Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2017-04-18T13:18:18Z No. of bitstreams: 1 Lais Tomaz Ferreira.pdf: 1246019 bytes, checksum: 4979421cc9252d247eba9fcb8d54e7a6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-18T13:18:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lais Tomaz Ferreira.pdf: 1246019 bytes, checksum: 4979421cc9252d247eba9fcb8d54e7a6 (MD5) Previous issue date: 2015-10-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The light source used in in vitro culture interferes in the morphogenesis and contributes to the quality of the obtained plantlets. Therefore, this study aimed to evaluate the use of LEDs in the induction of somatic embryogenesis, in the micropropagation and as this reflected in the acclimatization of sugarcane (RB98710). For ES induction immature leaf segments were inoculated on MS medium supplemented with two combinations of 2,4-D and BAP, forming treatments: C1- 13.6 μM of 2,4-D + 2.2 μM BAP and C2- 9 μM of 2,4-D + 1.1 μM BAP. For plant regeneration was used medium devoid of growth regulators. For multiplication used the concentrations of 4,44 μM BAP and 4,65 μM KIN during six consecutive subcultures; and for rooting, used 5.37 μM ANA. The cultures remained under fluorescent lights - FL (50 μmol m-²s-¹) or LEDs (80 μmol m-²s-¹), and after rooting plants were acclimatized. The medium C2 under LED lighting provided a higher percentage of responsive explants, however, the largest number of plants was obtained under C1 under FL lighting, averaging 26.75 plants/explant. Histological analysis revealed that there was embryo formation directly and indirectly from the explant. Plants grown under LEDs showed a higher proliferation rate compared to FL, averaging 5.06 and 4.20, respectively. After acclimatization plants from LED lighting showed 96% survival while they were under FL had 75%. The loss of water in leaves was about 10% lower for plants in LEDs. With regard to biometric parameters and carotenoids content, the best results were observed in plants derived from in vitro culture under LEDs. The H2O2 content before and during the acclimatization was higher in plants under LED still MDA content not differentiate between sources of light. The antioxidant enzymes were effective in combating oxidative stress in both lighting systems. Thus, it can be inferred that plants of sugarcane variety RB98710 have better rate of multiplication and development in vitro and ex vitro when cultured under the LEDs. / A fonte de luz utilizada no cultivo in vitro interfere na morfogênese e contribui na qualidade das mudas obtidas. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o uso de LEDs na indução da embriogênese somática, na micropropagação e como este se reflete na aclimatização da cana-de-açúcar (RB98710). Para indução da ES inoculou-se segmentos de folhas imaturas em meio MS suplementado com duas combinações de 2,4-D e BAP, formando os tratamentos: C1- 13,6 μM de 2,4-D + 2,2 μM de BAP e C2- 9 μM de 2,4-D + 1,1 μM de BAP. Para a regeneração das plantas utilizou-se meio desprovido de regulador de crescimento. Para multiplicação utilizaram-se as concentrações de 4,44μM de BAP e 4,65μM de KIN durante seis subcultivos consecutivos; e para o enraizamento, utilizou-se 5,37 μM de ANA. Os cultivos permaneceram sob lâmpadas fluorescentes - FL (50 μmol m-²s-¹) ou LEDs (80 μmol m-²s-¹) e após o enraizamento as plantas foram aclimatizadas. O meio C2 sob iluminação LED proporcionou maior percentagem de explantes responsivos, contudo, o maior número de plantas foi obtido em meio C1 sob iluminação FL, com média de 26,75 plantas/explante. As análises histológicas revelaram que houve formação de embriões direta e indiretamente do explante. As plantas cultivadas sob LEDs apresentaram maior taxa de multiplicação comparada à FL, com média de 5,06 e 4,20, respectivamente. Após a aclimatização, plantas provenientes da iluminação por LEDs apresentaram 96% de sobrevivência enquanto as que estavam sob FL apresentaram 75%. A perda de água em folhas foi cerca de 10% menor nas plantas sob LEDs. Em relação aos parâmetros biométricos e o teor de carotenoides, os melhores resultados também foram observados em plantas provenientes do cultivo in vitro sob LEDs. O conteúdo de H2O2 antes e durante a aclimatização mostrou-se maior em plantas sob LED, mesmo assim os conteúdos de MDA não diferenciaram entre as fontes de luz. As enzimas antioxidantes mostraram-se eficientes no combate ao estresse oxidativo, nos dois sistemas de iluminação. Assim, pode-se inferir que as plantas de cana-de-açúcar da variedade RB98710 apresentam melhor taxa de multiplicação e desenvolvimento in vitro e ex vitro quando cultivadas sob LEDs.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-09-20T13:24:05Z No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-09-20T13:24:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-09-20T13:24:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-20T13:24:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2011-02-24 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / This study aims to evaluate genotypic responses during somatic embryogenesis from zygotic embryos of oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) as well as to evaluate the ontogeny and identify proteins differentially expressed during different stages of embryogenesis. Zygotic embryos were used in nine genotypes: C2001, C2328, C2301, C3701, CM1115, C7201, C2528, C2501 and CN1637. Initially, the zygotic embryos were inoculated in culture medium for callus induction (450 μM Picloram), with subcultures every 30 days. After 150 days, callus were transferred to two culture media in orderto differentiation and maturation of somatic embryos: MTD -1 (0.6μM NAA and 12.3 μM 2-iP) and MTD-2 (40 μM Picloram). After 90 days, the callus with somatic embryos were transferred to regeneration medium devoid of growth regulators. At all stages the explants were kept in growth room with temperature 25 ± 2° C and dark conditions. The analysis was performed anatomical mold during the embryogenic process. Since the proteomic samplewere collected from zygotic embryos (E1), with swollen explants 14 days (E2) in induction medium, primary callus (E3) and callus pro-embryogenic (E4). It was found that the genotypes have different morphogenic responses in vitro. In the induction phase, genotypes C2501, C2001, C7201, C2528, C2328 and C3701 showed better results in the formation of embryogenic callus, with values between 90 and 100%. After 90 days of regeneration, the genotypes that showed the best results in the formation and regeneration of somatic embryos were C2328 and CM1115. The anatomical analysis allowed notice to 14 days in induction medium the formation of the first divisions procambium cells and perivasculary. This region has progressed to the formation of meristematic masses after 21 days, indicating their procambial and perivasculary. Primary callus appeared after 45 days of culture, followed by progression to embryogenic callus at 90 days. The formation of proembrions from meristematic cells, occurred after 135 of cultivation. The proembrions presented them selves isolated from the tissue of origin, by thickening the cell wall, indicating their unicellular origin. When transferred to the maturation phase in culture MTD -1 (0.6 μM NAA and 12.3 μM 2-iP) and MTD-2 (40 μM picloram), we observed the regeneration of somatic embryos at different stages development (globular-torpedo). The embryos were differentiated protoderm, strands of procambium and plumule. They were then transferred to culture medium free of growth regulators (regeneration phase plants), which was observed in the conversion of embryos into plants. The accumulation of starch during the process of somatic embryogenesis was concentrated near the centers of intense cell division, and the cortex of primary and embryogenic callus. However, in different stages of somatic embryos was not observed the accumulation of starch. Already proteomic analysis has identified proteins involved in the acquisition of embryogenic competence. Proteins were categorized into seven groups according to their biological function as well as by participating in different metabolic pathways: 1) proteins expressed in stress conditions, 2) proteins involved in cell cycle, 3) proteins involved in the accumulation of starch, 4) energy metabolism proteins, 5) protein of nitrogen metabolism, 6) processing of proteins and 7) proteins of zygotic embryo. Knowledge of the in vitro reconstitution of the events, physiological, genotypic ontogenetic and biochemical factors involved in somatic embryogenesis in E. guineensis enable a greater understanding of the kind of cloning, whether for the production of seedlings in scale, is to accelerate breeding programs of culture. / Este trabalho tem como objetivo avaliar respostas genotípicas durante a embriogênese somática a partir de embriões zigóticos de dendezeiros (Elaeis guineensis Jacq.), bem como avaliar a ontogênese e identificar proteínas diferencialmente expressas durante as diferentes etapas do processo embriogênico. Foram utilizados embriões zigóticos de nove genótipos: C2001, C2328, C2301, C3701, CM1115, C7201, C2528, C2501 e CN1637. Inicialmente, os embriões zigóticos foram inoculados em meio de cultura para a indução de calos (450 μM de Picloram), com subcultivos a cada 30 dias. Após 150 dias, os calos foram transferidos para dois meios de cultura visando à diferenciação e maturação de embriões somáticos: MTD -1 (0,6μM de ANA e 12,3 μM de 2-iP) e MTD-2 (40 μM de Picloram). Após 90 dias, os calos com embriões somáticos foram transferidos para o meio de regeneração, desprovido de reguladores de crescimento. Em todas as etapas os explantes foram mantidos em sala de crescimento com temperatura de 25±2ºC e sob condições de escuro. A análise mofo-anatômica foi realizada durante todo o processo embriogênico. Já a análise proteômica foi coletada amostras dos embriões zigóticos (E1), explantes intumescidos com 14 dias (E2) em meio de indução, calo primário (E3) e calo pró-embriogênico (E4). Verificou-se que os genótipos testados apresentam diferentes respostas morfogênicas in vitro. Na fase de indução, os genótipos C2501, C2001, C7201, C2528, C2328 e C3701 apresentaram os melhores resultados na formação de calos embriogênicos, com valores entre 90 e 100%. Após 90 dias de regeneração, os genótipos que apresentaram os melhores resultados para formação e regeneração de embriões somáticos foram o C2328 e CM1115. As analises anatômicas permitiram observar aos 14 dias em meio de indução a formação das primeiras divisões nas células procâmbiais e perivasculares. Essa região progrediu para a formação de massas meristemáticas, após 21 dias, indicando sua origem procambial e perivascular. Calos primários surgiram após 45 dias de cultura, seguido da progressão para calos embriogênicos aos 90 dias. A formação de proembriões, a partir das células meristemáticas, ocorreu após 135 de cultivo. Os proembriões apresentavam-se isolados do tecido de origem, pelo leve espessamento da parede celular, indicando sua origem unicelular. Quando transferidos para fase de maturação, nos meios de cultura MTD -1 (0,6μM de ANA e 12,3 μM 2-iP) e MTD-2 (40 μM picloran), observou-se a regeneração de embriões somáticos em diferentes estágios de desenvolvimento (globular-torpedo). Os embriões diferenciados apresentaram protoderme, cordões de procâmbio e plúmula. Em seguida foram transferidos para o meio de cultura isento de reguladores de crescimento (fase de regeneração de plantas), no qual foi observada a conversão dos embriões somáticos em plantas. O acúmulo de amido durante o processo de embriogênese somática concentrou-se próximos aos centros de intensa divisão celular, e no córtex dos calos primários e embriogênicos. No entanto, nos diferentes estágios de embriões somáticos não foi observado o acúmulo de amido. Já a análise proteômica identificou proteínas envolvidas no processo de aquisição da competência embriogênica. As proteínas foram categorizadas em sete grupos de acordo com sua função biológica, bem como pela participação em vias metabólicas distintas: 1) proteínas expressas em condições de estresse; 2) proteínas envolvidas no ciclo celular; 3) proteínas envolvidas no acúmulo de amido; 4) proteínas do metabolismo energético; 5) proteína do metabolismo do nitrogênio; 6) processamento das proteínas; e 7) proteínas do embrião zigótico. O conhecimento da reconstituição in vitro dos eventos, fisiológicos, genotípicos, ontogênicos e bioquímicos, que envolvem o processo de embriogênese somática em E. guineenses, permiti um maior entendimento da clonagem da espécie, seja para a produção de mudas em escala, seja para acelerar programas de melhoramento genético da cultura.

A cultura do cacaueiro (Theobroma cacao L.) na região sul da Bahia foi dizimada com a introdução do fungo Moniliophthora perniciosa. Novas fontes de resistência têm sido buscadas e alternativas são necessárias para assegurar a produção de cultivares considerando a variabilidade genética do patógeno. A descoberta de genes de resistência e de defesa presumíveis a partir de abordagens genômicas impõe a necessidade de estabelecimento de uma plataforma de análise funcional para comprovar a função dos genes identificados e/ou esclarecimento dos mecanismos envolvidos; isto requer o desenvolvimento de métodos de manipulação e/ou inserção de genes, permitindo a superexpressão ou silenciamento de genes de interesse. Os primeiros cacaueiros transgênicos só foram desenvolvidos a poucos anos, e a eficiência do processo ainda é limitada. Há grande influência genotípica na capacidade embriogênica, que reduz a eficiência de obtenção de transgênicos. Micro-Tom tem sido considerado um modelo para pesquisas em tomateiro, sendo uma cultivar miniatura, ciclo de vida curto, porte reduzido e de fácil transformação. MT pode ser usada no estudo da interação com o fungo M. perniciosa, visto a disponibilidade de isolados do biótipo-S que infectam o tomateiro, assim disponibilizando informações dos mecanismos de defesa do T. cacao a M. perniciosa em um menor tempo, suprindo alguns obstáculos encontrados nas características biológicas do cacaueiro. Considerando que durante a patogênese do cacaueiro, M. perniciosa é capaz de desencadear a morte celular programada no tecido infectado, foi analisada a hipótese de que a expressão de genes anti-apoptóticos diminuiria ou minimizaria os efeitos da infecção, permitindo uma menor susceptibilidade. Para tal, foi clonado o gene da proteína Bax-inhibitor-1, que atua como atenuador basal para a progressão da morte celular, e desenvolvida uma construção. Esse gene havia sido detectado numa biblioteca da interação M. perniciosa x T. cacao e identificado com sequência completa, e foi re-introduzido em tomateiro e cacaueiro sob controle de promotor constitutivo. Para o modelo genético MT, plantas transgênicas contendo Bax-inhibitor-1, SKP1 e Cafeína sintase foram obtidas. Plantas transgênicas de tomateiro contendo o gene Bax-inhibitor-1 foram inoculadas com M. perniciosa e demonstraram redução no número de plantas sintomáticas (40%), quando comparadas as plantas de MT inoculadas com o mesmo patógeno (83%). Esses dados corroboram com resultados das inoculações com os fungos necrotróficos B. cinerea, S. sclerotium e S. rolfsii, sendo que as plantas transgênicas inoculadas também apresentaram contenção dos sintomas dessas doenças, uma redução de 40% da área de infecção em comparação as plantas de MT infectadas. Desse modo, pode-se concluir que o gene Bax-inhibitor-1 em MT agiu de forma basal na atenuação da progressão da morte celular, reduzindo os sintomas da vassoura-de-bruxa, da mesma forma que esse transgene contribuiu na redução dos sintomas do mofo cinza, mofo branco e murcha-de-esclerócio, por conter o crescimento e desenvolvimento dos fungos inoculados em tomateiro. Foi possível otimizar o protocolo de embriogênese somática e de transformação genética de cacaueiro, o que levou a obtenção de plantas transgênicas contendo a construção Bax-inhibitor-1, confirmadas por RTqPCR. Indicando que a abordagem de transformação de cacaueiro está implementada no laboratório, porém a baixa eficiência do processo e o tempo necessário ainda impedem seu uso em larga escala para análise funcional / The cultivation of cocoa (Theobroma cacao L.) in south Bahia was decimated by the introduction of the fungus Moniliophthora perniciosa. New sources of resistance have been sought and alternatives are needed to ensure the production of cultivars considering the genetic variability of the pathogen. The discovery of genes for resistance and defense presumed from genomic approaches makes it necessary the establishment of a platform to verify the function of identified genes and/or the elucidation of the mechanisms involved; this requires the development of methods for manipulating and/or insertion of genes, allowing overexpressing or silencing of genes of interest. The first transgenic cocoa were only developed a few years ago, and the efficiency of the process is still limited. There is an expressive influence of the embryogenic capacity, which reduces the efficiency of obtaining transgenic plants. The cultivar Micro-Tom (MT) is considered a model for research on tomato, since it has a miniature size, short life cycle, and facile genetic transformation. MT can be used to study the interaction with the fungus M. perniciosa, since isolates of biotype-S are able to infect tomato, thus provinding inferences about defense mechanisms of T. cacao to M. perniciosa in a short time, providing some obstacles encountered in biological characteristics of cocoa. Since during the pathogenesis of cocoa, M. perniciosa is able to trigger programmed cell death in infected tissue, it was analyzed the hypothesis that the expression of anti-apoptotic genes diminish or minimize the effects of infection, allowing less susceptibility. To this end, was cloned the protein Bax-inhibitor-1, which acts as a basal attenuator for the progression of cell death, was cloned engineered in a vector for genetic transformation. This gene was detected in a library of interaction M. perniciosa x T. cacao and identified with the complete sequence, and was re-introduced into tomato and cocoa under the control of a constitutive promoter. For the genetic model MT, transgenic plants containing Bax-inhibitor-1, SKP1 and Caffeine synthase were obtained. Transgenic tomato plants containing the gene Bax-inhibitor-1 were inoculated with M. perniciosa and demonstrated a reduction in the number of symptomatic plants (40%) compared MT plants inoculated with the same pathogen (83%). These data corroborate results of inoculations with the necrotroph fungi B. cinerea, S. sclerotium e S. rolfsii. Thus, when transgenic plants were inoculated, it was observed a reduction of 40% in the area of infection, compared to infected MT plants. Taken together, the results indicate that the gene Bax-inhibitor-1 acted in the basal attenuation of progression of cell death in MT, reducing the symptoms of the witches\' broom disease, as well as the symptoms of gray mold, white mold and wilt esclerotia. Moreover it was possible to optimize the protocol for somatic embryogenesis and genetic transformation of cocoa, which led to the production of transgenic plants containing the construct Baxinhibitor- 1, confirmed by RT-qPCR. Although, a protocol for cocoa transformation was implemented in the laboratory, its the low efficiency and the time required still prevent its widespread use for functional analysis

Araucaria angustifolia é a única conífera nativa com importância econômica no Brasil. A espécie está incluída na lista oficial de espécies de plantas ameaçadas de extinção. A embriogênese somática é considerada como uma das ferramentas biotecnológicas mais promissoras na área de biotecnologia de plantas. A identificação de marcadores, que possam ser utilizados, para a seleção de genótipos aptos ao desenvolvimento do embrião somático é altamente desejável, uma vez que o desenvolvimento apropriado do embrião somático é extremamente dependente do genótipo. O presente trabalho teve como objetivo estudar e identificar marcadores bioquímicos e moleculares associados à competência para embriogênese somática em A. angustifolia. Culturas embriogênicas de genótipos com diferentes potenciais embriogênicos apresentaram diferenças nos parâmetros bioquímicos e moleculares avaliados (Poliaminas, expressão dos genes AaSERK1 e AaPP2C, proteoma). O presente trabalho propõe a utilização destes parâmetros como possíveis marcadores do potencial embriogênico no sistema A. angustifolia. / The Araucaria angustifolia is the only native conifer species with economical importance in Brazil. Recently, the species was included in the official list of endangered plant species. Somatic embryogenesis, i.e., in vitro asexual production of embryos is considered one of the most promising biotechnological tools in the area of plant biotechnology. Since the development of somatic embryos is dependent of the genotype, the identification of markers that could be used in the selection of genotypes which can develop somatic embryos is highly desirable. The main objective of the present work is to study and identify biochemical and molecular markers associated with competence for somatic embryogenesis in A. angustifolia. The evaluation of biochemical and molecular aspects (Polyamines, AaSERK1 and AaPP2C gene expression and proteome) indicated differences between embryogenic cultures of genotypes with different embryogenic potential. This work proposes the utilization of these parameters as possible markers of embryogenic potential in the system A. angustifolia.

A teca (Tectona grandis L. f) é uma espécie lenhosa originária da Ásia que possui grande interesse econômico devidos as características nobres de sua madeira. Muito usada para construção de embarcações e móveis de luxo para exposição em ambientes abertos, seu consumo tem aumentado a cada ano, principalmente nos países produtores. Com a pressão das políticas ambientais sobre o uso da madeira de espécies nativas, a teca se mostra uma ótima alternativa para o mercado de madeira serrada. Contudo, a produção comercial desta espécie encontra algumas barreiras, sendo a principal delas, a propagação de matrizes adultas cujas características se adequam ao manejo silvicultural. Para possibilitar a reprodução fiel das árvores selecionadas e, para se realizar o rejuvenescimento do material adulto procedente dessas matrizes, faz-se uso de algumas técnicas, sendo uma delas, o uso da cultura de tecidos. Uma maneira bastante considerada no processo de rejuvenescimento e obtenção de mudas de espécies agrícolas e florestais é a formulação de protocolos de embriogênese somática. A embriogênese somática pode ser descrita como o processo pelo qual células somáticas desenvolvem estruturas semelhantes a embriões zigóticos, por meio de uma sequência ordenada de estágios embriogênicos característicos, sem ocorrência de fusão de gametas. Para tanto, o desenvolvimento de um protocolo eficiente de tal técnica exige muitos estudos preliminares. Com isso, o presente trabalho teve como objetivo estudar a calogênese em diferentes explantes de teca, através de uma sequência de indução utilizando difrentes fitorreguladores visando a obtenção de embriões somáticos. Para avaliar a resposta dos calos a cada etapa da indução foram realizadas análises histológica e histoquímica dos tecidos. Como respostas foram encontrados os balanços auxina/citocinina mais adequado para produção de calos, sendo eles 1,5/1,0 e, 1,5/4,0mgL-1 de picloram e BAP respectivamente. Verificou-se que o pulse com TDZ foi responsivo na obtenção de massas próembriogênicas, e que o uso da zeatina e da glutamina, não favorecem a maturação de tais estruturas, além de ocasionarem a morte celular programada das células da massa calosa. Contudo, os resultados mostram-se positivos e auxiliam na formulação de novos tratamentos e técnicas de indução da embriogênese somática para a espécie estudada. / Teak (Tectona grandis L. f) is a native woody species from Asia that has great economic interest due the noble characteristics of its wood. Widely used for building ships and luxury furniture for display outdoors, their consumption has increased every year, especially in producing countries. With the pressure of environmental policies on the use of native species of wood, teak shown a great alternative to the market for lumber. However, commercial production of this species has some barriers, the main one, being the propagation of mature breeders whose characteristics are suited to forestry management. In order to enable the faithful reproduction of the selected trees, and to perform the rejuvenation of these matrices derived of adult material, some techniques can be used, one of them is the use of tissue culture. Considered in a way quite rejuvenating and seedlings of agricultural and forest species process is the formulation of somatic embryogenesis protocols. Somatic embryogenesis can be described as the process by which somatic cells develop structures similar to zygotic embryos, through an ordered sequence of characteristic embryogenic stages without occurrence of the fusion of gametes. Thus, the development of an efficient protocol for this technique requires a lot of preliminary studies. Thus, the present work aimed to study the callus induction in different explants of teak, through a sequence induction using different growth regulators in order to obtain somatic embryos. To assess the response of each stage during callus induction, histological and histochemical tissue analysis were performed. Responses as the most suitable for callus production auxin / cytokinin balance sheets were found, they 1.5 / 1.0 and 1.5 / 4,0mgL-1 picloram/BAP, respectively. It was found that TDZ pulse was responsive to obtain pro-embryogenic masses, and that the use of zeatin and glutamine, are not conducive to maturation of such structures, and enacting the programmed cell death of the cell calli mass. However, the results show up positive and assist in the formulation of new treatments and techniques for induction of somatic embryogenesis of this species.

O presente projeto analisou o perfil dos ácidos graxos, embriogênese e ontogenia do sistema digestório das larvas da garoupa verdadeira Epinephelus marginatus durante os primeiros dias de desenvolvimento. Além disso, descrevemos como os embriões se dividem, eclodem e desenvolvem suas principais características, e como se desenvolve seu sistema digestório ao longo dos primeiros dias de desenvolvimento, e como utilizam os AG durante os primeiros 8 dias de desenvolvimento. Observamos que as larvas da garoupa apresentam desenvolvimento de suas estruturas digestórias relativamente lento, no entanto, estas são capazes de capturar, ingerir e digerir presas já a partir do 4º DAE. Os ovos da garoupa verdadeira são compostos por elevados percentuais de PUFA nos fosfolipídios e para o processo de eclosão utilizam preferencialmente os SFA dos fosfolipídios. Além disso, os PUFA da série n3 sobrepõe-se aos da série n6, principalmente o DHA, que apresentaram valores elevados em comparação com outras espécies marinhas tanto nos fosfolipídios quanto nos triglicérides nos três primeiros dias de desenvolvimento. As larvas apresentam uma elevada necessidade dos HUFAs DHA/EPA, e durante essa fase é importante a utilização de alimento vivo de tamanho reduzido (copépodes ou “SS strain” Brachionus rotundiformes) enriquecidos com valores da relação entre DHA/EPA acima de 2,0. Com isso, todo o conhecimento gerado durante esses dias de desenvolvimento já permitem a aplicação deste conhecimento no processo de embriogênese e larvicultura da garoupa verdadeira contribuindo para alavancar sua domesticação e produção em cativeiro e elaborar futuramente um programa de repovoamento desta espécie contribuindo para sua conservação. / This project analyzed the fatty acids profile, embryogenesis and ontogeny of the digestive system of dusky grouper Epinephelus marginatus larvae during the first days of development. Furthermore, we described how the embryos are divided, hatch and develop its main features, and how develops its digestive system during the first days of development, and how they use the FA during the first 8 days of development. We observed that the grouper larvae present relative slow development of their digestive structures, however, the larvae are able to capture, ingest and digest preys already from 4º DAE. The dusky grouper eggs are composed by high percentages of PUFA in phospholipids and for the hatching process it uses preferably the SFA of phospholipids. Additionally, the n3 series PUFAs overlaps the n6 series, especially DHA, which exhibited high values compared to other marine species both on phospholipids as in the triglycerides during the first three days of development. The larvae exhibit a high requirement of HUFAs DHA/EPA, and during this phase is important to use live food of small size (copepods or “SS strain” Brachionus rotundiformes) enriched with the ratio of DHA/EPA levels above 2.0. Thus, all the knowledge generated during these days of development allow us the application of this knowledge in the embryogenesis and hatchery process of the dusky grouper contributing to leverage its domestication and production in captivity and eventually draw up a restocking program of this species contributing to their conservation.

A família Bromeliaceae apresenta importância ecológica e econômica, desta forma, o desenvolvimento de protocolos para a micropropagação de espécies dessa família, faz-se necessário, a fim de suprir sua demanda comercial e mesmo ecológica. A escolha do meio de cultura e do explante utilizado durante a micropropagação são fundamentais para um protocolo eficaz. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar as diferenças quantitativas e qualitativas no desenvolvimento de explantes de Neoregelia sp em meios de cultura e monitorar as vias morfogênicas dos propágulos obtidos em explantes foliares. Para tanto, brotos de microcepas e explantes foliares procedentes de um micro jardim clonal, foram transferidos para os meios de cultura de multiplicação MS, ½ MS e WPM, todos suplementados com 0,050 mg.L-1 ANA e 0,50 mg.L-1 de BAP, onde foram mantidos por 120 dias e submetidos a diversas análises morfofisiológicas. Paralelamente, explantes foliares foram mantidos em meio de cultura MS de multiplicação para o monitoramento das vias morfogênicas durante os processos regenerativos. Para os experimentos com brotos de microcepas verificou-se que o meio de cultura MS proporcionou a melhor taxa de multiplicação, maior crescimento dos brotos, obtendo os valores mais elevados de peso de matéria fresca e seca, além disso, apresentaram maior acúmulo de nitrogênio total e proteico. No entanto, os meios de cultura ½ MS e WPM promoveram uma taxa de multiplicação semelhante a do MS, mas com brotos menores e menos vigorosos, porém, mais homogêneos, com isso, na dependência do objetivo do cultivo in vitro, não deve ser desconsiderada a possibilidade de utilização dos meios de cultura ½ MS e WPM. Os explantes foliares não se desenvolveram bem no meio de cultura WPM, não havendo diferença entre os meios MS e ½ MS, visto que ambos apresentaram resultados satisfatórios. As análises histológicas e histoquímicas identificaram células parenquimáticas, que atuam como células-tronco, manifestando capacidade morfogênica para toti ou pluripotência, dando origem respectivamente a embriões somáticos e gemas adventícias, em resposta aos estímulos in vitro. / The Bromeliaceae family has an ecological and economic importance, therefore, the protocols development for micropropagation of species of this family becomes necessary in order to meet its business and even its ecological demand. The choice of culture medium and the explant used during micropropagation are essential for an effective protocol. Thus, the aim of this study was to evaluate the quantitative and qualitative differences in the explants development of Neoregelia sp in the culture media and monitor the morphogenetic pathways of obtained propagules from leaf explants. Consequently, shoots and leaf explants coming from microcloning garden were transferred to the MS, ½ MS and WPM multiplication culture media, all supplemented with 0.050 mg.L-1 NAA and 0.50 mg.L-1 BAP, where they were held for 120 days and submitted to morphological and physiological analysis. Therefore, leaf explants were kept on MS-medium multiplication for monitoring morphogenetic pathways during the regenerative processes. Furthermore, MS medium showed the best multiplication rate for the sprouts of the microstumps, increased growth of shoots, obtaining the highest values of fresh and dry matter weight, and also showed higher accumulation of total nitrogen and protein. However, the ½ MS and WPM culture media promoted a similar multiplication rate to the MS medium, with the development of the smaller and less vigorous shoots, but with greater homogeneity. This way, depending on the purpose of in vitro culture, their use in the micropropagation for this species should not be disregarded. The leaf explants are not well developed in WPM medium, and don\'t had significant difference between the MS and ½ MS culture medium, as both showed satisfactory results. The histological and histochemical analysis identified the presence of the parenchymatic cells, which act as stem cells, expressing morphogenic ability for toti or pluripotency, leading respectively to somatic embryogenesis or adventitious organogenesis in response to in vitro stimuli.

RIC-8B é um fator trocador de nucleotídeo de guanina (GEF) predominantemente expresso em neurônios olfatórios maduros de camundongos adultos. Trabalhos desenvolvidos em nosso laboratório mostraram que RIC-8B interage com Gαolf e Gγ13, duas subunidades de proteína G que estão enriquecidas nos cílios dos neurônios olfatórios, onde participam da transdução do sinal de odorantes. In vitro, RIC-8B é capaz de amplificar a sinalização de receptores olfatórios através de Gαolf, no entanto, seu papel fisiológico ainda é desconhecido. Para determinar a função desempenhada por essa proteína in vivo, nós utilizamos a tecnologia de Gene Trap com o objetivo de produzir um camundongo knockout para Ric-8B. Apesar de a expressão de Ric-8B ser restrita a poucos tecidos no camundongo adulto, descobrimos que homozigotos para a mutação em Ric-8B são inviáveis e morrem por volta do dia embrionário E10,5. Além disso, são menores e apresentam evidente falha no fechamento do tubo neural na região cranial (exencefalia). Utilizamos o gene repórter β-galactosidase expresso pelo alelo mutado para determinar o padrão de expressão de Ric-8B em embriões durante o desenvolvimento. Observamos que, no estágio E8,5, Ric-8B é expresso nas pregas neurais da região cefálica e na notocorda. De E9,5 a E12,5, a expressão de Ric-8B é detectada predominante no assoalho da placa. Esse padrão de expressão se assemelha ao de outro gene importante para a embriogênese, Sonic hedgehog (Shh). SHH é um morfógeno diretamente responsável pela padronização dorsoventral do sistema nervoso central e sua sinalização depende de cílio primário. Cílio primário é uma organela baseada em microtúbulos que se projeta da superfície da maioria das células de mamíferos e funciona como um centro de sinalização intracelular. Nossos dados mostram que fibroblastos embrionários Ric-8B-/- formam cílios primários, assim como alguns tecidos do embrião. Além disso, não encontramos alterações na sinalização de Shh em embriões homozigotos mutantes. No entanto, observamos que esses embriões apresentam apoptose aumentada em células migratórias da crista neural cranial. Shh é importante para a sobrevivência de células da crista neural migratória, sugerindo um possível papel para Ric-8B a downstream da sinalização de SHH. / Ric-8B is a guanine nucleotide exchange factor (GEF) which is predominantly expressed in mature olfactory sensory neurons in adult mice. We have previously shown that RIC-8B interacts with both Gαolf and Gγ13, two G protein subunits, which are enriched in olfactory cilia and are required for odorant signal transduction. In vitro, RIC-8B is able to amplify odorant receptor signaling through Gαolf, however, its physiological role remains unknown. To determine the role played by RIC-8B in vivo we used the Gene trap technology to generate a Ric-8B knockout mouse. We found that, despite the limited distribution of Ric-8B gene expression in adult mice, Ric-8B homozygous mutants are not viable and die around the E10,5 stage. Mutant embryos are also smaller and fail to close the neural tube at the cranial region (exencephaly). We used the activity of the β-galactosidase reporter gene to determine the pattern of expression of the Ric-8B gene in heterozygous embryos. At E8,5 the Ric-8B gene is expressed in the notochord and neural folds of the cephalic regions. From E9,5 to E12,5 Ric-8B is predominantly expressed in the floor plate, in a pattern that strongly resembles the one shown by Sonic hedgehog (Shh). SHH is a morphogen directly responsible for the dorsoventral patterning of the central nervous system and its signaling depends on primary cilia. Primary cilia are microtubule-based organelles that protrude from the surface of mammalian cells and act as a signaling center. We show that Ric-8B-/- embryonic fibroblasts and some embryonic tissues grow primary cilia normally. In addition, we did not find alterations in the SHH signaling of homozygous mutants. Instead, we found an increased apopotosis in migratory cells of the cranial neural crest in these embryos. Shh is an important factor to survival of neural crest cells, suggesting a role for RIC-8B downstream of the SHH signaling.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-01-04T16:13:07Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2270833 bytes, checksum: 96aab99f6b70bd80954147ae97d70a12 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-04T16:13:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2270833 bytes, checksum: 96aab99f6b70bd80954147ae97d70a12 (MD5) Previous issue date: 2016-09-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O objetivo do presente estudo foi determinar o conjunto de fatores que interferem nos estágios iniciais da embriogênese somática de Eucalyptus, tendo por base os seguintes objetivos específicos: 1) verificar o efeito de tipos de explantes, tipos e concentrações de auxinas na indução; tipos de meio de cultura e concentrações de auxina na proliferação de embriões somáticos em explantes juvenis de Eucalyptus grandis x E. urophylla; 2) verificar o efeito de concentrações e fontes de cálcio; concentrações e tempo de efeito de citocinina e poliamina, na indução e desenvolvimento de embriões somáticos em explantes juvenis de Eucalyptus grandis x E . urophylla; 3) verificar o efeito do pulso de auxina em diferentes estágios de desenvolvimento de embriões somáticos em explantes juvenis de Eucalyptus grandis x E . urophylla; 4) estimar a correlação genética entre as características de indução de embriões somáticos, além de estudar o controle genético relacionado às mesmas a fim de averiguar sua utilidade na seleção de genótipos com competência embriogênica de clones híbridos de Eucalyptus. A indução de pró-embriões somáticos de Eucalyptus grandis x E. urophylla pode ser obtida utilizando sementes ou cotilédones como fonte de explantes, e dicamba e picloram como reguladores de crescimento adicionados ao meio de cultura. Para a obtenção de médias mais altas no porcentual de indução de pró-embriões somáticos deve-se utilizar picloram e cotilédones como fontes de explantes. Para a proliferação de pró-embriões somáticos secundários, pode-se utilizar meio de cultura líquido adicionado de picloram. O meio de cultura JADS proporcionou maior calogênese em explantes cotiledonares de Eucalyptus grandis x E. urophylla, quando comparado ao meio de cultura MS. A adição de 28,36 μM de putrescina ao meio de cultura proporcionou maior porcentual de indução de embriogênese somática nesses mesmos explantes. O número de pró-embriões somáticos formados por explante foi superior quando se acrescentou BAP e principalmente putrescina ao meio de cultura se comparado com o meio contendo somente picloram. Acréscimos na concentração de cálcio nos meios MS e JADS não proporcionam melhorias no que se refere à indução de embriogênese somática. Tratamentos com pulso da auxina picloram (207,02 μM) podem ser utilizados como fonte de estresse inicial para aquisição da competência embriogênica em explantes cotiledonares em Eucalyptus grandis x E. urophylla. A indução média de calos embriogênicos foi superior no intervalo de dois dias de pulso de auxina, em relação aos outros dois intervalos testados tanto aos 30 dias, como aos 37 e 44 dias de avaliação. A oxidação dos explantes, quando colocados em meio de indução, pode ser considerada um indício de formação de calos embriogênicos. A presença de pectinas em regiões periféricas de pró-embriões somáticos pode ser vista como marcador de embriogênese somática em explantes cotiledoneres de Eucalyptus gradis x E. urophylla. A característica porcentual de pró-embriões somáticos apresenta controle genético. A correlação genética alta e positiva entre calogênese em média intensidade e indução de pró-embriões somáticos indica que a seleção para a primeira característica resulta em consistentes respostas na segunda. Os híbridos triplos utilizados no presente estudo apresentaram maiores valores genéticos para porcentual de indução de pró- embriões somáticos, quando comparados aos demais híbridos estudados, indicando maior facilidade na indução de embriogênese somática para essa espécie. / The objective of this study was to determine the set of factors that interfere in the early stages of somatic embryogenesis of Eucalyptus, and by the following specific objectives based on: 1) verify the effect of explants types, types and concentrations of auxin in the induction; types of culture media and auxin concentrations on the proliferation of somatic embryos in juvenile explants of Eucalyptus grandis x E. urophylla; 2) verify the effect of concentrations and sources of calcium; and cytokinin and polyamine concentrations and effect of time, in the induction and development of somatic embryos in juvenile explants of Eucalyptus grandis x E. urophylla; 3) verify the effect of auxin pulse at different stages of development of embryos in juvenile explants of Eucalyptus grandis x E. urophylla; 4) estimate the genetic correlation between the somatic embryo induction characteristics, in addition to studying the genetic control related to them to ascertain its usefulness in the selection of genotypes with embryogenic competence of hybrid clones of Eucalyptus. The induction of somatic pro-embryos of Eucalyptus grandis x E. urophylla. can be obtained using cotyledon or seed as a source of explants, dicamba and picloram as growth regulators added to the culture medium. However, to obtain higher means the percentage of somatic pro-embryos induction should be used picloram and cotyledon as source of explants. For the proliferation of secondary somatic pro-embryos may be used a liquid culture medium added picloram. The JADS culture medium showed higher callus formation in cotyledon explants of Eucalyptus grandis x E. urophylla when compared to MS medium. Addition of 28.36 μM of putrescine to the culture medium provided a higher percentage of somatic embryogenesis induction in these same explants. The number of somatic pro-embryos formed per explant was higher when added BAP and mainly putrescine to the culture medium compared to medium containing only picloram. Increases in calcium concentration in the MS and JADS media does not provide improvements with regard to the induction of somatic embryogenesis. Treatments with pulse auxin picloram (207.02 μM) can be used as a source of initial stress for the acquisition of embryogenic competence in cotyledons and Eucalyptus grandis x E. urophylla. The average of embryogenic callus induction was better in the interval of two days auxin pulse of the two other ranges tested both after 30 days and after 37 and 44 days of assessment. Oxidation of the explants, when placed on induction medium, can be considered a sign of formation of embryogenic callus. The presence of pectin in peripheral regions of somatic pro-embryos can be seen as a marker of somatic embryogenesis in cotyledon explants of Eucalyptus grandis x E. urophylla. The characteristic percentage of somatic pro-embryos has genetic control. High and positive genetic correlation between callus formation in average intensity and somatic pro-embryos induction indicates that selection for the first feature should lead to consistent responses in the second. Tree-cross hybrids used in this study showed higher genetic values of somatic pro-embryos induction when compared to other hybrids studied, indicating greater ease in inducing somatic embryogenesis in this species.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-07-12T11:23:59Z No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 481123 bytes, checksum: d6da385743a9569392c17fb1a9d1e9cc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-12T11:23:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 481123 bytes, checksum: d6da385743a9569392c17fb1a9d1e9cc (MD5) Previous issue date: 2002-02-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Avaliou-se o potencial genético de nove cultivares de soja em relação à embriogênese somática utilizando 2,4-D como agente indutor a fim de selecionar os genótipos mais responsivos para serem transformados com o gene que codifica a citrato sintase (CS). Foi verificado um efeito marcante do genótipo nas respostas morfogênicas. Os cultivares Spring, CAC-1 e COODETEC 201 apresentaram as melhores respostas, com médias de produções de embriões por cotilédone de 32,63, 27,60 e 26,80, respectivamente. Cinco cultivares foram utilizados na fase de proliferação. Destes, os cultivares CAC-1 e Spring apresentaram altas freqüências de formação de agregados de embriões secundários, 90,6% e 91,6%, respectivamente. Para avaliar a fidelidade genética das plantas regeneradas por este sistema embriogênico foram utilizados marcadores RAPD. Vinte “primers” foram usados para avaliar 44 regenerantes do cultivar Spring e 28 do cultivar CAC-1. Três “primers” apresentaram bandas polimórficas para dois regenerantes do cultivar Spring, em relação à planta matriz, com uma freqüência de variação somaclonal de 4,5%. Para ‘CAC-1’, quatro “primers” mostraram polimorfismos em um regenerante, com freqüência de variação de 3,5%. Estes resultados mostram que marcadores RAPD podem ser utilizados para assegurar a estabilidade genética de plantas regeneradas via sistema de embriogênese somática em soja, garantindo a fidelidade genética dos regenerantes. A taxa de variação somaclonal, avaliada em nível molecular, foi relativamente baixa para as plantas regeneradas (menor que 5%) quando comparado às relatadas para outras espécies. Portanto, o protocolo de embriogênese somática com 180 μM de 2,4-D foi usado para obter plantas de soja geneticamente modificadas com o gene CS. Após seleção dos cultivares mais responsivos à embriogênese, seguiu-se a transformação genética. Cotilédones dos cultivares Spring e CAC-1 foram utilizados para avaliar o nível de expressão transitória em resposta à transformação mediada por Agrobacterium com o auxílio da sonicação. O tempo de sonicação foi de 2 segundos e os cotilédones foram co-cultivados em meio MSD40 suplementados e não-suplementado com acetossiringona (100 μM). A freqüência relativa da expressão transitória de gene GUS, na face adaxial dos cotilédones, foi de 13,9% e 19,3% para os cultivares CAC-1 e Spring, respectivamente, quando acetossiringona foi empregado. Porém, na ausência de acetossiringona, a freqüência relativa reduziu para 0,37% e 1,46% para CAC-1 e Spring, respectivamente. A avaliação da expressão transitória na otimização de sistemas de transformação serviu como suporte para transformação com o gene CS. Agregados de embriões do cultivar CAC-1 foram transformados com o gene (CS) de Daucus carota e de Escherichia coli. Um total de 26 embriões transformados com o gene CS de D. carota e 31 com o gene CS de E. coli chegaram à fase final para conversão em plantas. Quando colocados no meio de conversão e germinação o processo de conversão foi iniciado com a emissão dos primeiros folíolos. No entanto, logo em seguida iniciava um forte processo de necrose dos folíolos com conseqüente morte das plântulas. Sugere-se que o efeito necrótico observado nos folíolos das plântulas transgênicas poderia estar associado ao nível de expressão do gene CS. Uma superexpressão desse gene levaria ao acúmulo de citrato nas folhas, inibindo a respiração o que acarretaria acúmulo de piruvato. Piruvato em excesso na folha é utilizado na síntese de lactato, causando elevação na acidez. Este fato promoveria a necrose observada nos folíolos das plântulas de soja transformadas com o transgene CS. / The genetic potential of nine soybean cultivars were evaluated in relation to the somatic embryogenesis using 2,4-D as inductor in order to select the most responsive genotypes to be transformed with the gene that codifies citrate synthase (CS). It was observed a strong effect of the genotype in the morphogenic response. Spring, CAC 1 and COODETEC 201 cultivars showed the best answers, with averages of embryo production for cotyledon of 32.6, 27.6 and 26.8, respectively. Five cultivars were used in the proliferation phase. Of these, CAC 1 and Spring showed the highest frequencies in the formation of secondary embryo clusters, 90.6% and 91.6%, respectively. It was concluded that the embryogenic system optimized in this work can be employed for soybean transformation once a responsive cultivar is used. RAPD markers were used to evaluate genetic stability of regenerants of soybean plants obtained via somatic embryogenesis using 180 μM 2,4-D. Twenty primers were used for screening 44 regenerants from cultivar ‘Spring’ and 28 from cultivar ‘CAC 1’. Three primers were polymorphic for two of the Spring-derived regenerants, with a somaclonal frequency of 4.5 %. Four primers were polymorphic for the CAC 1-derived regenerant, with a somaclonal frequency of 3.57%. The present results indicate the usefulness of RAPD markers to detect genetic instability in soybean primary regenerant plants derived from somatic embryogenesis, and as a certification tool for monitoring genetic stability during the regeneration process. Therefore, the somatic embriogenesis protocol with 180 μM 2,4-D was used to obtain genetically modified soybean plants with the CS gene. Cotyledons of the cultivar Spring and CAC-1 were used to evaluate the transient expression level in response to sonication-assisted Agrobacterium- mediated transformation. The time of sonication was of two seconds and the cotyledons were co-cultivated in MSD40 medium supplemented or not with acetosyringone (100 μM). The relative frequency of transient expression of GUS gene, in the adaxial face of the cotyledons, was 13.9% and 19.3% for cultivar CAC-1 and Spring, respectively, when acetosyringone was used. However, in the absence of acetosyringone, the relative frequency reduced to 0.37% and 1.46% for CAC-1 and Spring, respectively. Optimization of the transient expression in transformation systems gave support for transformation with the CS gene. Embryo clusters of cultivar CAC-1 were transformed with CS gene from Daucus carota and from Escherichia coli. A total of 26 transformed embryos with the CS gene from D. carota and 31 with the CS gene from E. coli was obtained for conversion into plants. When these embryos were placed in the conversion and germination medium, the conversion process was initiated by emitting the first leaflets. However, soon after it began a strong necrosis took place of the leaflets with consequent death of the plants. It is suggested that the necrotic effect observed in the leaflets could be associated with the level of expression of the CS gene. Over expression of this gene would lead to citrate accumulation in the leaflets, inhibiting the respiratory process. That would induce piruvate accumulation. Piruvate in excess would be used for lactate synthesis, causing an increase of the acidity. This fact would promote the necrosis observed in the leaflets of the transformed soybean plants with the CS gene. / Tese importada do Alexandria