Os protozoários do gênero Leishmania são os agentes etiológicos da leishmaniose cutânea e visceral. A infecção é transmitida por insetos hematófagos, nos quais os parasitos se desenvolvem sob a forma promastigota. Nos hospedeiros mamíferos, incluindo a espécie humana, as formas encontradas são as amastigotas que proliferam nos macrófagos; estas células podem controlar a infecção produzindo radicais derivados do oxigênio e do nitrogênio. O óxido nítrico (NO) é um dos mais potentes radicais com atividade leishmanicida. Existem várias moléculas já descritas que liberam NO em meio aquoso ou quando adicionadas a suspensões celulares. São chamadas de doadoras de NO. Algumas destas vêm sendo estudadas pelo seu potencial terapêutico no tratamento das leishmanioses cutâneas. A molécula S-nitrosoglutationa (GSNO) pertence a um grupo de moléculas conhecido com S-nitroso-tióis e é um doador de NO relativamente estável. A GSNO havia sido previamente testada em culturas de formas promastigotas de L. amazonensis e causou a morte do parasito. O possível uso da GSNO na terapia das leishmanioses cutâneas demanda o conhecimento de suas ações sobre as formas amastigotas encontradas nos hospedeiros mamíferos. Terapias complementares aos antimoniais usados no tratamento da leishmaniose cutânea são necessárias porque estes são apenas injetáveis, têm efeitos colaterais e ocorrem altos índices de desistência do tratamento. O objetivo do trabalho foi analisar o efeito da molécula GSNO nas culturas de células THP-1 (linhagem de monócitos humanos leucêmicos) infectadas com L.major e o efeito da sua administração tópica diretamente na lesão ulcerada leishmaniótica de camundongos infectados. Os experimentos com células THP-1 infectadas com L. major e tratadas com GSNO, mostram marcada redução do parasitismo intracelular, dose dependente, em comparação às culturas sem tratamento. O tratamento com GSNO foi testado em camundongos Balb/c 8 infectados com L. major e em camundongos C57BL/6 desprovidos do gene de IFN<font face=\"symbol\">g- (Knockout de IFN ou IFN-<font face=\"symbol\">g KO) infectados com L. braziliensis. Grupos de animais foram infectados no dorso e após 60 dias iniciou-se o tratamento tópico com GSNO diluída em PBS, em GEL F127 ou com os respectivos veículos, como controles; ainda, outros grupos foram tratados sistemicamente (via endovenosa) com o antibiótico com ação leishmanicida, anfotericina B, ou com anfotericina B associada à aplicação tópica de GSNO. Foram feitas duas medições semanais das lesões. Decorridos aproximadamente 60 dias após o início do tratamento, os animais foram sacrificados e retirados o linfonodo drenante (inguinal superficial) e a lesão para fazer a quantificação parasitária. O tratamento tópico da infecção por L.major com a molécula GSNO reduziu o tamanho da lesão cutânea, chegando a se observar fechamento da úlcera em alguns animais; a carga parasitária no linfonodo drenante e/ou na lesão também sofreu redução. Nos camundongos IFN-<font face=\"symbol\">g KO infectados por L. braziliensis, também ocorreu inibição da progressão da lesão pelo tratamento local com GSNO em comparação ao grupo não tratado. Como conclusão, conseguimos demonstrar que GSNO apresenta efeito leishmanicida sobre formas amastigotas de L. major em cultura celular e reduz a lesão cutânea causada por L.major ou por L. braziliensis em comparação aos grupos controle. / Protozoa of the genus Leishmania are the etiological agents of cutaneous and visceral leishmaniasis. The infection is transmitted by hematophagous insects in which the parasite multiplies and differentiates as promastigotes. In the mammalian hosts, including man, the parasite proliferates as amastigotes inside macrophages; production of reactive oxygen or nitrogen intermediates (ROI and RNI) by these cells can control the infection. Nitric oxide (NO) is a very toxic RNI active against leishmania. The are many molecules that liberate NO in solution or when added to cellular suspensions. They are collectively called NO donors. A few of them have been studied because of their potential therapeutic use in cutaneous leishmaniasis. The molecule S-nitrosoglutathione (GSNO) belongs to the S-nitroso-thiols and is a relatively stable NO donor. GSNO has been previously tested and caused the death of L. amazonensis promastigotes in liquid culture. A putative application of GSNO in the treatment of cutaneous leishmaniasis requires the understanding of its activities on amastigote forms which are the parasite forms found in the mammalian host. Because the classical leishmaniasis treatment relies on injectable antimonial drugs which have many side effects, many patients abandon the treatment. Therefore, additional therapy to accelerate the cure is needed as well as new drugs are much needed. The aim of the present work is to analyze the effect of the molecule GSNO in cultures of THP-1 cells (a leukemia human monocyte cell line) infected with Leishmania major as well as the effect of administering it topically into the lesion of infected mice. The experiments done on L. major-infected THP-1 cells showed marked dose-dependent reduction of parasitism when compared to untreated infected cells. The topical treatment with GSNO was done in BALB/c mice infected with L. major and in C57BL/6 mice deprived of the IFN-<font face=\"symbol\">g gene (IFN- <font face=\"symbol\">g KO) infected with L. braziliensis. Groups of mice were infected in the shaven dorsal skin and 60 days later the topical treatment with GSNO dissolved in PBS, in GEL F127 was started. Still other groups were treated systemically (i.v.) with Amphotericin B which is leishmanicidal or with Amphotericin B associated to topically applied GSNO. The lesions were measured twice a week. After 60 days the mice were killed and the draining lymph node and the lesion were removed for quantifying the parasite numbers. The topical treatment of L. major-induced ulcer with GSNO reduced the size of the ulcer leading in some mice to complete healing; the parasitic loads in the draining lymph node or in the lesion were also reduced. In L. braziliensis-infected IFN-<font face=\"symbol\">g KO mice, inhibition of lesion growth also occurred in the mice topically treated with GSNO in comparison to the untreated control group. In conclusion we showed that GSNO is leishmanicidal to L. major intracellular amastigotes and that the topical treatment reduces the size of the lesion caused in mice by L. major or by L. braziliensis in comparison to the control groups.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-04-05T17:16:52Z No. of bitstreams: 1 COSTA, Jaqueline França - 2009.pdf: 5023458 bytes, checksum: 0aad0e59a4ee55dd3db0b89317f4bd80 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-05T17:16:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 COSTA, Jaqueline França - 2009.pdf: 5023458 bytes, checksum: 0aad0e59a4ee55dd3db0b89317f4bd80 (MD5) Previous issue date: 2009 / Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina. Salvador, Bahia, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A Leishmaniose Cutânea Difusa (LCD) é uma manifestação clínica rara das Leishmanioses, caracterizada pela presença de inúmeros macrófagos intensamente parasitados e baixa reação inflamatoria. No Brasil, a espécie envolvida em casos de LCD é a Leishmania (Leishmania) amazonensis. Tem sido descrito na literatura a exposição e o reconhecimento de fosfatidílserina (PS) na superfície de células apoptóticas fagocitadas por macrófagos como mecanismo de desativação de macrófagos por urna via dependente de TGF-pi e PGE2 (Fadok et al. 1998). Foi demonstrado por Barcinski e colaboradores que formas amastigotas de L. amazonensis expõem PS em sua superfície, em um mecanismo chamado “Mimetismo Apoptótico”. Nesse contexto, nosso objetivo foi investigar a exposição de PS na superfície de isolados de L, amazonensis obtidos de pacientes com LCD e seu papel durante a infecção de macrófagos. Inicialmente, macrófagos peritoneais de camundongos Fl(BALB/c x C57BL/6) estimulados com tioglicolato foram infectados com os diferentes isolados obtidos de pacientes com Leishmaniose Cutânea Localizada (LCL) e LCD. A exposição de PS na superfície das amastigotas purificadas de macrófagos F1 foi determinada por citometria de fluxo. Os isolados obtidos de pacientes com LCD apresentaram maior expressão de PS do que os isolados de pacientes com LCL após 24 horas de infecção. Em seguida, avaliamos se a diferença observada na exposição de PS em amastigotas estaria relacionada à infectividade dos diferentes isolados. Os resultados indicaram que as amastigotas de pacientes com LCD apresentaram maior porcentagem de macrófagos infectados e índice de infecção, quando comparados com amastigotas de pacientes com LCL. Quanto ao mecanismo, 0 grupo infectado com os isolados de pacientes com LCD não apresentou diferença em relação ao grupo LCL quanto a produção de TGF-pl e óxido nítrico, sugerindo que outros mecanismos imunorregulatórios estejam envolvidos. Os resultados em conjunto, sugerem que 0 aumento na exposição de PS nos isolados de L. amazonensis de pacientes com a forma difusa pode representar um mecanismo de adaptação importante para a sobrevivência e estabelecimento da infecção. A elucidação de mecanismos supressores da LCD induzidos por isolados de L. amazonensis poderá ampliar 0 conhecimento sobre a imunorregulação dessa patologia / Diffuse Cutaneous Leishmaniasis (LCD) is a rare clinical manifestation of Leishmaniasis, characterized by a number of macrophages heavily parasitized and low inflammatory reaction. In Brazil, Leishmania (Leishmania) amazonensis is the main specie involved in LCD cases. It has been described that the exposure and recognition of phosphatidylserine (PS) on the surface of apoptotic cells phagocytosed by macrophages is a macrophage deactivation mechanism dependent on TGF-pi and PGE2 (Fadok et al. 1998). Morover, it was demonstrated by Barcinski and colleagues that L. amazonensis amastigotes expose PS on its surface, in a mechanism called ’’Apoptotic Mimicry." In this context, our goal was to investigate the exposure of PS on the surface of L. amazonensis isolates obtained from LCD patients and its role during the infection of macrophages. Initially, peritoneal macrophages from FI mice (BALB/c x C57BL/6) stimulated with thioglycolate were infected with different L. amazonensis strains isolated from patients with Localized Cutaneous Leishmaniasis (LCL) or LCD. The exposure of PS on the surface of amastigotes was determined by flow cytometry using staining to annexin V and propidium iodide. Isolates from LCD patients showed higher PS exposure than the isolates from LCL patients 24 hours after infection. Then, we evaluated whether the differences of PS exposure in amastigotes would correlate with the infectivity of different isolates. Percentage of infected macrophages and infection index were higher in cultures using amastigotes from LCD patients compared to the ones infected with amastigotes from LCL cases. Furthermore, cultures infected with LCD isolates showed no difference to the LCL isolates regarding TGF>pl and nitric oxide production, suggesting that other immuneregulatory mechanisms are involved in this process. These results suggest that the increased exposure of PS in L. amazonensis isolates from patients with diffuse form may represent an important mechanism for the establishment of infection. The elucidation of the LCD suppressing mechanisms induced by L. amazonensis strains may expand the knowledge about the immune regulation of this disease

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-04-10T16:47:02Z No. of bitstreams: 1 Pablo Rafael Silveira Oliveira Genética....pdf: 12348951 bytes, checksum: 971e7af3b39a1bb56feeb26578855f45 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-04-10T16:47:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Pablo Rafael Silveira Oliveira Genética....pdf: 12348951 bytes, checksum: 971e7af3b39a1bb56feeb26578855f45 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-10T16:47:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pablo Rafael Silveira Oliveira Genética....pdf: 12348951 bytes, checksum: 971e7af3b39a1bb56feeb26578855f45 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A leishmaniose cutânea (LC) é a forma clínica mais comum do complexo de doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania. Interessantemente, alguns indivíduos infectados com espécies dermotrópicas do parasito não desenvolvem a LC, enquanto outros desenvolvem lesões crônicas. Os mecanismos envolvidos nesta variação permanecem amplamente desconhecidos, embora fatores genéticos do hospedeiro podem influenciar o risco de desenvolver a doença. No primeiro estudo apresentado nesta tese, foi mostrado que a sinalização IL-2/IL-2R desempenha um papel crucial na resposta imune contra espécies dermotrópicas de Leishmania. Os transcritos de vários genes da via de sinalização IL-2 são mais abundantes em úlceras cutâneas causadas por Leishmania braziliensis do que em amostras de pele normal de dadores não infectados. Um estudo de associação em famílias brasileiras (209 famílias nucleares) identificou dois polimorfismos no gene IL2RA associados à LC causada por L. braziliensis [rs10905669 (p = 3x10-4) e rs706778 (p = 3x10-4)]. Estes resultados foram replicados em uma segunda amostra brasileira (80 famílias nucleares) [rs10905669 (p = 0.08) e rs706778 (p = 0.04)] e em iranianos infectados com Leishmania tropica (coorte do tipo caso-controle composta por 236 indivíduos) [rs10905669 (p = 0.03) e rs706778 (p = 0.04)]. Uma metanálise dos três estudos confirmou que os alelos rs10905669 T (pcombinado = 6x10-7) e rs706778 T (pcombinado = 2x10-9) são fortemente associados a uma maior predisposição à LC. O alelo T do SNP rs706778 também foi associado a uma menor produção de IFN- por células mononucleares após a estimulação com extrato de Leishmania e com uma redução na ativação de células T regulatórias (Treg) FoxP3+ in vitro. Em conjunto, os dados apresentados no estudo 1 suportam a hipótese de que a via de sinalização IL-2 é implicada no desenvolvimento da LC, com possíveis consequências no controle da replicação do parasito e na imunopatologia associada à infecção. No segundo estudo desta tese, foi realizada uma análise de ligação genômica em famílias brasilieras expostas à L. braziliensis. Esta análise revelou um novo locus de suscetibilidade para a LC na região 10q21-q23 (LOD sugestivo = 2.39). Em toda esta região, os genes mais fortemente induzidos em lesões cutâneas (em relação aos controles) foram PRF1 (fold-change = 49.3) e SRGN (fold-change = 21.8). Interessantemente, ambos os genes codificam moléculas envolvidas nos mecanismos de citotoxicidade de células T CD8+ e de células natural killer. Por fim, dois polimorfismos na região do gene SRGN foram associados ao risco de LC em famílias brasileiras expostas à L. braziliensis [estudo primário (209 famílias): rs10998538 (p = 0.001) e rs12437 (p = 0.003); estudo de replicação (80 famílias): rs10998538 (p = 0.01) e rs12437 (p = 0.007)]. Por fim, os dados apresentados nesta tese apontam a serglicina (codificada pelo gene SRGN) e a via de sinalização IL-2 como alvos potenciais de novas estratégias de tratamento ou prevenção contra a LC em humanos. / Cutaneous leishmaniasis (CL) is the most common clinical form of leishmaniasis and can be caused by several dermotropic Leishmania species. Interestingly, some infected individuals do not develop cutaneous lesions, while others are severely affected. The basis of this variation remains largely unknown, although host genetic factors seem to influence disease risk. In the first study presented in this thesis, it was shown that IL-2 plays a crucial role in human immunity against dermotropic Leishmania species. It was observed that the transcripts of several genes of the IL-2 pathway were more abundant in skin ulcers caused by Leishmania braziliensis than in normal skin samples. A primary association study on Brazilians (754 individuals from 209 families) identified two polymorphisms in the IL2RA gene associated with CL caused by L. braziliensis [rs10905669 (p = 3x10-4) and rs706778 (p = 3x10-4)]. This result was confirmed in a second Brazilian sample (325 subjects from 80 nuclear families) [rs10905669 (p = 0.08) and rs706778 (p = 0.04)] and in Iranians infected with Leishmania tropica (236 individuals) [rs10905669 (p = 0.03) and rs706778 (p = 0.04)]. A meta-analysis confirmed that rs10905669 T allele (pcombined = 6x10-7) and rs706778 T allele (pcombined = 2x10-9) were strongly associated with increased susceptibility to CL. The T allele of rs706778 was also associated with lower IFN- production by peripheral blood mononuclear cells after Leishmania antigen stimulation and with reduced FoxP3+ Treg activation in vitro. Altogether, these data support the notion that the IL-2 signaling pathway is implicated in the development of cutaneous leishmaniasis and could be involved in the control of both parasite replication and infection-induced immunopathology. In the second study, a genome wide linkage (GWL) scan conducted in Brazilian multiplex families revealed a new susceptibility locus for CL on chromosome 10q21-q23 (suggestive LOD = 2.39). Interestingly, in this entire region, the most strongly induced transcripts were from PRF1 (fold change = 49.3) and SRGN (fold change = 21.8) genes, both encoding molecules involved in the cytotoxic mechanisms by a variety of cell types, including CD8+ T cells and natural killer cells. Finally, two polymorphisms in the SRGN region were associated with susceptibility to CL in Brazilian families exposed to L. braziliensis [Discovery study (209 families): rs10998538 (p = 0.001) and rs12437 (p = 0.003); Replication study (80 families): rs10998538 (p = 0.01) and rs12437 (p = 0.007)]. These data highlight the serglycin (encoded by the SRGN gene) and the IL-2 pathway as suitable targets for new strategies aimed to treat or prevent cutaneous leishmaniasis.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-11-20T12:57:21Z No. of bitstreams: 1 Maira Garcia Saldanha. Avaliação da resposta...pdf: 27666774 bytes, checksum: 6259788e94ba7cdd8989c58b6e2433cf (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-11-20T12:57:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Maira Garcia Saldanha. Avaliação da resposta...pdf: 27666774 bytes, checksum: 6259788e94ba7cdd8989c58b6e2433cf (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-20T12:57:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maira Garcia Saldanha. Avaliação da resposta...pdf: 27666774 bytes, checksum: 6259788e94ba7cdd8989c58b6e2433cf (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Introdução: A leishmaniose cutânea (LC) é a forma clínica mais frequente da leishmaniose humana, considerada um importante problema de saúde no Brasil. A infecção por Leishmania braziliensis induz um amplo espectro de lesões que pode se manifestar como uma única lesão cutânea localizada, geralmente em partes descobertas do corpo. Tem início com uma pápula, caracterizando a leishmaniose cutânea recente (LCR) e, na maioria dos casos, tende a desenvolver uma úlcera, representando a leishmaniose cutânea clássica (LCC). Pacientes com LCR apresentam um elevado número de parasitas na lesão e, frequentemente, não respondem positivamente à terapia padrão, desenvolvendo a lesão mesmo após o tratamento. Objetivo: Descrever de modo comparativo os aspectos histopatológicos na Leishmaniose Cutânea Recente e Leishmaniose Cutânea Clássica. Métodos: Secções histológicas obtidas de biópsias de pele de 15 pacientes com LCR e 28 com LCC, foram coradas em HE e mensuradas as áreas de inflamação e necrose nas diferentes fases da doença. Realizamos imunohistoquímica para marcação de células CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD68+ e CD138+. Além disso, utilizamos a microscopia eletrônica de transmissão para identificar morfologicamente as células, localizar amastigotas nos meios intra e extracelulares e reconhecer possíveis interações celulares. Resultados: Alterações na epiderme foram aparentes em ambas as fases e na derme, foram mais frequentes as células gigantes e os neutrófilos na LCC. O número de amastigotas foi maior na LCR, apresentando o parasita uma morfologia ultraestrutural íntegra, sugerindo viabilidade. A inflamação conduzida por um variado espectro celular apresentou uma predominância dos linfócitos T CD3+, com os subtipos CD4+ e CD8+, que aumentaram de acordo com o progresso da doença. O número de macrófagos CD68+ foi correlacionado positivamente ao número de amastigotas, nas fases tardias da doença. Além disso, houve uma correlação positiva entre as células CD68+ e o tamanho da lesão nas fases iniciais e, entre os macrófagos e a área de necrose, durante todo o curso da doença. Conclusão: A presença do parasita e a extensiva infiltração celular, com participação efetiva dos macrófagos, provocam alterações na epiderme e derme, contribuindo para o desenvolvimento da lesão cutânea e interferindo na resposta terapêutica. / Introduction: Cutaneous leishmaniasis (CL) is the most common clinical form of human leishmaniasis induced by L. braziliensis. It is considered a major health problem in Brazil. Leishmania braziliensis infection induces a large spectrum of lesions that can manifest as one localized skin lesion, usually undressed body parts. It starts with a papule in early cutaneous leishmaniasis (ECL) clinical manifestation and, in most cases, tends to develop an ulcer, in the late cutaneous leishmaniasis (LCL). ECL patients have a high number of parasites in the lesion, and often do not respond to standard therapy, developing the lesion even after treatment. Aim: To describe comparative the histopathological aspects of early cutaneous leishmaniasis compared to late ulcerated cutaneous leishmaniasis. Methods: Histological sections of skin biopsies from 15 ECL patients and 28 LCL, were stained with HE and measured areas of inflammation and necrosis in the different stages of the disease. We performed immunohistochemical for CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD68+ and CD138+. In addition, we used transmission electron microscopy to identify the cells morphologically, to locate amastigotes in intra and extracellular and to recognize possible cellular interactions. Results: Changes in the epidermis are apparent in both phases. In the dermis chronic inflammation with giant cells and neutrophils in the LCL. The number of amastigotes is higher in the ECL. Amastigotes are morphologically intact at ultrastructural analysis, suggesting their viability. Inflammation with a varied spectrum of cells, commonly with CD3+, CD4+ and CD8+ cells, increasing as the lesion progress. The number of CD68+ macrophages are predominat cells in the infiltrate and was positively correlated with number of amastigotes in the late stages of the disease. Furthermore, there was positive correlation between CD68+ cells and the lesion size in the early stages and between macrophages and necrotic areas during the disease progress. Conclusion: The presence of the parasite and the extensive cellular infiltration with the effective participation of macrophages, cause changes in the epidermis and dermis, contributing to the development of skin lesion and affecting the therapeutic response.

Submitted by Valquíria Barbieri (kikibarbi@hotmail.com) on 2018-04-18T21:33:42Z No. of bitstreams: 1 DISS_2015_Helen Aguiar Lemes da Silva.pdf: 1095638 bytes, checksum: 6455f6c98e8a5cf2bacf4cd9e2f12fae (MD5) / Approved for entry into archive by Jordan (jordanbiblio@gmail.com) on 2018-04-27T17:33:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISS_2015_Helen Aguiar Lemes da Silva.pdf: 1095638 bytes, checksum: 6455f6c98e8a5cf2bacf4cd9e2f12fae (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-27T17:33:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISS_2015_Helen Aguiar Lemes da Silva.pdf: 1095638 bytes, checksum: 6455f6c98e8a5cf2bacf4cd9e2f12fae (MD5) Previous issue date: 2015-03-27 / FAPEMAT / CNPq / A leishmaniose tegumentar americana é causada por protozoários do gênero Leishmania e a transmissão ocorre através da picada de flebotomíneos. É uma doença infecciosa, que acomete pele e mucosa. A resposta imune celular tem sido apontada como um importante fator na progressão das lesões da leishmaniose tegumentar. A proteína anti-inflamatória anexina-A1 é reconhecida como um importante mediador no processo inflamatório. O objetivo deste trabalho foi quantificar a expressão da anexina-A1, nos macrófagos e nas células T CD4+ e T CD8+ de fragmento da pele de paciente com leishmaniose cutânea, e correlacionar com o aspecto histopatológico. Biópsias de pele de pacientes (n=55) com leishmaniose cutânea foram processadas e analisadas. Para caracterizar a espécie de Leishmania foi utilizada PCR–ITS1/RFLP, identificando que todas as amostras biológicas apresentavam o parasita Leishmania brasiliensis. Na análise histopatológica, observou-se intensa migração leucocitária, evidenciando infiltrado histiolinfoplasmocitário. Em seguida foi realizada a determinação da expressão de anexina-A1 nos macrófagos e nas células T CD4+ e T CD8+ dos pacientes pela técnica de imunofluorescência. Na quantificação da expressão da anexina-A1, observou-se um aumento dessa proteína nos macrófagos da pele de pacientes com leishmaniose cutânea, quando comparados com essas células em individuos saudáveis (controle: 64,6 ± 3,0 UA; LT: 107,0 ± 2,7 UA; p<0,0001). Esses dados podem indicar a atuação dessa proteina durante o processo de fagocitose. Além disso, os macrófagos presentes nas lesões do tipo reação exudativa necrótica da pele de pacientes com leishmaniose cutânea apresentavam maior expressão dessa proteína (123,5 ± 6,9 UA) quando comparados com as células presentes nas lesões do tipo reação exudativa granulomatosa e reação exudativa celular (100,0 ± 4,1, p<0,01; e 104,6 ± 3,0, p<0,05). Esses dados podem indicar que, nas lesões do tipo reação exudativa necrótica, os macrófagos expressam mais anexina-A1 devido a ativação celular para fagocitose dos parasitas e de fragmentos celulares provenientes das regiões necróticas. Com relação as células T CD4+ e T CD8+, nossas análises demonstraram que essas células apresentavam maiores níveis de anexina-A1 nas lesões do tipo reação exudativa celular (TCD4+: 123,9 ± 11,6 UA) (TCD8+: 121,3 ± 9,0 UA), quando comparadas com as células presentes nas lesões do tipo reação exudativa granulomatosa e reação exudativa necrótica (TCD4+: 87,7 ± 5,2, p<0,05; e 53,7 ± 15,7, p<0,01) (TCD8+: 76,0 ± 11,4, p<0,05; e 77,0 ± 10,4, p<0,05). Esses dados demonstram que essa proteína está expressa durante a resposta celular frente aos antígenos da Leishmania. Além disso, a expressão aumentada da anexina-A1 nas células T presentes nas lesões do tipo reação exudativa celular pode ser explicada pelo aspecto mais disseminado do infiltrado histiolinfoplasmocitário, com maior presença de edema e ausência de contenção da infecção como ocorre nas lesões do tipo reação exudativa granulomatosa. Em conclusão, os dados apresentados nesse trabalho, em associação com os dados da literatura, demonstram a relevância da dinâmica da anexina-A1 na regulação do sistema imunológico durante a leishmaniose cutânea. Esses dados trazem, pela primeira vez, uma contribuição para o entendimento do papel da anexina-A1 na ativação dos macrófagos e células T na leishmaniose cutânea. Estudos futuros permitirão o entendimento preciso do mecanismo de ação da anexina-A1 no processo infeccioso da leishmaniose cutânea. / American tegumentary leishmaniasis is caused by protozoa of the genus Leishmania, and the transmission occurs through the sandflies bite. It is an infectious disease that affects the skin and mucosa. The cellular immune response has been identified as an important factor in the progression of tegumentary leishmaniasis lesions. The anti-inflammatory protein annexin A1 is recognized as an important mediator in the inflammatory process. The aim of this study is quantify the annexin-A1 expression in macrophages and CD4+ and CD8+ T cells from skin fragment of patients with cutaneous leishmaniasis, and correlates with histopathological aspects. Skin biopsies of patients (n= 55) with cutaneous leishmaniasis were processed and analyzed. To characterize the species of Leishmania, it was used ITS1-PCR/RFLP, which identified that all biological samples had parasite Leishmania brasiliensis. In the histological analysis, there was an intense leukocyte migration, showing lymphohistiocytic and plasmocytic infiltrate. Then, it was conducted the determination of annexin-A1 expression in macrophages and CD4+ and CD8+ T cells by immunofluorescence technique. In annexin-A1 expression quantification, there was an increase of this protein in macrophages from patients skin with cutaneous leishmaniasis, when compared to these cells from healthy individuals (control: 64.6 ± 3.0 AU, LT: 107.0 ± 2.7 AU; p <0.0001). These data might indicate the role of this protein in the phagocytic process. In addition, macrophages present in the necrotic exudative reaction skin lesions of patients with cutaneous leishmaniasis showed higher expression of the protein (123.5 ± 6.9 AU) when compared with cells present in the granulomatous exudative reaction and cellular exudative reaction lesions (100.0 ± 4.1, p <0.01, and 104.6 ± 3.0, p <0.05). These data may indicate that in necrotic exudative reaction lesions, macrophages express more annexin-A1 due to cell activation induce by phagocytosis of parasites and cellular debris from necrotic regions. Regarding CD4+ and CD8+ T cells, our analysis showed that these cells had higher levels of annexin-A1 in cellular exudative reaction lesions (CD4+: 123.9 ± 11.6 AU) (CD8+: 121.3 ± 9.0 AU) when compared with cells present in necrotic exudative reaction and granulomatous exudative reaction lesions (CD4+: 87.7 ± 5.2, p <0.05; and 53.7 ± 15.7, p <0.01) (CD8+ T: 76.0 ± 11.4, p <0.05; and 77.0 ± 10.4, p <0.05). These data demonstrate that this protein is active during the cellular response to Leishmania antigens. Furthermore the increased annexin-A1 expression in T cells from cellular exudative reaction lesion could be explained by the widespread aspect of lymphohistiocytic and plasmocytic infiltrate, with higher presence of edema and absence infection containment, as occurs in the granulomatous exudative reaction lesions. In conclusion, the data presented here, together with the literature, show the relevance of the annexin-A1 dynamics in the immune system regulation during cutaneous leishmaniasis. These data shows for the first time, a contribution to understanding the role of annexin-A1 in the activation of macrophages and T cells in the cutaneous leishmaniasis. Future studies will allow the accurate understanding of the annexin-A1 mechanism of action in the infection process of cutaneous leishmaniasis.

Tem-se atribuído ao flebotomíneo o papel de transmissor das leishmanioses. Com relação a leishmaniose tegumentar americana, 23 espécies parecem estar incriminadas na transmissão. Contudo, somente em Psychodopygus trapidoi, Ps.ylephiletor, Ps. intermedius, Ps. welcomei, Ps. flaviscutellatus, Ps. panamensis, Ps. olmecus, Lutzomyia gomezi e Pinzomyia pessoai, foi possível o isolamento da Leishmania. O caráter zoonótico desta doença denota uma situação ainda complexa devido aos escassos conhecimentos sobre os hospedeiros, vetores e epidemiologia das diversas Leishmania. A presente revisão confirma que esta função é desempenhada por dípteros da subfamília Phlebotominae. / The function of transmitting Leishmaniasis is generally attributed to phlebotomine sandfly. In relation to American Cutaneous Leishmaniasis, 23 species appears to be involved in the transmission process. However, Leishmania organisms could be isolated from only Psychodopygus trapidoi, Ps. ylephiletor, Ps. intermedius, Ps. welcomei, Ps. flaviscutellatus, Ps. panamensis, Ps. olmecus, Lutzomyia gomezi and Pintomyia pessoai. The zoonotic charater of this disease is yet a complex situation due to lack of adequate knowledge about host, vector and epidemiology of various Leishmania. The present revision confirms that the function is perfomed by diptera of sub-family, Phlebotominae.

As doenças tropicais negligenciadas (DTNs) causam um imenso sofrimento para a pessoa acometida e em muitos casos podem levar o indivíduo a morte. Elas representam um obstáculo devastador para a saúde e continuam a ser um sério impedimento para a redução da pobreza e desenvolvimento socioeconômico. Das 17 doenças desse grupo, a leishmaniose, incluindo a leishmaniose cutânea, tem grande destaque devido sua alta incidência, os gastos para o tratamento e as complicações geradas em processos de coinfecção. Ainda mais agravante, os investimentos direcionados ao controle, combate e principalmente a inovação em novos produtos é ainda muito limitado. Atualmente, a academia tem um importante papel na luta contra essas doenças através da busca de novos alvos terapêuticos e também de novas moléculas com potencial terapêutico. É nesse contexto que esse projeto teve como meta a implantação de uma plataforma para a identificação de moléculas com atividade leishmanicida. Como alvo terapêutico, optamos pela utilização da enzima diidroorotato desidrogenase de Leishmania Viannia braziliensis (LbDHODH), enzima de extrema importância na síntese de novo de nucleotídeos de pirimidina, cuja principal função é converter o diidroorotato em orotato. Esta enzima foi clonada, expressa e purificada com sucesso em nosso laboratório. Os estudos permitiram que a enzima fosse caracterizada cineticamente e estruturalmente via cristalografia de raios- X. Os primeiros ensaios inibitórios foram realizados com o orotato, produto da catálise e inibidor natural da enzima. O potencial inibitório do orotato foi mensurado através da estimativa do IC50 e a interação proteína-ligante foi caracterizada através de estudos cristalográficos. Estratégias in silico e in vitro foram utilizadas na busca de ligantes, através das quais foram identificados inibidores para a enzima LbDHODH. Ensaios de validação cruzada, utilizando a enzima homóloga humana, permitiram identificar os ligantes com maior índice de seletividade que tiveram seu potencial leishmanicida avaliado in vitro contra as formas promastigota e amastigota de Leishmania braziliensis. A realização do presente projeto permitiu a identificação de uma classe de ligantes que apresentam atividade seletiva contra LbDHODH e que será utilizada no planejamento de futuras gerações de moléculas com atividade terapêutica para o tratamento da leishmaniose. Além disso, a plataforma de ensaios otimizada permitirá a avaliação de novos grupos de moléculas como uma importante estratégia na busca por novos tratamentos contra a leishmaniose / Neglected tropical diseases (NTDs) pose a devastating obstacle to health and remain a serious impediment to poverty reduction and socioeconomic development. Of 17 diseases listed among NTDs, the leishmaniasis, including cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis, are characterized by high number of cases and high costs for the treatment, usually of low efficacy and highly toxic. Even more problematic, the investment devoted to combat to control and to develop new therapies remains limited. Nowadays, the Academy has had an important role in the fight against NTDs, contributing in the search of new therapeutic targets and in the development of lead compounds. Within this context, the present project aimed the development of a pipeline for identification of leishmanicidal compounds based on the selective inhibition of the enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Leishmania Viannia braziliensis (LbDHODH). LbDHODH acts in the de novo biosynthetic pathway of pyrimidine nucleotides, by catalysing the conversion of dihydroorotate to orotate and has been considered an important macromolecular target against proliferative and parasitic diseases. LbDHODH was successfully cloned, expressed and purified. The target enzyme was characterized by kinetic studies and its structure was solved by X-ray crystallography techniques. Inhibition assays were performed in presence of orotate, product of catalysis and natural inhibitor of DHODH. Its inhibitory potential was evaluated by the estimative of IC50 and the protein-ligand interaction was characterized by crystallographic studies. In silico and in vitro strategies were used in the search for LbDHODH inhibitors. Cross-validation studies were performed against the human homologue enzyme. Inhibitors displaying higher selectivity index were evaluated against both promastigote and amastigote forms of Leishmania braziliensis. Our work allowed the identification of a new class of compounds that display selective inhibition of LbDHODH and show leishmanicidal activity. They will be used as prototypes for the development of new generations of LbDHODH inhibitors. Moreover, our pipeline can be used to screen large number of chemical libraries as tool for the identification of different chemical entities that can contribute to the development of new therapeutic strategies for the treatment of leishmaniasis.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-11-26T13:02:51Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Douglas Oliveira Andrade - 2015.pdf: 6446684 bytes, checksum: a1e954faf14aff161dbc0af5f7db0cbb (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-11-26T13:38:57Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Douglas Oliveira Andrade - 2015.pdf: 6446684 bytes, checksum: a1e954faf14aff161dbc0af5f7db0cbb (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-26T13:38:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Douglas Oliveira Andrade - 2015.pdf: 6446684 bytes, checksum: a1e954faf14aff161dbc0af5f7db0cbb (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2015-09-18 / Leishmaniasis are a group of endemic diseases in 98 countries, with an estimated incidence up to 1.6 million cases per year (0.7-1.2 million of cutaneous leishmaniasis and 0.2 to 0.4 million visceral leishmaniasis). The criteria for the cure of american tegumentary leishmaniasis adopted nowadays is the complete healing of the lesion. IgG3 subclass anti-leishmania antibodies decrease faster than the total IgG antibodies in cured patients. This study was aimed to identify differences in the recognition pattern of L. (V.) braziliensis protein by total IgG or IgG3 antibodies obtained from cutaneous leishmaniasis infected patients’ serum before and after treatment. Sera of 15 patients infected with L. braziliensis attended at the Tropical Diseases Hospital Anuar Auadi were tested by ELISA against crude extracts of L. braziliensis. When all patients were analyzed, it was observed that anti-leishmania IgG3 absorbance levels measured by ELISA were similar to the controls levels at 6 month. The absorbance levels of total antibodies in control and infected patients reached similarity only at 12/18 months. After split patients into group A: healing of the lesion before one month and B: healing of the lesion after one month, it was observed that absorbance levels in ELISA for IgG3 in group A was similar to the controls levels at the time of diagnosis. It was also observed, by Western Blotting, that the IgG3 reactivity of IgG3 to 49 kDa protein waspresent mainly for group B patients. The 28 kDa protein showed IgG3 reactivity mainly in group B the healing os lesions and the 14 kDa protein showed IgG3 reactivity in some controls our data suggest that the use of 49 kDa protein in ELISA may be useful for diagnosis and following up of patients and the 14kDa protein may be important in false-positive results. / As leishmanioses constituem um grupo de doenças endêmicas em 98 países, com uma incidência estimada de até 1,6 milhões de casos por ano (0,7-1,2 milhão de leishmaniose tegumentar e 0,2 a0,4 milhão de leishmaniose visceral). O critério de cura da leishmaniose tegumentar americana adotado hoje é a cura completa da lesão. Anticorpos anti-Leishmania da subclasse IgG3 decaem mais rapidamente que os anticorpos IgG totais em pacientes curados. O presente trabalho tem objetivo de identificar diferenças no reconhecimento de proteínas de L. (V.) braziliensis por anticorpos IgG totais ou IgG3 obtidos de soro de pacientes com leishmaniose tegumentar americana antes e após o tratamento. Soros de 15 pacientes infectados com L. braziliensis atendidos no Hospital de Doenças Tropicais Anuar Auad foram testados por ELISA contra extratos brutos de L. braziliensis. Quando analisados todos os pacientes, foi possível observar que as absorbâncias no ELISA para a subclasse IgG3 anti-Leishmania ficou semelhante aos controles com 6 meses, o que só aconteceu para anticorpos totais com 12/18 meses. Com a separação dos pacientes em A: pacientes com cura clínica antes de um mês e grupo B: pacientes com cura clínica após um mês, observou-se que as absorbâncias no ELISA para IgG3 no grupo A era semelhante à dos controles no momento do diagnóstico. Identificamos, pelo Western Blotting, que a reatividade à proteína de 49 kDa pela IgG3 de pacientes era presente principalmente no grupo B. A proteína de 28 kDa reagiu com IgG3 de pacientes do grupo B antes da cura clínica e a proteína de 14 kDa reagiu com IgG3 de três soros controles. Nossos dados sugerem que a proteína de 49 kDa pode ser usada em ELISA para o diagnóstico e acompanhamento dos pacientes portadores de LTA e que a proteína de 14kDa pode ser responsável por reações falso positivas.

Leishmania braziliensis é o agente responsável pela maior parte dos casos de leishmaniose tegumentar e mucocutânea no Brasil. Entre as espécies incriminadas como vetoras, na região Sudeste encontram-se Nyssomyia intermedia e Nyssomyia neivai. A comprovação destas espécies como responsáveis pela transmissão de Leishmania sp. depende de vários fatores, entre estes, a competência vetorial, definida como a capacidade da espécie se infectar e repassar a infecção para um hospedeiro vertebrado. Objetivo: O presente estudo teve como objetivo avaliar experimentalmente a competência vetorial de Ny. intermedia e Ny. neivai para transmitir L. braziliensis. Métodos: Fêmeas de primeira geração de ambas as espécies foram alimentadas em hamster infectado com L. braziliensis e após a oviposição, desafiados a um segundo repasto sanguíneo em hamsters susceptíveis (limpos). Adicionalmente, foram obtidos dados do desenvolvimento imaturo das duas espécies. Resultados: em relação ao ciclo imaturo, observou-se que a maior mortalidade ocorreu no primeiro instar larval para ambas as espécies, 27,6% para Ny. intermedia e 53,9% para Ny. neivai. O quarto instar larval teve a maior duração, com mediana de 8 a 12 dias. Quanto à susceptibilidade à infecção das fêmeas colonizadas de ambas as espécies 0,89% das fêmeas de Ny. intermedia e 8,33 % das fêmeas de Ny. neivai apresentaram infecção por L. braziliensis. Nenhuma fêmea de Ny. intermedia realizou um segundo repasto sanguíneo, enquanto que 3 fêmeas de Ny. neivai realizaram. Destas, duas estavam infectadas e o hamster potencialmente infectado ficou em observação por dois meses. Amostras de tecido do hamster exposto demostraram, por meio de PCR, a presença de L. braziliensis. Conclusão: Nyssomyia intermedia apresentou desenvolvimento de formas flageladas porém não repassou a infecção a um hospedeiro suscetível. Nyssomyia neivai, além de se infectar com a L. braziliensis, também repassou a infecção a um hospedeiro suscetível, demostrando assim sua competência vetora. / Leishmania braziliensis is the agent related to cases of cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis in Brazil. Among the sandflies involved in the Leishmania sp transmission in the Southeast Region, Ny. intermedia and Ny. neivai are suspected vectors. However, the incrimination of these species as vectors in the transmission of Leishmania sp. depends of several factors, including vector competence, defined as the ability of the species to develop the agent and transmit it to a vertebrate host. Objective: The present study aimed to demonstrate the vector competence to Ny. intermedia and Ny. neivai for L. braziliensis. Methods: To develop the experiments,specimens of both species were reared under laboratory conditions and the adults obtained were used to evaluate the vector competence. Thefemales were fed in infected hamsters and after oviposition, challenged to take a bloodmeal in suscetible hamsters (without infection). All females fed on infected hamster were dissected. The hamster bitted in the exposition were follow up for two months, after that, were euthanatized to evaluate the infection by PCR. Result: The highest immature mortality occurred in the first instar larval for both species, 27.6% for Ny. intermedia and 53.9% for Ny. neivai. The fourth larval instar had the longest duration, with a median varying between 8 to 12 days. About the females of Ny intermedia, only 0.89% of them develop the flagellates. For Ny. neivai, among 36 females feed on infected hamster, 2 were infected. None female of Ny intermedia take a second blood meal and 3 of Ny. neivai have had. The hamsters bitted by the infected females were follow up for 60 days. After that the hamster were euthanatized and the infection was observed. Conclusion: The vector competence of Ny. neivai to transmit Leishmania braziiensis was demonstrated. The susceptibility of Ny. intermedia to develop this leishmania was corroborated.

Doenças negligenciadas acometem milhares de pessoas em todo o mundo, principalmente em países subdesenvolvidos. A exemplo destas encontram-se doenças como a leishmaniose e a doença de Chagas que representam relevantes problemas de saúde pública. As terapias disponíveis para estas doenças tropicais, contudo, estão longe de serem satisfatórias e eficazes, considerando-se que os quimioterápicos existentes apresentam reconhecida toxicidade, alto custo e eficácia moderada. Com o propósito de obter alternativas terapêuticas otimizadas, este projeto de pesquisa teve como objetivo a obtenção de pró-fármacos de compostos nitroderivados com comprovada atividade leishmanicida e antichagásica para serem utilizados em sistemas ADEPT visando maior eficácia e menor toxicidade no tratamento destas parasitoses. A princípio, duas frentes de trabalho em paralelo foram adotadas: uma teórica, para determinação do mecanismo catalítico da carboxipeptidase G2 (CPG2) e obtenção de informações relacionadas ao mecanismo de clivagem dos pró-fármacos propostos, e a outra sintética, para obtenção dos compostos propriamente ditos. Estudos teóricos de ancoramento e dinâmica molecular da CPG2 com um de seus reconhecidos substratos, o metotrexato, indicaram que o mecanismo de ação proposto para metaloproteases em geral também pode ser aplicado a esta enzima. Informações relacionadas ao mecanismo de clivagem dos pró-fármacos propostos também foram obtidas. A rota sintética inicialmente proposta para a obtenção dos pró-fármacos partia da ligação dos nitroderivados ao ácido glutâmico por intermédio de um agente espaçante, o ácido succínico. Com base nas informações obtidas nos estudos teóricos, entretanto, o projeto foi reformulado focando-se na síntese dos pró-fármacos sem agente espaçante, pois estes se mostraram mais favoráveis ao reconhecimento pela enzima. Com relação à síntese, a obtenção dos compostos planejados não foi alcançada a despeito dos esforços empreendidos. Estudos teóricos e experimentais de reatividade parecem comprovar a tese de que o grupo nitro desativa as funções nucleofílicas das estruturas dos nitrocompostos que seriam fundamentais para as reações de acoplamento ao transportador ácido glutâmico. Este achado, contudo, constitui um importante problema a ser solucionado, visto que nitroderivados parecem exercer suas atividades principalmente mediante redução do grupo nitro e produção de espécies reativas de oxigênio nas redondezas dos parasitas. / Neglected diseases affect millions of people around the world for the most part in underdeveloped countries. Leishmaniasis and Chagas disease are example of important public health problems spread through Africa, Asia and Latin America. Unfortunately, currently available chemotherapy to treat these diseases remains ineffective, being the most frequently applied drugs toxic, expensive and of moderate potency. By considering this actual picture and envisioning new therapeutic alternatives, the aim of this work was to design and synthesize potential antichagasic and antileishmanial prodrugs of nitroderivatives to be used in Antybody-Directed Enzyme Prodrug Therapy (ADEPT), a drug design approach which results in targeted delivery of the active compounds, increasing their potencies in addition to lowering their toxicity. Theoretical studies to determine the catalytic mechanism of the carboxypeptidase G2 (CPG2) and to obtain information about the cleavage mechanism of proposed prodrugs were performed whereas different synthetic approaches were made to obtain the compounds. Docking and molecular studies of the CPG2 considering theoretical interactions with its known substrate, methotrexate, indicated that the proposed general mechanism for metalloproteases could be indeed applied to this enzyme. Information about the cleavage mechanism of prodrugs was also obtained. Initially prodrugs proposed were composed by nitroderivatives structures attached to glutamic acid, the chosen transporter agent, by a spacer group, the succinic acid. Theoretical studies, however, had showed that prodrugs constructed without a spacer agent could be better recognized by the enzyme. These results re-directed the synthetic approach to new prodrug structure without spacer. Despite all efforts spent, it was impossible to obtain the proposed prodrug structures. Experimental reactivity studies were then accomplished, since it was possible that the nitro group, from nitroderivatives structure, was able to reduce the nucleophilic power of particular functional groups chosen to accomplish the coupling between the active compound and the transporter. The results corroborate this hypothesis and the absence of nitro group facilitates the prodrug synthesis. This, however, constitute an important problem to be solved since the nitroderivative seams to exert their function mainly by nitro group reduction and production of free radical species in the surrounding of the parasites.