Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Diogo Trindade Fóis (diogo_fois@hotmail.com) on 2009-12-23T13:36:55Z No. of bitstreams: 1 2007_MariaCreuzadoEspiritoSantoBarros.PDF: 2427022 bytes, checksum: c1b6ff19e770ca676614dcd850cdc8f6 (MD5) / Approved for entry into archive by Carolina Campos(carolinacamposmaia@gmail.com) on 2010-01-06T16:18:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_MariaCreuzadoEspiritoSantoBarros.PDF: 2427022 bytes, checksum: c1b6ff19e770ca676614dcd850cdc8f6 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-06T16:18:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_MariaCreuzadoEspiritoSantoBarros.PDF: 2427022 bytes, checksum: c1b6ff19e770ca676614dcd850cdc8f6 (MD5) Previous issue date: 2007-02-15 / A Dengue é a doença humana transmitida por mosquitos mais comum que pode evoluir para um doença potencialmente letal denominada de febre hemorrágica do dengue (FHD). Essa doença é causada por um vírus de RNA fita simples, senso positivo e envelopado que pertence ao gênero Flavivirus, onde o genoma é organizado em uma única fase aberta de leitura (ORF), que codifica três proteínas estruturais (capsídeo, pré- M e envelope) e sete proteínas não-estruturais (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5). Entre as proteínas virais, a proteína do envelope é uma das mais antigênicas e a proteína NS1 está relacionada com a lise de células infectadas, mediada pelo sistema complemento. Diferentes sistemas de expressão podem ser usados para a expressão de antígenos virais para o desenvolvimento de vacinas e/ou diagnóstico. Entre estes sistemas, o sistema de expressão baseado em baculovírus (BEV) é um dos mais populares e eficientes. Baculovírus infectam artrópodes, principalmente insetos e possuem um genoma de DNA circular, dupla fita. Existem muitas vantagens do BEV em relação a outros sistemas de expressão, como, por exemplo, o alto nível de expressão e as modificações pós-traducionais que permitem a montagem correta e atividade biológica da proteína expressa. Um isolado brasileiro de Dengue virus 1 foi usado para amplificar o gene do envelope ou o gene do envelope fusionado ao gene NS1 por RT-PCR, usando oligonucleotídeos específicos e os fragmentos obtidos foram clonados no vetor de transferência comercial pFastBac1 (Invitrogen). Esse plasmídeo possui regiões sítio-específicas que permitam a transposição do inserto de interesse dentro do genoma de um baculovírus (bacmídeo) propagado em Escherichia coli. O bacmídeo recombinante é usado para a expressão da proteína heteróloga em células de inseto infectadas. Dois vírus recombinantes foram obtidos, vAcDE e vAcDENS1, que expressão e as modificações pós-traducionais que permitem a montagem correta e atividade biológica da proteína expressa. Um isolado brasileiro de Dengue virus 1 foi usado para amplificar o gene do envelope ou o gene do envelope fusionado ao gene NS1 por RT-PCR, usando oligonucleotídeos específicos e os fragmentos obtidos foram clonados no vetor de transferência comercial pFastBac1 (Invitrogen). Esse plasmídeo possui regiões sítio-específicas que permitam a transposição do inserto de interesse dentro do genoma de um baculovírus (bacmídeo) propagado em Escherichia coli. O bacmídeo recombinante é usado para a expressão da proteína heteróloga em células de inseto infectadas. Dois vírus recombinantes foram obtidos, vAcDE e vAcDENS1, que foram, então, usados para infectar larvas de Spodoptera frugiperda. Extratos de tecido adiposo de larvas infectadas (96 h.p.i.) foram analisadas por SDS-PAGE e Western- blot, usando um anticorpo contra o vírus do dengue, que detectou um polipeptídeo por volta de 70 kDa em ambos os extratos. Esse polipeptídeo é diferente do tamanho predito da proteína do envelope (~50 kDa) e das proteínas do envelope mais NS1 fusionadas (~90kDa). Entretanto, a análise transcricional confirmou que os genes estavam sendo transcritos em células infectadas. Nós também usamos o virus vAcDENS1 em um ensaio de fusão de membrana e confirmamos a formação de sincício dependente de pH, o que é uma característica da proteína do envelope do vírus do dengue. O gene NS1 foi também clonado em um plasmídeo, sob o comando do promotor hsp70 de Drosophila melanogaster e usado em uma co-transfecção com um plasmídeo contendo um gene de resistência à puromicina, visando a construção de células de inseto estavelmente transformadas. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Dengue is the most common mosquito-borne viral disease of humans and its infection may evolve to a potentially lethal disease known as Dengue haemorrhagic fever (DHF). This disease is caused by a positive-sense, single-stranded, enveloped RNA virus that belongs to the genus Flavivirus within Flaviviridae and its genome is organized in a single ORF which encodes three structural proteins (capsid, pre-M, and envelope) and seven non-structural proteins (NS1, NS2a, NS12b, NS3, NS4a, NS4b, NS5). Among the viral proteins, the envelope protein is one of the most antigenic and NS1 play a possible role in complement-mediated cytolysis. Different heterologous expression systems may be used for the expression of viral antigens for vaccine and/or diagnosis development. Among these, the Baculovirus Expression System (BEV) is one of the most popular and efficient system. Baculoviruses have a circular, double stranded DNA genome and infect arthropodes, mainly insects. There are many advantages of using BEV, when compared to other expression systems, such as high expression levels and post-translational modifications that allows the expressed proteins to be correctly folded and biologically active. A Brazilian Dengue 1 isolate was used to amplify the envelope gene alone or envelope plus NS1 gene by RT-PCR using specific oligonucleotides and cloned into the commercial transfer vector pFastBac1 (Invitrogen). This plasmid has site-specific regions which allows transposition of the chosen insert into a baculovirus genome (bacmid) propagated in Escherichia coli. The recombinant bacmid DNA is used to obtain recombinant baculovirus and heterologous protein expression in virus-infected insect cells. Two different recombinant virus were obtained, vAcDE and vAcDENS1, and they were used to infect Spodoptera frugiperda larvae. Fat body extracts of infected larvae (96 h p.i.) were analysed by SDS-PAGE and Western blot using an anti-Dengue antibody which detected a polypeptide around 70 kDa in both extracts. The size of this polypetide is different from the predicted size of the envelope protein (~50 kDa) and the fused envelope and NS1 proteins (~90kDa). However, transcriptional analysis confirmed that the genes were being transcribed in infected cells. We also used the vAcDENS1 virus in a membrane fusion assay and confirmed pH-dependent syncytium formation, which is a characteristic of the dengue virus envelope protein.. The NS1 gene alone was cloned under the control of hsp70 promoter and used to co-transfect insect cells with a plasmid containing the puromycin resistance gene, in order to produce stably transformed insect cells.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-01-29T12:38:35Z No. of bitstreams: 1 2013_MichelinePimentelRibeiroCavalcante.pdf: 8451536 bytes, checksum: 9078b3140856eb23d2ecaa84d17f0213 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-02-05T10:18:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_MichelinePimentelRibeiroCavalcante.pdf: 8451536 bytes, checksum: 9078b3140856eb23d2ecaa84d17f0213 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-05T10:18:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_MichelinePimentelRibeiroCavalcante.pdf: 8451536 bytes, checksum: 9078b3140856eb23d2ecaa84d17f0213 (MD5) / Introdução - A dengue, atualmente, traduz-se em uma ameaça para 40% da população mundial, o que representa, aproximadamente, espantosos 2,5 bilhões de pessoas, habitantes de todos os 100 países tropicais e subtropicais componentes do globo terrestre. O município de Palmas, Estado do Tocantins tem buscado estratégias governamentais e não-governamentais, visando à redução do número de casos da dengue, porém tamanhos esforços têm se mostrado insuficientes em seu propósito maior. Sendo indispensável e urgente a adoção de medidas para otimizar e direcionar tempo e recursos financeiros, com vistas a reduzir a incidência de dengue na população. Objetivos - Conhecer a magnitude da ocorrência de casos da dengue e os fatores que podem influir na transmissão da doença no município, sob a ótica da geomédica, no período compreendido entre o ano de 2008 ao de 2010. Metodologia - estudo analítico ecológico transversal, realizado em três etapas distintas, em que as duas primeiras consistiram em estudos quantitativos, com dados secundários e primários. Já a terceira delas refere-se ao estudo ecológico, com a utilização da geoestatística como parâmetro principal. Os locais selecionados para a análise espacial dos dados secundários situam-se no distrito de Palmas, e estão distribuídos em todas as quadras residenciais, comerciais, APM, AV e AE, totalizando 273 centróides. Enquanto os dados primários utilizaram-se as quadras residenciais cobertas pela Estratégia de Saúde da Família do município, perfazendo um total de 74 quadras, com 2220 domicílios investigados, representando uma amostra aleatória simples, com erro de 0,02. Estatística descritiva foi realizada, incluindo-se tabulações de acordo com as variáveis selecionadas. Na análise exploratória dos dados primários, foi usado o programa X-LSTAT, para a construção dos diagramas em caixas (Boxplots), com o objetivo de simplificar a descrição e obter uma visão mais profunda da sua natureza. Para a realização da análise multivariada, foi utilizado o método de Análise dos Componentes Principais (PCA), procurando analisar as correlações das variáveis estudadas com o número de casos de dengue na área em estudo. Foram utilizadas duas técnicas geoestatísticas: a krigeagem ordinária (KO) e a krigeagem indicativa (KI), que forneceram mapas mostrando a distribuição espacial das variáveis dependentes e independentes da investigação. Resultados - A incidência da dengue foi alta nos anos de 2008 e 2010 e, em todos os anos estudados, obedeceu-se a sazonalidade característica das doenças tropicais, em que, nos períodos chuvosos, de novembro a maio, verificou-se maior número de casos notificados. A faixa etária predominante, nos três anos pesquisados, foi de 20 a 29 anos, seguida de 30 a 39 anos e 10 e 19 anos. Analisando a umidade relativa e os níveis de precipitação mensalmente e associando esses dados ao número de casos notificados, houve uma correlação positiva nos anos de 2008 e 2010: quanto maior a precipitação e a umidade, maior o número de casos. A distribuição geográfica dos casos, por ano, mostrou uma grande diversidade entre as áreas, onde existem aquelas com grandes concentrações de casos e outras com média e baixa concentração. Após análise multivariada, foram encontradas correlações positivas quanto à escolaridade, presença de terrenos baldios e condições dos terrenos, ausência de bueiros, presença de focos nas residências e ausência de limpeza nos depósitos de água. Sobre as variáveis dos serviços de saúde, a não procura pelos serviços, ausência de medidas de controle, ausência de realização de exames e a falta de mobilização social tiveram correlação positiva com a incidência da dengue no ano de 2010. O relevo da cidade Palmas foi considerado como fator de risco na ocorrência de dengue, observou-se que, nas áreas mais baixas, houve menor incidência de casos e, nas mais elevadas, seguindo-se a direção norte-sul, em todos os pontos analisados de elevação, ocorreu uma maior incidência de casos. Quanto ao risco de ocorrência da dengue, houve anizotropia no sentido sudeste-noroeste, onde as áreas habitadas mostraram maior probabilidade de transmissão independente do ano pesquisado. Conclusão - Após análise da correlação espacial, notou-se que a ocorrência de casos no espaço é inversamente proporcional ao número de focos, o que significa dizer que não houve correlação espacial entre o número de casos de dengue e o número de focos, na maioria das áreas investigadas, no período de 2008 a 2010. As técnicas de análise geoestatística, tais quais as apresentadas nesta Tese, podem contribuir no aprimoramento em relação às atuais estratégias de controle, que são baseadas em análise descritiva de dados com distribuição geográfica estática. As novas técnicas utilizam dados analíticos e por isso podem auxiliar em mostrar a situação real das causalidades das epidemias. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction – Currently, the dengue fever is a threat for 40% of the world's population, which represents approximately 2,5 billion people, inhabitants of the 100 tropical and subtropical countries in the globe. The city of Palmas, in the State of Tocantins, has sought governmental and non-governmental strategies aiming to reduce the number of dengue fever cases, yet, all these efforts have not been enough. It is essential and urgent to employ measures to optimize and channelize time and financial resources, in order to reduce dengue fever rates. Objective – Become aware of the magnitude of dengue fever cases and the factors that can contribute to its transmission in the city of Palmas, under geomedicine perspective, from 2008 to 2010. Methodology – Cross-sectional analytical study performed in three different stages. The two initial ones were quantitative studies, with primary and secondary data. The third one refers to an ecological study using geostatistics as its primary parameter. The places selected for the spatial analysis of secondary data are in the administrative district of Palmas, and are located in all residential, commercial, APM, AV and AE areas, totaling 273 locations. While primary data use residential areas covered by the Family Health Care Program, totaling 74 locations, with 2,220 participant houses, representing a simple random sample with an error rate of 0.02. Descriptive statistics was carried out, including data entry according to pre-stablished variables. We employed the X-LSTAT program to do the exploratory analysis of primary data in order to elaborate the diagrams in boxes (Boxplots), aiming to easy the description and get a deeper view of its nature. To do the multivariate analysis we used the Principal Components Analysis (PCA) method, seeking to analyze the correlation between the variables and the number of dengue fever cases in the observed location. We employed two geostatistics techniques: ordinary kriging (KO) and simple kriging (KI), which provided maps showing the spatial distribution of dependent and independent variables. Results – The dengue fever rate from 2008 to 2010 was high and, along the years studied, it followed the seasonal feature that characterizes tropical diseases, in which there are more occurrences of registered cases in rainy season, from November to May. The prevailing age range, in the three years we studied, was from 20 to 29 years old, followed by the age range from 30 to 39 years old and from 10 to 19 years old. When we analyzed the air humidity and the levels of precipitation and related them to the number of registered cases, there was a positive correlation in 2008 and in 2010: as greater the precipitation and the humidity are, greater is the number of cases. Geographyc distribution of cases, by year, have shown diversity among the locations, where some presents a high rate of cases and others medium or low rates. After the multivariate analysis we found positive correlations regarding schooling, vacant lots and their conditions, lack of manholes, existing breeding points and no regular cleaning of the water tanks. Regarding to heath care, there was a positive correlation between dengue fever cases and no demand for health care, lack of control measures, absence of blood tests and no social campaigning in 2010. Palmas' landscaping was considered a risk factor, we found out that in the lower areas there were less cases of dengue fever then in the higher areas, from North to South, in all heights analyzed, there was greater occurrence of cases. As for dengue fever occurrence risk, there was anisotropy in Southwest-Northwest direction, where populated areas showed higher transmission probability, regardless of the year studied. Conclusion - After the spatial analysis, we found out that the occurrence of dengue fever cases in space is inversely proportional to the number of breeding points, which means that there was no spatial correlation between the number of dengue fever cases and the number of breeding points in most locations studied, from 2008 to 2010. Geostatistics analysis techniques presented in this Thesis can contribute to improve the current control strategies, which are based in descriptive data analysis within a static geographical coverage. These new techniques use analytical data and that is why they can help showing the real situation of epidemics causes.

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-04-27T18:47:41Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Debora Maximo das Neves Luna.pdf: 3149214 bytes, checksum: 948556bb6aaf20df2b076b5191f11142 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-27T18:47:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Debora Maximo das Neves Luna.pdf: 3149214 bytes, checksum: 948556bb6aaf20df2b076b5191f11142 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / FACEPE / A imobilização de lipídios em substratos sólidos tem sido amplamente utilizada no desenvolvimento de biossensores visando a uma alternativa simples e de baixo custo. Dessa forma, um ambiente favorável à imobilização de proteínas pode ser criado o que viabiliza a utilização destas moléculas como elemento de biorreconhecimento molecular. A finalidade deste estudo consiste em imobilizar a lectina Concanavalina A, em uma plataforma nanostruturada contendo moléculas fosfolipídicas a fim de identificar glicoproteínas presentes no soro contaminado com dengue (DENV-1, DENV-2 e DENV-3). A resposta foi avaliada por técnicas eletroquímica (Espectroscopia de Impedância Eletroquímica [EIE] e Voltametria Cíclica [VC]) e piezoelétrica (Microbalança de Cristal de Quartzo [QCM]). O biossensor eletroquímico apresentou maior resposta para DENV-3 (RCT = 180%) em relação aos DENV-1 (RCT = 60%) e DENV-2 (RCT = 80%). Por outro lado, o biossensor piezoelétrico identificou de forma qualitativa da presença do DENV. Com o objetivo de aumentar a especificidade na identificação do DENV, quatro imunossensores eletroquímicos constituídos por camada auto-organizada de cisteína, nanopartícula de ouro e anticorpo monoclonal (Anti-DENV-1, Anti-DENV-2, Anti-DENV-3 e Anti-DENV-4) foram desenvolvidos e avaliados após exposição ao vírus da dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. Os imunossensores demonstraram eficácia, linearidade e especificidade para todos os sorotipos analisados. Além disso, técnicas de microscopia de força atômica e microscopia eletrônica de varredura caracterizaram satisfatoriamente a imobilização na superfície de todos os biossensores desenvolvidos. / Immobilization of lipids on solid substrates has been extensively used in the development of biosensors, aiming a simple and low-cost alternative. Thus, a favorable environment for immobilization of proteins can be obtained and these molecules can be used as a molecular element for biorecognition. The purpose of this study is to conduct the immobilization of the Concanavalin A lectin on a nanostrutured platform containing phospholipid molecules with the aim of identify serum infected with dengue virus (DENV-1, DENV-2 and DENV- 3). The response was evaluated by electrochemical technique (Electrochemical Impedance Spectroscopy [EIS] and Cyclic Voltammetry [CV]) and piezoelectric technique (Quartz Crystal Microbalance [QCM]). The electrochemical biosensor showed greater response for DENV-3 (RCT = 180%) compared to DENV-1 (RCT = 60%) and DENV-2 (RCT = 80%). Moreover, piezoelectric technique identified qualitatively the presence of DENV. In order to increase the specificity in the identification of DENV, four electrochemical immunosensors based on self-organized layer of cysteine, gold nanoparticles and monoclonal antibody (Anti- DENV-1, Anti-DENV-2, Anti-DENV-3 e Anti-DENV-4) were developed and evaluated after exposure to dengue virus (DENV- 1, DENV-2, DENV-3 and DENV-4). The immunosensors demonstrated efficacy, linearity and specificity for all serotypes analyzed. In addition, atomic force microscopy and scanning electron microscopy techniques, satisfactorily characterized the immobilization on the surface of all developed biosensors.

Submitted by Irene Nascimento (irene.kessia@ufpe.br) on 2016-09-08T18:57:32Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO - CLARISSA BARROS MADRUGA versão digital.pdf: 2723819 bytes, checksum: ae4a199db2f44ecf66614c6242c348b3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-08T18:57:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO - CLARISSA BARROS MADRUGA versão digital.pdf: 2723819 bytes, checksum: ae4a199db2f44ecf66614c6242c348b3 (MD5) Previous issue date: 2015-06-18 / A dengue é importante causa de doença febril em países tropicais e de acordo com sua nova classificação a presença de sangramentos em mucosas e alterações hepáticas alertam para possível evolução desfavorável. O envolvimento do fígado manifesta-se principalmente por elevação de aminotransferases ou hepatomegalia e as formas hemorrágicas da dengue associam-se ao prolongamento precoce do TTPA. Foram selecionados 554 indivíduos com diagnóstico laboratorial de dengue a partir de banco de dados formado no período de março de 2009 a maio de 2011, divididos em dois grupos: com e sem sangramento espontâneo de mucosa, e os parâmetros laboratoriais (aminotransferases, TTPA e plaquetas) foram comparados entre eles. Dos 554 indivíduos, 285 (51,4%) eram do sexo feminino e 269 (48,6%) do sexo masculino, com idade média de 27,4 anos, mediana de 22 anos (3 meses a 92 anos), 219 (39,5%) tinham idade ≤ 15 anos e 335 (60,5%) com idade > 15 anos, 166 (30%) pacientes apresentaram manifestação hemorrágica espontânea, contra 388 (70%) que não apresentaram sangramento. Dentre os pacientes que sangraram, 81 (48,8%) eram do sexo masculino e 85 (51,2%) do sexo feminino, predominando na faixa etária ≤ 15 anos com 84/219 (38,4%) versus a faixa etária > 15 anos com 82/335 (24,5%). Pela localização, os sangramentos espontâneos apresentaram a seguinte ordem de ocorrência: gengivorragia, 30,3% (64/166); hematêmese, 26,5% (56/166); epistaxe, 22,3% (47/166); melena, 8,1% (17/166); hematúria, 6,6% (14/166), hemoptise; 3,3% (7/166) e hemotoquezia 2,8% (6/166). O prolongamento de TTPA foi encontrado em 23% (82/358) dos pacientes, enquanto 77% (276/358) tiveram TTPA normal. O prolongamento de TTPA foi mais frequente na faixa ≤ 15 anos com 51,2% versus a faixa etária >15 anos com 48,8% (p<0,05). Apenas 26% (138/524) apresentaram valores de AST maior que 175 e 74% (386/524) apresentaram AST até 175. Os valores de ALT apresentaram a seguinte distribuição: 16% (84/528) apresentam ALT maior que 200 e 84% (444/528) apresentam ALT até 200. Não houve associação entre elevação de aminotransferases e sangramentos (p > 0,05). Com a dicotomização das plaquetas em valores abaixo e acima de 50.000 mm3, o prolongamento de TTPA, apresentou resultado significativo para sangramentos espontâneos condicionado às plaquetas <50.000/mm³. Não foi encontrada associação entre alterações morfológicas do fígado e sangramentos espontâneos. Com a curva ROC foi estabelecido o ponto de corte de 41,3 segundos para a associação do TTPA com hemorragia espontânea de mucosa nos indivíduos estudados, com sensibilidade de 52,8%, especificidade de 69,2%, acurácia de 64,2%, Risco Relativo (RR) de 1,868 e Odds Ratio (OR) 2,511. Na análise multivariada apenas os fatores de risco prolongamento de TTPA e plaquetas apresentaram associação significativa quanto à ocorrência de sangramentos espontâneos (p < 0,05). O prolongamento de TTPA mostrou-se como possível preditor de sangramento, no entanto, faz-se necessário avaliação de outros elementos do coagulograma para que esse dado possa adquirir maior consistência. / Dengue is an important cause of febrile illness in tropical countries and according to the new classification the presence of mucosal bleeding and liver changes correlates with possible adverse developments. The involvement of the liver is manifested primarily by increased aminotransferases levels or hepatomegaly and hemorrhagic forms of dengue are associated with the early prolonged aPTT. Information from 554 patients with a laboratory diagnosis of dengue from the database formed from March 2009 to May 2011 were collected, divided into two groups: with and without spontaneous mucosa bleeding, and laboratorial parameters (aminotransferases, aPTT and platelet ) were compared. Of the 554 subjects, 285 (51.4%) were female and 269 (48.6%) were male, mean age 27.4 years, median 22 years (3 months to 92 years), 219 ( 39.5%) were aged ≤ 15 years and 335 (60.5%) aged> 15 years, 166 (30%) patients had spontaneous hemorrhagic manifestation, against 388 (70%) who did not have bleeding. Among the patients who bled, 81 (48.8%) were male and 85 (51.2%) were females, predominantly aged ≤ 15 years with 84/219 (38.4%) versus the age group > 15 years, with 82/335 (24.5%) (p <0.01). By location, spontaneous bleeding showed the following order of occurrence: gingival bleeding, 30.3% (64); hematemesis, 26.5% (56); epistaxis, 22.3% (47); melena, 8.1% (17); hematuria, 6.6% (14), hemoptysis; 3.3% (7) and hemotoquezia 2.8% (6). The extension of APTT was found in 23% (82/358) of patients, while 77% (276/358) had normal aPTT. The enlargement aPTT was more frequent in the range ≤15 years with 51.2% versus age> 15 years with 48.8% (p <0.05). Only 26% (138/524) had values of AST greater than 175 and 74% (386/524) had AST up to 175. ALT values were distributed as follows: 16% (84/528) have ALT greater than 200 and 84% (444/528) have ALT up to 200. There was no association between increased levels of aminotransferases and bleeding (p> 0.05). With the dichotomy of platelets in values below and above 50,000 mm3, the extension of aPTT, showed significant results (p <0.05) for spontaneous bleeding conditioning to platelets <50,000 / mm³. No association was found between morphological changes in the liver and spontaneous bleeding. With the ROC curve was established cutoff point of 41.3 seconds to the association of aPTT with spontaneous bleeding mucosa in studied subjects, with sensitivity 52.8%, specificity 69.2%, accuracy of 64.2% , relative risk (RR) of 1.868 and odds ratio (OR) 2.511. In multivariate analysis, only the risk factors enlargement aPTT and platelets were significantly associated for the occurrence of spontaneous bleeding (p <0.05). The extension of aPTT showed up as possible predictor of bleeding, however, it is necessary to evaluate other coagulation elements so that this data can acquire greater consistency.

Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-07-11T22:42:19Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Antonio Fernando da Purificação Júnior.pdf: 2087937 bytes, checksum: e1ada69a4a283be1ebcf72e615345586 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-07-18T17:51:01Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Antonio Fernando da Purificação Júnior.pdf: 2087937 bytes, checksum: e1ada69a4a283be1ebcf72e615345586 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-18T17:51:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Antonio Fernando da Purificação Júnior.pdf: 2087937 bytes, checksum: e1ada69a4a283be1ebcf72e615345586 (MD5) Previous issue date: 2017-02-24 / CNPQ / A dengue é uma importante doença de aspecto emergente e um grande desafio para a saúde pública mundial. No mercado, existe apenas uma vacina licenciada que não é totalmente eficaz na prevenção da doença. Também existem dificuldades para se expressar antígenos virais em sistemas procarióticos para uso no diagnóstico sorológico. O presente estudo, por meio da engenharia de proteínas, propõe moléculas alternativas de interesse diagnóstico e/ou vacinal para a dengue. Com o uso de ferramentas computacionais seguindo a estratégia “epitope-scaffolding”, elementos estruturais da NS1 de dengue (epitope) foram transplantados para a TOP7 (scaffold). Os genes sintéticos para as variantes dessa proteína, levando em consideração os 4 sorotipos de dengue, totalizando 4 proteínas recombinantes, foram otimizados, sintetizados comercialmente e clonados em vetor de expressão. As proteínas recombinantes tiveram sua expressão confirmada por ensaios de imunoblot e purificadas por cromatografia de afinidade, apresentando alto rendimento e solubilidade. Foram realizados ELISAs, com soros de pacientes infectados com DENV-3, para avaliação imunológica das proteínas quiméricas expressas. Os sinais detectados para as quimeras sugerem que elas são potencialmente imunogênicas. / Dengue is an important emerging disease and a major public health challenge worldwide. Currently, there is only one licensed vaccine that is not fully effective in preventing the disease. There are also difficulties in expressing viral antigens in prokaryotic systems for use in serological diagnosis. The present study, through the engineering of proteins, proposes alternative molecules to be employed in strategies for diagnostics and/or vaccines for dengue. With the use of computational tools following the epitope-scaffolding approach, structural elements of dengue NS1 (epitopes) were transplanted to the TOP7 protein (scaffold). Synthetic genes for 4 recombinant proteins, taking into account the 4 serotypes of dengue, were optimized, commercially synthesized and cloned into expression vector. The cells of Escherichia coli BL21 were transformed with the respective plasmid constructs. Proteins were confirmed by immunoblot assays and purified by affinity chromatography, exhibiting high yield and solubility. ELISAs, with sera from patients infected by DENV-3, were performed for the immunological evaluation of expressed chimeric proteins. Signals detected for the chimeras suggest that they are potentially immunogenic.

Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-08-07T21:00:13Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Renata Mendes Batista de Oliveira.pdf: 13269360 bytes, checksum: f4d6a704989eec28f454bbe580dc3903 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-08-15T21:20:53Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Renata Mendes Batista de Oliveira.pdf: 13269360 bytes, checksum: f4d6a704989eec28f454bbe580dc3903 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-15T21:20:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Renata Mendes Batista de Oliveira.pdf: 13269360 bytes, checksum: f4d6a704989eec28f454bbe580dc3903 (MD5) Previous issue date: 2012-05-02 / CNPq / A dengue é a mais importante arbovirose que afeta o homem, constituindo um sério problema de saúde pública. O vírus causador pertence à família Flaviviridae, e são conhecidos quatro sorotipos (DENV 1-4), não oferecendo proteção cruzada entre si. As manifestações clínicas decorrentes da infecção por qualquer um dos sorotipos virais vão desde um quadro assintomático a um quadro mais grave da doença, denominado febre hemorrágica da dengue (FHD). Atualmente, quase metade da população mundial vive em áreas de risco da doença e, apesar de sua extensão e gravidade, vacinas ou tratamentos específicos ainda não estão disponíveis. A neutralização do vírus da dengue por um anticorpo específico consiste em uma importante ferramenta terapêutica. No presente trabalho, descrevemos, pela primeira vez, a produção de uma solução de imunoglobulina específica para o vírus da dengue (IgG anti-DENV), produzida a partir do plasma de doadores brasileiros. Esta preparação foi bioquimicamente caracterizada e os sorotipos de DENV quantificados por testes de neutralização. Também foram realizados ensaios pré-clínico, frente a animais infectados com o sorotipo DENV-3. Os resultados iniciais revelaram exacerbação da resposta à infecção, aumento da letalidade e aumento da carga viral, nos animais tratados com IGIV específica. Entretanto estes são resultados preliminares os quais serão investigados a hipótese de sua ocorrência, e a realização de novos testes com outros parâmetros terapêuticos, utilizando IgG anti- DENV em outras concentrações. / Dengue is the most importante arbovirus que infects human beings, and represents an important health problem. Dengue belongs to the Flaviviridae family, having four virus serotypes are known (DENV 1-4), which there is no crossed protection to each other virus serotype. Clinical signs of Dengue infection due to any of these virus serotypes can result to asymptomatic disease until the most severe infection, which is Dengue hemorrhagic fever (DHF). Despite the importance of Dengue infection to the health care, nowadays there no vaccines or specific nowadays. Virus neutralization by specific human antibody constitutes a reliable therapy. In light of this, we described here, for the first time, the production of human immunoglobulins specifics in neutralizing Dengue virus (IgG anti-DENV), purified from Brazilian blood-donations. These IgG were biochemically and biophysically characterized and the overall ratio of IgG serotypes (DENV) were estimated using a neutralizing virus screening in vitro. Once these IgG were characterized, we tested this material in mice infected by DENV-3 serotype. Although preliminary, the administration of IgG anti-DENV impaired mouse immune response, resulting in high virus titles and decreasing animal survive. However these are preliminary results which will investigate the possibility of its occurrence, and further testing with other therapeutic parameters, using anti-DENV IgG in other concentrations.

Orientador: Carlos Fernando S. Andrade / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T18:20:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_LucianaUrbanodos_M.pdf: 4510361 bytes, checksum: 0a5a452200effa839f1b5a1c677a9813 (MD5) Previous issue date: 1997 / Mestrado / Parasitologia / Mestre em Ciências Biológicas

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-11-20T11:26:09Z No. of bitstreams: 2 Tese - Solomar Martins Marques - 2013.pdf: 2691124 bytes, checksum: 04ee7837e335b7d3d617e5d8fe652956 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-11-20T11:26:37Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Solomar Martins Marques - 2013.pdf: 2691124 bytes, checksum: 04ee7837e335b7d3d617e5d8fe652956 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-20T11:26:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Solomar Martins Marques - 2013.pdf: 2691124 bytes, checksum: 04ee7837e335b7d3d617e5d8fe652956 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-04-26 / Introduction: In the 21st century, Brazil has become the country with the highest number of cases of dengue in the world, with a wide distribution of Aedes aegypti in all regions and simultaneous circulation of the four serotypes. The identification of the four serotypes is confirmed in Goiânia, which is among the municipalities and cities with the highest concentration of reported cases. Objective: To identify clinical and laboratory markers associated with complications and severe forms of dengue in Goiania, from 2001 to 2011. Methods: A case-control study in which the cases are severe forms (DHF and CCD) and the controls are patients with CD. Secondary data from the Information System for Notifiable Diseases (Sinan) was used, Brazilian Ministry of Health. Verification of consistency, checking and data analysis was performed by the SPSS 20.0 program. Results: 3359 patients aged under 15 years were laboratory confirmed as dengue, with 349 cases and 3010 controls. It did not differ by gender. It is noted an increased tendency to severity, over the years (X2 for trend = 19.03, p <0.0001). Regarding age, the greatest risk of severe forms strata was 5-9 years old (OR 2.32, 95% CI 1.28 to 4.03) and 10 to 14 years old (OR 2.08, 95% CI 1.50 to 2.89). Discussion: Abdominal pain, hypotension and hemorrhagic phenomena such as petechiae, epistaxis and gastrointestinal bleeding were significantly associated with severity after logistic regression. Regarding the laboratory tests available, hemoconcentration, thrombocytopenia and tourniquet test had statistically significant association with CCD and HDF. We identified 10 patients with neurological complications, including 2 deaths. Conclusions: detailed clinical assessment and collection of blood counts are strongly suggested for all patients in the pediatric age group. This study contributed to consolidate the classical signs and ordinary laboratories as important instruments in both the diagnosis, the prognosis of children and adolescents with dengue disease. / Introdução: No século 21, o Brasil se tornou o país com maior número de casos relatados de dengue no mundo, com ampla distribuição do Aedes aegypti em todas as regiões e circulação simultânea dos quatro sorotipos. Goiânia tem confirmada a identificação dos quatro sorotipos e se encontra entre os municípios e localidades com maior concentração de casos notificados. Objetivo: Identificar marcadores clínicos e laboratoriais associados a formas graves de dengue em menores de quinze anos de idade, na cidade de Goiânia, de 2001 a 2011. Métodos: estudo caso-controle, onde Casos são definidos como formas graves (DCC e FHD) e os Controles, pacientes com DC. Utilizados dados secundários do Sistema de Informação de Agravos de Notificação (Sinan). Feita verificação da consistência, checagem e análise de dados, pelo programa SPSS 20. Resultados: 3.359 menores de 15 anos foram confirmados laboratorialmente como dengue, sendo 349 casos e 3.010 controles. Não apresentaram diferenças quanto ao sexo. Nota-se incremento da tendência de gravidade, ao longo dos anos (X2 p/tendência= 19,03; p<0,0001). Quanto à idade, o maior risco de formas graves foi nos estratos de 5 a 9 anos (OR 2,32; IC95% 1,28 - 4,03) e 10 a 14 anos (OR 2,08; IC95%1,50 - 2,89). Discussão: Dor abdominal, hipotensão e fenômenos hemorrágicos como petéquias, epistaxe e sangramento gastrointestinal tiveram associação estatisticamente significante com gravidade após regressão logística. Respectivo aos exames laboratoriais disponíveis, hemoconcentração, plaquetopenia e prova do laço tiveram associação estatisticamente significante com FHD e DCC. Foram identificados 10 pacientes com complicação neurológica, sendo dois óbitos. Conclusões: avaliação clínica minuciosa e a coleta de hemograma são fortemente sugeridas em todos os pacientes na faixa etária pediátrica. Este trabalho contribuiu para consolidar os sinais clínicos clássicos e os laboratoriais básicos como importantes ferramentas auxiliares, tanto no diagnóstico, quanto no prognóstico de crianças e adolescentes com dengue.

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:55:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maria Raika.pdf: 1899808 bytes, checksum: 77cc709bf1d3f9b9a28dfa1611a631fa (MD5) Previous issue date: 2013-08-27 / Dengue disease is a serious public health problem in Brazil. There are four serotypes, DENV 1 to 4. In Brazil, all serotypes are circulating and are able to cause disease to humans, and may progress to a severe level, including death. Dengue transmission occurs by the bite of the female mosquito Aedes aegypti, widely distributed in tropical and subtropical countries. Brazil underwent a major epidemic in 1955 after which the disease was considered eradicated, causing disinterest among the medical community. The objective of this project was to trace the profile of cytokines in serum from patients with dengue in the city of Manaus. The immune response to dengue virus (DENV) and their serotypes has not yet been fully elucidated. Recently, studies demonstrated increased proinflammatory cytokines in patients infected with DENV-2, as IFN-γ, IL-6 and IL-17. However, the role of cytokines in the immune reponse Th1, Th2 and Th17 in dengue disease is still poorly understood. Tropical countries such as Brazil are conducive to a proliferation of vectors making it necessary to investigate the cytokine profile in the serum of patients with dengue, especially in a locality like Manaus. This study was a retrospective cross-sectional analytical component with cases of patients seen during the dengue epidemic in the Tropical Medicine Foundation of Amazonas Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT / HVD) in the period of January to December 2011, as well as negative controls from the Foundation of Hematology and Hemotherapy of the State of Amazonas (FHEMOAM). There were 90 serum samples, 60 from patients with dengue and 30 control patients divided into: Group I: negative control - blood donors (n = 30), Group II: positive control - DENGUE NOT SEVERE (n = 30) and Group III: positive control DENGUE SEVERE (n = 30). The diagnosis was made by viral protein NS1, dengue IgM serology, and finally the RT-PCR. The project was approved by the Ethics Committee of the Universidade do Amazonas (UFAM), n. 256-163 - CONEP. The dosages of IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ and IL17A were performed by flow cytometry (BD CBA Kit ® Biosciences). We used the nonparametric Kruskal-Wallis (P<0,05). The graphics were designed using Graphprisma ® software. In all quantified cytokines (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ and IL-17A and TNF-α) it was possible to evaluate that in dengue groups (severe and non-severe) they had concentrations increased and statistically significant when compared to the negative control group. There was no difference in these cytokines when comparing the severe and not severe groups. Observing the behavior of cytokine IL-10, there was a trend in increase when comparing patients from dengue group who progressed to severe dengue. This pioneer study in this field in the northern region enabled us to identify the profile of a group of cytokines and infer their involvement in the immune response in circulating serotypes in Manaus in 2011. / A dengue é uma doença considerada como problema de saúde pública no Brasil. São conhecidos quatro sorotipos virais: 1, 2, 3 e 4, que são denominados de DENV 1, 2, 3 e 4. No Brasil todos os sorotipos estão circulantes e são capazes de causar doença ao homem, podendo evoluir para quadros graves, inclusive óbito. A transmissão da dengue ocorre exclusivamente pela picada da fêmea do mosquito Aedes aegypti que se desenvolve amplamente em países tropicais e subtropicais. A resposta imunológica ao vírus da dengue (DENV) e seus sorotipos, ainda não está totalmente elucidada. Recentemente foi demonstrado aumento de citocinas pró-inflamatórias em pacientes infectados com DENV-2, entre os quais foram observados altos níveis séricos de IFN-γ, IL-6 e IL-17. No entanto, o papel das citocinas na resposta Th1, Th2 e Th-17 na dengue ainda é pouco compreendido. Sendo assim, o objetivo deste projeto foi traçar o perfil de citocinas no soro de pacientes com dengue na cidade de Manaus. Este estudo foi retrospectivo de caráter transversal com componente analítico de casos de pacientes atendidos durante a epidemia de dengue na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT / HVD) no período de Janeiro a Dezembro de 2011, bem como controles oriundos da Fundação (FHEMOAM). Foram utilizadas 90 amostras de soro, sendo 60 de pacientes com dengue e 30 de indivíduos separados em: Grupo I: controle negativo doadores de sangue (n= 30), Grupo II: controle positivo 1 DENGUE NÃO GRAVE (n= 30) e Grupo III: controle positivo 2 DENGUE GRAVE (n= 30). O diagnóstico foi feito por isolamento viral da proteína NS1, sorologia para dengue IgM, e finalmente o RT-PCR. O projeto foi aprovado no Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade do Amazonas UFAM sob parecer n0 256.163 via CONEP. As dosagens das citocinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ e IL17A foram realizadas pela técnica de citometria de fluxo (kit CBA da BD® Biosciences). A comparação de médias dos níveis séricos de citocinas foi realizada por meio do teste não paramétrico de Kruskall-Wallis (P < 0,05). Os gráficos foram elaborados utilizando o software Graphprisma®. Em todas as citocinas quantificadas (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ e IL-17A e TNF-α) foi possível avaliar que os grupos de dengue (grave e não grave) apresentaram concentrações aumentadas e estatisticamente significativas em relação ao grupo controle negativo. Não houve diferença entre as citocinas quando comparados o grupo de dengue grave com o de dengue não grave. Este estudo, pioneiro nessa linha na Região Norte, possibilitou identificar o perfil de um grupo de citocinas e inferir no seu envolvimento/relação na resposta imunológica aos sorotipos circulantes em Manaus no ano de 2011. Observando isoladamente o comportamento da citocina IL-10, houve tendência no seu aumento no grupo composto por pacientes que evoluíram para dengue grave quando comparado ao grupos dengue não grave.

A dengue é uma doença que afeta milhões de pessoas e possui um número significativo de mortes. Não há nenhum tratamento vacinal legalizado para uso. As estratégias vacinais contra a dengue baseadas em proteínas não estruturais têm demonstrado serem mais seguras do que as baseadas em proteínas estruturais. A proteína não estrutural 5 (NS5) do vírus dengue é a proteína mais conservada entre os quatro sorotipos e desempenha um papel crucial na replicação viral. Neste estudo, foi gerada uma forma recombinante da NS5 expressa em E. coli com propriedades antigênicas preservados. As condições de cultura foram optimizadas, o que permitiu a expressão dessa proteína na forma solúvel. A imunização de camundongos Balb/c com a NS5 sozinha ou em combinação com um adjuvante (poli (I:C)) promoveu o aumento da sobrevida de camundongos após desafio letal com DENV2. A combinação da NS5 com poli (I:C) emulsionado em Montanide 720 levou a expansão de linfócitos T CD8+ específicos. Os resultados indicam que a proteína NS5 obtida preserva determinantes antigênicos da proteína nativa e pode ser uma ferramenta útil para estudos sobre a biologia do DENV, busca de drogas antivirais e desenvolvimento de vacinas. / Dengue fever is a disease affecting millions of people worldwide and causing a significant number of deaths. There are no effective treatments or vaccine approaches capable of preventing such infection. Anti-DENV vaccine strategies based on nonstructural proteins as antigens have been shown to be safer than those based on structural proteins. The DENV nonstructural protein 5 (NS5), plays a crucial role in viral replication. In this study, we generated a recombinant form of DENV2 NS5 expressed in E. coli in high amounts and with preserved antigenic properties with regard to the native protein. Culture conditions were optimized in order to allow expression of NS5 as a soluble protein. The immunization of Balb/c mice using this protein alone or in combination with poly (I:C) led to increased survival after intracranial challenge with the DENV2 JHA1 strain. The combination of the protein with poly (I:C) emulsified in Montanide 720 led to the activation of NS5-specific CD8+ T lymphocytes. Altogether, the results indicate that the recombinant NS5 protein preserves antigenic determinants of the native protein and may be a useful tool for studies dealing with the DENV\'s biology, search for anti-viral drugs and vaccine development.