire appartenant à la famille du TNF (Tumor necrosis factor). L'intérêt de TRAIL en thérapie anti-cancéreuse réside dans sa capacité à induire la mort par apoptose des cellules tumorales, sans exercer de toxicité envers les cellules saines. Le principal frein à l’utilisation de TRAIL est la survenue de mécanismes de résistance à TRAIL dans certaines tumeurs. Mon travail de thèse a consisté à étudier ces mécanismes de résistance à TRAIL et à élaborer des stratégies visant à les contourner. Dans un premier temps, mon intérêt s'est porté sur le récepteur antagoniste TRAIL-R4, qui est capable de fixer TRAIL sans engager de signal de mort. Nous avons montré pour la première fois que TRAIL-R4 est à l'origine de l'induction de voies de signalisation intracellulaires de survie et de prolifération dans le modèle HeLa de carcinome du col de l'utérus. Ces cellules résistantes peuvent néanmoins être sensibilisées à l'action de TRAIL par un pré-traitement chimiothérapeutique conventionnel (cisplatine, étoposide ou 5-FU). Cette sensibilisation ne fait pas intervenir la voie mitochondriale de l'apoptose, mais passe par une augmentation du recrutement et de l'activation de la caspase-8 au sein du complexe initiateur de mort (DISC). Dans un deuxième temps, mon travail s'est focalisé sur des lymphomes B non-Hodgkiniens particulièrement agressifs, les lignées VAL et RL. La résistance à TRAIL de ces lymphomes est due à un blocage de la voie mitochondriale de l'apoptose, notamment en raison de l'expression des protéines anti-apoptotiques Bcl-2, Mcl-1 et survivine. Mon objectif a été d’élaborer une stratégie thérapeutique visant à contourner cette résistance. Dans ce contexte, nous avons évalué l’efficacité d'un composé polyphénolique issu des plantes, la quercétine. Nos résultats montrent que la combinaison de la quercétine et de TRAIL permet de tuer de façon synergique les lymphomes VAL et RL. Le mécanisme moléculaire de cette synergie comprend l'activation de la voie mitochondriale de l’apoptose, ainsi que l'inhibition de Mcl-1 et de la survivine. L'ensemble de ce travail est rassurant quant à l'utilisation de la cytokine TRAIL en thérapie anti-tumorale, dans le cadre d'une thérapie combinée. / The TNF-family member TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand) is a cytokine involved in immune anti-tumour surveillance. TRAIL is one of the most promising agents currently under investigation, as it exhibits efficient anti-cancer cytotoxicity with limited side effects on healthy cells. The problem in current cancer therapy is that some cancer cells are already resistant, or can become resistant to TRAIL-induced cell death. The aim of my thesis was to study the mechanisms of resistance to TRAIL, and to find a way to bypass it. First, we were interested in the TRAIL-R4 antagonistic receptor, which is known to bind TRAIL without inducing a death signal. We have demonstrated for the first time that TRAIL-R4 is able to induce intracellular signalling that mediates cell survival and proliferation in the cervical carcinoma HeLa cell line. However, these resistant cells could be sensitized to TRAIL by a pretreatment with standard chemotherapy (cisplatinum, etoposide or 5-FU). This chemo-sensitization does not require the mitochondrial loop of apoptosis, but is accompanied by an enhancement of caspase-8 recruitment and activation within the death-inducing signalling complex (DISC). Next, our interest focused on aggressive non Hodgkin B-lymphomas. These lymphomas are highly resistant to TRAIL because of a defect in the mitochondrial pathway of apoptosis, and through the expression of Bcl-2, Mcl-1 and survivin antiapoptotic proteins. My objective was to elucidate a strategy to restore TRAIL-sensitivity in these lymphomas. In this context, we assessed the use of quercetin, a polyphenolic compound derived from plants. Our results showed that the combination of TRAIL with quercetin efficiently killed these lymphomas in a synergistic fashion. The molecular mechanisms of the synergy include the activation of the mitochondrial pathway, and the inhibition of Mcl-1 and survivin. Taken together, these results are promising for the future use of TRAIL as a combined therapy against cancer.

Objectifs: La cytokine TRAIL (TNF Related Apoptosis Inducing Ligand) suscite un intérêt majeur en thérapie anti-cancéreuse grâce à sa capacité à induire l’apoptose des cellules cancéreuses tout en épargnant les cellules saines. L’association du récepteur Fas et de l’actine via l’ezrine, une protéine de la famille ERM (Ezrin, Moesin, Radixin), régule les premières étapes de l’induction de l’apoptose par FasL. Au cours de mon projet de thèse, nous avons voulu déterminer le rôle que pouvait jouer l’ezrine au cours de l’apoptose induite par TRAIL, dans des lymphomes B ou des cellules cancéreuses adhérentes (HeLa, HCT116 et SW480). Matériel et Méthodes: Des approches biochimiques et moléculaires nous ont permis d’étudier et de déterminer l’implication de l’ezrine et sa phosphorylation dans la régulation de la mort induite par TRAIL. Résultats: Ce travail démontre que l’ezrine peut réguler de manière négative l’apoptose induite par TRAIL et FasL. Cette activité inhibitrice est régulée par la phosphorylation/déphosphorylation sur la serine 66 ainsi que sur la thréonine 353. Néanmoins cette régulation n’affecte ni la formation, ni l’activation du DISC (Death Inducing Signalling Complex). Des mutations de ces résidus par une alanine (S66A) ou un acide aspartique (Y353D) augmente sélectivement la capacité de TRAIL à induire l’apoptose. Au contraire, des mutations ponctuelles de ces résidus permettant de mimer la phosphorylation de l’ezrine sur la serine 66 (S66D) ou l’expression d’un variant non phosphorylable sur la thréonine 353 (Y353F) protègent les cellules cancéreuses de l’apoptose induite par TRAIL. De manière concordante, l’utilisation du H89, un inhibiteur de PKA, kinase responsable de la phosphorylation de la serine 66 augmente la sensibilité des cellules cancéreuses à TRAIL, alors qu’au contraire, un activateur de PKA (8bromocyclic AMP) rend ces mêmes cellules plus résistantes à TRAIL. Enfin, l’association de TRAIL et du cisplatine permet de dépasser l’inhibition de l’apoptose par l’ezrine. / Background and Aim: TRAIL has sparked a growing interest in oncology due to its ability to selectively trigger cancer cell death while sparing normal cells. The Fas/actin association through ezrin, a member of the ERM protein family, has been reported to regulate early steps of Fas-mediated apoptosis. In this project, we addressed the role of ezrin regarding TRAIL-induced cell death in B lymphoma cell lines, or adherent cancer cell lines (HeLa WT, HCT116, SW480). Methods: Molecular and biochemical approaches were employed to study the relevance of ezrin and its phosphorylation status in TRAIL signaling. Results: We found that ezrin displays a negative function towards TRAIL- and Fas-mediated apoptosis and that the ezrin-mediated TRAIL-induced cell death inhibition led to ezrin activation through phosphorylation/dephosphorylation events at serine 66 and tyrosine 353, but is mainly independent of TRAIL DISC (Death Inducing Signalling Complex) formation or activation. Mutations of these residues to alanine (S66A) or aspartic acid (Y353D) selectively enhanced TRAIL-induced cell death, whereas point mutations mimicking ezrin phosphorylation on S66 (S66D) or a nonphosphorylable variant on Y353 (Y353F) strongly protected cancer cells from apoptosis induced by TRAIL. Moreover, inhibition of the ezrin serine 66 PKA target site, using H89, increased cancer cell sensitivity to TRAIL, while treatment with 8bromocyclic AMP, a PKA activator, decreased TRAIL-induced cell death. In addition, combined TRAIL/cisplatin treatments abrogated ezrin-mediated inhibition of TRAIL-induced apoptosis.

Les traitements actuels anticancéreux ont une action cytotoxique directe sur les cellules tumorales mais également sur les cellules saines des systèmes immunitaires et hématopoïétiques. De plus, ces traitements ont l’incapacité de stimuler le système immunitaire et de prévenir les récidives. Cependant, certains agents tels que les anthracyclines, la radiothérapie ou encore la thérapie photodynamique ont la capacité d’induire une mort cellulaire dite immunogène. Durant cette modalité, l’exposition à la surface des cellules tumorales mourantes d’une protéine chaperonne du reticulum endoplasmique (RE), la calréticuline (CALR), est une étape essentielle et caractéristique de l’immunogénicité ainsi que la libération d’HMGB1, l’autophagie et la sécrétion d’ATP. Des données issues de la littérature prouvent que les anthracyclines sont également capables d’activer des marqueurs du stress du RE. Notre travail a consisté à étudier les liens moléculaires entre le stress du RE et les marqueurs de la mort cellulaire immunogène. Grâce à un criblage à haut débit, nous avons déterminé que les drogues dites immunogènes activaient la phosphorylation d’eIF2α (eukaryotic initiation factor 2 alpha) et qu’il existait une corrélation forte avec l’exposition de la CALR (R score 0,73 ; p<0,01). De manière surprenante, ces agents échouent à activer la voie de signalisation sous-jacente ainsi que les deux autres voies du stress du RE médiées par ATF6 (activating transcription factor 6) et XBP1s (spliced X-box binding protein 1). Par ailleurs, une anthracycline appelée mitoxantrone inhibe activement les trois voies du stress du RE en co-traitement avec un inducteur du stress du RE et inhibiteur de la N-glycosylation: la tunicamycine. Ces données in vitro ont également été validées dans un modèle in vivo de souris immunodéficientes xénogreffées. De plus, grâce à un algorithme reliant les propriétés physico-chimiques des drogues anti-cancéreuses avec leurs capacités à induire les marqueurs de mort cellulaire immunogène suivants: P-eIF2α, CALR, HMGB1, granules de stress et autophagie, un score prédictif d’immunogénicité a pu être déterminé. Nous devrons déterminer dans le futur comment utiliser ce score comme marqueur prédictif d’une réponse immunogène au cours des traitements cliniques. / Conventional anticancer chemotherapies display a high degree of toxicity with certain specificity for tumor cells. However most of these approaches fail to activate immune system-related bystander effects and thus do often fail to prevent from recurrence. Despite these premises, certain anticancer treatments (including anthracycline-based chemotherapy, radiotherapy and photodynamic therapy) have the ability to induce an immunogenic cell death (ICD) modality. The exposure of calreticulin (CALR) during the course of ICD is quintessential for the transfer of tumor antigen from dying tumors to dendritic cells of the immune system as well as translocation of high mobility group box 1 (HMGB1), autophagy and ATP secretion. Previous studies have shown that certain anticancer agents including anthracylins are able to activate markers of endoplasmic reticulum stress (ER stress). Here we investigated the molecular mechanisms that link ER stress responses with hallmarks of ICD. In a drug screening approach, we showed that ICD-inducing drugs triggered the phosphorylation of the eukaryotic initiation factor 2 alpha (P-eIF2α) and that this correlated with CALR exposure (R score 0.73, p<0.01). Surprisingly though the agents failed to induce downstream ER stress pathways including the transcriptional activation of activating transcription factor 4 (ATF4), the alternative splicing of X-box binding protein 1 (XBP1s) mRNA and the proteolytic cleavage of activating transcription factor 6 (ATF6). In addition, we found that mitoxantrone actively inhibited all three arms of the unfolded protein response, when co-administered with the inhibitor of N-linked glycosylation tunicamycin, whereas tunicamycin alone triggered all arms of ER-stress. These findings were validated in vivo in immunodeficient animals xenografted with biosensors for ER-stress responses. Moreover, using a machine learning approach that integrates physicochemical properties of oncologic drugs with their ability to elicit immunogenic hallmarks including the phosphorylation of eIF2α, the exposure of CALR, the translocation of HMGB1, the formation of stress granules and the induction of autophagy we established an in silico approach for ICD prediction. For the future, we further aim to investigate the possibility to use these score comprising P-eIF2α and its downstream consequences as biomarker for immunogenic responses during anticancer treatment in patients.

Activée par la chimiothérapie, la sénescence est un mécanisme suppresseur de tumeur qui empêche la progression tumorale. Cependant, certaines cellules cancéreuses sont capables d’émerger et de provoquer une rechute clinique. Les mécanismes mis en place par les cellules pour échapper à la sénescence ne sont pas encore clairement connus. Nous avons récemment décrit que les cellules qui échappent à la sénescence résistent à l’anoïkis et sont dépendantes de Mcl-1. Dans cette étude, nous caractérisons plus en détail cette émergence en réponse à l'irinotécan, un traitement de première ligne utilisé dans le cancer colorectal. Nos résultats indiquent que la kinase Aktest activée comme une voie de survie lors de l'étape précoce de la sénescence et qu’elle est également réactivée lors de l’émergence. L'inhibition de la kinase avec le GSK690693 empêche l’émergence et améliore l’efficacité du traitement, à la fois in vitro et in vivo. Cette amélioration a été corrélée à l'inhibition de la sénescence et l’activation concomitante de l'apoptose via l’inactivation de Mcl-1 par Noxa. De plus, en utilisant des cellules p21Waf1 déficientes, nous avons confirmé que la voie p53-p21, principal régulateur de la sénescence, favorise l’émergence. A l’inverse, son inhibition améliore l'efficacité du traitement par induction de l'apoptose. Ces résultats mettent en évidence que l'inhibition d’Akt améliore l’efficacité de l’irinotécan et empêche l'émergence de cellules persistantes en diminuant la sénescence au profit de la réponse apoptotique. Par conséquent, nous proposons que l’utilisation d’inhibiteurs d’Akt en thérapies séquentielles devrait être considérée dans le futur pour améliorer le traitement des cancers colorectaux réfractaires à l’irinotécan. / Activated by chemotherapy, senescence is a tumor suppressive mechanism that prevents tumor progression. However, some cancer cells can emerge to induce clinical relapse. The mechanisms set up by cells to escape senescence are not yet clearly known. We have recently described that cells that escape senescence are more transformed than non treated parental cells ; they resist anoikis and depend on Mcl-1. In this study, we further characterize this emergence in response to irinotecan, a first line treatment used in colorectal cancer. Our results indicate that the Akt kinase was activated as a feedback pathway during the early step of senescence and also during emergence. Inhibition of the kinase with GSK690693 prevented cell emergence and improved treatment efficacy, both in vitro and in vivo. This improvement was correlated with senescence inhibition, p21waf1 down regulation and a concomitant activation of apoptosis due to Noxa upregulation and Mcl-1 inactivation. Indeed, Noxa inactivation prevented apoptosis and increased the number of emergent cells. Moreover, using p21waf1-deficient cells, we further confirmed that an intact p53-p21-senescence pathway favored cell emergence and that its down regulation improved treatment efficacy through apoptosis induction. These results highlight that Akt inhibition improves irinotecan treatment and prevent cell emergence by switching the senescence response to apoptosis. Therefore, we propose that use of Akt inhibitors in sequential therapies should be considered in future to improve the treatment of irinotecan-refractory colorectal cancers.

<p align="justify">Les glioblastomes sont les tumeurs cérébrales malignes les plus répandues chez l’adulte et l’enfant, et les plus agressives avec une médiane de survie inférieure à quinze mois. Deux caractéristiques biologiques rendent leur traitement particulièrement difficile. Tout d’abord, la capacité d’invasion du parenchyme cérébral par les cellules gliales tumorales rend la résection chirurgicale totale impossible. De plus, ces cellules développent une résistance aux stimuli pro-apoptotiques rendant la plupart des agents chimiothérapeutiques peu efficaces contre ce type de tumeur. Actuellement, le seul agent chimiothérapeutique efficace dans le traitement des glioblastomes est le témozolomide. Malheureusement des mécanismes de résistance acquise peuvent apparaître chez des patients traités avec cette molécule. Nous avons donc étudié ces mécanismes moléculaires de résistance acquise au témozolomide et dans un deuxième temps nous avons tenté de trouver de potentielles molécules susceptibles de lutter contre les gliomes. </p align="justify"><p><p align="justify">Nous avons rendu résistants deux modèles de cellules gliales tumorales au témozolomide par un traitement incrémental durant plusieurs mois. Grâce à une analyse de type Affymétrix, nous avons comparé l’expression de l’ensemble des gènes entre les lignées normales et les lignées rendues résistantes. Deux familles de gènes sont ressorties comme impliquées dans ce processus de résistance :les transporteurs glucose et les aldo-kéto réductase 1C (akr1c). Pour les transporteurs glucose, il se pourrait que leur implication se fasse au niveau du métabolisme des cellules résistantes en permettant d’apporter plus de substrat énergétique et ainsi contourner les effets pro-autophagiques du témozolomide. Dans le cas des akr1c, il semblerait que leur surexpression ait pour but d’augmenter la prolifération des cellules tumorales résistantes. </p align="justify"><p><p align="justify">Nous avons, par la suite, étudié les propriétés anticancéreuses de métabolites fongiques, les phyllostictines, extraites du champignon Phyllosticta cirsii. Quatre métabolites naturels et deux dérivés hémisynthétiques ont été testés démontrant des activités plus ou moins importantes sans toutefois montrer in vitro de biosélectivité entre cellules tumorales et cellules normales. Les phyllostictines semblent se lier au groupement thiol libre comme nous l’avons déterminé sur le glutathion ou la cystéine. Il reste à déterminer la cible des phyllostictines dans les cellules tumorales et à améliorer la sélectivité de ces molécules.</p align="justify"> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le cancer du sein triple négatif (CSTN) est le sous-type de cancer du sein le plus hétérogène et le plus défavorable. La pierre angulaire du traitement de ces tumeurs repose sur la chimiothérapie systémique, de plus en plus fréquemment administrée en néoadjuvant, puisqu’aucune thérapie ciblée n’est à ce jour validée. L'obtention d'une réponse complète histologique (RCH) constitue un marqueur pronostique favorable majeur ainsi qu'un test in vivo de la sensibilité aux médicaments anti-tumoraux. L’objectif de notre travail de thèse a donc été d’apporter des éléments de compréhension de cette hétérogénéité grâce à la dissection clinique, biologique et moléculaire de ces tumeurs. Nous avons analysé les profils d'expression géniques de ces CSTN et ainsi identifié 6 sous-types moléculaires distincts avec des biologies et des pronostics différents. Cette classification s’appuie sur une méthodologie originale basée à la fois sur des outils bioinformatiques classiques associée à l’utilisation de réseaux biologiques. L’enrichissement en gènes de l'immunité issus du compartiment stromal de la tumeur représente un déterminant majeur du pronostic de ces tumeurs : une forte expression des gènes de l'immunité est associée un pronostic significativement plus favorable. Notre principale contribution repose sur une meilleure compréhension de l’immunité et de l’infiltrat lymphocytaire (TILS) de ces CSTN. Il s’agit probablement du sous-groupe de cancers du sein le plus immunogène avec des taux de TILS pré-CNA parmi les plus élevés avec les tumeurs HER2-positives. Cet infiltrat lymphocytaire est d'ailleurs très corrélé aux gènes de notre module immunitaire pronostique dans les CSTN. La valeur prédictive et pronostique des TILS du stroma tumoral est différente selon le sous-type moléculaire de cancer du sein, suggérant une immunité complètement différente de ces tumeurs. Le taux de TILS varie également différentiellement au sein de chaque sous-groupe sous l'influence de la CNA, témoignant d'une interaction complexe entre les TILS et les traitements. Nous montrons que la cinétique des TILS sous l'effet de la CNA est un indicateur pertinent de réponse à la CNA avec une réponse d'autant plus importante qu'une décroissance du taux de TILS sera importante. Les tumeurs les plus immunogènes avec une activité immunitaire importante sont donc les tumeurs triple-négatives les plus favorables. L'un des challenge des années à venir sera donc d'identifier le plus tôt possible les CSTN les moins immunogènes susceptibles de bénéficier au mieux des immunothérapies seules ou combinées au traitement chimiothérapique afin d'activer ou de rétablir précocement une immunité déficiente. Sous une même dénomination de TILS se trouve très certainement des populations phénotypiques de lymphocytes différentes. En effet, après CNA, leur valeur pronostique est opposée entre les CSTN et les tumeurs HER2-positives: des taux élevés de TILS sont associés à un pronostic défavorable dans les tumeurs HER2-positives alors qu’ils ont une tendance à être associés à des CSTN de meilleur pronostic. Les interactions sont complexes entre les agents cytotoxiques et la tumeur et/ou son microenvironnement. L'analyse du résidu tumoral mammaire ou ganglionnaire représente un matériel sous-exploité qui pourrait permettre de mieux comprendre les mécanismes de sensibilité ou de résistance aux traitements. Au delà de la pierre angulaire que constitue l'immunité pour ces tumeurs, nos travaux identifient certains CSTN pour lesquels l'environnement hormonal, au travers de l'indice de masse corporel ou du statut ménopausique, pourrait jouer un rôle. Ainsi l'exploration du métabolome, des particularités immunitaires chez les patientes en surpoids/obèses ou l'analyse de la voie androgène-récepteur (et ses connexions avec les voies oestrogène et progestérone-récepteur) des CSTN doit aussi être explorée de manière détaillée. Ceci ouvre des perspectives de traitement possibles pour certaines patientes. / Triple negative breast cancer (TNBC) is the most heterogeneous and pejorative subtype of breast cancer. The cornerstone of the treatment of such tumors is based on systemic chemotherapy, more and more frequently administered before surgery, since no targeted therapy has been validated to date. Obtaining a pathological complete response (PCR) is a major favorable prognostic marker as well as an in vivo test of anti-tumor drug susceptibility. The objective of our thesis work was therefore to provide elements of understanding of this heterogeneity through the clinical, biological and molecular dissection of these tumors.We analyzed gene expression profiles of TNBCs and identified 6 distinct molecular subtypes with different biologies and prognoses. This classification used an original methodology based on both classical bioinformatic tools and biological networks. The enrichment of immunity genes from the stromal compartment of the tumor represents a major determinant of the prognosis of these tumors: a strong expression of the immunity genes is associated with a significantly more favorable prognosis.Our main contribution is based on a better understanding of immunity and tumor infiltrated lymphocytes (TILS) of these TNBCs. It is probably the most immunogenic subgroup of breast cancers with the highest TILs levels pre-NAC with HER2-positive tumors. TILS levels are also highly correlated with genes of our immune prognosis module. The predictive and prognostic value of stromal TILS is different according to the molecular subtype of breast cancer, suggesting a completely different immunity of these tumors. The rate of TILS also varies differentially within each subgroup under the influence of the NAC, indicating a complex interaction between TILS and treatments. We show that the kinetics of TILS levels with NAC is a relevant indicator of response to NAC with a response that is all the more important that a decrease in the TILS rate will be important. The most immunogenic tumors with an important immune activity are therefore the most favorable triple-negative tumors. One of the challenges of the coming years will therefore be to identify, as soon as possible, the least immunogenic TNBC that can best benefit from immunotherapies alone or in combination with chemotherapeutic treatment in order to activate or restore early a deficient immunity.Under the same denomination of TILS there are probably different phenotypic populations of lymphocytes. Indeed, after CNA, their prognostic value is opposite between the TNBC and the HER2-positive tumors: high levels of TILS are associated with an unfavorable prognosis in HER2-positive tumors whereas they have a tendency to be associated with a better prognosis for TNBC tumors. The interactions are complex between cytotoxic agents and the tumor and / or its microenvironment. The analysis of the breast or axillary lymph node residual disease represents an underutilized material that could lead to a better understanding of the mechanisms of sensitivity or resistance to treatment.Beyond the key role immunity for these tumors, our work identifies some TNBCs for which the hormonal environment, through the body mass index or the menopausal status, could play a role. Thus, the exploration of the metabolome, immune features in overweight / obese patients or the analysis of the androgen-receptor pathway (and its connections with the estrogen and progesterone-receptor pathways) of the TNBC must also be explored. This opens up possible treatment perspectives for some patients.