Submitted by Amauri Alves (amauri.alves@ufv.br) on 2015-11-04T12:14:30Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 583903 bytes, checksum: 2502ab1ef4041967c288e1621742e282 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-04T12:14:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 583903 bytes, checksum: 2502ab1ef4041967c288e1621742e282 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Neste estudo foram analisadas 100 amostras de sangue de cães com trombocitopenia importante (plaquetas < 100.000/μL), oriundas da rotina laboratorial de atendimento do Hospital Veterinário da Universidade Federal de Viçosa (UFV), Viçosa, Minas Gerais. Todas as amostras de sangue foram submetidas ao analisador hematológico automático, à confecção de esfregaços sanguíneos de sangue total, à capa de leucócitos e à técnica de centrifugação por gradiente de densidade. Além disto, as amostras foram submetidas à extração de DNA e posteriormente à reação em cadeia da polimerase (PCR), para o diagnóstico molecular de Ehrlichia spp., Hepatozoon sp., Babesia spp., Anaplasma spp. e Leishmania spp. Os resultados da PCR confirmaram amostras positivas para Ehrlichia spp. (69%), Hepatozoon sp. (25%), Babesia spp. (16%) e Anaplasma platys (4%), com alguns animais apresentando até três patógenos em coinfecção. Verificou-se ainda estreita relação entre a ocorrência da trombocitopenia e erliquiose e a alta frequência de coinfecções. A centrifugação por gradiente de densidade mostrou-se bastante sensível na identificação do Hepatozoon canis, com resultados superiores aos das técnicas tradicionais (esfregaço sanguíneo e capa de leucócitos) e concordância substancial com a PCR. Foram observadas diferenças significativas nos parâmetros sanguíneos entre os animais com e sem hematozoários, como a presença de desvio nuclear de neutrófilos à esquerda maior nos animais positivos para Babesia spp. e alterações no volume plaquetário médio e PDWc nos animais com erliquiose. No sequenciamento realizado, identificou-se a presença de várias espécies, incluindo Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, Hepatozoon canis, Babesia canis vogeli, Anaplasma platys, Anaplasma phagocytophilum e Rangelia vitalii, sendo os patógenos Ehrlichia chaffeensis e Anaplasma phagocytophilum relacionados a infecções em humanos. / In this study we analyzed blood samples from 100 dogs with important thrombocytopenia (Platelets < 100.000/μL), of the routine care of the Veterinary Hospital from Universidade Federal de Viçosa (UFV). All Samples were processed on automated hematology analyzer and subjected to analysis of their blood smears, buffy coat, and the density gradient centrifugation technique. In addition, samples were subjected to procedure for DNA extraction and subsequent polymerase chain reaction (PCR) to Ehrlichia spp., Hepatozoon sp., Babesia spp., Anaplasma spp. and Leishmania spp. The PCR results confirmed positive samples to Ehrlichia spp. (69%), Hepatozoon sp. (25%), Babesia spp. (16%) and Anaplasma platys (4%), with some animals having up to three concomitant pathogens. We also found a close relationship between the occurrence of thrombocytopenia and ehrlichiosis and the high frequency of coinfection. The density gradient centrifugation showed to be more sensitive at detecting Hepatozoon canis than traditional tecniques (blood smears, buffy coat) and the results are in agreement to those by PCR. Significant differences were observed in blood parameters between animals with and without hemoparasite, such as presence of a nuclear deviation of neutrophils on the left bigger in positive animals for Babesia spp. and changes in mean platelet volume and PDWc in animals with ehrlichiosis. In the sequencing performed we identified the presence of several species, including Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, Hepatozoon canis, Babesia canis vogeli, Anaplasma platys, Anaplasma phagocytophilum and Rangelia vitalii, being the Anaplasma phagocytophilum and Ehrlichia chaffeensis related pathogens infections in humans.

Streptococcus pneumoniae é a maior causa de doenças infecciosas invasivas. As vacinas conjugadas, ao contrário das vacinas polissacarídicas, se mostram eficazes na indução de uma resposta protetora em crianças menores de 2 anos de idade. Entretanto, apesar do sucesso na redução dos casos de doenças pneumocócicas, publicações recentes têm mostrado um aumento nos casos de doença por sorotipos de S. pneumoniae não inclusos nas vacinas conjugadas atualmente licenciadas. Com o objetivo de evitar a substituição dos sorotipos prevalentes e aumentar a cobertura vacinal, nosso projeto prevê a introdução de uma proteína de superfície do pneumococo como carreador em uma vacina conjugada. A Proteína de Superfície Pneumocócica A (PspA), por ser conservada entre diversos sorotipos e por sua alta imunogenicidade, foi escolhida para constituir o conjugado, juntamente com o Polissacarídeo Capsular de S. pneumoniae sorotipo 6B (PS6B), um sorotipo de elevada prevalência no Brasil. Também foi avaliada a influência de diferentes espaçadores entre a proteína carreadora e o PS sobre a resposta imune induzida. Estudos envolvendo diferentes condições reacionais tiveram como objetivo o estabelecimento de um protocolo de conjugação com elevado rendimento. A substituição do ativador EDAC (hidrocloreto de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida), comumente empregado na ativação do grupo carboxila da proteína, pelo DMT-MM (cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino) foi capaz de aumentar significativamente o rendimento reacional, o qual passou de menos de 10% para aproximadamente 50%. A proteção com formaldeído dos grupos lisinas da PspA aumentou a especificidade da reação de conjugação, com consequente aumento no rendimento reacional. A PspA modificada manteve a mesma estrutura secundária apresentada pela PspA nativa (análise por dicroísmo circular - CD) bem como sua imunogenicidade (título de anticorpos, capacidade de deposição de complemento e atividade opsonofagocítica). Apesar das análises por CD mostrarem que a conjugação alterou a estrutura secundária da PspA, ensaios imunológicos mostraram que essa desestruturação não afetou a sua capacidade de induzir uma resposta imune protetora. A resposta anti-PspA e anti-PS6B induzida pelo conjugado mostrou-se dose dependente, muito embora o PS6B tenha se comportado como um antígeno pouco imunogênico. / Streptococcus pneumoniae is the main cause of invasive infectious diseases. Unlike polysaccharide (PS) based vaccines, conjugate vaccines have shown to protect children less than 2 years old. However, regardless of the success in reducing pneumococcal disease, recent reports have shown an increase in the rate of disease caused by serotypes not included in licensed conjugate vaccines. In order to avoid serotype replacement, our project proposes to test a surface exposed pneumococcal protein as carrier. Pneumococcal Surface Protein A (PspA), a conserved protein among various serotypes, and highly immunogenic was chosen to take part in the conjugate together with the Polysaccharide Serotype B of Streptococcus pneumoniae (PS6B), a serotype of high incidence in Brazil. In this sense, studies involving different reactional conditions were aimed at stablishing a high yield conjugation protocol. Also, the influence of different spacer between carrier protein and polysaccharide were evaluated on immune response. The replacement of EDAC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride), usually used in the activation of protein carboxyl groups, to DMT-MM (4-[4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl]-4-methylmorpholinium chloride), was able to significantly increase the reactional yield from less than 10% to approximately 50%. The protection of lysines groups of PspA with formaldehyde increased conjugation specificity, with subsequent increase in reactional yield. Modified PspA maintained the same secondary structure of native PspA (circular dichroism analyses - CD) as well as its immunogenicity (antibody titers, deposition of complement and opsonophaghocytic activity). Despite circular dichroism analyses have shown changes in PspA secondary structure, immunological tests proved that this alteration did not affect its ability in inducing a protective immune response. Anti-PspA and anti-PS6B responses proved to be dose dependent, although PS6B acted as a poor immunogenic antigen in mice.

Poucos são os estudos acerca da saúde de onças-pintadas em vida livre. Visando obter melhores parâmetros para avaliação clínica desta espécie ameaçada de extinção, foram realizados exame clínico, hemograma, perfil bioquímico e acompanhamento de 10 onças-pintadas da região de Corumbá, no Pantanal do Mato Grosso do Sul. Além disso, buscando obter informações sobre o possível papel da espécie como suscetível, hospedeira ou sentinela de patógenos de importância em saúde pública e animal, amostras destas 10 onças foram testadas através de métodos sorológicos para verificar contato com vírus rábico, Rickettsia spp. e Ehrlichia canis. As amostras das onças e os carrapatos que as parasitavam no momento das capturas foram testados por reação em cadeia pela polimerase para a família Anaplasmataceae e os gêneros Rickettsia, Borrelia, Coxiella, Hepatozoon e Babesia. Este é o primeiro estudo a relatar os valores de hemograma e perfil bioquímico de uma população de onças-pintadas de vida livre. Dois animais, assintomáticos, apresentaram baixo título sorológico para o vírus da raiva, sugerindo contato da espécie com este patógeno. Todas as onças capturadas foram consideradas soropositivas para Rickettsia spp., e Rickettsia parkeri foi sequenciada a partir de um Amblyomma triste que estava parasitando um dos animais. Foi descoberta uma possível nova espécie do gênero Ehrlichia através do sequenciamento de DNA obtido de um Amblyomma triste e um Amblyomma cajenense que estavam parasitando onças. Quatro onças-pintadas foram consideradas soropositivas para Ehrlichia canis, possivelmente uma reação cruzada com esta outra espécie. Todas as onças-pintadas avaliadas neste estudo apresentaram DNA de Cytauxzoon sp., com 98% de similaridade a C. felis, em amostras sanguíneas. Todas as onças avaliadas neste estudo apresentaram DNA de Hepatozoon sp., com 98% de similaridade a H. felis, em amostras sanguíneas. As onças apresentavam boas condições de saúde geral. / Few studies have been conducted to investigate the health of free-ranging jaguars. In order to obtain better parameters for clinical evaluation of this endangered species, clinical exams, hemogram, biochemical tests and ecological monitoring were done for 10 jaguars in the Pantanal region - Corumbá City, Mato Grosso do Sul State. This project also evaluated the possible role of this species as susceptible, host or sentinel for pathogens of public and/or animal health importance, testing samples from these animals by serological methods to rabies virus, Rickettsia spp. and Ehrlichia canis. All samples and all ticks collected from the jaguars were also tested by polymerase chain reaction to the Anaplasmataceae family and the genera Rickettsia, Borrelia, Coxiella, Hepatozoon and Babesia. This is the first report of hemograms and biochemical profile of a free-ranging jaguar population. Two asymptomatic animals presented low seropositivity for rabies virus, suggesting contact with this pathogen. All jaguars were considered seropositive for Rickettsia spp., and Rickettsia parkeri was sequenced from an Amblyomma triste that was parasitizing one of the animals. A possible new species of the genus Ehrlichia has been identified by DNA sequencing obtained from an Amblyomma triste and an Amblyomma cajenense that were parasitizing jaguars. Four jaguars were considered seropositive for Ehrlichia canis, possibly a cross-reaction with this other species. All jaguars evaluated in this study presented DNA fragments of Cytauxzoon sp., 98% similarity to C. felis in blood samples. In addition, all jaguars presented DNA fragments of Hepatozoon sp., 98% similarity to H. felis in blood samples. In general, these jaguars presented good health.

A malária é a doença infecciosa mais prevalente em regiões tropicais e subtropicais e a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) com primers do 18S rRNA (4-8 cópias/parasito) no formato semi-nested ou nested-PCR são empregadas como referência. O genoma mitocondrial dos plasmódios é pequeno (6 kb) contendo três genes que codificam a enzima citocromo c oxidase I (cox I), a citocromo c oxidase III (cox III) e a citocromo b (cyt b), com número de cópias variando de 20-150/parasito. Esta pesquisa desenvolveu uma multiplex-PCR baseada na amplificação de cox I, cox III e cytb para a detecção simultânea de Plasmodium das espécies falciparum, vivax e malariae. A utilização de três pares de primers espécie-específicos, em uma única etapa de amplificação em lugar de uma nested-PCR (18S rRNA) poderia minimizar a ocorrência de contaminações (carry-over), reduzindo o custo das reações e o tempo para a liberação de resultados. A seleção dos primers empregou a estratégia ASO (Allele Specific Oligonucleotide), os amplificados das três espécies foram clonados e os plasmídeos contendo os insertos (controles positivos) foram usados em diluições seriadas determinar o limite de detecção que foi de 22,5 cópias para P. falciparum, 28,7 cópias para P. vivax e 32 cópias para P. malariae. Como cada parasito possui entre 20-150 cópias dos genes mitocondriais, a multiplex-PCR detectou 1 parasito das três espécies. Na etapa de validação, amostras antigas e recentes provenientes de regiões endêmicas foram testadas, todas com diagnóstico de gênero e espécie de Plasmodium. A multiplex-PCR foi mais sensível que a microscopia (gota espessa) quando 104 amostras foram testadas, e tão sensível quanto a semi-nested (n=60), a nested-PCR (n=6) e a PCR em Tempo Real (n=38). No entanto, na análise das espécies de Plasmodium, houve discordâncias da multiplex-PCR tanto em relação a gota espessa, quanto com a semi-nested-PCR principalmente na detecção de infecções mistas, havendo mais espécies detectadas pela semi-nested-PCR. Não houve discordâncias com a nested-PCR e a PCR em Tempo Real. Testes de especificidade da multiplex-PCR utilizando DNA de outros microrganismos e de doadores de banco de sangue não encontraram reações cruzadas (100% de especificidade). O estudo concluiu que a multiplex-PCR foi desenvolvida com sucesso, com especificidade de 100%, apresentando sensibilidade superior à gota espessa e equivalente à semi-nested-PCR, nested-PCR e PCR em Tempo Real, no entanto com discordâncias na identificação de espécies. Estudos prospectivos com amostras apresentando resultados discordantes nos testes moleculares de referência deverão ser testadas para avaliar se a nova ferramenta molecular possui sensibilidade superior. / Malaria is the most prevalent infectious disease in tropical and subtropical regions and the Polymerase Chain Reaction (PCR) based on the 18S rRNA sequence (4-8 copies/parasite) in semi-nested and nested-PCR formats are the reference tests. Plasmodium mitochondrial genome is small (6 kb) containing three genes encoding cytochrome c oxidase I (cox I), cytochrome c oxidase III (cox III) and cytochrome b (cyt b), with number of copies varying from 20-150/parasite. This research developed a multiplex-PCR based on the amplification of cox I, cox III and cytb for the simultaneous detection of Plasmodium falciparum, vivax and malariae. The use of three pairs of species-specific primers in a single amplification step rather than a nested-PCR (18S rRNA) could minimize the occurrence of carry-over, reducing the cost of reactions and the time to release of results. The selection of primers employed the ASO (Allele Specific Oligonucleotide) strategy. Amplification products of the three species were cloned and the plasmids containing the inserts (positive controls) were used in serial dilutions to determine the limit of detection (LoD) of 22.5 copies for P. falciparum, 28.7 copies for P. vivax and 32 copies for P. malariae. As each parasite has between 20-150 copies of the mitochondrial genes, the multiplex-PCR was able to detect 1 parasite of the three species. In the validation stage, old and recent samples from endemic regions were tested, all with diagnosis of genus and Plasmodium species. The multiplex-PCR was more sensitive than the thick blood smear when 104 samples were tested, and was as sensitive as the semi-nested (n=60), the nested-PCR (n=6) and the Real-Time PCR (n=38). However, in relation to Plasmodium species, there were disagreements of the multiplex-PCR with respect to both, the thick blood smear and the semi-nested PCR, mainly in the detection of mixed infections, with more species detected by the semi-nested-PCR. There were no disagreements with the nested-PCR and the Real-Time PCR. Multiplex-PCR specificity tests using DNA from other microorganisms and from blood bank donors found no cross-reactivity (100% specificity). The study concluded that the multiplex-PCR was successfully developed with specificity of 100%, presenting higher sensitivity than the thick blood smear and equivalent sensitivity to the semi-nested-PCR, the nested-PCR and the real-time PCR, however with disagreements in the identification of species. Prospective studies are needed to test the multiplex-PCR on samples with discordant results in reference molecular tests to assess whether the new molecular tool has superior sensitivity.

A leishmaniose visceral (LV) no Brasil é causada pela espécie Leishmania chagasi (L. infantum) e os cães são considerados o principal reservatório doméstico desse parasita. Portanto, o diagnóstico correto e seguro é muito importante para evitar a transmissão da doença ou o sacrifício desnecessário de cães. O objetivo deste trabalho foi avaliar o swab conjuntival (SC), um método não invasivo de amostragem, para o diagnóstico da LV canina por PCR-hibridização. Primeiramente, um teste in vitro foi delineado utilizando-se swabs contaminados com 103 até 1,0 célula de L. chagasi. Três métodos de extração de DNA foram testados: fenol-clorofórmio, kit Wizard e fervura. Em seguida, dois grupos de 23 cães soropositivos foram utilizados. Foram feitos esfregaços por SC em ambos os olhos de cada animal. A extração de DNA de SC foi realizada utilizando-se o método fenolclorofórmio no grupo 1 e a técnica de fervura no grupo 2. Além disso, sangue foi coletado de cada cão sendo que 30&#956;L foram aplicados em papel filtro (PF) e 1,0mL foi tratado para obtenção do anel leucocitário (AL). A purificação de DNA para PF e AL foi realizada da mesma forma em ambos os grupos utilizando-se kits comerciais. A análise de todas as amostras foi feita por PCR seguida de hibridização com sondas de DNA marcadas com 32P. O experimento com swabs contaminados com L. chagasi mostrou positividade na PCR para até 25, 10 e 1,0 célula pelos métodos da fervura, kit Wizard e fenol-clorofórmio respectivamente. A hibridização aumentou a sensibilidade para até 10 e 1,0 célula pelos métodos da fervura e kit Wizard respectivamente. As positividades da PCR para os cães do grupo 1 e 2 foram respectivamente: 73,9% e 52,2% (SC), 8,7% e 30,4% (AL), 8,7% e 17,4% (PF). A hibridização aumentou essas positividades para: 91,3% e 65,2% (SC), 21,7% e 34,8% (AL), 30,4% e 43,5% (PF) respectivamente. Os melhores resultados foram obtidos pela associação de SC com o método de fenol-clorofórmio para extração de DNA. O resultado final obtido desse tratamento foi estatisticamente diferente daqueles referentes ao AL e PF no grupo 1 (p<0,01). No grupo 2, o resultado final proveniente do SC associado com a técnica de fervura para o isolamento de DNA foi estatisticamente distinto apenas do resultado referente ao AL (p<0,05). Concluiu-se que a combinação de SC com a extração de DNA por fenol-clorofórmio é uma ferramenta valiosa para o diagnóstico da LV canina e pode ser recomendada para o diagnóstico em cães sintomáticos. / The visceral leishmaniasis (VL) in Brazil is caused by Leishmania chagasi (L. infantum) and dogs are considered to be the main domestic reservoir. Therefore the correct diagnosis is very important in order to avoid the disease transmission or unnecessary culling of dogs. The aim of this study was to evaluate the conjunctival swab (CS) as a noninvasive sampling method for the canine VL diagnosis by the PCR-hybridization procedure. Firstly, an in vitro test was carried out using cotton swabs seeded with 103 to one cell of L. chagasi. Three DNA purification techniques were tested: phenol-chloroform, Wizard kit and boiling. After that, two groups of 23 seropositive dogs were used. CS samples were obtained from both eyes of each animal. The DNA extraction from CS was performed by the phenol chloroform method in group 1 and by boiling in group 2. In addition, blood was collected from each animal so that 30&#956;L were spotted onto filter paper (FP) and 1.0mL was treated to obtain the buffy coat (BC). The DNA extraction from the BC and FP was accomplished by the same way in both groups using commercial kits. The analysis of all samples was made by PCR associated to the hybridization with 32P labeled DNA probes. The in vitro test with seeded parasites showed positivity to until 25, 10 and one cell for boiling, Wizard kit and phenol chloroform methods respectively. The hybridization step increased the sensitivity until 10 and one cell for the boiling and Wizard respectively. The PCR positivities for the dogs in groups 1 and 2 were respectively: 73.9% and 52.2% (CS), 8,7% and 30.4% (BC), 8.7% and 17.4% (FP). The hybridization step increased the positivities for: 91.3% and 65.2% (CS), 21.7% and 34.8% (BC), 30.4% and 43.5% (FP) respectively. The best frequency of positivity was obtained by the association between CS and the DNA extraction by phenol chloroform. The final result obtained from this treatment was statistically different from the BC and FP data in group 1 (p<0,05). In group 2, the result from CS associated with DNA purification by boiling was distinct only from the BC data (p<0,05). We conclude that the CS associated with the DNA extraction by phenol chloroform is a valuable tool for diagnosis of canine LV and can be recommended for diagnosis of symptomatic dogs.

A malária é a doença infecciosa mais prevalente em regiões tropicais e subtropicais e a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) com primers do 18S rRNA (4-8 cópias/parasito) no formato semi-nested ou nested-PCR são empregadas como referência. O genoma mitocondrial dos plasmódios é pequeno (6 kb) contendo três genes que codificam a enzima citocromo c oxidase I (cox I), a citocromo c oxidase III (cox III) e a citocromo b (cyt b), com número de cópias variando de 20-150/parasito. Esta pesquisa desenvolveu uma multiplex-PCR baseada na amplificação de cox I, cox III e cytb para a detecção simultânea de Plasmodium das espécies falciparum, vivax e malariae. A utilização de três pares de primers espécie-específicos, em uma única etapa de amplificação em lugar de uma nested-PCR (18S rRNA) poderia minimizar a ocorrência de contaminações (carry-over), reduzindo o custo das reações e o tempo para a liberação de resultados. A seleção dos primers empregou a estratégia ASO (Allele Specific Oligonucleotide), os amplificados das três espécies foram clonados e os plasmídeos contendo os insertos (controles positivos) foram usados em diluições seriadas determinar o limite de detecção que foi de 22,5 cópias para P. falciparum, 28,7 cópias para P. vivax e 32 cópias para P. malariae. Como cada parasito possui entre 20-150 cópias dos genes mitocondriais, a multiplex-PCR detectou 1 parasito das três espécies. Na etapa de validação, amostras antigas e recentes provenientes de regiões endêmicas foram testadas, todas com diagnóstico de gênero e espécie de Plasmodium. A multiplex-PCR foi mais sensível que a microscopia (gota espessa) quando 104 amostras foram testadas, e tão sensível quanto a semi-nested (n=60), a nested-PCR (n=6) e a PCR em Tempo Real (n=38). No entanto, na análise das espécies de Plasmodium, houve discordâncias da multiplex-PCR tanto em relação a gota espessa, quanto com a semi-nested-PCR principalmente na detecção de infecções mistas, havendo mais espécies detectadas pela semi-nested-PCR. Não houve discordâncias com a nested-PCR e a PCR em Tempo Real. Testes de especificidade da multiplex-PCR utilizando DNA de outros microrganismos e de doadores de banco de sangue não encontraram reações cruzadas (100% de especificidade). O estudo concluiu que a multiplex-PCR foi desenvolvida com sucesso, com especificidade de 100%, apresentando sensibilidade superior à gota espessa e equivalente à semi-nested-PCR, nested-PCR e PCR em Tempo Real, no entanto com discordâncias na identificação de espécies. Estudos prospectivos com amostras apresentando resultados discordantes nos testes moleculares de referência deverão ser testadas para avaliar se a nova ferramenta molecular possui sensibilidade superior. / Malaria is the most prevalent infectious disease in tropical and subtropical regions and the Polymerase Chain Reaction (PCR) based on the 18S rRNA sequence (4-8 copies/parasite) in semi-nested and nested-PCR formats are the reference tests. Plasmodium mitochondrial genome is small (6 kb) containing three genes encoding cytochrome c oxidase I (cox I), cytochrome c oxidase III (cox III) and cytochrome b (cyt b), with number of copies varying from 20-150/parasite. This research developed a multiplex-PCR based on the amplification of cox I, cox III and cytb for the simultaneous detection of Plasmodium falciparum, vivax and malariae. The use of three pairs of species-specific primers in a single amplification step rather than a nested-PCR (18S rRNA) could minimize the occurrence of carry-over, reducing the cost of reactions and the time to release of results. The selection of primers employed the ASO (Allele Specific Oligonucleotide) strategy. Amplification products of the three species were cloned and the plasmids containing the inserts (positive controls) were used in serial dilutions to determine the limit of detection (LoD) of 22.5 copies for P. falciparum, 28.7 copies for P. vivax and 32 copies for P. malariae. As each parasite has between 20-150 copies of the mitochondrial genes, the multiplex-PCR was able to detect 1 parasite of the three species. In the validation stage, old and recent samples from endemic regions were tested, all with diagnosis of genus and Plasmodium species. The multiplex-PCR was more sensitive than the thick blood smear when 104 samples were tested, and was as sensitive as the semi-nested (n=60), the nested-PCR (n=6) and the Real-Time PCR (n=38). However, in relation to Plasmodium species, there were disagreements of the multiplex-PCR with respect to both, the thick blood smear and the semi-nested PCR, mainly in the detection of mixed infections, with more species detected by the semi-nested-PCR. There were no disagreements with the nested-PCR and the Real-Time PCR. Multiplex-PCR specificity tests using DNA from other microorganisms and from blood bank donors found no cross-reactivity (100% specificity). The study concluded that the multiplex-PCR was successfully developed with specificity of 100%, presenting higher sensitivity than the thick blood smear and equivalent sensitivity to the semi-nested-PCR, the nested-PCR and the real-time PCR, however with disagreements in the identification of species. Prospective studies are needed to test the multiplex-PCR on samples with discordant results in reference molecular tests to assess whether the new molecular tool has superior sensitivity.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-10-18T12:20:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AtividadeAntiplasmodialModelagem.pdf: 2404946 bytes, checksum: f50c8e09794716ea2356ae20dc9b113b (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-11-03T14:56:45Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AtividadeAntiplasmodialModelagem.pdf: 2404946 bytes, checksum: f50c8e09794716ea2356ae20dc9b113b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-03T14:56:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AtividadeAntiplasmodialModelagem.pdf: 2404946 bytes, checksum: f50c8e09794716ea2356ae20dc9b113b (MD5) Previous issue date: 2008 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A malária é uma infecção causada pelo Plasmodium sp. e pode ser grave, se não tratada precocemente. Ela acomete importante fração da humanidade e tem profundo impacto sanitário mundial. Estima-se que 3,3 bilhões de pessoas estejam expostas ao risco de transmissão. Um dos problemas inerentes à infecção é o progressivo aumento da resistência do parasito aos antimaláricos. Nesse contexto, fazem-se necessários estudos para o desenvolvimento de novas alternativas quimioterápicas. Muitas substâncias têm atividade antiplasmodial comprovada, como as chalconas. Entretanto, as propriedades fisico-químicas dessas moléculas, que são importantes para suas ações biológicas, não estão bem estabelecidas. Neste trabalho, foi realizada a modelagem molecular e avaliada a atividade antiplasmodial de duas chalconas (HBR1 e LH2) e quatro derivados de chalconas (GH3, IV4, LCH1 e LCH3). Para isso, foram determinadas: as concentrações inibitórias em 50% do crescimento do P. falciparum in vitro e as propriedades físico-químicas das substâncias, como HOMO, LUMO, potencial eletrostático, C log P, energia de hidratação, polarizabilidade e volume molecular, através de cálculos virtuais. Os resultados dos valores calculados foram correlacionados com a atividade biológica, a fim de se identificar parâmetros químicos que possam influenciar a ação antiplasmodial. As concentrações inibitórias em 50% do crescimento do P. falciparum variaram de 0,2 a 1,7 μM, sendo que estes valores foram menores do que os descritos na literatura. O estudo da correlação entre as atividades biológicas e as propriedades fisico-químicas mostraram parâmetros determinantes de atividade biológica, como LUMO, potencial eletrostático, C log P e energia de hidratação, que podem auxiliar na seleção de moléculas mais ativas contra o P. falciparum. Assim, essas propriedades moleculares podem ser utilizadas no planejamento racional de novas chalconas e/ou derivados com atividade antiplasmodial. / Malaria is an infection caused by Plasmodium sp. and It can be serious, if not treated precociously. It affects significant fraction of humanity and has profound health impact worldwide. It is estimated that 3.3 billion people are exposed to the risk of transmission. One of the problems of the infection is the growing emergence of parasite resistance to antimalarial drugs. In this context, studies are needed to develop new alternative chemotherapy. Many substances, such as the chalcones, have had their antiplasmodial activity proven. However, the physicochemical properties of these molecules, which are important for biological actions, are not well established. In this work, molecular modeling was performed and the antiplasmodial activity was evaluated of two chalcones (HBR1, and LH2) and four derivatives of chalcones (GH3, IV4, LCH1, and LCH3). For that, we determined the drug concentration inhibitory of 50% of the growth of P. falciparum in vitro as well as the physicochemical properties of derivatives of chalcones as HOMO, LUMO, electrostatic potential, C log P, hydration energy, polarizability and molecular volume through virtual calculations. The results of the calculated values were correlated with the biological activity in order to identify chemical parameters that can influence the antiplasmodial action. The inhibitory concentrations in 50% of the growth of P. falciparum ranged from 0,2 to 1,7 M, and these values were smaller than described them in the literature. The study of the correlation between the biological activities and the physicochemical properties showed determinating parameters for the biological activity, as LUMO, electrostatic potential, C log P and hydration energy, which may help in the selection of molecules more active against P. falciparum. Thus, these molecular properties can be used in the rational planning of new chalcones and/or derivatives with antiplasmodial activity.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-10-18T16:04:54Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AvaliacaoFuncoesNeurologicas.pdf: 2607715 bytes, checksum: fc59c0313010dbe1d99be8952a633716 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-12-01T13:38:39Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AvaliacaoFuncoesNeurologicas.pdf: 2607715 bytes, checksum: fc59c0313010dbe1d99be8952a633716 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-01T13:38:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AvaliacaoFuncoesNeurologicas.pdf: 2607715 bytes, checksum: fc59c0313010dbe1d99be8952a633716 (MD5) Previous issue date: 2016 / Apesar de curável, a hanseníase ainda representa um relevante problema de saúde pública. Trata-se de uma doença infecciosa crônica causada pelo Mycobacterium leprae e caracterizada por acometimento dermatoneurológico, que quando não tratado adequadamente pode levar a graves incapacidades. A avaliação das funções neurológicas do paciente é de relevante importância para o diagnóstico precoce e tratamento das lesões dos nervos periféricos. Tendo em vista a quantidade de exames subjetivos presentes na avaliação neurológica do hanseniano e preocupando-se com a sua consistência em mostrar, de forma fidedigna, a situação dos pacientes, este estudo busca correlacionar as queixas clínicas apresentadas pelos hansenianos com os achados sensitivos e motores de membros superiores e inferiores. Para isso, foi realizado um estudo do tipo transversal analítico composto de duas etapas. A primeira etapa contou com 97 hansenianos, atendidos no serviço entre os anos de 2014 e 2015, neles foi aplicada a avaliação neurológica simplificada, na qual foram feitos o exame de palpação de nervos, teste de força muscular, teste de sensibilidade tátil em mãos e pés com monofilamentos de Semmes-Weinstein, além da coleta da queixa clínica. Para a segunda etapa foram selecionados aleatoriamente 14 pacientes, que foram submetidos também aos testes de sensibilidade superficial (térmica, dolorosa e tátil) no trajeto dos nervos mais comumente afetados. Para análise dos dados foram utilizados o teste de Qui-quadrado, teste G e teste t, quando pertinentes à comparação com o esperado para população ou entre grupos. Para correlação de variáveis ordinais o teste correlação de Spearman, considerando-se o nível alfa de significância igual a 0,05. Dos 97 hansenianos, 77 (79,4%) apresentaram queixas, sendo as mais comuns aquelas relacionadas às fibras sensoriais, entre elas dor e dormência foram as mais referidas. À palpação, o nervo ulnar e o tibial foram os mais acometidos e os pacientes multibacilares apresentaram maiores médias de nervos acometidos e maior dano sensitivo. O dano motor não foi muito comum entre os pacientes, mas os baixos índices de força muscular encontrados foram relacionados com estágios de dano sensitivo mais elevados, maior grau de incapacidade e maior quantidade de nervo acometida. Quando comparados quanto à ocorrência de queixa, os pacientes queixosos apresentaram estágios de dano sensitivo mais avançados, grau de incapacidade mais elevado em membros inferiores e ocorrência de dano motor com maior freqüência, porém o tipo de queixa não influenciou esses resultados. Na avaliação da sensibilidade superficial no trajeto do nervo, observou-se uma maior ocorrência de alterações sensitiva também entre os queixosos, sendo a térmica a mais afetada. Percebe-se, então, que os pacientes queixosos estão mais sensíveis aos danos sensitivo e motor, ao elevado grau de incapacidade, e à alteração de sensibilidade em trajeto de nervo. Portanto, os profissionais de saúde devem ficar atentos com este grupo de paciente, destinando maior atenção no momento da avaliação a fim de evitar as temidas incapacidades. / Although curable, leprosy is still a major public health problem. This is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae and characterized by dermatological and neurological involvement. If not treated, this disease can lead to serious disability. The evaluation of the neurological function of the patient is very important for the early dignosis and treatment of nerves damage. The exams in neurological evaluation of leprosy are too subjective. This study, worrying about the consistency of neurological evaluation in showing in a reliable manner the situation of patients, aims to correlate the clinical complaints from leprosy patients with sensory and motor findings in upper and lower limbs. For this, an analytical cross-sectional study was conducted in two steps. The first stage included 97 leprosy patients treated at the service between the years 2014 and 2015, in them was applied the simplified neurological evaluation, which was made the examination of nerve palpation, voluntary muscle strength test, tactile sensitivity test at hand and feet with Semmes-Weinstein, in addition to the collection of clinical complaints. For the second stage were randomly selected 14 patients who were submitted to surface sensitivity tests (thermal, painful and tactile) in the path of the most commonly affected nerves. Data analysis was performed using the chi-square test, G test and t test, when relevant to the comparison with the population or between groups. For correlation ordinal variables the Spearman correlation test, considering the alpha significance level of 0.05. Of the 97 leprosy patients, 77 (79.4%) had complaints, the most common being those related to sensory fibers, including pain and numbness were the most mentioned. On palpation, the ulnar nerve and tibial were the most affected and multibacillary patients had higher averages of affected nerves and most sensitive damage. Engine damage was not very common among patients, but low levels of muscle strength found were related to higher sensory damage stages, higher degree of disability and greater amount of affected nerve. When compared to the occurrence of complaint, the complainants patients had more advanced stages of sensory damage, higher degree of disability in the lower limbs and motor damage occurring more frequently, but the type of complaint did not influence these results. In the evaluation of the surface sensitivity in the nerve pathway, there was a higher incidence of sensory changes also among the plaintiffs, and the heat the most affected. It is clear, then, that the complainants patients are more sensitive to sensory and motor damage, the high degree of disability, and the sensitivity of changes in nerve path. Therefore, health professionals should be alert to this patient group, allocating more attention at the time of evaluation in order to avoid the dreaded disabilities.

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:06:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Shirley.pdf: 2487120 bytes, checksum: 840010088c8c6cc034faf3bb463fd6dd (MD5) Previous issue date: 2009-03-31 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Oral candidosis is an infection disease caused mainly by Candida albicans, normal commensal yeast in oral cavity of healthy individuals. The aim of this study was determine the prevalence of different species of Candida in patients of Basic Unit of Healthy (UBS)/SEMSA in Manaus city/Amazon state/Brazil, that wearing denture or present natural teeth. This transversal study was performed by analysis of oral mucosa samples. The samples were collected of 594 patients in ten UBS s and were cultured in Petri dishes containing Sabouraud Dextrose Agar with chloramphenicol and direct analysis (Gram method). The yeasts were submitted to biochemical identification with Candifast® (International Microbio) and morphological study on Corn Meal Tween 80 Agar. C. dubliniensis identification was carried out by primer-specific amplification. The analysis of the results was made by measurements of frequencies, average, median, standard deviation and confidence limits and also was used Student s t method, ANOVA tests, Pearson chi-square and Fischer Exact test. The data were analyzed by Epi-Info software, version 3.5. In the total 594 patients taken, 436 were women and 158 were men of ten UBS-SEMSA, with the average age of 32.5 ±11.6 years old. Candida species occurred in 50% of patients. C. albicans was the most prevalent species followed by C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei, C. kefyr e C. glabrata. Factors like gender, age, medical treatment and use of medication were directly associated with the presence of Candida in oral cavity. In the patients taken, 188 wearing denture, with 75% of prevalence of Candida and present a significant statistical difference (p<0.05). It was confirmed, by PCR, the identity of 113 samples for C. albicans and 28 samples were identified as C. dubliniensis. We concluded that the prevalence of species of Candida in patients wearing denture, as well as individuals with natural teeth, was the same that observed in other regions of Brazil and other countries. The data suggested the specifics oligonucleotides CdF/CdR and CaF/CdR, used in this work, were effective to confirm C. albicans species and efficient to identification of C. dubliniensis species from theses isolates. / A candidíase oral é uma doença infecciosa causada geralmente pela Candida albicans, habitante comum da cavidade bucal de pessoas sadias. O objetivo deste estudo foi determinar a prevalência das diferentes espécies de Candida em pacientes atendidos nas Unidades Básicas de Saúde/SEMSA na cidade de Manaus/AM, usuários ou não de prótese dentária. Foi realizado um estudo transversal pela análise de amostras de Candida da cavidade oral. As amostras foram coletadas de 594 pacientes atendidos em 10 UBS s e cultivadas em placas de Petri contendo Ágar Sabouraud Dextrose com clorafenicol e feito exame direto (método de Gram). As leveduras foram submetidas à identificação bioquímica utilizando-se o Kit Candifast® e estudo morfológico com microcultivo em ágar fubá com Tween 80. A identificação de C. dubliniensis foi feita com primer espécie-específico. A análise dos resultados foi realizada através de medidas de freqüências, média, mediana, desvio-padrão e intervalo de confiança e utilizados os testes t de Student, ANOVA, qui-quadrado de Pearson e exato de Fisher. Os dados foram armazenados e analisados utilizado o software Epi-Info versão 3.5. Das 594 pessoas participantes, 436 são do gênero feminino e 158 do gênero masculino, com média de idade de 32,5 ± 11,6. Culturas positivas para Candida foram observadas em 50% dos pacientes. C. albicans foi a espécie mais prevalente seguida pela C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei, C. kefyr e C. glabrata. Fatores como gênero, idade, tratamento médico e uso de medicamentos foram diretamente associados com a presença de Candida na cavidade oral. Do total de pacientes, 188 usavam prótese dentária, com prevalência de Candida de 75%, com diferença estatística significante (p < 0,05). Foi confirmada por PCR a identidade de 113 amostras de C. albicans e identificados 28 isolados de C. dubliniensis. Podemos concluir que a prevalência das espécies de Candida tanto em pacientes usuários de prótese como em indivíduos com dentição natural foi semelhante a prevalência encontrada em outras regiões do Brasil e outros países. Os dados sugerem, ainda, que oligonucleotídeos específicos CdF/CdR e CaF/CdR, utilizados neste estudo, foram efetivos para confirmar isolados de C. albicans e eficientes para identificar C. dubliniensis a partir desses isolados.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-10-20T16:22:11Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - José Alberto Alvarenga - 2008.pdf: 340716 bytes, checksum: e24f369f53383dc817cf234c17729275 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2014-10-20T17:09:06Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - José Alberto Alvarenga - 2008.pdf: 340716 bytes, checksum: e24f369f53383dc817cf234c17729275 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-20T17:09:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - José Alberto Alvarenga - 2008.pdf: 340716 bytes, checksum: e24f369f53383dc817cf234c17729275 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2008-08-25 / It is estimated that until the year 2020, in Brazil, 13 % of the population will be constituted by the elderly (population who are above 60 years old), counting 30 million people. The frequency and the gravity of the infectious diseases spread with age. Among these days, infectious diseases are the third cause of death after the sixty’s. The physical changes and the lack of immunological response in the elderly worsen day after day, favoring the infections’ gravity. Moreover, chronic diseases treated with immunosuppressor drugs and other, repeated hospitalizations and nutritional deficiency are addictive factors which explain this kind of diseases to grow worse in this specific population. This dissertation is about a retrospective essay with a descriptive analysis raising medical documents from patients with infectious meningitis in the Hospital de Doenças Tropicais (HDT), State of Goiás, Brazil, and aimed to evaluate the epidemiologic and clinical profile of the infectious meningitis in the elderly, the level of clinical suspicion and confirmation in health services in our State. About 110 cases of meningitis in elderly were notified between the years 2000 and 2006. From all cases, 64 (58,71%) were confirmed, 64,0% of non-specified infection meningitis, 14,06%, fungus meningitis (4,68%), pneumococcol meningitis (12,5%), tuberculosis meningitis (3,12%) and meningococcal meningitis(1,5%). The mortality was higher in non-specified meningitis (65,21%), and fungus, tuberculosis and pneumococcol meningitis presented the highest lethality. The long period between the clinical suspicion of meningitis, with 6,41 days until the diagnose was confirmed, delayed treatment and surely contributed to raise the number of the infections and deaths. The unsuitable medical graduation in elderly’s support has delayed diagnose, extending the interval between the beginning of the symptoms and the effective treatment, and so on, increasing the mortality index of this population. The proposal of this essay is to build a preferable attendance service for the elderly, with basic knowledge in infectious diseases in this particular population, favoring the fast diagnose and the effective treatment in order to reduce the mortality in this age group. / No Brasil estima-se que até o ano 2020 a população de idosos deva chegar a 30 milhões de pessoas (13% do total) e a esperança de vida alcançará 70,3 anos. A frequencia e a gravidade das doenças infecciosas aumentam com o envelhecimento e hoje representam a terceira causa de morte após os 60 anos. As alterações fisiológicas e a queda da função nos órgãos de resposta imune do idoso acentuam-se progressivamente, favorecendo a superveniencia das infecções. Além disso, as moléstias cronicas associadas ao tratamento com imunossupressores e outras drogas, as hospitalizações repetidas e a deficiencia nutricional são fatores suplementares que explicam a elevada freqüência das moléstias infecciosas nesta faixa etária. O objetivo do estudo foi avaliar o perfil clínico e epidemiológico das meningites infecciosas na população idosa, o nível de suspeição e de confirmação diagnóstica nos serviços de saúde do Estado de Goiás, mediante análise dos registros de prontuários de pacientes portadores de meningites infecciosas, internados no Hospital de Doenças Tropicais – (HDT) do Estado de Goiás, Brasil, referência regional para doenças transmissíveis. No período de 2000 a 2006 foram internados 110 pacientes com suspeita de meningite, sendo a doença confirmada em 64 (58,71%), de acordo com os critérios do SINAN-MS. Predominaram as meningites bacterianas não especificadas (64,02%), seguindo-se a pneumocócica (14,06%), viral (12,5%), as fúngicas (4,68%), a tuberculosa (3,12%) e a meningocócica (1,56%). O maior número de mortes ocorreu nas meningites não especificadas (65,21%). As meningites tuberculosas, fúngicas e pneumocócica apresentaram maior letalidade. Observou-se um período entre o início do quadro clínico e a confirmação do diagnóstico (média de 6,4 dias) nos pacientes do interior, situação que resultou em retardo na instituição do tratamento antimicrobiano adequado e em maior letalidade. Os dados do presente estudo mostram que o atendimento à saúde pouco voltado para os idosos resulta em delonga no diagnóstico e na instituição da terapeutica antimicrobiana adequada, responsáveis pela elevada mortalidade por doenças infecciosas nos idosos, destacadamente as meningites. Daí a necessidade de se construir uma rede de atendimento preferencial a pacientes idosos, com pessoal qualificado em doenças infecciosas, com vistas a diminuir o drástico impacto destes agravos nos idosos.