O Diabetes Mellitus é uma doença metabólica crônica com múltiplos fatores etiológicos (genético, viral e imunológico) que condiciona deficiência absoluta ou relativa de insulina, causando persistência de níveis elevados de glicose no sangue. Atualmente, o Diabetes Mellitus é considerado um importante problema de saúde devido a sua prevalência e alta morbimortalidade. Sua importância clínica resulta essencialmente de suas graves complicações, especialmente as microvasculares. A hiperglicemia crônica ou intermitente tem sido identificada como o fator indutor de lesão endotelial, sendo este, o agente desencadeante das complicações microvasculares. As células endoteliais, por serem influenciadas pela força hemodinâmica local, respondem com a transdução de sinais (mecanotransdução), as quais podem ser responsáveis pelo início de processos patológicos na parede dos vasos. Desta forma, o objetivo deste estudo foi analisar a microcirculação da bolsa da bochecha do hamster sob a influência do Diabetes Mellitus tipo 1 experimental induzido por estreptozotocina, avaliando seus aspectos morfofuncionais aos 6 e 15 dias de evolução da doença. As características morfológicas de arteríolas e vênulas foram estimadas por medidas do diâmetro do lúmen e da espessura da parede; pela densidade de volume e de área destes vasos na bolsa da bochecha; pela análise imunohistoquímica da expressão de actina, talina, alfa-actina de músculo liso, vimentina, laminina e colágeno IV através da microscopia de luz com a utilização um sistema semiquantitativo baseado em uma escala de intensidade de imunomarcação; e por microscopia eletrônica de transmissão. Também foi avaliado o relaxamento dependente do endotélio, medido pela variação do diâmetro do lúmen antes e após a aplicação de acetilcolina e a permeabilidade de vênulas pós-capilares à histamina, determinada pelo número de pontos de extravasamento plasmático. Nossos resultados mostraram que arteríolas e vênulas não apresentaram diferenças entre os grupos para o espessamento da parede, diâmetro luminal, densidade por área e de volume. A permeabilidade vascular, após 2 minutos da administração de histamina, foi diminuída significativamente nos grupos diabéticos, entretanto este achado não foi observado após 5 minutos da administração, o mesmo ocorrendo com a reatividade vascular. A expressão de actina, talina, laminina e vimentina esteve aumentada em arteríolas do grupo diabético com 6 dias de evolução da doença, sendo esta alteração persistente no grupo diabético de 15 dias de evolução para a laminina e a vimentina. Na microscopia eletrônica, partículas de ouro coloidal conjugadas a talina e a laminina se distribuíram no citoplasma e ao longo da superfície basal das células endoteliais. Na membrana basal, a laminina mostrou-se formando aglomerados. Essas evidências sugerem que aos 6 dias de evolução do diabetes as proteínas relacionadas a adesão com a matriz extracelular sofrem alteração possivelmente em resposta a mudanças na força hemodinâmica local promovida pela nova condição fisiológica induzida pela hiperglicemia. / Diabetes Mellitus is a chronic metabolic disease with multiple etiologic factors (genetic, viral and immunological) that results in absolute or relative insulin deficiency, causing persistent elevated blood glucose levels. Nowadays, Diabetes Mellitus is considered as an important health concern due to its increasing prevalence and high morbimortality. Its clinical importance comes from the complications, especially microvascular. Chronic or transitory hyperglycemia has been identified as endothelial harm inductor factor, being this the first outcome of microvascular complications. Endothelial cells, under local hemodynamic strength, produce signal transduction (mechanotransduction), which can be responsible for the beginning of pathological events in vessels wall. In this regard, the objective of this study was to analyze hamster cheek pouch microcirculation under the influence of type 1 diabetes mellitus induced by streptozotocin, evaluating its morpho-functional aspects at 6 and 15 days of diseases evolution. Morphological characteristics of arterioles and venules were estimated by the measurement of lumen diameter and wall thickness; the volume density and area of these vessels from cheek pouch; immunohistochemistry of the expression of actin, talin, smooth muscle alpha-actin, vimentin, laminin and type IV collagen through light microscopy with the utilization of a semi-quantitative score system based on the intensity of the immunostaining; and transmission electron microscopy. It was also evaluated the endothelium dependent relaxation, measured by the variation of lumen diameter before and after acetylcholine administration and post-capillary venules permeability to histamine, determined by number of points of plasma extravasation. Our results reveal that arterioles and venules do not show differences between the groups concerning wall thickness, luminal diameter, density per area and volume density. Vascular permeability, after 2 minutes of histamine administration, was reduced significantly in diabetic groups. However, this finding was not observed after 5 minutes of administration, the same occurring with vascular reactivity. The expression of actin, talin, laminin and vimentin was higher in arterioles of diabetic group with 6 days of evolution, being this alteration persistent in diabetic group at 15 days of evolution for laminin and vimentin. In electron microscopy, colloidal gold particles conjugated with talin and laminin were distributed at cytoplasm and basal surface of endothelial cells. In basement membrane, the laminin was forming clusters. These evidences suggest that at 6 days of diabetes course the proteins related to extracellular matrix adhesion were altered possibly due to changes in local hemodynamic forces caused by the new physiologic condition induced by hyperglycemia.

Le cytosquelette de microtubule (MT) est essentiel dans de nombreux processus cellulaire. Il est notamment impliqué dans le trafic intracellulaire, la division cellulaire, la modification et le maintien de la forme de la cellule. En fonction du type cellulaire ou de son état de différenciation, les réseaux de MTs vont adopter des architectures différentes. Ces organisations sont définies par des contraintes géométriques intracellulaires et l'activité moléculaire de nombreuses protéines associées aux MTs (MAPs). Parmi ces protéines, des membres de la famille des MAP65s ont été identifiés. In vitro, elles forment des ponts entre les MTs pour les organiser en faisceaux. Le but de mon travail de thèse a été d'étudier in vitro le rôle de MAP65s dans l'auto-organisation d'un réseau de faisceaux de MTs. Dans un premier temps, j'ai mis au point un système biomimétique utilisant la technique de « micro-patterning » qui imposent une géométrie d'assemblage pour les MTs dans des limites qui se rapprochent de celles observées dans les cellules. Cette méthode permet de contrôler précisément l'assemblage des MTs à partir de zones dont les formes, la taille et la distribution des unes par rapport aux autres sont définies. Pour valider cette technique, j'ai reconstitué des réseaux qui miment des architectures cellulaires (i.e modules du fuseau mitotique). Dans un deuxième temps j'ai étudié le rôle de MAP65s dans l'auto-organisation de réseaux de faisceaux de MTs, et plus particulièrement l'étape de co-alignement entre MTs dynamiques et dispersés. J'ai montré que MAP65-1 de plante et son orthologue chez la levure, Ase1, diminuent fortement la longueur de persistance de MTs isolés ou organisés en faisceaux. Cet assouplissement leur permet de se déformer et donc de se co-aligner pour former des faisceaux lorsqu'ils se rencontrent à des angles de rencontre élevés. L'augmentation de flexibilité est du à l'interaction du domaine de liaison de MAP65-1/Ase1 avec la lattice des MTs. Ces résultats suggèrent que la diminution de la rigidité des MTs contrôle dans les cellules l'issue des évènements des rencontres entre MTs. De façon plus générale, la modulation des propriétés mécaniques des MTs par des MAPs représente un nouveau mécanisme pour réguler la plasticité des réseaux de MTs dans les cellules eucaryotes. / The microtubule (MT) cytoskeleton is essential for many cell processes, such as the intracellular trafficking, the cell division, and the cell morphogenesis. Depending on the cell type or on its differentiation state, the MT networks will adopt different architectures. These organizations are defined by intracellular geometric constraints and the regulation of the acticity of many MT associated proteins (MAPs). Among these proteins, we get a particular interest in MAP65s family that crosslink MTs to organize them into bundles. The aim of my thesis was to study in vitro the role of MAP65s in the self-organization of MT bundles in particular networks. As a first step, I developed a biomimetic system using the micro-patterning procedure which imposes a MT assembly geometry within limits close to those observed in cells. This method allows to precisely control the MT assembly from micro-patterns with define shape, size and spatial distribution. In order to validate this technic, I reconstituted MT networks which mimic cellular architecture (i.e mitotic spindle modules). In a second time, I studied the role of major MT cross-linkers that are members of the MAP65 family in the formation of MT bundles, particularly the step of MT co-aligment after encountering of dynamic growing MTs. I found that plant MAP65-1 and its yeast ortholog, Ase1, lower the global rigidity of single MTs and MT bundles. This increase in MT flexibility is directly caused by interactions between the MAP65 MT-binding domain and the MT lattice. These data suggest that MT softening by MAP65 controls the issue of MT encounters, so that self-organized ordered MT bundles are formed in living cells. In a more general way, the modulation of MT mechanical propreties by MAPs represent a new mecanism to regulate MT networks plasticity in eukaryote cells.

O Diabetes Mellitus é uma doença metabólica crônica com múltiplos fatores etiológicos (genético, viral e imunológico) que condiciona deficiência absoluta ou relativa de insulina, causando persistência de níveis elevados de glicose no sangue. Atualmente, o Diabetes Mellitus é considerado um importante problema de saúde devido a sua prevalência e alta morbimortalidade. Sua importância clínica resulta essencialmente de suas graves complicações, especialmente as microvasculares. A hiperglicemia crônica ou intermitente tem sido identificada como o fator indutor de lesão endotelial, sendo este, o agente desencadeante das complicações microvasculares. As células endoteliais, por serem influenciadas pela força hemodinâmica local, respondem com a transdução de sinais (mecanotransdução), as quais podem ser responsáveis pelo início de processos patológicos na parede dos vasos. Desta forma, o objetivo deste estudo foi analisar a microcirculação da bolsa da bochecha do hamster sob a influência do Diabetes Mellitus tipo 1 experimental induzido por estreptozotocina, avaliando seus aspectos morfofuncionais aos 6 e 15 dias de evolução da doença. As características morfológicas de arteríolas e vênulas foram estimadas por medidas do diâmetro do lúmen e da espessura da parede; pela densidade de volume e de área destes vasos na bolsa da bochecha; pela análise imunohistoquímica da expressão de actina, talina, alfa-actina de músculo liso, vimentina, laminina e colágeno IV através da microscopia de luz com a utilização um sistema semiquantitativo baseado em uma escala de intensidade de imunomarcação; e por microscopia eletrônica de transmissão. Também foi avaliado o relaxamento dependente do endotélio, medido pela variação do diâmetro do lúmen antes e após a aplicação de acetilcolina e a permeabilidade de vênulas pós-capilares à histamina, determinada pelo número de pontos de extravasamento plasmático. Nossos resultados mostraram que arteríolas e vênulas não apresentaram diferenças entre os grupos para o espessamento da parede, diâmetro luminal, densidade por área e de volume. A permeabilidade vascular, após 2 minutos da administração de histamina, foi diminuída significativamente nos grupos diabéticos, entretanto este achado não foi observado após 5 minutos da administração, o mesmo ocorrendo com a reatividade vascular. A expressão de actina, talina, laminina e vimentina esteve aumentada em arteríolas do grupo diabético com 6 dias de evolução da doença, sendo esta alteração persistente no grupo diabético de 15 dias de evolução para a laminina e a vimentina. Na microscopia eletrônica, partículas de ouro coloidal conjugadas a talina e a laminina se distribuíram no citoplasma e ao longo da superfície basal das células endoteliais. Na membrana basal, a laminina mostrou-se formando aglomerados. Essas evidências sugerem que aos 6 dias de evolução do diabetes as proteínas relacionadas a adesão com a matriz extracelular sofrem alteração possivelmente em resposta a mudanças na força hemodinâmica local promovida pela nova condição fisiológica induzida pela hiperglicemia. / Diabetes Mellitus is a chronic metabolic disease with multiple etiologic factors (genetic, viral and immunological) that results in absolute or relative insulin deficiency, causing persistent elevated blood glucose levels. Nowadays, Diabetes Mellitus is considered as an important health concern due to its increasing prevalence and high morbimortality. Its clinical importance comes from the complications, especially microvascular. Chronic or transitory hyperglycemia has been identified as endothelial harm inductor factor, being this the first outcome of microvascular complications. Endothelial cells, under local hemodynamic strength, produce signal transduction (mechanotransduction), which can be responsible for the beginning of pathological events in vessels wall. In this regard, the objective of this study was to analyze hamster cheek pouch microcirculation under the influence of type 1 diabetes mellitus induced by streptozotocin, evaluating its morpho-functional aspects at 6 and 15 days of diseases evolution. Morphological characteristics of arterioles and venules were estimated by the measurement of lumen diameter and wall thickness; the volume density and area of these vessels from cheek pouch; immunohistochemistry of the expression of actin, talin, smooth muscle alpha-actin, vimentin, laminin and type IV collagen through light microscopy with the utilization of a semi-quantitative score system based on the intensity of the immunostaining; and transmission electron microscopy. It was also evaluated the endothelium dependent relaxation, measured by the variation of lumen diameter before and after acetylcholine administration and post-capillary venules permeability to histamine, determined by number of points of plasma extravasation. Our results reveal that arterioles and venules do not show differences between the groups concerning wall thickness, luminal diameter, density per area and volume density. Vascular permeability, after 2 minutes of histamine administration, was reduced significantly in diabetic groups. However, this finding was not observed after 5 minutes of administration, the same occurring with vascular reactivity. The expression of actin, talin, laminin and vimentin was higher in arterioles of diabetic group with 6 days of evolution, being this alteration persistent in diabetic group at 15 days of evolution for laminin and vimentin. In electron microscopy, colloidal gold particles conjugated with talin and laminin were distributed at cytoplasm and basal surface of endothelial cells. In basement membrane, the laminin was forming clusters. These evidences suggest that at 6 days of diabetes course the proteins related to extracellular matrix adhesion were altered possibly due to changes in local hemodynamic forces caused by the new physiologic condition induced by hyperglycemia.

CHAPTER I: Leishmania spp are obligate intracellular protozoan that can cause a complex of known infectious diseases such as leishmaniasis, affecting millions of people worldwide. The host-pathogen interaction involves the parasite surface molecules and cellular receptors that culminate in phagocytosis. This internalization process involves changes in cytoskeleton through interaction with proteins related to actin polymerization, as AFAP, Arp 2/3 complex, Galectin-3, Septins and WASp, as well as activation and signaling pathways. It is known that L. amazonensis promastigotes after entry into phagocytes are present in phagosomes, and these vesicles undergo a maturation process, forming phagolysosome, important for differentiation of the promastigote forms to amastigotes. This study aimed to understand which proteins related to actin cytoskeleton exert role in the process of invasion and multiplication of L. amazonensis and which signaling pathways are involved in the formation of phagolysosome, the invasion and multiplication of this protozoan process the host cell. For this, we did invasion and multiplication assays with macrophages C57 BL/6 and BALB/c peritoneal treated or not with cytochalasin D, invasion assay with macrophages C57 BL/6 previously fixed in formaldehyde (0.01%), assay with macrophages C57 BL/6 knockdown for AFAP-1L1, Arp2, Galectin-3, Septin 4, 14 and WASP proteins compared to wild type cells. And yet, assays phagolysosome kinetics of formation and proliferation and invasion assays using inhibitors of Akt, ERK2, MEK1, MEK1/2, mTOR, PI3K and Ras signaling pathways. The results show that L. amazonensis invaded cells defective in actin polymerization, as well as fixed cells as well as decreased expression of Arp2, Galectin-3 and WASp proteins increased internalization of these parasites. The signaling pathways MEK1/2, ERK2 and AKT delayed the recruitment of the lysosomes to phagosome, and inhibition of PI3K, MEK1/2 and ERK2 pathways drastically decreased internalization of the parasite in the cells. We concluded that L. amazonensis were able to actively invade phagocytic cells, and that the Arp2, Galectin-3 and WASp proteins are involved in the process of entry into host cells. In addition, the MEK1/2, AKT and ERK2 signaling pathways are involved in the formation of phagolysosome as well as PI3K, MEK1/2 and ERK2 pathways seem to favor infection with L. amazonensis. CHAPTER II: The flagellate protozoan Trypanosoma cruzi is the causative agent for Chagas disease. It is estimated that there are eight million people infected worldwide. T. cruzi has different surface proteins related to cell invasion. In this context, our research group identified in T. cruzi, a protein of 21 kDa (P21) showed that pro-phagocytic and chemotactic activities, playing an important role in the internalization of this parasite in vitro. This study aimed to evaluate the role of recombinant protein P21-His6 based on native P21 of T. cruzi in Leishmania amazonensis in order to seek greater understanding of the mechanism of action of this protein and its relationship with the host in vivo. To this end, the footpad infect BALB/c mouse treated with 40μg of active and denatured recombinant P21, BSA and PBS for 6 weeks and assess the footpad size, parasitic load (real time PCR) and cytokine production of IL-1β in the paws, the popliteal lymph nodes and spleen. The results showed an increase in the footpad area, as well as increased parasite load in the infected and treated animals with P21-His6. Also, increased production of IL-β in the footpad and the popliteal lymph nodes also in animals treated with P21-His6. We conclude that the P21 protein plays a role in pro-phagocytic also in vivo experiments, favoring infection. / CAPÍTULO I: Leishmania spp são protozoários intracelulares obrigatórios, que podem causar um complexo de doenças infecciosas conhecidas como leishmanioses, que afetam milhões de pessoas mundialmente. A interação entre patógeno-hospedeiro envolve moléculas de superfície do parasito e receptores celulares que culminam na fagocitose. Este processo de internalização envolve modificações no citoesqueleto celular por meio da interação com proteínas relacionadas à polimerização de actina, como AFAP, Complexo Arp2/3, Galectina-3, Septinas e WASp, bem como a ativação de vias de sinalização. Sabe-se que formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis após a entrada nos fagócitos, estão presentes em fagossomos, e essas vesículas sofrem um processo de maturação, formando o fagolisossomo importante para a diferenciação da forma promastigota em amastigota. Este trabalho teve como objetivo, entender quais proteínas relacionadas ao citoesqueleto de actina exercem papel no processo de invasão e na multiplicação de L. amazonensis, bem como, quais vias de sinalização estão envolvidas no processo de formação do fagolisossomo, na invasão e na multiplicação deste protozoário na célula hospedeira. Para isso, fizemos ensaios de invasão e multiplicação em macrófagos imortalizados C57 BL/6 e peritoneais de BALB/c tratados ou não com citocalasina D, ensaio de invasão em macrófagos C57 BL/6 previamente fixadas em formaldeído, ensaio com macrófagos C57 BL/6 knockdown para as proteínas AFAP-1L1, Arp2, Galectina-3, Septina 4 e 14 e WASp, comparando com células Wild Type. E ainda, ensaios de cinética de formação do fagolissomo e ensaios de invasão e multiplicação utilizando inibidores das vias de sinalização envolvendo Akt, ERK2, MEK1, MEK1/2, mTOR, PI3K e Ras foram realizados. Os resultados mostram que L. amazonensis invadiu células deficientes na polimerização de actina, e também células fixadas, bem como a diminuição da expressão das proteínas Arp2, Galectina-3 e WASp aumentaram a internalização desses parasitos. As vias de sinalização MEK1/2, ERK2, AKT atrasaram o recrutamento de lisossomos para o fagossomo, e a inibição das vias PI3K, MEK1/2 e ERK2 diminuíram drasticamente a internalização do parasito nas células. Concluímos que L. amazonensis foi capaz de invadir ativamente células fagocíticas, e que as proteínas Arp2, Galectina-3 e WASp estão envolvidas no processo de entrada na células hospedeira. Além disso, as vias de sinalização MEK1/2, ERK2 e AKT estão envolvidas na formação do fagolisossomo, bem como as vias PI3K, MEK1/2 e ERK2 parecem favorecer a infecção por L. amazonensis. CAPÍTULO II: O protozoário flagelado Trypanosoma cruzi é o causador da Doença de Chagas. Estima-se a existência de 8 milhões de pessoas infectadas em todo o mundo. T. cruzi apresenta diferentes proteínas de superfície relacionadas ao processo de invasão celular. Nesse contexto, nosso grupo de pesquisa identificou em T. cruzi, uma proteína de 21 kDa (P21) que apresentou atividades pro-fagocíticas e quimiotáticas, exercendo papel importante na internalização desse protozoário in vitro. O presente trabalho teve como finalidade avaliar o papel da proteína recombinante P21-His6 baseada na P21 nativa de T. cruzi na infecção por Leishmania amazonensis, a fim de buscar maior entendimento no mecanismo de ação dessa proteína e sua relação com o hospedeiro in vivo. Para isso, infectamos as patas de animais BALB/c e tratamos os animais com 40μg de P21 recombinante ativa e desnaturada, PBS e BSA por 6 semanas e avaliamos o tamanho da pata, a carga parasitária (PCR em tempo real) e a produção da citocina IL-1β nas patas, linfonodos do poplíteo e baços. Os resultados mostraram aumento na área da pata, bem como aumento da carga parasitária nos animais infectados e tratados com a P21-His6. E ainda, aumento da produção da citocina Il-1β na pata e no linfonodo do poplíteo também nos animais tratados com a P21-His6 também foram observados. Concluímos que a proteína P21 exerce papel pro-fagocítico também em experimentos in vivo, favorecendo a infecção. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

INTRODUÇÃO: A ventilação mecânica é uma terapia importante, mas com possíveis complicações. Uma das mais relevantes é a lesão pulmonar induzida pelo ventilador (VILI do inglês Ventilator-induced lung injury). Devido à hiperdistensão alveolar, o pulmão inicia um processo inflamatório, com infiltrado neutrofílico, formação de membrana hialina, fibrogênese e prejuízo de troca gasosa. Nesse processo, a mecanotransdução do estímulo da hiperdistensão celular se faz através do citoesqueleto da célula e de suas interações com a matriz extracelular e com as células vizinhas. Apesar desse papel fundamental no processo da VILI, não existem estudos in vivo sobre as alterações do citoesqueleto e de suas proteínas associadas durante esse processo patológico. O objetivo desse estudo foi descrever as alterações no citoesqueleto e em duas de suas principais proteínas associadas (FAK e paxilina) durante esse processo. MÉTODOS: Nesse estudo experimental foram feitos três grupos (n = 4 6): um controle e dois ventilados por quatro horas com PEEP de 5 cmH2O. Um grupo foi ventilado com volume corrente de 8 ml/kg (BV) e o outro com 24 ml/kg (AV). Dados de mecânica respiratória foram calculados no início e no final do período experimental. Os pulmões foram avaliados por histomorfometria quanto à área proporcional de parênquima, índice de infiltrado neutrofílico e índice de edema perivascular, quanto à quantidade de fosfo-FAK, fosfo-paxilina, paxilina total, actina músculo liso e alfa-tubulina por Western Blot, quanto à imunofluorescência para paxilina total com microscopia confocal a laser e com microscopia eletrônica de transmissão. RESULTADOS: os grupos foram semelhantes nas características basais. Houve aumento da elastância dinâmica (Edin) no grupo BV e redução no grupo AV (Edin inicial e final: 0,76 ± 0,4 vs 1,02 ± 0,47 respectivamente, em cmH2O/ml; p = 0,001). Não houve diferença na área proporcional de parênquima ou índice de edema perivascular entre os grupos estudados. A ventilação mecânica induziu infiltrado neutrofílico pulmonar nos animais, tanto no grupo BV como no AV em relação ao controle (p < 0,001). O infiltrado foi mais importante no grupo AV que no BV (p = 0,003). Houve um aumento de 40% na fosfo-FAK pelo Western Blot no grupo AV em relação ao controle (p=0,069) e aumento significativo de fosfo-paxilina no grupo AV em relação ao controle (p<0,001) e ao BV (p<0,001). Não se observaram diferenças para paxilina total, actina músculo liso e alfa-tubulina. A microscopia confocal demonstrou marcação para paxilina total nos septos alveolares. A microscopia eletrônica sugeriu reorganização do citoesqueleto nas zonula adherens do grupo AV. CONCLUSÕES: A ventilação mecânica promove lesão pulmonar com infiltrado neutrofílico numa relação dose-dependente. A ventilação com alto volume corrente promove fosforilação da FAK e de paxilina. As alterações no citoesqueleto em modelo in vivo de VILI são possíveis de serem descritas utilizando-se de métodos de microscopia confocal, Western Blot e microscopia eletrônica. / INTRODUCTION: Mechanical ventilation is an important therapy, but is associated with complications. One of the most relevant is ventilator-induced lung injury (VILI). Due to alveolar hyperdistension, the lung initiates an inflammatory process, with neutrophilic infiltration, hyaline membrane formation, fibrogenesis and gas exchange impairment. In this process, cellular mechanotransduction of the overstretching stimulus is mediated through the cytoskeleton and its cell-cell and cell-matrix interactions. But, although the cytoskeleton has this important role in the pathogenesis of VILI, there are no in vivo models for the research of cytoskeletal and cytoskeleton-associated proteins modifications during this pathological process. Our objective was to describe the immunohistochemical modifications during this process on the cytoskeleton and on two of its associated proteins (FAK and paxillin). METHODS: in this experimental study, three groups (n = 4 6) were studied: a control group and two ventilated for four hours with PEEP of 5 cmH2O. One group was ventilated with tidal volume of 8 mL/kg (LV) and the other with 24 mL/kg (HV). Data of respiratory mechanics were obtained at the beginning and the end of the experimental period. The lungs were evaluated with histomorphometry for parenchymal proportional area, neutrophilic infiltrate and perivascular edema, with Western Blot for phospho-FAK, phospho-paxillin, total paxillin, alpha-smooth muscle actin and alpha-tubulin, with confocal laser scanning microscopy for total paxillin, and with transmission electron microscopy. RESULTS: the groups were similar at the baseline. Dynamic elastance (Edin) increased in LV group and decreased in HV group (Edin initial to final: 0.76 ± 0.4 vs. 1.02 ± 0.47 respectively, in cmH2O/ml; p = 0.001). There was no difference in the parenchymal proportional area or the perivascular edema in the three groups. Mechanical ventilation induced pulmonary neutrophilic infiltration, both in the LV group and the HV group in comparison with control (p < 0.001). The infiltrate was more important in the HV group than in the LV group (p = 0.003). Phospho-FAK increased 40% in the HV group in Western Blot in comparison with control (p=0.069). Phosphopaxillin increased significantly in HV group compared with control (p<0.001) and with LV (p<0.001). Total paxillin, alpha-smooth muscle actin and alpha-tubulin did not show any differences. Confocal microscopy showed total paxillin labeling at alveolar septa. Electron microscopy suggested cytoskeleton reorganization at the zonula adherens in the AV group. CONCLUSIONS: Mechanical ventilation induces pulmonary injury with neutrophilic infiltrate in a dose-dependent relationship. Ventilation with high tidal volume promotes FAK and paxillin phosphorilation. The alterations in cytoskeleton in an in vivo model of VILI are possible to be studied with confocal microscopy, Western Blot and electron microscopy.

Orientador: Jose Francisco Figueiredo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T02:40:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bertels_IvoneMedeirosVieira_D.pdf: 6733194 bytes, checksum: c8a7c3bcca8ad5732334627b49957dcc (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Introdução: A qualidade da conservação obtida em um órgão e a duração do armazenamento seguro são dependentes do tipo de solução e tempo de conservação, estando sujeitas a intercorrências imprevisíveis. Em virtude disso, o parênquima renal e, particularmente, o túbulo contornado proximal (TCP), local onde ocorre necrose tubular aguda (NTA), são susceptíveis às mudanças na homeostase funcional do órgão, durante a conservação e durante a reperfusão pós-implante. O TCP reabsorve cerca de 70% de Na+ e H2O filtrados; sua membrana apical tem células especializadas com microvilosidades para aumentar a área de transporte unidirecional de solutos do lúmen para o sangue. O principal componente estrutural da bordadura em escova, filamentos de F-actina, interage com uma variedade de proteínas transmembranas, inclusive moléculas transportadoras de íons. Esta função é regulada por parâmetros fisiológicos e hormonais, sendo a Angiotensina II (AII) uma das principais envolvidas com o citoesqueleto de actina e proteínas associadas, mediada principalmente por seus receptores AT1. Métodos: Neste trabalho, túbulos isolados de fragmentos frescos e de fragmentos conservados por períodos de 1 e 24h nas soluções de Euro - Collins (ECO) e de Belzer (UW) foram tratados com AII, losartan e AII+losartan, para medida do volume de absorção de fluido (Jv=nl. min_1. mm-1 (microperfusão in vitro), e medida da intensidade (média) de pixel da fluorescência dos receptores AT1 e do citoesqueleto de actina (imunoistoquímica). Resultados: a) Demonstrou-se que AII (10-12M) estimula absorção fluida (Jv), que é diminuída com losartan (10-6M) em TCP frescos e também em TCP conservados em soluções de ECO 1h e UW 1-24h. Em túbulos conservados 24h em ECO, não houve absorção de fluidos. b) A média da intensidade de pixel de fluorescência dos receptores AT1 em túbulos frescos (sem conservação) apresentou discreta variação entre os grupos não estatisticamente significante. Em túbulos conservados 1h com ECO e UW, a média da intensidade de pixel de receptores AT1 estava aumentada no grupo sem drogas, quando comparados aos tratados com AII, losartan e AII+losartan. Entretanto, em túbulos conservados 24h, ambas as soluções, houve aumento na média de intensidade do pixel de receptores AT1, no grupo tratado com AII, quando comparados aos demais grupos. c) O citoesqueleto de actina em túbulos frescos (sem conservação) não mostrou variação estatisticamente significante na média de intensidade de pixel entre os grupos (AII, losartan ou AII+losartan). No entanto, verificamos uma maior coesão entre os filamentos de actina de túbulos tratados com AII. A distribuição dos filamentos de actina em túbulos conservados em ECO 1h e UW 1 e 24h, mostrou-se uniforme, sem diferenças entre os grupos. Entretanto, em túbulos conservados em ECO 24h (tratamentos AII, losartan, AII+losartan) foi verificada alteração do citoesqueleto de actina. Conclusão: Baseados nestes dados, verificamos que, na conservação do TCP realizada por tempo reduzido, as diferenças na composição das soluções escolhidas não acarretaram alterações estatisticamente significantes na capacidade de absorção de fluidos, na distribuição dos receptores AT1 e no citoesqueleto de actina. Porém, quando o tempo de conservação é estendido, a composição da solução utilizada no processo, interfere na qualidade da conservação, acarretando alterações no citoesqueleto de actina, determinando alterações que poderiam implicar em mudanças na função absortiva, sendo que a solução de UW mostrou o melhor desempenho nestas condições experimentais / Abstract: Introduction: Depending on the preservation quality and duration, considering the solution composition and the preservation method, unexpected intercurrences may occur. In consequence, the renal parenchyma and particularly the proximal convoluted tubule (PCT), site where the acute tubular necrosis (NTA) occurs, are susceptible to changes in the organ functional homeostasis during preservation in the post implantation reperfusion period. The PCT reabsorbs approximately 70% of filtered Na+ and H2O, and its apical membrane has specialized cells with microvilli to increase the area of unidirectional solute transport from the lumen to the blood. The major structural component of brush border microvilli is the filamentous F-actin, which has been shown to interact with a variety of transmembrane proteins, including ion transport molecules. This function is regulated by physiological and hormonal parameters, such as angiotensin II (AII) interacting with actin cytoskeleton and associated proteins, mediated mainly through type I receptors (AT1R). After via different signaling pathways having been triggered, the varied functions are started, including fluid absorption (Jv), which is directly related to the actin cytoskeleton. Methods: Fresh (no preserved) and tubules preserved for 1h and 24hrs in Euro-Collins (EC) and Belzer (UW) solutions, treated with AII, losartan and AII+losartan, evaluated by "in vitro" microperfusion technique (fluid absorption (Jv=nl. min-1. mm-1), and by immunohistochemical technique (AT1 receptor measurement and actin cytoskeleton). Results: a) Our results showed that AII (10-12M) (physiological concentration) stimulates fluid absorption (Jv), which is reduced with losartan (10-6M) in fresh PCT, such as PCT preserved for 1h in EC and for 1-24hrs in UW solutions. There was no fluid absorption (Jv?0) in tubules preserved for 24hrs in EC solution. b) The mean fluorescence intensity of pixel of AT1 receptors in fresh tubules (no preserved) showed discreet changes while using drug treatments; however, these differences were not statistically significant. In tubules preserved for 1h in EC and UW, the mean fluorescence intensity of pixel of AT1 receptors increased in the group with no drug treatment, when compared with tubules treated with AII, losartan and AII+losartan. However, the mean pixel intensity of AT1 receptors in tubules preserved for 24hrs in both solutions increased in those treated with AII, when compared with other groups, control group, losartan and AII+losartan. c) When we examined actin cytoskeleton of fresh tubules (no preserved), comparing groups with no drug treatment and those treated with AII, losartan or AII+losartan, we verified that the variation in the mean pixel intensity of actin cytoskeleton, there was no difference statistically significant. However, we verified a greater cohesion in the actin filaments in tubules treated with AII. In tubules preserved in EC for 1h and UW for 1-24hrs there was a uniform distribution of actin filaments. However, it was verified disorganization in all groups (AII, losartan, AII+losartan) in tubules preserved for 24hrs in EC solution, showing that the organ preservation in this solution was not adjusted. Conclusion: Based on these data, we verified that when PCT preservation was carried out for a reduced time (1h), the differences in the composition of the chosen solutions were not significant; however, when the preservation time was extended, the composition of the solution used in the process affected the preservation quality and altered the actin cytoskeleton, determining alterations that could imply in changes in its absorptive functions. The UW solution showed better performance in these experimental conditions / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

O diferencial da cultura de células em 3-dimensões é permitir que as células explorem as 3-dimensões do espaço, aumentando assim as interações com o ambiente e entre as células. Em estudos relacionados à biologia do câncer de mama, vem ganhando espaço a utilização de esferóides para estudos que visam à compreensão da morfogênese do espaço luminal. Neste trabalho foi mostrado que as células MCF-7 reorganizam-se em estruturas tubulares e acinares. Em ambas as situações, a formação do lúmen veio acompanhada pelo estabelecimento de uma camada de células polarizadas, arranjo este muito semelhante ao encontrado em glândulas mamárias. Os resultados apresentados apontam para a existência de uma população de células na linhagem MCF-7 que não estão totalmente comprometidas ao fenótipo tumoral. Mantidos diferenciados, os esferóides de células MCF-7 apontam como um novo modelo para estudos relacionados à formação do lúmen, permitindo assim explorar o papel de diferentes vias como as relacionadas a apoptose, autofagia, diferenciação e sobrevivência celular. / As a particularity, a 3D cell culture permits cells to explore the three dimensions of the space thereby increasing cell-cell interactions, as well as interaction with the environment. In studies related to breast cancer biology, spheroids are becoming widely used in the aim to comprehend luminal space morphogenesis. We showed that MCF-7 cells reorganize themselves in tubular and acinar structures. In both situations, lumen formation was accompanied by the establishment of a layer of polarized cells, an arrangement that is very similar to that of breast glands. The presented results suggest the existence of an MCF cell line population not completely committed to the tumor phenotype. When maintained as differentiated, MCF-7 cell spheroids can be a new model for studies regarding lumen formation, thereby exploring the role of diiferent pathways, such as those related to cell apoptosis, autophagy, differentiation and survival.

O endotélio reveste a parede vascular e possui função essencial na manutenção da homeostase. A célula endotelial é capaz de perceber estímulos extracelulares, como fatores químicos e mecânicos, transmitir a informação para dentro da célula e regular sua função e fenótipo. Neste sentido, investigamos os mecanismos moleculares associados as células endoteliais em dois contextos importantes de intervenções vasculares 1) nos stents farmacológicos, onde a rapamicina exerce funções antiproliferativas e pró-trombogênicas, e 2) na revascularização cardíaca por ponte de safena, onde o alto estiramento mecânico exerce grande impacto no remodelamento vascular e no fenótipo da célula endotelial. A rapamicina pertence à classe de drogas limus, bastante utilizadas nos stents farmacológicos usados no procedimento de desobstrução vascular. Além de sua função antiproliferativa, exploramos os efeitos deletérios associados a pró-trombogênese. Os dados demonstraram que a rapamicina ativa o receptor de TGF independentemente de seu ligante TGFbeta, promovendo aumento na expressão da PAI-1 (pró-trombogênica), alteração no fenótipo endotelial (Transição endotélio-mesenquimal - EndMT) e na formação de fibras de estresse. Os efeitos observados são dependentes da ativação de Smad2 e independentes da via clássica antiproliferativa por mTOR. Experimentos in vivo mostraram que o tratamento com inibidor do receptor de TGF diminui os efeitos pró-trombogênicos e a expressão de PAI-1 induzidos pela rapamicina em artérias carótidas de camundongos. A ponte de safena é um procedimento bastante utilizado na cirurgia de revascularização cardíaca e a arterialização do segmento venoso submetido ao estresse hemodinâmico arterial resulta em remodelamento vascular, que influencia o sucesso do procedimento. Nossos dados demonstram que a célula endotelial humana de veia safena humana (hSVEC), susceptível as modificações do tipo EndMT induzido quimicamente (estímulo pró-fibrótico e pró-inflamatório), não expressou o mesmo comportamento em resposta ao aumento de estiramento mecânico que ocorre durante a arterialização venosa. Entretanto, detectamos uma pronunciada redução dos filamentos de actina, modulação no padrão de ativação da cofilina e na proporção de actina glomerular (G-actina) entre citoplasma e núcleo, com redução da biodisponibilidade de NO. De modo interessante, demonstramos que a redução no filamento de actina é específica para a célula endotelial venosa, não sendo observado em células endoteliais de origem arterial de aorta e coronária. Em conjunto, os dados mostram que 1) efeitos pró-trombogênicos associados a rapamicina são mediados por ativação do receptor de TGF independente do seu ligante e da atividade antiproliferativa da droga e 2) a adaptação da célula endotelial venosa ao estiramento mecânico envolve modulação da síntese/degradação de filamentos de actina e redução na biodisponibilidade de NO. Estes novos elementos sobre o mecanismo de transdução de estímulos químicos e físicos pelo endotélio poderão ser explorados terapeuticamente para modular a plasticidade endotelial em disfunções cardiovasculares / Endothelium is the inner layer in vascular wall and displays an essential role in the maintenance of cardiovascular homeostasis. Endothelial cell senses the extracellular stimuli, such as chemical and mechanical factors, transduce and process these signals to regulate cell function and phenotype. Here, we investigated molecular underpinning of the endothelial cells under two important scenarios: 1) in drug-eluting stents, where rapamycin exerts antiproliferative and undesirable prothrombogenic functions, and 2) in vein graft bypass surgery, where increased stretch modulates vascular remodeling and endothelial cell phenotype. Rapamycin belongs to the class of limus drugs and is widely used in drug eluting stents (DES) to vascular restenosis. In addition to its antiproliferative function, we explore the deleterious effects associated with prothrombogenesis. Our data demonstrated that rapamycin activates TGF receptor independent of its ligand TGFbeta, in concert with promotion of PAI-1 expression (prothrombogenic), changes in endothelial phenotype (Endothelial to Mesenchymal Transition - EndMT) and stress fibers induction. These effects are Smad2 dependent and independent of the classical antiproliferative mTOR pathway of rapamycin. Our in vivo experiments showed that TGF receptor inhibitor treatment decreases prothrombogenic effects and PAI-1 expression induced by rapamycin in mice carotid arteries. Saphenous vein is widely used in coronary artery bypass surgery (CABG) and the vein arterialization remodeling in response to the increased stress influences graft patency. Our data demonstrated that human saphenous vein endothelial cell (hSVEC) is susceptible to chemically induced endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) by pro-fibrotic and pro-inflammatory stimuli. On the other hand, physical stimulus associated with high stretch failed to induce EndMT. However, we detected a pronounced decrease of actin filaments, modulation of the cofilin activation, changes in the proportion of glomerular actin (G-actin) between cytoplasm and nucleus, and reduction of NO bioavailability. Interestingly, the reduction of actin fibers by high stretch is specific to venous endothelial cell since arterial endothelial cells from aorta, and coronary artery failed to display the response. Altogether, our data show that 1) the thrombogenic effects of rapamycin are mediated by TGF receptor activation independent of its ligand and independent of the antiproliferative pathway of the drug, and 2) the adaptation of venous endothelial cell to mechanical stretch involves synthesis/degradation of actin filaments and reduced NO bioavailability. These new elements on signal transduction of endothelial cells in response to chemical and physical stimuli may be therapeutically explored to modulate endothelial plasticity in cardiovascular disorders

Les infections bactériennes touchant la circulation sanguine conduisent à un vaste éventail de graves pathologies, comme les chocs septiques ou les infections locales (endocardites et méningites). Neisseria meningitidis colonise avec succès l’endothélium vasculaire et cause des sepsis sévères. Ces infections résultent de la colonisation des cellules endothéliales de l’hôte, étape clef de la pathophysiologie à laquelle les travaux présentés dans ce manuscrit se sont intéressés. La colonisation de l’endothélium par N. meningitidis est un processus complexe qui implique l’adhésion et la multiplication des bactéries à la surface des cellules endothéliales dans le contexte particulier de la circulation sanguine, où des forces mécaniques sont générées par le flux sanguin sur les objets circulants. Bien que de nombreuses études se soient intéressées à l’interaction entre les cellules endothéliales et N. meningitidis, plusieurs aspects demeurent incertains comme par exemple l’impact des contraintes générées par le flux sanguin et la participation relative des deux partenaires de l’interaction dans la colonisation de l’endothélium par N. meningitidis.L’adhésion de la bactérie à la surface des cellules endothéliales est dépendante de facteurs bactériens (les pili de type IV, PT4) et induit une réponse de la part de la cellule hôte, qui se traduit par un remodelage de la membrane plasmique et une réorganisation du cytosquelette d’actine sous les microcolonies. Dans un premier temps, ces travaux de thèse montrent que la réponse cellulaire induite par N. meningitidis participe activement à la colonisation. En effet, la formation de projections membranaires permet à chaque bactérie de la microcolonie d’établir des contacts avec la cellule hôte, nécessaires à la résistance des microcolonies face aux forces mécaniques générées par le flux sanguin. De plus, nous montrons que la protéine PilV, composant des PT4, est impliquée dans le remaniement de la membrane plasmique et la réorganisation du cytosquelette. Nous avons développé une méthode combinant vidéo-microscopie et analyse de fluorescence pour décrypter les événements précoces prenant place lors du contact entre les bactéries et la surface des cellules hôtes. Nous avons alors montré que le remodelage de la membrane induit par N. meningitidis ne dépend pas de la réorganisation du cytosquelette d’actine au site d’infection mais plutôt des propriétés intrinsèques de la bicouche lipidique.Dans un second temps, nous nous sommes intéressés aux étapes tardives de l’infection, c'est-à-dire à l’initiation d’un nouveau cycle de colonisation. Bien que solidement ancrées à la surface des cellules par l’intermédiaire des projections membranaires, quelques bactéries se détachent des microcolonies pour coloniser des nouveaux sites au sein de l’hôte. Nous avons démontré l’importance de modifications post-traductionnelles de la piline majeure dans cette étape de l’infection et caractérisé les mécanismes impliqués.Cette étude a permis d’affiner les mécanismes impliqués dans l’induction de la réponse cellulaire induite par N. meningitidis et son impact sur la colonisation efficace de l’endothélium par ce pathogène. / Bacterial infections targeting the bloodstream lead to a wide array of severe clinical manifestations, such as septic shock or focal infections (endocarditis and meningitis). Neisseria meningitidis colonizes successfully the vascular wall and causes severe sepsis. Such infections result from an efficient colonization of host endothelial cells, a key step in meningococcal diseases which has been the subject of the work presented here. Endothelium colonization by N. meningitidis is a complex process implying bacterial adhesion and multiplication on the endothelial cell surface in the specific context of the bloodstream, where mechanical forces generated by the blood flow are applied on circulating bacteria. Even though many studies focused on the interaction between N. meningitidis and the endothelial cell, many aspects remain elusive, such as the impact of shear stress generated drag forces and the relative contribution of the two partners involved in this interaction.Adhesion to the endothelial cell surface is dependent on bacterial factors called type IV pili (Tfp) and leads to induction of a host cell response, characterized by a local remodeling of the plasma membrane and reorganization of actin cytoskeleton underneath bacterial microcolonies. First, we have shown that the cellular response induced by N. meningitidis actively participate in the colonization process. Indeed, membrane deformation allows contact with every bacterium inside the microcolony, which is necessary for microcolony resistance to mechanical forces. Additionally, we have demonstrated that the PilV protein, a Tfp component, is involved in plasma membrane remodeling and actin cytoskeleton reorganization. We designed a method combining high resolution live-cell fluorescence video-microscopy and fluorescence quantification to decipher the early events induced on contact of bacterial aggregates with the host cell surface. Using this technique we have shown that membrane remodeling does not rely on actin cytoskeleton reorganization but rather on intrinsic properties of the lipid bilayer. Second, we focused on latter steps of the infection process when initiation of a new colonization cycle is initiated. While firmly attached to the host cell surface through the membranous projections, some bacteria can detach from the microcolony to disseminate throughout the host. We have demonstrated the importance of post-translational modification of the major piline in this step and characterized the underlying mechanisms.This work allows refinement of the molecular mechanisms involved in the induction of the cellular response induced by N. meningitidis and its impact on successful endothelium colonization by this pathogen.

La mucoviscidose est causée par des mutations du gène CFTR (p.Phe508del étant la plus fréquente). Celui-ci code pour la protéine CFTR qui constitue un canal chlorure exprimé à la face apicale des cellules épithéliales. Au niveau du reticulum endoplasmique (RE), le contrôle de qualité conformationnelle oriente la majorité du CFTR en cours de repliement vers une voie de dégradation. Une fraction limitée du WT-CFTR parvient cependant à se replier correctement et peut ensuite progresservers la surface cellulaire, contrairement au Phe508del-CFTR (qui est néanmoins fonctionnel). Lorsque des formes mutées sont exportées à partir du RE, grâce à des traitements correcteurs, elles sont alors instables à la membrane plasmique. Par ailleurs, il a été montré que l'organisation des microfilaments d'actine participe à l'ancrage du canal au cytosquelette et à sa stabilité. Or, la petite GTPase Cdc42 influence la dynamique de nucléation de l'actine fibrillaire. Au cours de nos travaux, nous avons testé l'implication de Cdc42 et de certains de ses effecteurs dans la régulation de WT-CFTR dans des cellules épithéliales bronchiques. Dans ce cadre, la fonction de la voie Cdc42 a été perturbée par des traitements pharmacologiques et par ARN interférence. Les résultats obtenus, principalement par biotinylation de surface, ont permis de proposer que (1) la protéine Cdc42 participe à ladégradation de formes mal repliées de CFTR dans les étapes précoces et tardives de la voie de sécrétion et (2) la voie Cdc42, par son implication dans l'organisation de l'actine F corticale, affecte l’ancrage du canal chlorure au cytosquelette et régule ainsi son recrutement dans des vésicules d'internalisation. / Cystic Fibrosis is caused by CFTR gene mutations (p.Phe508del being the most frequently encountered). The CFTR protein functions as a chloride channel expressed at the plasma membrane of epithelial cells. Its productive folding in the endoplasmicreticulum (ER) is poorly efficient and unfolded proteins are therefore targeted to degradation. Nevertheless, a limited fraction of WT-CFTR acquires a native conformation and then progesses into the secretory pathway. In the case of Phe508del-CFTR, virtually all channels are degraded at this step except through corrector treatments. Under these conditions the mutant remains unstable at the plasma membrane (although it is functionnaly competent). Furthermore, it has been shown that fibrillar actin organization is involved in CFTR tethering to the cytoskeleton and channel stability. Moreover, the small GTPase Cdc42 promotes F actin nucleation. In the present study, we aimed at testing the involvement of Cdc42, and of some of its effectors, in WT-CFTR regulation in epithelial airway cells. In this context, Cdc42 pathway function was altered through pharmacological treatments or siRNAmediated depletions. Our results, mainly obtained via cell surface biotinylation assays, led us to propose that (1) Cdc42 is involved in misfolded CFTR degradation at early and late steps of the secretory pathway, and (2) Cdc42 pathway, through its F actin organization function, affects CFTR anchoring to the cytoskeleton and thus regulates its endocytosis.