O experimento foi conduzido com o objetivo de avaliar a influência da interação entre o nitrato de amônio e nitrato de potássio sobre as respostas morfogênicas de embriões somáticos de pupunheiras in vitro a fim de otimizar o protocolo de micropropagação da espécie. As concentrações utilizadas foram 0, 825, 1650, 2475 e 3300 mg L-1 de nitrato e amônio e 0, 950 , 1900, 2850 e 3800 mg L-1 de nitrato de potássio, combinadas entre si, perfazendo um total de 25 tratamentos. Os tratamentos foram preparados a partir da solução completa de Murashige e Skoog, devidamente modificado para as proporções desses íons no suprimento de nitrogênio. Utilizaram-se duzentos e cinqüenta embriões somáticos com características morfológicas homogêneas, isentos de raízes e folhas, obtidos a partir de microplantas mantidas em sala de crescimento com temperatura e luminosidade controladas. Foram aferidos dados do comprimento da parte aérea e da raiz, o número de raízes, brotações e folhas, a porcentagem de ramificação da raiz, a porcentagem de raízes finas, medianas e grossas, em quatro períodos de cultura, a cada 60 dias, totalizando 240 dias de cultivo. Ao final desse período, avaliou-se também o teor de proteínas totais solúveis, o teor de clorofila pelo índice SPAD e os teores de macro e micronutrientes nas microplantas. Utilizou-se delineamento estatístico inteiramente casualizado e os dados foram submetidos ao teste de Bartlett a 5% e análise de variância (ANOVA) a 1% e 5% de probabilidade de erro ou foi elaborada uma matriz de correlação de Pearson a 1% e 5% de probabilidade de erro, conforme o caso. Os resultados permitiram inferir que aos 240 dias de cultivo as microplantas passam a investir mais em formação de parte aérea e aumentam a porcentagem de raízes finas, e funcionais. Os tratamentos que melhor favoreceram a formação de proteínas foram aqueles com concentração de 2475 mg L-1 de NH4NO3 ou com 2850 mg L-1 de KNO3. Os maiores índices SPAD ocorreram nos tratamentos com até 1650 mg L-1 de NH4NO3 combinado com até 1900 mg L-1 de KNO3. Diferentes combinações dos sais de NH4NO3 e KNO3 podem favorecer a absorção de cada nutriente. Conclui-se que os resultados obtidos no trabalho podem contribuir com a melhoria do protocolo de micropropagação de B. gasipaes, na medida em que permitem estabelecer o melhor tratamento para maximização de uma resposta específica desejada para cada momento do processo de cultivo dos embriões somáticos de pupunheiras, como enraizamento, crescimento da parte aérea, formação de proteínas e formação de brotações, facilitando dessa forma a otimização da produção de microplantas com características desejáveis e, conseqüentemente, sua aclimatização e desenvolvimento ex vitro. / This study aimed to evaluate the influence of the interaction between ammonium nitrate and potassium nitrate on the morphogenetic responses of peach palm somatic embryos in vitro cultivated, to optimize the micropropagation protocol for this species. The concentrations used were 0, 825, 1650, 2475 and 3300 mg L-1 of ammonium nitrate and 0, 950 , 1900, 2850 and 3800 mg L-1 of potassium nitrate, in all possible associations, totalizing 25 treatments. The treatments were prepared with the complete solution of Murashige and Skoog, with modified proportions of these ions in relation to the nitrogen supply. Two hundred and fifty somatic embryos with homogeneous morphological characteristics, without roots and leaves, obtained from microplants from a controlled temperature and luminosity room, were used in the experiment. Every 60 days, during 240 days, the length of shoot and root, the number of roots, propagules and leaves and the root architecture were measured. At the end of 240 days of cultivation, it was also analyzed the total soluble proteins, the foliar chlorophyll by a chlorophyll meter equipment (SPAD-502) and the macronutrients and micronutrients concentrations in the microplants. The experiment was conducted in a randomized design. The data were subjected to Bartlett´s test at 5% and variance analysis (ANOVA) at 1% and 5% of probability of error, or it was made a correlation matrix at 1% and 5% of probability of error, according to each analysis. The results showed that at 240 days of cultivation the microplants spent more energy building the shoot part and raised the percentage of thin, functional root. The best treatments for proteins formation were those with 2475 mg L-1 of NH4NO3 or with 2850 mg L-1 of KNO3. The highest SPAD index occurred in the treatments with at most 1650 mg L-1 of NH4NO3 associated with at most 1900 mg L-1 of KNO3. Different associations of NH4NO3 e KNO3 may favor the absorption of each nutrient. We conclude that the results obtained may contribute to the optimization of the B. gasipaes micropropagation protocol, as it is possible to establish the best treatment for maximization of a specific answer for each moment of the somatic embryos cultivations process, such as rooting, shoot growth, propagules and protein formation, and thus increase the optimization of microplants production with wanted characteristics and hence its acclimatization and ex vitro development.

A Araucaria angustifólia é uma conífera nativa do Brasil que apresenta sementes recalcitrantes. Devido a sua importância econômica, foi intensamente explorada ao longo dos anos, encontrando-se atualmente classificada como espécie em perigo crítico de extinção pela International Union for Conservation of Nature. A embriogênese somática apresenta-se como uma ferramenta biotecnológica de grande valia na propagação de espécies recalcitrantes e de difícil propagação, com aplicação em programas de conservação, reflorestamento, e melhoramento genético vegetal. Estudos comparativos dos processos de embriogênese somática e zigótica têm permitido o conhecimento dos fatores bioquímicos, fisiológicos e genéticos que controlam o desenvolvimento do embrião, e o estabelecimento as condições artificiais para o correto desenvolvimento embrionário in vitro. O objetivo deste trabalho foi estudar a participação do ácido salicílico como sinalizador do processo de embriogênese zigótica e somática em A. angustifólia. Para tanto foi determinado o conteúdo de ácido salicílico livre e conjugado ao longo da embriogênese zigótica, e o efeito de sua suplementação em culturas embriogênicas com diferentes potenciais para a maturação. Para a embriogênese somática, a presença do ácido salicílico foi correlacionada com a geração de óxido nítrico e espécies reativas de oxigênio , e com a expressão do gene \"Somatic Embryogenesis Receptor Kinase\" (AaSERK). Os resultados obtidos demonstram que: a) ocorre um maior conteúdo de ácido salicílico na forma livre e conjugada nas etapas iniciais da embriogênese zigótica; b) a suplementação de ácido salicílico, nas concentrações de 0,5 a 2 mM, inibiram a indução de culturas embriogênicas; c) culturas embriogênicas incubadas em ácido salicílico apresentaram redução da síntese endógena de espécies reativas de oxigênio e aumento no conteúdo de óxido nítrico; d) a redução de espécies reativas de oxigênio indicou uma relação dose dependente com o ácido salicílico; e) a adição de um doador de óxido nítrico e um sequestrador inibiram a produção de espécies reativas de oxigênio; f) a expressão do gene AaSERK atingiu o maior nível no período de quatro horas de incubação em 0,1 mM de AS / Araucaria angustifolia is a conifer native of Brazil with recalcitrant seeds. Due to its economic importance, the exploration has been extensively over the years, currently this specie is classified as critically endangered by the International Union for Conservation of Nature. Somatic embryogenesis is presented as a biotechnological tool of great value in the propagation of recalcitrant species and difficult to spread, with applications in conservation, reforestation programs, and plant breeding. Comparative studies of the processes of zygotic and somatic embryogenesis has allowed the knowledge of biochemical, physiological and genetic factors that control embryo development, and the establishment artificial conditions for proper embryonic development in vitro. The objective of this work was to study the role of salicylic acid as a marker of zygotic embryogenesis and somatic process in A. angustifolia. Thus, we determined the content of free salicylic acid and conjugated along the zygotic embryogenesis, and the effect of their supplementation with different potential embryogenic cultures for maturation. For somatic embryogenesis, the presence of salicylic acid was correlated with the generation of nitric oxide, reactive oxygen species and in the gene expression \"Somatic embryogenesis Receptor Kinase\" (AaSERK). The results show that: a) there is an increased content of salicylic acid in free and conjugated form in the initial stages of zygotic embryogenesis; b) salicylic acid supplementation, in concentrations from 0.5 to 2 mM, inhibited the induction of embryogenic cultures; c) embryos incubated in salicylic acid decreased endogenous synthesis of reactive oxygen species and increase in content of nitric oxide; d) the reduction of reactive oxygen species indicated a dose-dependent relationship with salicylic acid; e) the addition of a nitric oxide donor and a kidnapper inhibited the production of reactive oxygen species; f) the expression of the gene AaSERK reached the highest level in four hours of incubation in 0.1 mM AS

Nos últimos anos, nós propusemos um modelo de duas etapas para a padronização antero-posterior do coração. Ácido retinóico (AR) produzido pela enzima RALDH2 induz o destino sino atrial nos precursores cardíacos posteriores. Subsequentemente, estes precursores adquirem a capacidade de expressar RALDH2, formando uma onda caudo-rostral desta enzima. A nossa hipótese é que esta onda surgiu nos para padronizar as células precursoras da bomba circulatória ancestral em regiões de influxo e efluxo, resultando na origem das câmaras cardíacas. Para testar se a onda cauro-rostral é ancestral nos vertebrados, nós mapeamos a expressão de RALDH2 em relação ao campo cardíaco em anfíbios, vertebrados basais e no cordado invertebrado anfioxo. Nossos dados sugerem que o modelo de duas etapas está presente em anfíbios e peixes. Clonagem do gene RALDH em lampréias indica presença de AR no campo cardíaco. Em anfioxo, a caracterização do padrão de expressão do ortólogo da RALDH2 revela ausência da onda caudo-rostral. Nossos resultados sugerem que a onda caudo-rostral de RALDH2 foi cooptada nos vertebrados para padronizar o campo cardíaco no eixo AP, o que corrobora a hipotése de que este mecanismo foi importante na origem evolutiva das câmaras cardíacas. / In the last years, we have proposed a 2-step model for the establishment of cardiac chamber identities. Retinoic acid (RA) produced by its synthetic enzyme RALDH2, induces an atrial fate in posterior cardiac precursors of amniote embryos. Subsequently, a RALDH2 caudorostral wave engulfs posterior precursors. Our hypothesis is that this wave evolved in vertebrates to pattern an ancestral circulatory pump into AP fields, which were later fashioned into cardiac chambers. To test whether the wave is an ancestral or derived feature of amniotes, we mapped expression of RALDH2 in relation to the cardiac field in amphibians, basal vertebrates and the amphioxus. Our data suggests RA signaling patterns amphibian and piscine hearts. Cloning of RALDH in lampreys shows that RA synthesis takes place in the heart field. In the amphioxus, cloning of RALDH reveals a vertebrate-like expression pattern, although the RALDH2 wave is absent. Our results support the hypothesis that the caudorostral wave of RALDH2 was coopted to pattern the vertebrate cardiac field. This supports the hypothesis that the caudorostral wave of RALDH2 was an important player in the evolutionary origin of the cardiac chambers.

Introdução: DAX1 (NR0B1), SF1 (NR5A1) e a via Wnt controlam o desenvolvimento de células progenitoras/tronco adrenais. NANOG, OCT4, SOX2 e STAT3 estão envolvidos na manutenção de células-tronco e têm papel em vários cânceres de diferentes tecidos. Ainda não está claro se esses fatores de transcrição interagem para promover a tumorigênese adrenocortical. Objetivo: Nos tumores adrenocorticais (TAC): avaliar o ganho de material genômico e a expressão de RNAm e proteica de DAX1 e SF1; avaliar a expressão de RNAm e proteica de marcadores de células-tronco (NANOG, OCT4, SOX2 e STAT3). No desenvolvimento do córtex adrenal: avaliar a expressão proteica desses genes. In vitro: avaliar a interação entre a via Wnt/Beta-catenina e a expressão de NANOG. Pacientes e Métodos: Painel de 30 córtices adrenais fetais humanos (20-38 semanas de gestação) e 14 pós-natais. Pacientes com TAC: 96 crianças/adolescentes (81% do sexo feminino, idade mediana de 1,6 anos [0,4 a 15,6 anos]) e 18 adultos (10 adenomas e 8 carcinomas, 89% do sexo feminino e idade mediana de 42,5 anos [21-66 anos]). Tecidos adrenais normais (controles para qPCR e MLPA): 13 crianças (idade mediana de 3 anos) e 13 adultos (mediana de idade de 48 anos). A expressão proteica de SF1, DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 foi avaliada por imunohistoquímica nos TAC e nos córtices adrenais fetais e pós-natais. A expressão de RNAm de NR0B1, NR5A1, STAT3, NANOG e POU5F1 (OCT4) foi avaliada por qPCR nos TAC. Ganho ou perda de material genômico de NR0B1 e NR5A1 foi avaliada por MLPA nos TAC. In vitro, a expressão de NANOG (qPCR) foi avaliada em células adrenais H295 antes e após inibição da via Wnt/Beta-catenina com a substância PNU-74654. Resultados: Em adrenais fetais com 20 e 25 semanas de gestação detectou-se marcação intensa de SF1, DAX1, SOX2 e OCT4 na região subcapsular e marcação leve a moderada e difusa de STAT3 e NANOG. Após as 31 semanas e no período pós-natal, a marcação intensa de SF1 persistiu, porém a marcação de DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 diminuiu ou desapareceu. Nos TAC, a marcação nuclear de SF1 foi positiva em 67% das amostras pediátricas e em 19% das amostras de adultos. Ganho de material genômico do NR5A1 foi observado em 71% dos TAC pediátricos e 33% de TAC adultos. Porém observou-se hipoexpressão do RNAm do NR5A1 em 84% dos TAC pediátricos. Nenhum ganho de material genômico ou aumento da expressão do RNAm do NR0B1 foi observado nos TAC pediátricos. Porém em 45% desses tumores detectou-se marcação nuclear. Nos TAC de pacientes adultos, houve aumento da expressão de RNAm de NR0B1 em 89% das amostras. Não se observou marcação de STAT3 nos TAC pediátricos e adultos. Porém nos pacientes adultos, a expressão do RNAm de STAT3 foi significativamente maior nos adenomas do que nos carcinomas. Por sua vez, a marcação nuclear do OCT4 associou-se significativamente com a ocorrência de metástases nos pacientes pediátricos. Nos TAC com a mutação p.S45P no gene da Beta-catenina detectou-se expressão significativamente aumentada do RNAm do NANOG. Além disso, após a inibição in vitro da via Wnt/Beta-catenina nas células tumorais adrenais houve redução significativa na expressão do RNAm de NANOG. Conclusão: Existe um padrão temporal na expressão de SF1, DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 durante o desenvolvimento do córtex adrenal fetal, porém apenas a expressão de SF1 permanece no final da gestação e após o nascimento. TAC pediátricos exibem ganho de material gênico, aumento da expressão proteica e aparentemente redução paradoxal do RNAm do SF1 (NR5A1). Marcação nuclear de OCT4 se associa a fenótipo tumoral mais agressivo nos pacientes pediátricos. Parece exisitir interação entre a via Wnt/Beta-catenina e células-tronco, por meio do fator de transcrição NANOG, na tumorigênese adrenocortical. / Background: DAX1 (NR0B1), SF1 (NR5A1) and the Wnt pathway control adrenal stem/progenitor cells development. NANOG, OCT4, SOX2 and STAT3 are involved in the maintenance of stem cells and have role in various types of cancers in different tissues. It is still unclear whether these transcription factors interact to promote adrenocortical tumorigenesis. Objective: In adrenocortical tumors (ACT): to evaluate the gain of genomic material and the expression of mRNA and protein of DAX1 and SF1; to evaluate the mRNA and protein expression of stem cell markers (NANOG, OCT4, SOX2 and STAT3). In the development of the adrenal cortex: to evaluate the protein expression of these genes. In vitro: to evaluate the interaction between the Wnt/Beta-catenin pathway and NANOG expression. Patients & Methods: Panel of 30 fetal human adrenal cortices (20-38 gestational weeks) and 14 postnatal human adrenal cortices. ACT Patients: 96 children/ teenagers (81% female; median age of 1.6 years; 0.4-15.6 years) and 18 adults (10 adenomas and 8 carcinomas; 89% female; median age of 42.5 years; 21-66 years). Normal adrenal tissues (qPCR and MLPA controls): 13 children (median age of 3 years) and 13 adults (median age of 48 years). Protein expression of SF1, DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 was assessed by immunohistochemistry in ACT, fetal and postnatal adrenal cortices. The mRNA expression of NR0B1, NR5A1, STAT3, NANOG and POU5F1 (OCT4) was assessed by qPCR in ACT. Gain or loss of NR0B1 and NR5A1 genomic material was assessed by MLPA in ACT. In vitro, NANOG expression (qPCR) was evaluated in H295 adrenal cells before and after inhibition of the Wnt/Beta-catenin pathway with PNU-74654. Results: In the adrenal glands at 20 and 25 gestational weeks, intense staining of SF1, DAX1, SOX2 and OCT4 was detected in the subcapsular region and a diffuse pattern mild to moderate staining of STAT3 and NANOG. After 31 weeks and in the postnatal period, intense SF1 staining persisted, but the staining of DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 decreased or disappeared. In the ACT, the nuclear staining of SF1 was positive in 67% of pediatric samples and in 19% of adult samples. Gain of NR5A1 genomic material was observed in 71% of pediatric ACT and 33% of adult ACT. However, hypoexpression of NR5A1 mRNA was observed in 84% of pediatric ACT. No gain of genomic material or increase in mRNA expression of NR0B1 was observed in pediatric ACT. However, in 45% of these tumors nuclear staining was detected. In adult ACT, there was an increase in NR0B1 mRNA expression in 89% of the samples. No STAT3 staining was found in pediatric and adult ACT. However, in adult ACT, the STAT3 mRNA expression was significantly higher in adenomas than in carcinomas. In turn, the nuclear marking of OCT4 was significantly associated with the occurrence of metastases in pediatric patients. In the TACs with the p.S45P mutation in the Beta-catenin gene significantly increased NANOG mRNA expression was detected. In addition, after in vitro inhibition of the Wnt / Beta-catenin pathway in adrenal tumor cells there was a significant reduction in NANOG mRNA expression. Conclusion: There is a temporal pattern in the expression of SF1, DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 during the development of the fetal adrenal cortex, but only SF1 expression remains at the end of gestation and after birth. Pediatric ACT show gain in NR5A1 gene material, increase in its protein expression but an apparent paradoxical reduction of mRNA. Nuclear staining of OCT4 is associated with more aggressive tumor phenotype in pediatric patients. There appears to be an interaction between the Wnt/Beta-catenin pathway and stem cells via NANOG, in adrenocortical tumorigenesis.

Introdução: DAX1 (NR0B1), SF1 (NR5A1) e a via Wnt controlam o desenvolvimento de células progenitoras/tronco adrenais. NANOG, OCT4, SOX2 e STAT3 estão envolvidos na manutenção de células-tronco e têm papel em vários cânceres de diferentes tecidos. Ainda não está claro se esses fatores de transcrição interagem para promover a tumorigênese adrenocortical. Objetivo: Nos tumores adrenocorticais (TAC): avaliar o ganho de material genômico e a expressão de RNAm e proteica de DAX1 e SF1; avaliar a expressão de RNAm e proteica de marcadores de células-tronco (NANOG, OCT4, SOX2 e STAT3). No desenvolvimento do córtex adrenal: avaliar a expressão proteica desses genes. In vitro: avaliar a interação entre a via Wnt/Beta-catenina e a expressão de NANOG. Pacientes e Métodos: Painel de 30 córtices adrenais fetais humanos (20-38 semanas de gestação) e 14 pós-natais. Pacientes com TAC: 96 crianças/adolescentes (81% do sexo feminino, idade mediana de 1,6 anos [0,4 a 15,6 anos]) e 18 adultos (10 adenomas e 8 carcinomas, 89% do sexo feminino e idade mediana de 42,5 anos [21-66 anos]). Tecidos adrenais normais (controles para qPCR e MLPA): 13 crianças (idade mediana de 3 anos) e 13 adultos (mediana de idade de 48 anos). A expressão proteica de SF1, DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 foi avaliada por imunohistoquímica nos TAC e nos córtices adrenais fetais e pós-natais. A expressão de RNAm de NR0B1, NR5A1, STAT3, NANOG e POU5F1 (OCT4) foi avaliada por qPCR nos TAC. Ganho ou perda de material genômico de NR0B1 e NR5A1 foi avaliada por MLPA nos TAC. In vitro, a expressão de NANOG (qPCR) foi avaliada em células adrenais H295 antes e após inibição da via Wnt/Beta-catenina com a substância PNU-74654. Resultados: Em adrenais fetais com 20 e 25 semanas de gestação detectou-se marcação intensa de SF1, DAX1, SOX2 e OCT4 na região subcapsular e marcação leve a moderada e difusa de STAT3 e NANOG. Após as 31 semanas e no período pós-natal, a marcação intensa de SF1 persistiu, porém a marcação de DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 diminuiu ou desapareceu. Nos TAC, a marcação nuclear de SF1 foi positiva em 67% das amostras pediátricas e em 19% das amostras de adultos. Ganho de material genômico do NR5A1 foi observado em 71% dos TAC pediátricos e 33% de TAC adultos. Porém observou-se hipoexpressão do RNAm do NR5A1 em 84% dos TAC pediátricos. Nenhum ganho de material genômico ou aumento da expressão do RNAm do NR0B1 foi observado nos TAC pediátricos. Porém em 45% desses tumores detectou-se marcação nuclear. Nos TAC de pacientes adultos, houve aumento da expressão de RNAm de NR0B1 em 89% das amostras. Não se observou marcação de STAT3 nos TAC pediátricos e adultos. Porém nos pacientes adultos, a expressão do RNAm de STAT3 foi significativamente maior nos adenomas do que nos carcinomas. Por sua vez, a marcação nuclear do OCT4 associou-se significativamente com a ocorrência de metástases nos pacientes pediátricos. Nos TAC com a mutação p.S45P no gene da Beta-catenina detectou-se expressão significativamente aumentada do RNAm do NANOG. Além disso, após a inibição in vitro da via Wnt/Beta-catenina nas células tumorais adrenais houve redução significativa na expressão do RNAm de NANOG. Conclusão: Existe um padrão temporal na expressão de SF1, DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 durante o desenvolvimento do córtex adrenal fetal, porém apenas a expressão de SF1 permanece no final da gestação e após o nascimento. TAC pediátricos exibem ganho de material gênico, aumento da expressão proteica e aparentemente redução paradoxal do RNAm do SF1 (NR5A1). Marcação nuclear de OCT4 se associa a fenótipo tumoral mais agressivo nos pacientes pediátricos. Parece exisitir interação entre a via Wnt/Beta-catenina e células-tronco, por meio do fator de transcrição NANOG, na tumorigênese adrenocortical. / Background: DAX1 (NR0B1), SF1 (NR5A1) and the Wnt pathway control adrenal stem/progenitor cells development. NANOG, OCT4, SOX2 and STAT3 are involved in the maintenance of stem cells and have role in various types of cancers in different tissues. It is still unclear whether these transcription factors interact to promote adrenocortical tumorigenesis. Objective: In adrenocortical tumors (ACT): to evaluate the gain of genomic material and the expression of mRNA and protein of DAX1 and SF1; to evaluate the mRNA and protein expression of stem cell markers (NANOG, OCT4, SOX2 and STAT3). In the development of the adrenal cortex: to evaluate the protein expression of these genes. In vitro: to evaluate the interaction between the Wnt/Beta-catenin pathway and NANOG expression. Patients & Methods: Panel of 30 fetal human adrenal cortices (20-38 gestational weeks) and 14 postnatal human adrenal cortices. ACT Patients: 96 children/ teenagers (81% female; median age of 1.6 years; 0.4-15.6 years) and 18 adults (10 adenomas and 8 carcinomas; 89% female; median age of 42.5 years; 21-66 years). Normal adrenal tissues (qPCR and MLPA controls): 13 children (median age of 3 years) and 13 adults (median age of 48 years). Protein expression of SF1, DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 was assessed by immunohistochemistry in ACT, fetal and postnatal adrenal cortices. The mRNA expression of NR0B1, NR5A1, STAT3, NANOG and POU5F1 (OCT4) was assessed by qPCR in ACT. Gain or loss of NR0B1 and NR5A1 genomic material was assessed by MLPA in ACT. In vitro, NANOG expression (qPCR) was evaluated in H295 adrenal cells before and after inhibition of the Wnt/Beta-catenin pathway with PNU-74654. Results: In the adrenal glands at 20 and 25 gestational weeks, intense staining of SF1, DAX1, SOX2 and OCT4 was detected in the subcapsular region and a diffuse pattern mild to moderate staining of STAT3 and NANOG. After 31 weeks and in the postnatal period, intense SF1 staining persisted, but the staining of DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 decreased or disappeared. In the ACT, the nuclear staining of SF1 was positive in 67% of pediatric samples and in 19% of adult samples. Gain of NR5A1 genomic material was observed in 71% of pediatric ACT and 33% of adult ACT. However, hypoexpression of NR5A1 mRNA was observed in 84% of pediatric ACT. No gain of genomic material or increase in mRNA expression of NR0B1 was observed in pediatric ACT. However, in 45% of these tumors nuclear staining was detected. In adult ACT, there was an increase in NR0B1 mRNA expression in 89% of the samples. No STAT3 staining was found in pediatric and adult ACT. However, in adult ACT, the STAT3 mRNA expression was significantly higher in adenomas than in carcinomas. In turn, the nuclear marking of OCT4 was significantly associated with the occurrence of metastases in pediatric patients. In the TACs with the p.S45P mutation in the Beta-catenin gene significantly increased NANOG mRNA expression was detected. In addition, after in vitro inhibition of the Wnt / Beta-catenin pathway in adrenal tumor cells there was a significant reduction in NANOG mRNA expression. Conclusion: There is a temporal pattern in the expression of SF1, DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 during the development of the fetal adrenal cortex, but only SF1 expression remains at the end of gestation and after birth. Pediatric ACT show gain in NR5A1 gene material, increase in its protein expression but an apparent paradoxical reduction of mRNA. Nuclear staining of OCT4 is associated with more aggressive tumor phenotype in pediatric patients. There appears to be an interaction between the Wnt/Beta-catenin pathway and stem cells via NANOG, in adrenocortical tumorigenesis.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-05T19:27:04Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1771019 bytes, checksum: b262604d234aeca157bb65df2932b25d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-05T19:27:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1771019 bytes, checksum: b262604d234aeca157bb65df2932b25d (MD5) Previous issue date: 2005-09-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A introdução de características agronomicamente importantes em soja pode ser realizada por transformação genética de plantas como um método alternativo ao melhoramento tradicional. Alterações nas proporções relativas dos ácidos graxos na fração óleo podem ser alcançadas por meio do silenciamento gênico de enzimas dessaturases, responsáveis pela síntese de ácidos graxos polinsaturados. Os objetivos deste trabalho foram: isolar um fragmento do gene da oleoil dessaturase de soja, construir cassete de expressão para a co-supressão deste gene e estabelecer metodologias para a extração e quantificação de ácidos graxos de embriões somáticos. A análise por RT-PCR mostrou que o gene Fad2-1 é expresso em todos os estádios de desenvolvimento da semente. A expressão desse gene aumentou a partir dos estádios iniciais de desenvolvimento e diminuiu em sementes maduras. Um fragmento de cDNA de cerca de 1 kb foi clonado nos vetores binários pCAMBIA 3301 e 1304, cujos T- DNAs apresentam genes para resistência a herbicida e antibiótico, respectivamente. A clonagem foi confirmada por meio de PCR, restrição enzimática e seqüenciamento. A construção clonada no vetor pCAMBIA 3301 foi utilizada para a transformação de soja via Agrobacterium. Embriões somáticos foram originados a partir de cotilédones imaturos cultivados na presença de 40 mg/L de 2,4-D. Agregados de embriões globulares foram transformados com suspensão bacteriana mediante sonicação e adição de acetoseringona e mantidos em meio seletivo com 3 mg/L e 5 mg/L do herbicida Finale → . A maioria dos embriões germinou normalmente em meio sem regulador de crescimento, embora alguns não tenham sido capazes de regenerar plantas. Apenas cinco plantas foram aclimatadas em casa de vegetação, mas não eram transgênicas. As análises moleculares com plântulas e/ou embriões somáticos cotiledonares permitiram a detecção de vários eventos de transformação. O conteúdo de ácidos graxos dos diferentes estádios de desenvolvimento embrionário foi determinado por cromatografia gasosa. Foram observadas mudanças na composição de ácidos graxos no estádio globular, com aumento dos conteúdos de ácido oléico (18:1) e linoléico (18:2) e diminuição de ácido linolênico (18:3). A partir do estádio torpedo, a composição de ácidos graxos não variou significativamente até o final do desenvolvimento, apresentando resultados similares aos de sementes maduras. A análise por RT-PCR mostrou um aumento no acúmulo de transcritos do gene Fad2-1 do estádio globular para torpedo. A expressão desse gene permaneceu relativamente constante até o estádio cotiledonar maduro, com redução da expressão após o processo de dessecação. Os dados quanto aos perfis de ácidos graxos de 138 embriões cotiledonares transformados foram analisados por meio de estatística descritiva para verificar a freqüência dos diferentes eventos de transformação. Oitenta e quatro embriões apresentaram conteúdo de 18:1 semelhante ao controle não transformado (13-21%), 18 apresentaram níveis inferiores (9-13%) e 36 apresentaram níveis aumentados (22-61%), provavelmente como possível conseqüência de silenciamento gênico. Em relação ao conteúdo de 18:2, 88 embriões apresentaram conteúdo semelhante ao controle não transformado (49-59%), 17 apresentaram níveis superiores (59-64%) e 33 apresentaram níveis inferiores de 18:2 (6-49%). Em 101 embriões o conteúdo de 18:3 foi semelhante ao controle não transformado (8-15%), 30 mostraram níveis superiores (15-27%) e 7 mostraram níveis inferiores (4-8%). Os resultados mostraram a existência de modificação na composição de ácidos graxos nos embriões cotiledonares analisados, mas não se pode afirmar que essas alterações sejam causadas por fenômenos de silenciamento gênico. Estes resultados podem ter sofrido a influência de variações somaclonais ou da auxina 2,4-D. / The introduction of agronomically important traits into soybean may be accomplished by genetic transformation of the plants as an alternative method to traditional breeding. Alterations in the relative proportions of the fatty acids in the oil fraction may be reached through gene silencing of desaturase enzymes that are responsible for the synthesis of the polyunsaturated fatty acids. The objectives of this work were: to isolate a fragment of the soybean oleoil desaturase gene; to construct expression cassettes for co-suppression of this gene; and to establish methodologies for the extraction and quantification of fatty acids in soybean somatic embryos. The analysis based on RT-PCR showed that the Fad2-1 gene is expressed in all developmental stages of the seed. The expression of the gene increases after the first stages of development and decreases in the dry seeds. One cDNA fragment around 1 kb was cloned in the binary vectors pCAMBIA 3301 and 1304, in which the T-DNAs harbor genes for resistance to herbicide and antibiotic, respectively. Cloning was confirmed through PCR, enzymatic restriction and sequencing. The constructs cloned in pCAMBIA 3301 were used for the soybean transformation via Agrobacterium. Somatic embryos were obtained from immature cotyledons cultivated in the presence of 2,4-D (40 mg/L). The globular embryo clusters were transformed with bacterial suspension using sonication and addition of acetosyringone and kept in selective medium with 3 mg/L and 5 mg/L of the Finale ® herbicide. Most embryos germinated in medium without growth regulator, however, some of them were not able to regenerate plants. Only five plants were acclimated in the greenhouse, but they were not transgenic. The molecular analyses of seedlings and/or cotyledone somatic embryos allowed the detection of several transformation events. Fatty acid content at different stages of the embryonic development was determined by gas chromatography. Changes in the fatty acid xcompositions at the globular stage were observed. There was an increase on oleic (18:1) and linoleic (18:2) acids contents and a decrease on linolenic acid (18:3) content. From the torpedo stage, the composition of the fatty acids did not vary significantly until the end of the development. The values obtained were similar to those of the dry seeds. The RT-PCR analysis showed an increase on the accumulation of transcripts for the Fad2-1 gene from globular to the torpedo stage. The expression of this gene remained relatively constant until the ripe cotyledonal stage, but there was a reduction on expression after the desiccation process. The data relative to the fatty acid profiles of 138 cotyledonal transformed embryos were analyzed by descriptive statistics in order to verify the frequency of the different transformation events. Eighty-four embryos showed a content of 18:1 similar to the non-transformed control (13-21%), 18 presented lower levels (9- 13%) and 36 presented increased levels (22-61%), probably a possible consequence of gene silencing. In relation to 18:2, 88 embryos presented a content similar to that of the non-transformed control (49-59%), 17 presented higher levels (59-64%) and 33 presented lower levels of 18:2 (6-49%). In 101 embryos, the content of 18:3 was similar to the non-transformed control (8-15%), 30 showed higher levels (15-27%) and 7 showed lower levels (4-8%). The results show that the cotyledonal embryos analyzed had a modified fatty acid composition, but one cannot state that these alterations were caused by the gene silencing phenomenon. These results might have been affected by the influence of either somaclonal variations or the auxin 2,4-D .

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-04-27T08:33:54Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3736622 bytes, checksum: 39fd593857e319e4d9577fd3428a7f25 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-27T08:33:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3736622 bytes, checksum: 39fd593857e319e4d9577fd3428a7f25 (MD5) Previous issue date: 2015-03-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A aquisição de competência embriogênica por células somáticas é um processo intrigante e necessita da junção de dados genético-moleculares e citológicos para melhor compreensão dos mecanismos e mudanças celulares envolvidas. À vista disso, os objetivos desse trabalho foram isolar e caracterizar o padrão de expressão dos genes SERK e BBM por hibridização in situ durante o processo de embriogênese somática em Passiflora cincinnata, avaliar a responsividade morfogênica in vitro de P. setacea e P. cincinnata submetidas a condições de indução de embriogênese somática, bem como, acompanhar a mobilização de reservas e a expressão dos genes supracitados durante a embriogênese somática. Para tal, a partir de calos embriogênicos de P. cincinnata, com 20 dias em meio de indução (MI), extraiu-se o RNA total e obteve-se o cDNA, o qual serviu como molde para amplificação da sequência codante utilizando-se primers degenerados para SERK e BBM. A responsividade de embriões zigóticos maduros de P. setacea e P. cincinnata foi avaliada mediante o cultivo em meio de indução alternativo constituído por sais MS suplementado com 31,06 μM de Picloram + 2,22 μM de BA + 2,27 μM de TDZ (MIP) + 500 mg L -1 de Extrato de Malte (EM) + 13,77 μM de Espermidina (Spd). Após 30 dias as culturas foram transferidas ao meio de maturação (MM) composto de meio MS acrescido de 1,0% de carvão ativado e ausência de reguladores de crescimento. Amostras com 0, 10, 20 e 30 dias foram coletadas para microscopia de luz, microscopia eletrônica de varredura, testes histoquímicos e hibridização in situ, todas seguindo protocolos específicos. Para visualização da expressão dos genes SERK e BBM foi gerada uma sonda de RNA a partir de um clone sequenciado de P. cincinnata. Para P. setacea utilizou-se uma sonda heteróloga sense e antisense de P. cincinnata. O relacionamento filogenético das sequências isoladas de P. cincinnata comparadas às de outras espécies apontou que as funções das proteínas podem ser conservadas na espécie. Em SERK, o Pc contig1 agrupou-se com membros de SERK1 e SERK2, enquanto o Pc contig2 agrupou-se com membros de SERK3/BAK1. Por sua vez, o Pc contig1 de BBM, agrupou-se com membros de BBM1 e BBM2. A expressão do gene SERK foi constatada em embriões zigóticos e gradualmente diminuída até os 20 dias em MI. Aos 30 dias em MI, embriões somáticos globulares foram intensamente marcados, assim como em embriões com 5 e 40 dias em MM. Transcritos do BBM foram observados em embriões zigóticos, no entanto, a expressão foi cessada no decorrer do desenvolvimento dos embriões somáticos. A expressão foi retomada em embriões somáticos cotiledonares após 40 dias em MM, assemelhando-se ao observado no embrião zigótico. Observou-se que em P. setacea, durante o processo embriogênico, houve formação de protuberâncias que deram origem a zonas pró-embriogênicas, as quais se desenvolveram em embriões somáticos. Já em P. cincinnata houve proliferação das células do meristema fundamental e formação de meristemoides, caracterizando regiões organogênicas. Quando transferidos ao meio de maturação não houve regeneração de plantas a partir de embriões somáticos em P. setacea. Em P. cincinnata houve intumescimento das regiões calejadas e, em alguns casos, formação de primórdios foliares. Quanto à expressão gênica, em P. setacea foi constatada expressão de BBM e SERK em todas as fases analisadas, especialmente em protuberâncias e embriões somáticos formados. P. cincinnata, por sua vez, também apresentou transcritos dos genes BBM e SERK em todas as fases analisadas, sendo intensificado o sinal de hibridização na periferia dos explantes e regiões meristemáticas após 20 dias em MI. P. setacea apresentou corpos proteicos com decréscimo gradativo até os 30 dias em meio de indução. Houve presença de carboidratos e amido no explante e seu decréscimo após 10 dias, e verificou-se a síntese de novo de amido aos 30 dias de indução, quando há formação de embriões somáticos. Não foi verificada a presença de corpos lipídicos durante o processo embriogênico. Já em P. cincinnata, constatou-se corpos proteicos e amido de forma moderada em todas as etapas de desenvolvimento e a presença de carboidratos totais e corpos lipídicos foi averiguada nas fases iniciais de indução. Após 20 dias, houve mobilização dessas substâncias de reserva concomitantemente com a formação e desenvolvimento de meristemoides. Deste modo, sugere-se que a expressão desses genes está associada aos processos de aquisição de competência embriogênica e podem servir como marcadores moleculares desse processo. Os resultados do isolamento e expressão dos genes SERK e BBM em P. cincinnata são inéditos e contribuem para o melhor entendimento dos processos que envolvem a embriogênese somática na espécie. Nosso trabalho apresenta dados inéditos da indução de embriões somáticos em P. setacea e como as espécies estudadas apresentam respostas morfogênicas divergentes quando submetidas ao mesmo meio de indução. E ainda, relatamos à expressão dos genes BBM e SERK e a mobilização de compostos de reserva no decorrer dos eventos morfogênicos in vitro em P. setacea e P. cincinnata. / The acquisition of embryogenic competence in somatic cells is intriguing process and requires both molecular-genetic and cytological knowledge to better understand the mechanisms and cellular changes involved. Based on this, the aim of this study was to isolate and characterize the expression of SERK and BBM genes in somatic embryos of Passiflora cincinnata, as well as to evaluate the morphogenic in vitro response of Passiflora setacea and P. cincinnata somatic embryogenesis inducted and monitoring the reserve mobilization and expression of the these genes during embryogenesis. For this, RNA was extracted and cDNA was obtained from embryogenic calli of P. cincinnata after 20 days in induction medium (IM), which was used as template for the coding sequence amplification with degenerate primers of SERK and BBM. Mature zygotic embryos of P. setacea and P. cincinnata were inoculated on MS medium supplemented with 31.06 μM of picloram + 2.22 μM of benzyladenine + 2.27 μM of thidizuron + 500mg L -1 of malt extract + 13.77 μM of spermidine. After 30 days, the cultures were transferred to the maturation medium (MM), composed of MS medium supplemented with 1 % of activated charcoal without growth regulators. Samples with 0, 10, 20 and 30 days were collected for light microscopy, scanning electron microscopy, histochemical analyzes and in situ hybridization, following specific protocols. A RNA probe from P. cincinnata cDNA was generated to figure out the expression of SERK and BBM genes, whereas to P. setacea a heterologous sense and antisense probe of P. cincinnata was used. The phylogenetic relationship of P. cincinnata isolated sequences compared with other species suggests that the functions of the proteins are preserved. In SERK, the Pc contig1 grouped up with SERK1 and SERK2 members, while the Pc contig2 grouped with SERK3/BAK1 members. On the other hand, the BBM Pc contig1 was grouped with BBM1 and BBM2 members. The expression of SERK gene was found in zygotic embryos and gradually decreased until 20 days in the IM. After 30 days in the IM, globular somatic embryos were intensely marked with the hybridization signal, as well as embryos with 5 and 40 days in the MM. BBM transcripts were observed in zygotic embryos, but the expression was stopped during the somatic embryos development. The expression was resumed in somatic globular embryos after 40 days in the MM, similar to that observed in zygotic embryos. In the second chapter, in P. setacea embryogenesis process, it was observed the formation of lumps that originate pro-embryogenic zones, which developed into somatic embryos. In P. cincinnata a proliferation of the ground meristem cells and meristemoids formation occurred, emphasizing organogenic regions. When transferred to MM, there was no plant regeneration from somatic embryos of P. setacea. In P. cincinnata, swelling of callus regions and, in some cases, formation of leaf primordia was observed. Regarding the gene expression, in P. setacea there was BBM and SERK expression in all stages, especially in lumps and somatic embryos. Also P. cincinnata showed transcripts of BBM and SERK genes in all stages, with intensification of the hybridization signal at the explants edges and meristematic regions after 20 days in the IM. Protein bodies were found in P. setacea, decreasing gradually until 30 days in the IM. Carbohydrate and starch levels decreased after 10 days, but there was de novo synthesis of starch at 30 days of induction, coupled with the somatic embryos formation. No lipid bodies during the embryogenic process were verified. In P. cincinnata protein bodies and starch were moderately present in all development stages whereas carbohydrates and lipid bodies were present only at the early stages of induction. After 20 days, these reserve substances were mobilized, along with the meristemoids formation and development. Therefore, it is suggested that the expression of these genes is associated with embryogenic competence acquisition process and can be a molecular marker of this process. These results of isolation and expression of SERK and BBM genes in P. cincinnata are original and contribute to a better understanding of the processes involving somatic embryogenesis in this species. This work brings a new approach for somatic embryogenesis induction in P. setacea and highlights how these two species show different responses when submitted to the IM. In addition, the expression of the genes BBM and SERK as well as the mobilization of reserve compounds during in vitro morphogenic events in P. setacea and P. cincinnata were related.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-04-28T10:57:56Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 8375227 bytes, checksum: 55dfde271f45ab327a73b5c840bc894d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-28T10:57:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 8375227 bytes, checksum: 55dfde271f45ab327a73b5c840bc894d (MD5) Previous issue date: 2014-02-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O uso da biotecnologia, especialmente com a utilização de técnicas da cultura de tecidos, proporciona uma forma alternativa de propagação das plantas, além de ser importante ferramenta para o melhoramento e conservação dos recursos genéticos. As espécies desse estudo, bastão-do-imperador [Etlingera elatior cv. Porcelana (Zingiberaceae)] e antúrio [Anthurium andraeanum cv. Eidibel (Araceae)] têm elevada importância econômica na floricultura tropical mundial, sendo fundamentais o domínio e o aprimoramento de técnicas biotecnológicas aplicadas à propagação in vitro. Nesse tipo de propagação, de modo especial aplicada às ornamentais, prima-se pela otimização dos sistemas de propagação em larga escala. Na propagação in vitro convencional, o sistema de vedação dos frascos restringe, entre outros fatores, as trocas gasosas, além de dificultar a absorção de água e nutrientes, aumentando as perdas do material vegetal durante a aclimatização. No presente trabalho, para bastão-do-imperador, realizou-se a propagação fotoautotrófica associada ao enriquecimento da atmosfera dos frascos com CO2, com o intuito de rustificar as vitroplantas ainda em condições in vitro, com grandes benefícios à sobrevivência, com o aumento da tolerância aos estresses impostos às plantas na fase de aclimatização, aproximando-as daquelas produzidas em condições de campo. Para o antúrio, o desenvolvimento de técnicas eficientes de propagação in vitro proporcionou perspectivas novas e promissoras para o melhoramento do antúrio, capazes de ampliar a produção comercial e o abastecimento do mercado brasileiro e mundial. Dentre essas técnicas destaca-se a embriogênese somática, pois pode ser aplicada com sucesso na produção de plantas em larga escala, além de ser um modelo para estudos anatômicos, estruturais e moleculares envolvidos na aquisição de competência embriogênica e de grupos de genes especificamente expressos durante a embriogênese somática. O presente trabalho contribuiu para a geração de conhecimentos a cerca da propagação in vitro das espécies a partir das técnicas de propagação fotoautotrófica, em bastão-do-imperador, caracterizando as respostas morfofisiológicas das plantas submetidas a condições de crescimento heterotrófico, fotomixotrófico e fotoautotrófico; e da propagação in vitro do antúrio via embriogênse somática, abordando alterações estruturais e o acúmulo de reservas envolvidas durante a ontogênese dos calos embriogênicos, além de caracterizar e analisar a expressão do gene SERK nessa espécie. / The use of biotechnology, particularly with the use of tissue culture techniques, provides an alternative way of plant propagation, as well as being an important tool for breeding and genetic resources conservation. The species of this study, torch ginger [Etlingera elatior cv. Porcelana (Zingiberaceae)] and anthurium [Anthurium andraeanum cv. Eidibel (Araceae)] present a high economic importance in the global tropical floriculture, being fundamental the domain and enhancement of biotechnological techniques applied to in vitro propagation. This kind of propagation, especially applied to ornamentals, stands out for the optimization of large-scale propagation. In conventional in vitro propagation, the flasks sealing system restricts, among other things, gas exchange, and hinders water and nutrients absorption, increasing losses in the plant material during acclimatization. In the present study, with torch ginger, the photoautotrophic propagation was performed associated with CO2- enriched atmosphere flasks, with the aim of hardening the plantlets even in vitro, with great benefits to survival and increase tolerance to stresses imposed on plants during the acclimatization phase, approaching those produced in the field. To anthurium, the development of efficient in vitro propagation techniques provided new and promising perspectives for the breeding of this specie, able to expand commercial production and supply Brazilian and worldwide market. Among these techniques highlights the somatic embryogenesis, which can be successfully applied in plant production system for large- scale, besides being an ideal system for anatomical, structural and molecular studies involved in the acquisition of embryogenic competence and clusters of genes specifically expressed during somatic embryogenesis. This work contributed to the generation of knowledge about in vitro propagation of the species from photoautotrophic propagation techniques, in torch ginger, characterizing the morphophysiological responses of plants submitted to heterotrophic, photomixotrophic and photoautotrophic growth conditions; and in vitro propagation of anthurium via somatic embryogenesis, addressing structural changes and the accumulation of reserves involved during ontogeny of embryogenic callus, besides characterizing and analyze the expression of SERK gene in this species.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:39:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2024686 bytes, checksum: 927a0cecb4bcec1327a0e0c20f95445e (MD5) Previous issue date: 2011-07-08 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Somatic embryogenesis is the process of development of embryos from somatic cells. The aim of this study was to evaluate the efficiency of growth regulators at different stages of somatic embryogenesis of three cultivars of sugarcane, RB 867515, RB928064 e RB925345, and characterize the effects of in vitro treatments of the anatomical development of somatic embryos. Embryogenic calluses were obtained after inoculation of immature leaves arising from lateral buds on MS medium plus 30g.L sucrose, 2.5 g.L agar and different concentrations of 2,4-D, Dicamba and CPA (5,10,15 and 20 mM). After 30 days of induction it showed that the dose of 20μM 2, 4-D was the concentration that induced the highest percentage of callus, 36.95%, and callus were compact and whitish. The calluses were subcultured in the same medium for 30 days and after this period, the callus were transferred to medium with low concentration of 2,4-D (0.5 mg.L-1) to obtain globular pro-embryos. The globular pro-embryos were transferred to multiplication medium and after 30 days were transferred to maturation medium. osmotic regulators were tested, mannitol and sucrose (30, 60 and 90 gL) and ABA (0 and 5 mM). The embryos were transferred to regeneration medium containing 1 mg. L-1 BAP and GA3. The embryos that were in the medium with 30g. L-1, with ABA when transferred to regeneration medium formed healthy and vigorous plants. The histochemical Blue Evans test and Carmine Acetic confirmed the embryogenic of the material. The anatomical study of the process of somatic embryogenesis in leaf explants of sugar cane showed the emergence of callus from the epidermis, which in more advanced stages (globular embryos) easily detached from the explant. It was evident the presence of a well-defined protoderms, isodiametric cells with prominent nuclei and nucleoli and high nucleus / cytoplasm ratio. In the later stages were observed the basal and apical meristem well defined, bounded by a protoderm and immersed in a mass of vacuolated cells, assuming one is in the process of somatic embryo formation. At the end of 30 days in maturation, it was observed a bipolar structure, consisting of stem and root apices, which had a closed vascular system, without connection to the adjacent tissue, confirming the presence of the somatic embryo. / A embriogênese somática é o processo de desenvolvimento de embriões a partir de células somáticas. O objetivo desse trabalho foi avaliar a eficiência de reguladores de crescimento nas diferentes fases da embriogênese somática de três cultivares de cana-de- açúcar, RB 867515, RB928064 e RB925345, e caracterizar os efeitos dos tratamentos in vitro no desenvolvimento anatômico dos embriões somáticos. Foram obtidos calos embriogênicos após inoculação de folhas imaturas advindas de gemas laterais em meio MS acrescido de 30g.L de sacarose, 2,5g.L de ágar e diferentes concentrações de 2,4-D, Dicamba e CPA (5,10,15 e 20 μM). Aos 30 dias após indução verificou-se que a dose de 20μM de 2,4-D foi a dose que induziu maior porcentagem de calos embriogênicos, 36,95%, sendo que estes calos tinham aspecto compacto e eram de coloração esbranquiçada. Os calos foram subcultivados no mesmo meio por mais 30 dias e após esse período, os calos embriogênicos obtidos foram transferidos para meio com baixa concentração de 2,4-D (2,26μM) para obtenção de embriões globulares. Os embriões globulares foram transferidos para meio de multiplicação composto do memso meio de indução, acrescido de três diferentes doses de AIA (6, 12 e 24 μL/placa) e foi observada diferença significativa entre as variedades testadas, sendo que na maior dose ocorreu maior multiplicação de calos embriogênicos. Após 30 dias foram transferidos para meio de maturação, onde foram testados os reguladores osmóticos, manitol e sacarose (30, 60 e 90 g.L) e o ABA (0 e 5 μM). Os embriões viáveis foram transferidos para meio de regeneração, contendo 1mg. L-1 de BAP e GA3. Os embriões somáticos que estavam em meio com 30g. L-1, com ABA quando transferidos para meio de regeneração formaram plântulas sadias e vigorosas. O teste histoquímico azul de Evans e carmim acético confirmaram a natureza embriogênica do material. O estudo anatômico do processo de embriogênese somática em explantes foliares de cana-de-açúcar evidenciou o surgimento de calos embriogênicos a partir da epiderme, que em estágios mais avançados (embriões globulares) se desprendiam facilmente do explante. Era evidente a presença de uma protoderme bem definida, células isodiamétricas, com núcleo e nucléolo proeminentes e alta relação núcleo/citoplasma. Nos estágios posteriores foi possível observar uma estrutura apresentando meristema apical e basal bem definido, delimitada por uma protoderme e imersa em uma massa de células vacuolizadas, supondo ser um embrião somático em processo de formação. Ao final dos 30 dias em meio de maturação foi observada uma estrutura bipolar, constituída de ápices caulinar e radicular, que apresentava um sistema vascular fechado, sem conexão com os tecidos adjacentes, confirmando ser um embrião somático.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1425522 bytes, checksum: 6c4fc6ad33dadc94d0af11b40c2fa78f (MD5) Previous issue date: 2010-09-20 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Somatic embryogenesis is a useful tool for plant propagation and a suitable model system for deciphering early events during embryo development. Molecular and genetic studies focused in plant development have reported the involvement of SERK (Somatic Embryogenesis Receptor Kinase) gene in the acquisition of embryogenic competence. In order to increase the efficiency of plant regeneration processes we need to understand it better. Therefore, the purpose of the present work was to determine if the SERK gene is present in the soybean genome and analyze its expression during somatic embryogenesis. Genes encoding tree novel members of the Leucine-rich repeat receptor like kinase (LRR-RLK) superfamily have been identified. These genes was named GmSERK1, GmSERK2 and GmSERK3, since they share a conserved intron/exon structure with other members of the SERK family and encode a signal peptide, a leucine zipper domain, five LRR, the SPP domain, a single transmembrane domain and a kinase domain with 11 subdomains, features that distinguishes SERK proteins from other proteins belonging to the LRRRLK superfamily. To investigate the position of GmSERK proteins in the plant LRR-RLKs superfamily, the conserved parts of the extracellular or intracellular domains were compared to other published LRR-RLKs sequences taken from literature. In the LRR domain, SERK proteins share all conserved amino acids of the plant LRR consensus sequence. Moreover, conservations of an aspartic acid (D) at position 1, an asparagine (N) at position 4 and a glycine (G) at position 16 were observed, although they are not consensus between other LRRs. A phylogenetic tree was constructed based on kinase domains and results showed that SERK proteins form a distinct branch in the phylogenetic tree and GmSERKs clustered most closely with SERK gene members such as Medicago truncatula (MtSERK1), ix Teobroma cacao (TcSERK) and Solanum tuberosum (StSERK1). Treatment of explants with 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (40 mg/L) was effective in inducing somatic embryos derived from the cultivar CAC-1 and a large number of globular embryos could be viewed after 30 days. However, it was observed a strong effect of the genotype in the morphogenic response. Unlike CAC-1, explants derived from the cultivar CS303 showed a low frequency of induction and only a small number of somatic embryos were obtained. Analysis of gene expression, performed by in situ hybridization, showed that a high level of GmSERK1 transcripts could be detected in embryogenic tissues of CAC-1 during the induction of somatic embryogenesis. In contrast, immature cotyledons of soybean cultivar CS303 showed low levels of GmSERK1 transcripts. These results suggest the involvement of GmSERK1 gene with somatic embryogenesis, probably acting as an important player in acquisition of embryogenic competence. / A embriogênese somática é uma ferramenta útil para a propagação de plantas e consiste num sistema modelo adequado para a elucidação de eventos iniciais do desenvolvimento embrionário. Estudos genéticos e moleculares focados no desenvolvimento vegetal têm relatado o envolvimento do gene SERK (Somatic Embryogenesis Receptor Kinase) no processo de aquisição de competência embriogênica. Para que seja possível o aumento da eficiência dos processos de regeneração de plantas, é preciso compreendê-los melhor. Dessa forma, os objetivos do presente trabalho foram determinar se o gene SERK está presente no genoma da soja e analisar a sua expressão durante a indução de embriogênese somática. Genes que codificam três novos membros da superfamília de receptores cinase ricos em leucina (LRR-RLK - Leucine-rich repeat receptor like kinase) foram identificados. Esses genes foram denominados GmSERK1, GmSERK2 e GmSERK3, já que compartilham com outros membros da família SERK uma conservada estrutura íntron/éxon e codificam um peptídeo sinal, um zíper de leucina, cinco repetições de leucina (LRR), um domínio rico em prolina (SPP - serine proline proline), um domínio transmembrana e um domínio cinase com 11 subdomínios, características que distinguem os receptores SERK dos demais membros da superfamília LRR-RLK. Com o objetivo de verificar a posição das proteínas GmSERK dentro da superfamília de LRR-RLKs de plantas, partes conservadas de seus domínios extracelular e intracelular foram comparadas a outras sequências de LRR-RLKs retiradas da literatura. Em relação ao domínio LRR, verificou-se que as proteínas SERK apresentam todos os aminoácidos conservados da sequência consenso das LRR de plantas. Além disso, a conservação dos resíduos de ácido aspártico (D) na posição 1, asparagina (N) na posição 4 e glicina (G) na posição 16 em proteínas da família SERK foi observado, embora não seja consenso entre as LRRs de plantas. Uma árvore filogenética foi construída com base nos domínios cinase e os resultados mostraram que as proteínas SERK formam um ramo distinto dos outros tipos de receptores LRR-RLKs e as GmSERKs agrupam-se melhor com outros membros da família SERK, como as de Medicago truncatula (MtSERK1), Teobroma cacao (TcSERK) e Solanum tuberosum (StSERK1). O tratamento dos explantes com ácido 2,4-diclorofenoxiacético (40 mg/L) mostrou-se eficiente em induzir embriões somáticos a partir da cultivar CAC- 1 e um grande número de embriões globulares pode ser visualizado após 30 dias de cultivo. Entretanto, um grande efeito do genótipo na resposta morfogênica foi observado. Ao contrário de CAC-1, explantes derivados da cultivar CS303 apresentaram uma baixa freqüência de indução e apenas um pequeno número de embriões somáticos foi obtido. As análises de expressão, realizadas por meio da técnica de hibridização in situ, mostraram que um alto nível de transcritos correspondentes ao gene GmSERK1 pôde ser detectado em tecidos embriogênicos de CAC-1 durante a fase de indução de embriogênese somática. Em contraste, cotilédones imaturos da cultivar de soja CS303 apresentaram um baixo acúmulo de transcritos de GmSERK1. Estes resultados sugerem o envolvimento do gene GmSERK1 no processo de embriogênese somática, provavelmente atuando como um importante fator na aquisição de competência embriogênica.