O desenvolvimento de uma resposta imune adequada é um processo extremamente importante para a manutenção da homeostase do organismo. Uma série de processos são desencadeados a partir do primeiro contato com micro-organismos patógenos até a efetivação da resposta imune de memória. Todos esses processos envolvem a participação e a complexa atuação de mediadores como as citocinas inflamatórias e também citocinas regulatórias, que exercerão efeitos controlando o processo inflamatório. Diversos mecanismos moleculares, subjacentes à resposta inflamatória, ainda não estão totalmente compreendidos, como por exemplo o controle da expressão de genes inflamatórios exercido pela IL-10. Os processos envolvidos na resposta inflamatória são mantidos às custas do consumo de nutrientes, dentre eles podemos destacar o aminoácido glutamina, que atua em nível molecular, fornecendo nitrogênio para a formação do material genético e fonte energética para determinadas células do sistema imunológico como os macrófagos. Portanto, neste trabalho, investigamos os efeitos da IL-10 na modificação de nucleossomos, evidenciando o papel dessa citocina em regular a expressão de genes inflamatórios em macrófagos. Avaliamos também a função da glutamina, modulando a expressão de RNAm de citocinas inflamatórias e regulatórias dessas células. E por último, desenvolvemos um modelo de restrição alimentar em camundongos, nos quais avaliamos os efeitos desse modelo considerando-se alguns aspectos hematológicos e estudamos as alterações na resposta inflamatória em células esplênicas e do peritônio, bem como avaliamos a suplementação de glutamina in vitro na produção das citocinas (IL-12, TNF-alfa, IL-10) e a expressão do fator de transcrição NFkB. Os resultados compilados mostraram que a IL-10 leva a uma rápida redução da acetilação de nucleossomos, modulando a arquitetura da cromatina de genes inflamatórios como a IL-12. A glutamina modula a expressão de citocinas inflamatórias, regulando positivamente a expressão de IL-10 e Interferon beta. E a restrição alimentar induz a redução de citocinas proinflamatórias (IL-12 e TNF-α), influenciadas pelo aumento da produção de IL-10 e finalmente a suplementação com glutamina não interfere nesses parâmetros nas células peritoneiais e esplênicas do grupo submetido à restrição alimentar. Conclusão: a IL-10 modula a expressão gênica através da modificação de nucleossomos em macrófagos derivados da medula; a glutamina modula a expressão de IL-10 inibindo a resposta inflamatória, e a restrição alimentar modula alguns aspectos hematológicos e possui propriedades anti-inflamatórias. / The development of an appropriate immune response is an important process to the organism\'s homeostatic maintenance. A series of processes are triggered upon the very first contact with pathogens, up to the immunological memory establishment. These processes implicate in the participation of complex mediators, such as inflammatory and regulatory cytokines that will control the inflammatory process. Some mechanisms underlying the inflammatory response are not totally understood, the control of inflammatory genes exerted by IL-10 is an example. The processes involved in the inflammatory response are kept with nutrients expense, among these nutrients we can highlight the amino acid glutamine. It acts in a molecular level, supplying nitrogen to genetic material formation and as an energy supply for immune cells such as macrophages. Thus, we investigated the IL-10 effects on nucleosome modifications evidencing this cytokine role regulating inflammatory genes expression in macrophages. We also evaluated glutamine functions modulating inflammatory and regulatory cytokines mRNA expression on these cells. Ultimately, we developed a dietary restriction animal model where we evaluated it\'s effects on selected haematological aspects, analyzing the alteration in the inflammatory response of splenic and peritoneal cells. We also evaluated in vitro glutamine supplementation assessing cytokines production (IL-12, TNF-α, and IL-10) and the expression of NFkB transcription factor. The compiled results a expressive reduction in nucleosome acetylation modifying the chromatin architecture of inflammatory genes such as IL-12 and IL-6. Glutamine modulates inflammatory cytokines gene expression upregulating the expression of IL-10 and interferon beta. The dietary restriction reduces proinflammatory cytokines production (IL-12 and TNF-α), these results are influenced by the upregulated IL-10 production, glutamine supplementation have no effect on these parameters in the dietary restriction group. In conclusion, we can infer that IL-10 modulates gene expression trough nucleosome modification in bone marrow derived macrophages, glutamine has a potential effect on IL-10 expression, inhibiting the inflammatory response and dietary restriction modifies hematological parameters, presenting anti-inflammatory properties.

Orientador: Agnes Cristina Fett-Conte / Banca: Ana Elizabeth Silva / Banca: Paula Rahal / Banca: Ana Luiza Bossolani Martins / Banca: Flávio Naoum / Resumo: Síndromes Mielodisplásicas (SMDs) é a denominação de um grupo de doenças neoplásicas clonais das células hematopoéticas, mais frequentemente observadas em idosos, caracterizadas por citopenias, displasia, hematopoese ineficaz e risco elevado para leucemia mielóide aguda (LMA). Citopenia(s) persistente(s), por mais de seis meses, e ausência de critérios diagnósticos para SMD, caracteriza a Citopenia Idiopática de Significado Indeterminado (ICUS). ICUS foi definida recentemente e é pouco conhecida quanto aos fatores etiológicos. Já as SMDs são consideradas protótipos de doenças epigenéticas, uma vez que distúrbios na metilação de alguns genes que regulam proliferação e diferenciação celular têm sido considerados fatores causais. O gene SOX17, por exemplo, é um supressor de tumor expresso em vários tecidos e alterações no seu padrão de metilação já foram observadas em tumores sólidos e neoplasias hematológicas, entretanto, foram pouco estudadas nas SMDs e não há descrições de estudos em ICUS. Do mesmo modo, alguns microRNAs vem sendo utilizados como marcadores moleculares para diagnóstico e prognóstico para diversas anormalidades hematológicas, mas seu papel na etiologia e desenvolvimento das SMDs também é pouco conhecido. Neste contexto, este estudo propos investigar o padrão de metilação do gene SOX17 por MSP-PCR em células da medula óssea (MO) de pacientes com SMD e ICUS ao diagnóstico, e analisar alterações no padrão de expressão de microRNAs por RT-PCR em células da MO de... / Abstract: Myelodysplastic syndromes (MDS) denominates a group of neoplastic diseases of the hematopoietic cells, most commonly observed in elderly patients, characterized by cytopenias, dysplasia, ineffective hematopoiesis and high risk of acute myeloid leukemia (AML). Persistent cytopenia (s), for more than six months, and absence of diagnostic criteria for MDS, characterizes Idiopathic Cytopenia of Undetermined Significance (ICUS). ICUS has been recently defined, and little is known about its etiological factors. The MDSs are considered as prototypes of epigenetic diseases, due to the fact that methylation disorders of some genes that regulate cell proliferation and differentiation have been considered as causal factors. The SOX17 gene, for example, is a tumor suppressor expressed in several tissues and changes in its methylation pattern have already been observed in solid tumors and hematological malignancy, however, these changes have been little studied in MDS and there are no descriptions of studies in ICUS. Similarly, some microRNAs are being used as molecular markers for diagnosis and prognosis for various hematological abnormalities, but its role in the etiology and development of MDS is also poorly understood. In this context, this study aimed to investigate the methylation pattern of the SOX17 gene by MSP-PCR in bone marrow (BM) cells of patients diagnosed with MDS and ICUS, and to analyze changes in the expression pattern of microRNAs by RT-PCR in cells of BM for adults and ... / Doutor

Stereotypic behaviour is considered an indicator of compromised welfare. We have conducted studies to test the controversial hypothesis that stereotypic behaviour helps animals to cope with challenges. We proposed that animals that do not express stereotypies could be under more compromised welfare, than the ones showing the behaviour, when exposed to difficult situations. Rather than asking to the animal if stereotypies are indicating good welfare, we assessed the effects on foetal programming. This study investigated the outcomes of stereotypies measured in sows (Sus scrofa) during gestation in shaping their offsprings phenotype measuring both behavioural and physiological indicators of welfare. Environmental enrichment is an efficient protocol, acting in the causal factors of stereotypies, such as motivational systems, to reduce repetitive, invariant behavioural patterns, defined as stereotypies. We demonstrated that stereotypies in pregnant sows are related with a reduction in fear indicators in their offspring. Then, we showed that environmental enrichment, in the last third of gestation, improved the welfare of sows and also the welfare in their offspring. Comparing the brain of the offspring of sows kept in enriched and non-enriched environments and comparing non-enriched sows performing stereotypies with non-enriched sows not showing stereotypies, we identified eight genes related with neuroplasticity and psychiatric diseases, which were differentially methylated. The main contribution of this study is that maternal stereotypic behaviour during gestation decreases fear indicators and alters the neuroepigenome of the limbic system of the offspring. As far as we know, this is the first evidence showing that stereotypies expressed by the mother during gestation did affect offsprings emotionality, in which the mechanism were epigenetic changes in the brain. / O comportamento estereotipado é considerado um indicador de comprometimento do bemestar. Nós conduzimos estudos para testar a controversa hipótese de que o comportamento estereotipado ajuda os animais a lidar com desafios. Propusemos que animais que não expressam estereotipias possam estar sob um bem-estar mais comprometido do que aqueles que demonstram o comportamento, quando expostos a situações difíceis. Ao invés de perguntar ao animal se as estereotipias estão indicando um bem-estar adequado, avaliamos os efeitos na programação do feto. Este estudo investigou os resultados de estereotipias em fêmeas suínas (Sus scrofa) durante a gestação no fenótipo da prole, acessando indicadores comportamentais e fisiológicos. O enriquecimento ambiental é um protocolo eficiente, atuando nos fatores causais de estereotipias, como os sistemas motivacionais, para reduzir padrões comportamentais repetitivos e invariantes, definidos como estereotipias. Nós demonstramos que estereotipias em suínas prenhes estão relacionadas com uma redução nos indicadores de medo na prole. Em seguida, mostramos que o enriquecimento ambiental, no último terço da gestação, melhorou o bem-estar das porcas e também o bem-estar de seus filhos. Comparando o cérebro da prole de porcas mantidas em ambientes enriquecidos e não enriquecidos e comparando porcas não enriquecidas realizando estereotipias com porcas não enriquecidas sem estereotipias, foram identificados oito genes relacionados com a neuroplasticidade e doenças psiquiátricas, que foram diferencialmente metilados. A principal contribuição deste estudo é que o comportamento estereotipado materno durante a gestação diminui os indicadores de medo e altera o neuroepigenoma do sistema límbico da prole. Até onde sabemos, esta é a primeira evidência mostrando que estereotipias expressas pela mãe durante a gestação afetaram a emocionalidade da prole, na qual o mecanismo era uma mudança epigenética no cérebro.

Orientador: Flavia Lombardi Lopes / Banca: Silvia Helena Venturoli Perri / Banca: José Fernando Garcia / Banca: Ricardo da Fonseca / Banca: José bento Sterman Ferraz / Resumo: O objetivo desse estudo foi identificar polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) potencialmente sujeitos a controle epigenético exercido por metilação do DNA via seus envolvimentos na criação, remoção ou deslocamento de sítios CpG (meSNPs) e a partir de tal identificação criar um banco de dados para meSNPs, bem como determinar a possível associação desses marcadores com ilhas CpG (CGIs) e com o perfil metilacional de tecidos submetidos ao ensaio de recuperação de ilhas CpG metiladas combinado com plataformas de sequenciamento de nova geração (MIRA-seq) em bovinos. Usando as variantes anotadas para os SNPs identificados no Run5 do projeto 1000 Bull Genomes e a sequência genômica bovina de referência UMD3.1.1, identificamos e anotamos 12.836.763 meSNPs de acordo com o padrão de variação criado por cada SNP em um sítio CpG. Também analisamos a distribuição genômica desses meSNPs, sendo a maioria deles localizados em regiões intergênicas (68,00%) e intrônicas (26,32%). Globalmente, os meSNPs representam 22,53% dos 56.969.697 SNPs descritos na base de dados e 12,35% deles estão localizados em CGIs. Comparando o número observado com o número esperado de meSNPs nas CGIs e nos tecidos submetidos ao MIRA-seq, verificamos um enriquecimento médio (P<0,01) para meSNPs de 2,47 vezes em CGIs relaxadas e 1,90 vezes em CGIs rigorosas. Nos tecidos, o enriquecimento foi de 1,52 vezes em longissimus dorsi e 2,09 vezes em intestino delgado. Dez meSNPs com metilação diferencial, sendo 1 em longi... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) potentially subject to epigenetic control exerted by DNA methylation via their involvement in creating, removing or displacement CpG sites (meSNPs) and from this identification create a database for meSNPs, as well as to determine its possible association with CpG islands (CGIs) and the methylation profile of tissues submitted to the methylated-CpG island recovery assay combined with next generation sequencing platforms (MIRA-seq) in cattle. Using the variant annotations for SNPs identified in Run5 of the 1000 bull genomes project and the UMD3.1.1 bovine reference genome sequence assembly, we identified and classified 12,836,763 meSNPs according to the pattern of variation caused at the CpG site. We have also analyzed the genomic distribution of the meSNPs, with the majority being located in intergenic regions (68.00%) and then in introns (26.32%) and the remainder distributed among proximal promoters (3.93%), coding regions (1.27%), untranslated regions (UTRs) (0.29%), non-coding RNAs (0.11%) and splice regions (0.08%). Overall, meSNPs represent 22.53% of 56,969,697 SNPs described in the database of which 12.35% are located in CGIs. Comparing the observed number with the expected number of meSNPs in the CGIs and tissues submitted to the MIRAseq we found a mean enrichment (P<0.01) for meSNPs of 2.47 times in the relaxed CGIs and 1.90 times in the strict CGIs. In the tissues the enrichment was of 1.52... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

O estado da cromatina influencia diretamente nos processos de expressão gênica desencadeada durante a formação de memórias. Nesse sentido sendo de grande interesse seu estudo na área biomédica. Modificações epigenéticas como a metilação do DNA e modificações pós-traducionais em histonas são reguladores cruciais do estado da cromatina e ds transcrição gênica. Uma das modificações pós-traducionais mais bem estudada é a acetilação de histonas. Quando as histonas estão acetiladas a cromatina encontra-se num estado relaxado permitindo a expressão gênica. A reação é catalisada por acetiltransferases de histonas (HATs) e é um processo reversível catalisado por histona desacetilases (HDACs). A utilização de fármacos inibidores de histona desacetilases (HDACis) tem ajudado na elucidação dos mecanismos gênicos envolvidos na formação do aprendizado e da memória. Nosso trabalho se baseia na hipótese de que a atividade de HDACs é crucial para modulação das respostas de aprendizado na tarefa de esquiva inibitória e que a acetilação de histonas é um passo essencial neste processo. Os resultados apresentados neste trabalho demonstram que a infusão intra-hipocampal de tricostatina A (TSA) ou butirato sódico (NaB) imediatamente após o treino resulta na melhora da memória de longa duração (LTM). TSA demonstrou ainda possuir duas ondas de efeitos melhoradores da LTM, uma imediatamente e outra 3h após o treino que coincidem com as ondas de ativação de vias de sinalização intracelular e de síntese de proteínas importantes para a formação da LTM. Adicionalmente, a inativação farmacológica da amigdala basolateral (BLA) antes do treino bloqueou os efeitos melhoradores do TSA administrado no hipocampo, evidenciando que a integridade da BLA é importante para este processo. Neste trabalho demonstramos também que a administração intraperitoneal de NaB imediatamente após o treino em animais velhos sem prejuízo cognitivo resulta em melhora significativa da memória. O tratamento com NaB não afetou a LTM de animais jovens saudáveis. Por fim, nossos dados demonstram que a administração de um fármaco antagonista de receptores TrkB, ANA-12, no hipocampo de animais jovens após o treino ou teste resulta no prejuízo da memória. No entanto a administração de NaB antes do treino preveniu os efeitos prejudiciais de ANA-12. Em conjunto estes resultados demonstram que a modulação epigenética através da atividade de HDACs é importante para a formação da LTM. Nossos dados fortalecem ainda a visão de que eventos epigenéticos possuem papel critico no aprendizado e memória interagindo com vias de sinalização intracelulares desencadeadas por estes processos. / The chromatin state directly impacts gene expression triggered by memory formation. Therefore, this process is of great interest to the biomedical area. Critical regulators of chromatin state and gene transcription are the epigenetic modifications such as DNA methylation and posttranslational modifications of histone proteins. One of the most studied postranslational modification of histones is histone acetylation. When histones are acetylated, chromatin is in a relaxed conformation allowing gene expression. Lysine acetylation is catalyzed by histone acetyltransferases (HATs) and is reversed by the action of histone deacetylases (HDACs). The use of histone deacetylase inhibitors (HDACis) is helping to elucidate genetic mechanisms of learning and memory. Our work is based on the hypothesis that HDACs activity is crucial for inhibitory avoidance (IA) learning responses modulation and the idea that histone acetylation is an essential step. The data presented in this work demonstrate that infusion of Trichostatin A (TSA) or Sodium Butyrate (NaB) intrahipocampally produced memory enhancement. Moreover, TSA showed two waves of memory enhancing effects when given immediately or 3 h after training coinciding with the observed waves of protein synthesis and PKA activation for memory formation. Our study also demonstrates that the enhancement of IA memory consolidation depends on the integrity of basolateral amygdala (BLA) since its functional inactivation by muscimol (MUS) completely blocked the enhancing effect of TSA infused in the rat hippocampus. Here, we also demonstrate that intraperitoneal administration of NaB immediately after training led to memory enhancement in aged rats with no cognitive deficit. Surprisingly, NaB had no effect in younger rats with normal memory retention. Finally, data presented here also demonstrate that TrkB activity in the hippocampus is crucial for long-term memory (LTM) since administration of a TrkB receptor antagonist, ANA-12, in the dorsal hippocampus immediately after training or retrieval led to memory retention impairment. Moreover, infusion of NaB before training prevented this impairing effect of TrkB antagonism. Taken together, these results show that epigenetic modulation by HDACs activity is required for memory formation. Our data also supports the idea of HDACs playing critical roles in learning and memory interacting with intracellular signaling pathways triggered by these processes.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-07-25T04:12:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 347035.pdf: 1475783 bytes, checksum: 8ddebabe058cf5e37e595d8c32776065 (MD5) Previous issue date: 2017 / Theobroma cacao L. é uma espécie amplamente cultivada na zona tropical húmida do planeta. As sementes tem um elevado valor econômico e são a matéria prima para a produção de chocolate. No entanto, devido às características botânicas que esta espécie apresenta, associadas a um alto grau de auto-incompatibilidade, os plantios comerciais apresentam alta heterozigosidade genética, afetando diretamente a produtividade do cultivo. Por esta razão, sistemas de propagação clonal como estacas enraizadas e enxertia tem sido aplicados para a multiplicação de variedades de elite. Estas técnicas, contudo, apresentam alto custo de mão de obra e não garantem a qualidade sanitária das plantas. Neste contexto, técnicas de micropropagação in vitro associadas à embriogênese somática podem contribuir para produção em larga escala de novas variedades e de genótipos superiores, bem como para a conservação de germoplasma, além de servir como modelo para o estudo de processos fisiológicos, genéticos e bioquímicos envolvidos no desenvolvimento embrionário. A embriogênese somática a partir de partes florais tem sido o método mais eficiente para a regeneração in vitro de plântulas. Este sistema integra a embriogênese indireta com subsequente embriogênese secundária direta, a partir da qual o sistema se torna cíclico. Os protocolos de embriogênese somática apresentam lacunas no conhecimento que precisam ser preenchidas. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivos aprofundar nos mecanismos moleculares que determinam a qualidade dos embriões somáticos e estudar a relação da metilação do DNA e a capacidade de conversão de embriões somáticos com a embriogênese somática secundaria a longo prazo. Assim, utilizou-se a tecnologia de identificação multidimensional de proteínas (HDMSE), para identificar o perfil proteômico de embriões do tipo branco e do tipo translúcido, os quais diferem amplamente pela capacidade de conversão. O grupo das proteínas diferencialmente expressas revelou que a capacidade de conversão dos embriões somáticos está relacionada com o metabolismo dos carboidratos e com a capacidade das culturas em manter um equilíbrio no sistema redox. A análise global dos níveis da metilação do DNA em embriões somáticos jovens e embriões somáticos envelhecidos sugere que a hipometilação do DNA observada em embriões envelhecidos é uma resposta adaptativa (acumulativa) das culturas às condições in vitro, enquanto que a perda do potencial embriogênico associada com a embriogênese somática a longo prazo, é uma característica epigenética que pode ser reversível. Finalmente, o uso da droga demetilante 5-azcC mostrou uma correlação positiva com a recuperação do potencial embriogênico em embriões somáticos envelhecidos.<br> / Abstract : Theobroma cacao L. is a plant species widely cultivated in the humid tropics of the planet. The cacao beans have a high economic value and they are the raw material for the chocolate industry. However, due to the botanical traits associated with a high degree of self-incompatibility, the commercial plantations present high genetic heterozygosity, directly affecting the crop yield. For this reason, clonal propagation systems such as rooted cuttings and grafting have been applied for the multiplication of elite varieties. However, these methods present a high labor cost and do not guarantee the plants sanitary quality. In this view, in vitro micropropagation methods associated with somatic embryogenesis can contribute to the large-scale propagation of improved varieties and genotypes, as well as the conservation of germoplasm, and this can uses as a model for the study of the physiological, genetic and biochemical processes involved in plant embryogenic development. Somatic embryogenesis using floral explants has been the most efficient method for regeneration in vitro seedlings. This system integrates indirect embryogenesis with subsequent direct secondary embryogenesis, from which the system becomes cyclic. Somatic embryogenesis protocols present hole in the knowledge, which need to be elucidated. In this context, the present work had as objective to deepen in the molecular mechanisms that determine the somatic embryo quality to study the relationship between the DNA methylation and the embryogenic potential of somatic embryos in the long-term secondary somatic embryogenesis. Thus, the multidimensional protein identification technology (HDMSE) was used to identify the proteomic profiles of white and translucid somatic embryos, which are widely different in the conversion capacity. The somatic embryos conversion ability was related to carbohydrate metabolism and the ability of cultures to maintain equilibrium in the redox system. The global DNA methylation levels in young somatic embryos and aged somatic embryos suggested that hypomethylation of DNA in aged somatic embryos is an adaptive (cumulative) response to in vitro culture conditions, whereas the loss of the embryogenic potential associated with long-term somatic embryogenesis, is an epigenetic feature that can be reversible. Finally, the 5 -azaC showed a positive correlation with the recovery of the embryogenic potential in aged somatic embryos.

Ao longo dos últimos anos observou-se um aumento no número de idosos no mundo, com isso faz-se necessário buscar terapias que amenizem os danos relacionados e também elucidar os mecanismos envolvidos neste processo. O exercício físico tem sido sugerido como uma ferramenta importante, não farmacológica, para atenuar os déficits relacionados à idade. Ainda, estudos recentes sugerem uma relação entre o processo de envelhecimento cerebral e o desequilíbrio de mecanismos epigenéticos, contudo, estes dados ainda não são conclusivos. Sabe-se que o grau de neuroplasticidade varia com a idade e que as estruturas encefálicas podem responder diferentemente à exposição ao exercício. Estudos demonstram que o córtex pré-frontal está envolvido em funções de alta ordem como atenção, tomada de decisão e memória de trabalho. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos de diferentes protocolos de exercício físico (sessão única e exercício diário moderado) sobre a modulação de marcadores epigenéticos em córtex pré-frontal de ratos Wistar de 3 e 21 meses de idade. Os animais foram submetidos ao protocolo de sessão única (20 minutos) ou o exercício diário moderado (20 minutos durante 14 dias), 1 hora após a última sessão foram eutanasiados. O córtex pré-frontal foi dissecado e a acetilação da H4, o conteúdo da DNA metiltransferase (DNMT1 e DNMT3b), assim como a atividade da histona metiltransferase H3K27 foram analisadas. Os resultados serão apresentados na versão completa desta dissertação. / Over the past few years the number of elderly people has increased in the world, therefore it is necessary to search therapies that ameliorate age-related deficits as well as elucidate the mechanisms involved in this process. Physical exercise has been suggested as an important non-pharmacological approach to alleviate the age-related decline. Furthermore, recent studies have suggested a relationship between the process of brain aging and imbalance of epigenetic mechanisms, however, these data are not conclusive. It is well described that prefrontal cortex is involved in higher functions like attention, decision making and working memory. Then, the aim of this study was to investigate the effects of two exercise protocols (single session and daily moderate exercise) on the modulation of epigenetic markers in the prefrontal cortex from Wistar rats of 3- and 21- months-old. Animals were submitted to single session protocol (20 minutes) or the daily moderate exercise (20 minutes for 14 days), and 1hour after the last exercise session animals were euthanized. Prefrontal cortex was dissected out and acetylation of H4, the content of DNA methyl transferase (DNMT1 and DNMT3B), as well as histone methyltransferase H3K27 activity were analyzed. Results will be presented in the full version.

A descondensação da cromatina exerce um papel central nas diversas etapas do processo de carcinogênese abrindo o genoma para a ação de fatores de transcrição, exercendo papel na progressão e resistência tumoral. Bromodomínios e proteínas com terminal extra, como o BRD4, são leitores epigenéticos que regulam a expressão gênica e, portanto, também estão envolvidos na patogênese do câncer. O objetivo do presente estudo foi estudar o efeito da inibição do BRD4 no carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (CECP). Para esse propósito, foi utilizado JQ1, inibidor de BRD4, em concentração de 1uM, nas linhagens de carcinoma de cabeça e pescoço HN6, HN12 e HN13. Foi analisado os níveis de BRD4, H4 acetilada e SIRT1 fosforilado através de reações de imunofluorecência e p16ink4 por imunohistoquímica. Foi realizado western blot para checar os níveis de p53 e p53 acetilado. Ensaio de formação de colônias e câmera de invasão foram realizados para testar o efeito do inibidor na proliferação e invasão celular. Através da citometria de fluxo foi analisado o efeito da apoptose com a marcação de caspase-3 clivada, do ciclo celular através da reação por iodeto de propídio e ainda da população de células tronco tumorais pela análise de ALDH e CD44. Por fim, foi realizado modelo xenográfico subcutâneo para analisar o efeito do JQ1. Os resultados mostraram diminuição significativa da expressão de BRD4 e H4ac após tratamento com JQ1. As linhagens celulares mostraram redução na capacidade de invasão e de formação de colônias quando submetidas ao JQ1. Não foram encontradas diferenças em relação ao número de células caspase-3 clivada positivas. Por outro lado, foi encontrado um maior número de células na fase G1 do ciclo celular após o uso do inibidor estudado. As células tratadas com JQ1 mostraram menor expressão de p-SIRT1 o que levou a uma diminuição da acetilação do p53 e um aumento na expressão de p16ink4. Paralelamente, foi encontrado uma diminuição na população de células positivas para ALDH e CD44. Houve diminuição do crescimento do tumor no modelo xenográfico tratado com JQ1 quando comparado ao veículo. Nos tecidos derivados do ensaio in vivo, houve uma diminuição nos marcadores p16ink4, pSIRT1 além de acúmulo de H2AX. Conclui-se que o uso de JQ1 resulta na disrupção do crescimento do CECP associado a ativação de senescência, indução de dano de DNA além de reduzir a população de células tronco tumorais. Esses novos achados indicam que o BRD4 é um importante modificador epigenético nos CECP sendo um viável alvo terapêutico. / Chromatin descondensation plays a central step in the various stages of the carcinogenesis process opening the genome for transcription factors playing a role in tumor progress and resistance. Bromodomains and extra terminal family, as BRD4, are epigenetics readers that regulate gene expression thus they are also involved in cancer pathogenesis. The objective of this project was studied the effect of BRD4 in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). For this purpose, JQ1, a BRD4 inhibitor, was used in 1uM concentration, in HN6, HN12 and HN13 head and neck carcinoma cell lines. The levels of BRD4, acetylates h4 and phosphorylated SIRT1 were analyzed by immunofluorescence and p16ink4 labeling by immunohistochemistry. Western blot was performed to check the levels of p53 and acetylated p53. Colony assay and invasion chamber were performed to test the inhibitory effect on cell proliferation and invasion. The effect of apoptosis with the cleaved caspase-3 labeling, the cell cycle by propidium iodide and of the population of tumor stem cells by the analysis of ALDH and CD44 was analyzed through flow cytometry. Finally, a subcutaneous xerographic model was performed to analyze the effect of JQ1. A significant decrease in the expression of BRD4 and H4ac was found after application of JQ1. The cell lines results showed a reduction in the capacity of invasion and also formation of colonies when submitted to JQ1. No differences were found in relation to the number of cells caspase-3 cleaved positives. On the other hand, a large number of cells were found in G1 arrest of cell cycle after use of the BRD4 inhibitor studied. Cells treated with JQ1 showed lower expression of p-SIRT1 which led to a decrease in p53 acetylation and an increase in p16ink4 expression. In parallel, a decrease of ALDH and CD44 positive cells population was found. A decrease in tumor growth was discovered when treated by JQ1 if compared to the vehicle. In tissues samples derived from the in vivo assay, there was a decrease in p16ink4, pSIRT1 markers in addition to -H2Ax accumulation. In conclusion JQ1 causes HNSSC tumor growth disruption associated a senescence activation, DNA damage and a reduce number of cancer stem cells. These new findings indicate that BRD4 is an important genetic modifier in HNSSC and is a viable therapeutic target.

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Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-10-13Bitstream added on 2014-06-13T20:33:41Z : No. of bitstreams: 1 silva_bm_me_jabo.pdf: 548750 bytes, checksum: 36f590119119f6fe622e3615252bd6ac (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A acetilação das histonas é um dos principais mecanismos de reprogramação epigenética do genoma dos gametas a fim de estabelecer um estado totipotente para o desenvolvimento normal. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da utilização da Tricostatina A (TSA) sobre os níveis de acetilação das histonas e o desenvolvimento embrionário, avaliando-se a contagem do número de células da massa celular interna (MCI), trofectoderma (TE), e células totais, e os níveis da reação de imunocitoquímica para H3K9ac. Para isso, três experimentos foram delineados. No primeiro experimento, verificou-se que o grupo tratado com 5nM de TSA por 144h durante o cultivo in vitro (CIV) aumentou (p<0,01) o nível de H3K9ac em relação ao grupo controle. A taxa de clivagem e o desenvolvimento embrionário foram avaliados em um segundo experimento, e o grupo tratado com 5nM de TSA não apresentou diferença na produção de embriões comparado ao grupo controle. No experimento 3, o tratamento com a TSA não apresentou efeitos significativos em relação ao número de células da MCI, porém houve redução (p<0,01) tanto do número de células da TE quanto de células totais comparado ao grupo controle. Portanto, conclui-se que o tratamento com TSA não altera o desenvolvimento embrionário pré-implantacional de embriões fêmeas de bovinos, mostrando efeito negativo sobre o desenvolvimento dos embriões tratados / Histone acetylation is one of the major mechanisms of epigenetic reprogramming of gamete genome to establish a totipotent state for normal development. The aim of this work was to evaluate the use of Trichostatin A (TSA) on the levels of histone acetylation and embryonic development, the assessment of counting the cell number of inner cell mass (ICM), trophectoderm (TE), and total cells, and the levels of H3K9ac for immunocytochemical reaction. Therefore, three experiments were designed. In the first experiment, it was verified that the group treated with TSA for 5nM for 144h during in vitro culture (IVC) increased (p <0.01) the level of H3K9ac in the control group. Cleavage rate and embryo development were evaluated in a second experiment, and the group treated with 5nM TSA showed no difference in embryo production compared to control. In Experiment 3, treatment with TSA had no significant effect on the cell number of ICM, but decreased (p <0.01) both the cell number of TE and total cells as compared to control. Therefore, it is concluded that treatment with TSA does not alter the preimplantation embryonic development female bovine embryos, showing a negative effect on the development of embryos treated