AREG und EREG sind Liganden des EGFR, deren Expression mit einem positiven EGFR-zielgerichtetem Therapieansprechen in Darmkrebs korreliert. Ziel dieser Arbeit war es, einen epigenetischen Einfluss auf die AREG und EREG Expression zu klären. Es wurde gezeigt, dass AREG und EREG in verschiedenen kolorektalen Krebszelllinien differenziell exprimiert sind, und dass die Expression beider Gene durch epigenetische Inhibitoren erhöht werden kann. Eine Analyse in fünf Zelllinien zeigte jedoch, dass die Promotoren beider Gene hauptsächlich unmethyliert vorlagen. Hingegen wurden kurze Regionen im Gen als differentiell methyliert identifiziert. Im AREG Gen liegt diese Region im Exon 2, was auf einen ungewöhnlichen Regulationsmechanismus hindeutet. Promotorfunktionsanalysen zeigten dann, dass diese Region eine methylierungs- und orientierungsabhängige Promotorfunktion hat, in die das MDB-Protein CTCF involviert sein könnte. Expressionsanalysen wiesen darauf hin, dass auch ZBTB33, ein anderes MDB-Protein, in die AREG Regulation involviert sein könnte. Die ZBTB33 Expression korrelierte negativ mit der AREG Expression in den Zelllinien. Eine ZBTB33-Bindungsstelle konnte ausserdem bioinformatorisch im AREG Exon 2 identifiziert werden. Des weiteren wurde gezeigt, dass die Behandlung der Zelllinie LIM1215 mit HDAC Inhibitoren in vitro zu einer Erhöhung der Sensitivität gegenüber EGFR-zielgerichteten Medikamenten führt, begleitet von einer Erhöhung der AREG und EREG Expression. Im in vivo Versuch konnte die Sensitivität von LIM1215 Zellen durch die Behandlung mit DNMT Inhibitoren erhöht werden. Begleitet wurde dies hier mit einer Verringerung der Methylierung der AREG und EREG intragenischen CpGs. Diese Ergebnisse zeigen auf, dass Patienten, die resistent gegenüber EGFR-zielgerichteten Therapien sind, möglicherweise sensitiv gemacht werden können. In dem Fall könnten AREG und EREG als prädiktive Marker eingesetzt werden, um den Effekt der epigenetischen Inhibitoren zu evaluieren. / AREG and EREG are ligands of the EGFR whose expression correlates with a positive EGFR-targeted therapy response in colorectal cancer. Aim of this work was to define the influence of epigenetic mechanisms on AREG and EREG gene expression. It could be shown that AREG and EREG are differentially expressed in a set of colorectal cancer cell lines and that the expression of both genes increases after treatment with epigenetically interfering compounds such as DNMT inhibitors and HDAC inhibitors. Methylation analysis showed that the promoters of both genes were mainly unmethylated. Nevertheless, short intragenic regions were identified to be differentially methylated. For AREG, this region is located within exon 2, indicating an uncommon epigenetic regulatory mechanism. Promoter function analyses showed that the AREG exon 2 region harbor methylation- and orientation dependent promoter function and they suggested CTCF, an MDB-protein, to be involved in this mechanism. Expression analysis experiments suggested also ZBTB33, another MDB-protein, to be involved in AREG regulation. ZBTB33 was differentially expressed in the cells and it correlated inversely with the AREG expression. Additionally, bioinformatic analyses identified a ZBTB33 binding site within AREG exon 2. It was also shown in this work that LIM1215 cells treated with HDACis were more sensitive towards EGFR inhibitors in vitro. This effect was accompanied by an increased AREG and EREG expression. In vivo, an increased sensitivity towards EGFR inhibitors was achieved in LIM1215 cells by treatment with a DNMT inhibitor. Here the effect was accompanied by a reduced methylation within the AREG and EREG intragenic CpGs. Together, the results suggested a new possibility to potentially make EGFR-targeted therapy resistant patients suitable for this therapy by epigenetic compound treatment. In that case AREG as well as EREG might be predictive markers to evaluate the effect of the epigenetic compounds during therapy.

Adipositas ist eine polymorphe chronische Erkrankung mit epidemischer Prävalenz. Im katabolen Leptin-Melanocortin-Signalweg ist das Proopiomelanocortin Gen (POMC) ein zentrales Element, das bei Dysfunktion massive Adipositas bewirken kann. Auch eine kürzlich identifizierte intragenische Methylierungsvariante des POMC wurde mit Adipositas assoziiert und deutet somit auf eine mögliche epigenetische Modulation des Gewichtsphänotyps hin. Zur Aufklärung der Relevanz, Stabilität und Entwicklung dieser epigenetischen Modifikation wurden die Funktionalität, Ontogenese und Phylogenese der POMC DNA-Methylierung untersucht. In vitro Analysen zeigten DNA-Methylierungsabhängige Promoteraktivität beider CpG-Inseln (CGIs) des POMC. Diese hier erstmals beschriebene Transkriptionsaktivität der intragenischen CGI weist auf einen alternativen Promoter des POMC hin. Hinsichtlich der Ontogenese konnten in Mensch und Maus postnatal stabile DNA-Methylierungsmuster mit interindividueller Konservierung für beide CGIs des POMC identifiziert werden. Zusätzlich erwiesen sich Gewebeunabhängigkeit der DNA-Methylierungsmuster und ihre pränatale Ausbildung zwischen dem Blastocystenstadium und der frühen Organogenese in der Maus. Die POMC DNA-Methylierungsmuster upstream des Exon3 unterscheiden sich in Mensch und Maus. Der mögliche Einfluss von primatenspezifischen Alu-Elementen im Intron2 des POMC hierauf wurde in verschiedenen Primatenfamilien analysiert. Die Ergebnisse zeigen eine bedingte Assoziation der Alu-Elemente mit der DNA-Methylierung in der entsprechenden Region, lassen jedoch auch weitere Einflussfaktoren vermuten. Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass die POMC DNA-Methylierung artspezifisch konserviert ist und in der frühen Embryogenese, vermutlich Alu-abhängig, ausgebildet wird. Dabei könnten stochastische Variationen der DNA-Methylierung die POMC-Aktivität beeinflussen und somit das Risiko für Adipositas erhöhen. / Obesity is a polymorphic chronic disease with epidemic prevalence. Within the catabolic leptin-melanocortin signaling pathway pre-proopiomelanocortin (POMC) is a pivotal element. Dysfunction of POMC, e.g. due to mutations, can cause severe obesity. Moreover, a recently identified intragenic methylation variant of POMC was found to be associated with obesity. Therefore, this indicates potential epigenetic modulation of the weight phenotype. To gain further insight into the relevance, stability, and origin of this epigenetic modification, the functionality, ontogenesis, and phylogenesis of the POMC DNA methylation patterns were analyzed. In vitro analyses revealed DNA methylation-dependent promoter activity of both CpG islands (CGIs) of POMC. Thereby, the intragenic CGI was identified as a potential alternative promoter of POMC, which has not been described before. Regarding the ontogenesis, postnatally stable POMC DNA methylation patterns with interindividual conservation were detected for both CGIs in humans and mice. In addition, it was observed that the POMC DNA methylation patterns are non-tissue-specific, stable upon long time administration of a high fat diet, and develop prenatally between the blastocystal stage and the early organogenesis. The POMC DNA methylation pattern upstream of exon3 differs in humans and mice. A possible influence of primate-specific Alu elements within the intron2 region of POMC was analyzed in various primate families. Results evince a partial association of the Alu elements with the DNA methylation pattern in this particular region, but also suggest an influence of additional factors. Overall, this work demonstrates that DNA methylation of the POMC locus is species-specific highly conserved, and that it is established during early embryogenesis, possibly Alu-triggered. In the course of this, stochastic variances of the POMC DNA methylation might influence the POMC activity and consequently alter the risk to develop obesity.

DNA-Methylierung spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Chromatinorganisation und Genregulation in höheren Eukaryoten und muss zusammen mit der genetischen Information in jedem Zellzyklus dupliziert werden. Bei Mammalia wird DNA durch die DNA-Methyltransferase 1 (DNMT1) methyliert, die dabei mit nuklearen Replikationsstellen (RF) assoziiert und so die Erhaltung des Methylierungsmusters mit der Duplikation der DNA verbindet. In dieser Arbeit wurden die Funktion der regulatorischen Sequenzen in der N-terminalen Domäne von DNMT1 bei der Kontrolle ihrer subnuklearen Lokalisierung während des Zellzyklus und die evolutionäre Konservierung dieser Sequenzen, sowie die Mechanismen die eine Assoziation von Proteinen mit RF vermitteln, untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass DNMT1 eine dynamische Verteilung im Kern aufweist, die durch regulatorische Sequenzen zellzyklusabhängig gesteuert wird. Um die subnukleare Verteilung von DNMT1 während des Zellzyklus zu untersuchen, wurden RFP-Ligase Fusionsproteine hergestellt, die als Marker für die Identifikation von Zellzyklusstadien in lebenden Zellen dienen. Verschiedene, mit GFP fusionierte DNMT1 Mutanten wurden zusammen mit RFP-Ligase exprimiert und über einen ganzen Zellzyklus hinweg mit 4-dimensionaler Lebendzellmikroskopie verfolgt. Die PBD (PCNA-Bindungsdomäne) bewirkt die Lokalisierung von DNMT1 an RF während der S-Phase, und die TS (targeting sequence) vermittelt die Retention von DNMT1 an spät replizierendem Heterochromatin von der späten S- bis zur frühen G1-Phase. Im Gegensatz dazu scheint die PBHD (Polybromohomologiedomäne) für die Freisetzung von DNMT1 von perizentrischen Regionen während der G1-Phase notwendig zu sein. Eine Überexpression der TS zu Störung dieser Assoziation, senkt die Überlebensrate der Zellen und fördert die Bildung von Mikronuklei sowie die Verschmelzung von zentromerem Heterochromatin. Diese Ergebnisse zeigen eine neue Funktion für die TS bei der Assoziation von DNMT1 mit perizentrischem Heterochromatin von der später S- über die G2-Phase bis hin zur Mitose, die eine wichtige Voraussetzung für die Erhaltung der DNA-Methylierung und Heterochromatinstruktur und -funktion ist. Datenbankanalysen zeigten, dass es sich bei der TS um eine einzigartige Domäne innerhalb der DNMT1 Proteinfamilie handelt. Innerhalb der DNMT1 Familie besitzen nur die DNMT1 Proteine der Metazoen die PBD. Das lässt vermuten, dass die Verknüpfung von Beibehaltung der DNA Methylierung mit der DNA Replikation nur in Metazoen auftritt, während in Pflanzen und Pilzen alternative Mechanismen zur Aufrechterhaltung des Methylierungsmusters, wahrscheinlich vermittelt durch die TS, zur Anwendung kommen. Die evolutionäre Konservierung von Mechanismen, zur Assoziation von Proteine mit RF in Säugerzellen, wurde durch die Analyse der Säugerproteine PCNA, DNA Ligase I und DNMT1 in Drosophila-zellen direkt getestet. Von allen untersuchten Proteinen assoziiert nur PCNA mit RF, während die anderen nur eine diffuse Verteilung innerhalb des Kerns zeigten, obwohl sie eine funktionale PBD enthalten. Überraschenderweise assoziierte auch die Drosophila DNA Ligase I in Säugerzellen nicht aber in Drosophila-zellen mit RF. Diese Ergebnisse weisen auf Unterschiede in der Dynamik und dem Aufbau der Replikationsmaschinerie in diesen entfernt verwandten Organismen hin, was mit der Vergrösserung und höheren Komplexität des Säugergenoms korreliert. / DNA methylation constitutes an essential epigenetic mark controlling chromatin organization and gene regulation in higher eucaryotes, which has to be duplicated together with the genetic information at every cell division cycle. In mammals duplication of DNA methylation is mediated by DNA methyltransferase-1 (DNMT1). It associates with sites of nuclear DNA replication, called replication foci (RF), and thereby couples maintenance of DNA methylation to DNA duplication. In this work, we have analyzed the role of regulatory sequences in the N-terminal domain of DNMT1 in controlling its subnuclear localization throughout the cell cycle, and the evolutionary conservation of these sequences and of the mechanisms that mediate association of proteins with RF. We provide evidence that DNMT1 shows dynamic subnuclear distribution that is controlled by the regulatory sequences depending on the cell cycle stage. To determine the subnuclear distribution of DNMT1 throughout the cell cycle, an RFP-Ligase fusion protein was developed as a marker that allows identification of the cell cycle stage in live cells. Various DNMT1 mutants fused to GFP were coexpressed with RFP-Ligase and imaged by 4-dimensional live cell microscopy during an entire cell cycle. The PBD (PCNA binding domain) drives the localization of DNMT1 at RF throughout S phase and the TS (targeting sequence) mediates retention of DNMT1 only at the late replicating pericentric heterochromatin from late-S phase until early-G1. In contrast, the PBHD (polybromo homology domain) seems to be required for unloading DNMT1 from the pericentric regions in G1. Overexpression of the TS to interfere with this association lowers cell viability and induces the formation of micronuclei and coalescence of centromeric heterochromatin. These results bring forth a novel function of the TS in mediating association of DNMT1 with pericentric heterochromatin from late-S phase through G2 until mitosis, which is important for maintenance of DNA methylation, and heterochromatin structure and function. Database searches indicate that the TS is a domain unique to the DNMT1 family of proteins. Amongst the DNMT1 family, only the metazoan DNMT1 proteins have the PBD. This suggests that coupling of maintenance of DNA methylation with DNA replication occurs only in metazoans, while plants and fungi have alternative mechanisms that maintain DNA methylation patterns, probably mediated by the TS. The evolutionary conservation of the mechanisms by which proteins associate with RF in mammalian cells was directly tested by analyzing the ability of mammalian replication proteins PCNA and DNA Ligase I as well as DNMT1 to associate with RF in Drosophila cells. Of all the proteins tested, only PCNA associated with RF while the others showed diffused nuclear distribution although they contain a functional PBD. Surprisingly, Drosophila DNA Ligase I associates with RF in mammalian but not in Drosophila cells. These results suggest differences in the dynamics and organization of the replication machinery in these distantly related organisms, which correlates with the increased size and complexity of mammalian genomes.

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S. cerevisiae Ada2 and Bre1 has a role in histone post-translational modifications. Deletion of these genes causes deficiency in acetylation (Ada2) or ubiquitination (Bre1) of histones. Further, mutants lacking these genes or homologous genes showed different phenotypes in human and S. cerevisiae while treated with DNA damaging agents 4-NQO and MMS. Bre1 deficient cells showed 4-NQO sensitivity in S. cerevisiae and resistance in human cells. Since it has been shown that S. pombe is more close to mammals in chromatin regulation we wanted to examine S. pombe response against MMS and 4-NQO. By homologous recombination, genes were deleted and mutants were treated with different concentration of both the genotoxins. In accordance with a previous study, Ada2Δ showed sensitivity to MMS while Brl1Δ & Brl2Δ grew as wild type. Surprisingly, unlike S. cerevisiae, S. pombe showed resistance to 4-NQO and has a phenotype similar to the one found in human cells.

Genregulation beeinflusst Phänotypen im Kontext von Gesundheit und Krankheit. In Krebszellen regulieren genetische und epigenetische Faktoren die Genexpression in cis. Das Neuroblastom ist eine Krebserkrankung, die häufig im Kindesalter auftritt. Es ist gekennzeichnet durch eine geringe Anzahl exonischer Mutationen und durch häufige Veränderungen der somatischen Kopienzahl, einschließlich Genamplifikationen auf extrachromosomaler zirkulärer DNA. Bisher ist wenig darüber bekannt, wie lokale genetische und epigenetische Faktoren Gene im Neuroblastom regulieren. In dieser Arbeit kombiniere ich die allelspezifische Analyse ganzer Genome (WGS), Transkriptome und zirkulärer DNA von Neuroblastom-Patienten, um genetische und cis-regulatorische Effekte zu charakterisieren. Ich zeige, dass somatische Dosis-Effekte der Kopienzahl andere lokale genetische Effekte dominieren und wichtige Signalwege regulieren. Genamplifikationen zeigen starke Dosis-Effekte und befinden sich häufig auf großen extrachromosomalen zirkulären DNAs. Die vorgestellte Analyse zeigt, dass der Verlust von 11q zu einer Hochregulation von Histonvarianten H3.3 und H2A in Tumoren mit alternativer Verlängerung der Telomere (ALT) führt, und dass erhöhte somatische Kopienzahl die Expression der TERT Gens verstärken können. Weitere Erkenntnisse sind, dass 17p-Ungleichgewichte und die damit verbundene Herunterregulierung neuronaler Gene sowie die Hochregulierung des genomisch geprägten Gens RTL1 durch Kopienzahl-unabhängige allelische Dosis-Effekte mit einer ungünstigen Prognose verbunden sind. Die cis-QTL-Analyse bestätigt eine zuvor beschriebene Regulation des LMO1 Gens durch einen Enhancer-Polymorphismus und charakterisiert das regulatorische Potenzial weiterer GWAS-Risiko-Loci. Die Arbeit unterstreicht die Bedeutung von Dosis-Effekten im Neuroblastom und liefert eine detaillierte Übersicht regulatorischer Varianten, die in dieser Krankheit aktiv sind. / Gene regulation controls phenotypes in health and disease. In cancer, the interplay between germline variation, genetic aberrations and epigenetic factors modulate gene expression in cis. The childhood cancer neuroblastoma originates from progenitor cells of the sympathetic nervous system. It is characterized by a sparsity of recurrent exonic mutations but frequent somatic copy-number alterations, including gene amplifications on extrachromosomal circular DNA. So far, little is known on how local genetic and epigenetic factors regulate genes in neuroblastoma to establish disease phenotypes. I here combine allele-specific analysis of whole genomes, transcriptomes and circular DNA from neuroblastoma patients to characterize genetic and cis-regulatory effects, and prioritize germline regulatory variants by cis-QTLs mapping and chromatin profiles. The results show that somatic copy-number dosage dominates local genetic effects and regulates pathways involved in telomere maintenance, genomic stability and neuronal processes. Gene amplifications show strong dosage effects and are frequently located on large but not small extrachromosomal circular DNAs. My analysis implicates 11q loss in the upregulation of histone variants H3.3 and H2A in tumors with alternative lengthening of telomeres and cooperative effects of somatic rearrangements and somatic copy-number gains in the upregulation of TERT. Both 17p copy-number imbalances and associated downregulation of neuronal genes as well as upregulation of the imprinted gene RTL1 by copy-number-independent allelic dosage effects is associated with an unfavorable prognosis. cis-QTL analysis confirms the previously reported regulation of the LMO1 gene by a super-enhancer risk polymorphism and characterizes the regulatory potential of additional GWAS risk loci. My work highlights the importance of dosage effects in neuroblastoma and provides a detailed map of regulatory variation active in this disease.