A endometriose é um distúrbio ginecológico benigno, crônico e inflamatório definido pela presença de glândulas e estroma endometriais fora do sítio normal. Alterações inflamatórias e imunológicas nos níveis celular e molecular na endometriose podem contribuir para a sobrevivência e crescimento do implante endometriótico e uma variedade de citocinas e fatores de crescimento podem desempenhar este papel no desenvolvimento da doença, embora sua etiologia ainda seja desconhecida. O objetivo deste estudo foi avaliar os níveis séricos e no fluído peritoneal (FP) e a expressão gênica da interleucina-6 (IL6) em tecido adiposo (TA) subcutâneo e visceral e de focos endometrióticos de mulheres com endometriose pélvica e compará-las com mulheres hígidas. Foram incluídas no estudo 31 mulheres com endometriose e 18 mulheres com pelve normal. A endometriose foi diagnosticada por videolaparoscopia ou confirmada por exame histológico. Amostras de sangue venoso periférico foram coletadas imediatamente antes da laparoscopia, e o FP, imediatamente após ter iniciado o procedimento. Biópsias de TA e tecido endometrial eutópico e ectópico foram coletados para avaliação da expressão gênica por RT-PCR em tempo real. O TA subcutâneo e visceral de pacientes com endometriose não mostrou diferença nos níveis de expressão gênica de IL6 quando comparadas ao grupo controle. Da mesma forma, a expressão gênica foi similar em tecido endometrial eutópico e ectópico de pacientes com endometriose comparadas ao grupo com pelve normal. Não houve associação dos níveis de expressão gênica no TA com o grau de endometriose e tipo de lesão. Contudo, os níveis de IL6 no FP foram significativamente maiores no grupo endometriose em relação ao controle. Além disso, os níveis de IL6 foram maiores no grupo de pacientes com estágio III/IV da doença em relação ao estágio I/II ou pacientes controles. Uma correlação positiva da IL-6 no LP e o escore da severidade da doença também foi observada (r-ASRM, RS= 0.77; p=0.0001). Nossos achados sugerem que a IL6 pode estar associada com a endometriose pélvica e sua severidade. Estudos adicionais deverão esclarecer se a expressão da proteína da IL6 está alterada no endométrio eutópico e ectópico e o papel desempenhado por esta citocina na patogênese da endometriose. / Endometriosis is a gynecological benign disorder, chronic inflammatory and defined by the presence of endometrial glands and stroma outside the normal site. Inflammatory and immunological changes in the cellular and molecular levels in endometriosis may contribute to the survival and growth of endometriotic implants and a variety of cytokines and growth factors can play this role in the development of the disease, although its etiology is still unknown. The objective of this study was to evaluate serum levels and peritoneal fluid (PF) and eutopic and ectopic the gene expression of IL6 in subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) and endometriotic tissue of women with pelvic endometriosis and compare them with healthy women. Were included in the study 31 women with endometriosis and 18 women with normal pelvis. Endometriosis was diagnosed by laparoscopy or confirmed by histological examination. Peripheral venous blood samples were collected immediately before the laparoscopy and the PF immediately after having started the procedure. Adipose tissue biopsies and endometrial tissues were collected for evaluation of gene expression by real-time RT-PCR. Adipose tissue subcutaneous and visceral of patients with endometriosis showed no difference in gene expression levels of IL6 when compared to the control group. Similarly, the gene expression was similar in eutopic and ectopic endometrial tissue of patients with endometriosis compared to the group with normal pelvis. No association was observed in levels of gene expression in AT with the degree of endometriosis and type of injury. However, the levels of IL6 on the PF were significantly higher in endometriosis group relative to the control. In addition, the IL6 levels were higher in the group of patients with stage III/IV of the disease in relation to the stage I/II or patients controls. A positive correlation of IL6 on the PF and the score of the severity of the disease was also observed (r-ASRM, RS = 0.77; p = 0.0001). Our findings suggest that IL6 may be associated with pelvic endometriosis and its severity. Additional studies will clarify if the expression of IL6 protein is changed in endometrium and ectopic and eutopic the role played by this cytokine in the pathogenesis of endometriosis.

A maioria das plantas transgênicas disponíveis atualmente possuem seus insertos regulados por promotores fortes que induzem uma transcrição intensa, permanente e generalizada, o que causa gastos energéticos desnecessários e dificulta a regeneração de um maior número de indivíduos transgênicos. O objetivo principal que norteou o presente trabalho foi desenvolver uma série de vetores plasmidiais contendo sequências promotoras projetadas e artificialmente sintetizadas para modular a expressão de genes de interesse em plantas. O promotor CaMV35S serviu como base para teste de elementos cis e geração de novos cassetes artificiais de expressão (CAEs). Os elementos cis TATA-box, CAAT-box e sítio de início da transcrição (TSS) originais da sequência de 90 pb do promotor mínimo CaMV35S foram substituídos pelos consensos já definidos para sequências promotoras de plantas, e a distância entre o TSS e o ATG de início da tradução, que originalmente era de 8 nucleotídeos, foi alterada para 75. Sítios de restrição para endonucleases foram introduzidos em posições estratégicas do promotor de forma a permitir a ligação dos elementos cis a serem testados e substituição de genes repórteres por genes de interesse. A distância entre o CAAT-box e o TATA-box, que originalmente era de 28 pb, foi alterada para 34 pb pela inclusão de um sítio para EcoRV na posição -46 do promotor artificial. Para compor o CAE, foram escolhidos o gene repórter tdTomato-ER e o terminador da nopalina sintase (Tnos). Foi desenvolvida, também, uma versão do CAE contendo o promotor CAMV35S (35S-CAE) integral para ser utilizada como controle positivo nesse trabalho. A partir de dados da literatura científica, foram selecionados os elementos cis W1, AC e RHE cujas atividades foram comprovadas como críticas à expressão regulada em sementes, tecidos vasculares e raízes respectivamente. Os elementos W1 e AC foram adaptados ao sítio de SmaI do CAE, dando origem às versões W1-CAE e AC-CAE. Não foram obtidas versões de RHE-CAE até o momento. Todas as versões do CAE obtidas nesse trabalho foram adaptadas ao vetor pKGW da série Gateway e empregadas para a transformação genética de Arabidopsis thaliana. Somente plantas transformadas com as versões CAE e 35S-CAE foram recuperadas. Sinais de fluorescências do gene repórter regulado pelas diferentes versões do CAE, necessários para validação da atividade promotora dos mesmos, não foram verificados em quaisquer das plantas recuperadas até o presente. / Most transgenic plants currently available have their inserts regulated by strong promoters that induce intense, permanent, and generalized transcription, which may cause unnecessary energy costs, preventing the regeneration of a larger number of transgenic events. The main purpose of this work was to develop a set of plasmid vectors containing designed promoter sequences, artificially synthesized to modulate the expression of genes of interest in plants. The CaMV35S was used as core promoter to test cis elements and to generate new artificial expression cassettes (AECs). Original-TATA box, CAAT-box and transcriptional start site (TSS) of the minimal 90 bp CaMV35S promoter sequence were replaced by already defined plant consensus sequences, and the distance between TSS and ATG, that was originally of 8 bp, was changed to 75 bp. Endonuclease restriction sites were introduced in strategic positions of the promoter in order to enable the cloning of cis elements and the replacement of reporter genes by genes of interest. The distance between CAAT-box and TATA-box, originally with 28 bp, was changed to 34 bp since one EcoRV site was included at position -46 of the artificial promoter. The reporter gene TdTomato-ER and the terminator of the nopaline synthase gene (Tnos) were chosen to compose the AEC. It was also developed an AEC version containing the CAMV35S promoter (35S-AEC) to be employed as positive control in this study. The W1, AC and RHE cis elements, whose activities were respectively proven as critical to the regulated expression in seeds, vascular tissues and roots, were selected from the scientific literature to be assayed. The W1 and AC cis elements were adapted to the SmaI site of the AEC, giving rise to the W1-AEC and AC-AEC versions. We did not obtain RHE-AEC versions. All AEC versions that were obtained in this study were ligated into pKGW vector of the Gateway series, and all vectors were employed to genetically transform Arabidopsis thaliana. Only plants transformed with the AEC and 35S-AEC versions were recovered. Fluorescence signals of the reporter gene regulated by AEC different versions, which were necessary for validation of promoter activity, were not observed in any of the recovered plants up to the present.

O degrane é uma das principais características que tornam o arroz vermelho daninho. A compreensão da regulação do degrane em arroz vermelho permitirá o desenvolvimento de procedimentos de biotecnologia que reduzam os problemas causados por esta planta daninha. O objetivo geral deste trabalho foi determinar a variabilidade e a regulação gênica do degrane de sementes em arroz vermelho. Os objetivos específicos foram i) caracterizar fenotipicamente o degrane das sementes em cultivares de arroz, genótipos de arroz silvestre, e ecótipos de arroz vermelho; ii) caracterizar a expressão dos genes conhecidos relacionados ao degrane em populações contrastantes; iii) analisar a variabilidade nucleotídica de genes relacionados direta e indiretamente ao degrane nestas populações; iv) identificar novas sequências gênicas expressas diferencialmente em ecótipos com diferentes níveis de degrane. Os genótipos avaliados apresentaram elevada variabilidade do degrane que variou de 20 a 270 gf. O gene qSH1 comumente relacionado com o degrane não possui efeito nos genótipos avaliados. A expressão relativa dos genes OsCPL1 e OsXTH8 apresentou uma relação direta com o nível de degrane. Já a expressão relativa do gene OsCel9D apresentou uma relação inversa aos níveis de degrane. A variabilidade nucleotídica do gene Os08g0512400 a 1271 bases upstream mostrou que os genótipos com o nucleotídeo T possuem em geral elevado degrane, enquanto que os genótipos com o nucleotídeo A apresentam baixo degrane. Além disso, a variação nucleotídica do exon 5 do gene Os01g0849100 apresentou dois SNPs, nas posições 2981 e 3057, que estão relacionados ao degrane. A metodologia SSH identificou 154 clones diferencialmente expressos que podem estar relacionados ao degrane em arroz. Destes clones, 61% apresentam funções conhecidas relacionadas ao processamento e armazenamento da informação, sinalização, processos celulares e metabolismo. Além de genes conhecidos como OsCPL1, os genes OsXTH8, OsCel9D, Os08g0512400 e Os01g0849100 também estão relacionados ao degrane de sementes em arroz. / Seed shattering is one of the main traits that make the red rice a weed. Better understanding of seed shattering regulation in red rice can be used to develop biotechnological procedures to reduce the problems of this weed. The main objective of this study was to determine the variability and genetic regulation of seed shattering in red rice. The specific objectives were i) to characterize the seed shattering in rice cultivars, wild rice and red rice ecotypes; ii) to characterize the expression of known genes related to seed shattering in contrasting rice genotypes; iii) to analyze the nucleotide variability of genes directly and indirectly related to seed shattering in these genotypes, and iv) identify new gene sequences differentially expressed in ecotypes with different levels of seed shattering. The evaluated genotypes presented large variability of seed shattering, which ranged from 20 to 270 gf. The gene qSH1, commonly related to seed shattering had no effect on the evaluated genotypes. The expression of the genes OsCPL1 and OsXTH8 was directly related with seed shattering. Otherwise, the expression of the gene OsCel9D was inversely related with seed shattering. The gene Os08g0512400 was polymorphic at 1271 bases upstream, where, in general, the genotypes with the T nucleotide had high seed shattering, and with the A nucleotide had low seed shattering. In addition, the exon 5 of the gene Os01g0849100 presented two SNPs at positions 2981 and 3057, which may be related to seed shattering. The SSH study identified 154 clones genes differentially expressed that may be related to seed shattering. The sequencing and analysis of these clones indicated that 61% of then have known functions related to processing and storage of information, signaling, cellular processes and metabolism. The variability of seed shattering in red rice is related with several genes. In addition to the know gene OsCPL1, the genes OsXTH8, OsCel9D, Os08g0512400 and Os01g0849100 are also related to seed shattering in rice.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2015. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2015-10-20T19:44:19Z No. of bitstreams: 1 2015_WilsonOliveiraSantos.pdf: 885429 bytes, checksum: 5be36bd125c215438c3dad1144fa155e (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2015-11-11T14:02:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_WilsonOliveiraSantos.pdf: 885429 bytes, checksum: 5be36bd125c215438c3dad1144fa155e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-11T14:02:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_WilsonOliveiraSantos.pdf: 885429 bytes, checksum: 5be36bd125c215438c3dad1144fa155e (MD5) / A leucemia linfoide crônica (LLC) é uma doença linfoproliferativa em que há acúmulo de células B monoclonais na medula óssea, sangue periférico, linfonodos e baço. O curso clínico da LLC é bastante variável, sendo os sintomas mais comuns o acúmulo de linfócitos B e, nos casos mais graves, a ocorrência de hepatomegalia, esplenomegalia, anemia e trombocitopenia. Embora a fisiopatologia da doença seja desconhecida, alguns marcadores prognósticos da LLC são bem definidos, sendo a expressão de ZAP70+ um dos mais avaliados. Atualmente, a fisiopatologia de diversos tipos de neoplasias tem sido relacionada a mecanismos epigenéticos. Nessa linha, nosso grupo recentemente demonstrou o envolvimento da família SMYD no desenvolvimento da leucemia linfoide aguda. Essa associação da família SMYD com uma neoplasia linfoide nos levou a desenvolver o presente trabalho, em que investigamos o padrão de expressão gênica de componentes da família SMYD em amostras de LLC e avaliamos a influência desse achado sobre dados laboratoriais como leucometria, número de plaquetas, expressão da proteína ZAP70 e achados citogenéticos dos pacientes estudados. Para isso, usamos 59 amostras de LLC e 10 amostras de células B obtidas de doadores saudáveis, como controles. Os pacientes com LLC foram submetidos a coleta de sangue para determinação do hemograma. Por citometria de fluxo determinamos a expressão da proteína ZAP-70 nas células B leucêmicas. Além disso, todas as amostras foram submetidas à análise citogenética e a extração de RNA para a análise do perfil de expressão genica da família SMYD por PCR em tempo real. Analisando as características clínicas e laboratoriais dos pacientes com LLC enrolados no estudo, 66% dos casos foram classificados como Binet A, 22% como Binet B e 12% como Binet C. Nessa amostragem, 25% dos casos apresentaram cariótipo normal e 75% dos casos apresentaram algum tipo de alteração citogenética. As amostras de células B leucêmicas e normais não expressaram SMYD1. Entretanto, as células da LLC, comparadas as amostras controle, apresentaram maior expressão de SMYD2, SMYD3, SMYD4 e SMYD5. Tendo em vista a heterogeneidade na expressão desses genes pelas amostras de LLC, as amostras neoplásicas foram dicotomizadas em casos de baixa e alta expressão dos membros SMYD. As amostras que tiveram menor expressão de SMYD2, SMYD3 e SMYD4 dentro do grupo de LLC apresentaram maior número de leucócitos, comparadas aos casos de maior expressão desses genes. É interessante, pois essas amostras com baixa expressão de SMYD2 e SMYD3 apresentaram um elevado índice de alterações citogenéticas complexas, que é um indicador de progressão e de mau prognóstico na LLC. Outro aspecto importante é que existe forte correlação entre a expressão dos genes SMYDs na LLC, indicando a possibilidade de existir na LLC um mecanismo de regulação comum para indução da expressão dos membros dessa família. Por fim, mais estudos são necessários para estabelecer os mecanismos pelo qual essas metiltransferases regulam a evolução da LLC. Esses resultados poderão servir de base para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para prevenir a progressão da LLC. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a lymphoproliferative disease that coexists with monoclonal B cells accumulated in the bone marrow, peripheral blood, lymph nodes and spleen. The clinical course of CLL is highly variable, and the most common symptoms are the accumulation of B lymphocytes and, in severe cases, the occurrence of hepatomegaly, splenomegaly, anemia and thrombocytopenia. Although the pathophysiology of the disease is unknown, some CLL prognostic markers are well defined, being the expression of ZAP70+ is one of the most assessed. Recently, the pathophysiology of various types of cancers has been linked to epigenetic mechanisms. In this line, our group recently demonstrated the involvement of SMYD family in the development of acute lymphocytic leukemia. This association of SMYD family with a lymphoid neoplasia led us to develop this work, in which we investigated the gene expression of SMYD members in CLL samples and evaluated the influence of this finding on white blood cell count, platelet count, expression of ZAP70 protein and cytogenetic findings. For this purpose, we recruited 59 CLL samples and 10 normal B-cells. ZAP-70 protein expression was determined by flow cytometry. In addition, all samples were subjected to cytogenetic analysis and RNA extraction, in order to study the genetic profile expression of SMYD family by real time PCR. Analyzing the clinical and laboratorial characteristics of patients with CLL enrolled in the study, 66% of cases were classified as Binet A, 22% as Binet B and 12% as Binet C. Normal karyotype was detected in 25% of cases, while 75% of cases presented some type of alteration cytogenetic. SMYD1 gene expression was not detected in CLL and in normal B-cells. However, compared to the control group, patients with CLL showed higher levels of the genes SMYD2, SMYD3, SMYD4 and SMYD5. Taking into account that the expression of the genes evaluated was heterogeneous among the CLL patients, we used the median value of genes expression as the cut-off to dichotomize CLL patients in ―low‖ and ―high‖ SMYD gene expression. Interestingly, patients with residual expression of SMYD2, SMYD3 and SMYD4 possess high WBC count. More important, these samples with low expression of SMYD2 and SMYD3 expression presented complex cytogenetic alterations, in contrast to the cases where the expression of these genes is high, where the karyotype was normal. Another important aspect is that there is a strong correlation among the SMYDs genes, indicating the possible existence of a common regulatory mechanism of induction of these genes in this cancer. Additional studies are required to establish the complete mechanism by wich these methyltransferases regulate the evolution of the CLL. These results may provide an important starting point for studies aiming to develop new therapeutic strategies to prevent CLL progression.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014 / Introdução: Quando um neuronio e ativado de forma intensa, desencadeia-se o aparecimento de genes de expressao imediata, dentre eles o c-fos. Este gene codifica uma proteina nuclear c-Fos, relacionada a diversas cascatas de sinais envolvidos em importantes processos bioquimicos como plasticidade neuronal, crescimento celular e mitose. Objetivos: Neste trabalho investigamos o padrao de expressao e do periodo refratario de c-Fos no cerebro de ratos e macacos apos estimulacao com pentilenotetrazol. Materiais e metodos: Foram utilizados 40 ratos (Wistar) e 40 macacos (Callithrix jacchus) sacrificados em diferentes tempos apos crise convulsiva. Os grupos para o mapeamento do padrao de expressao de c-Fos foram: grupo controle (animais sem crise); grupo PTZ 0,5h; 1, 2, 3, 6, 9 e 12h. Ja os grupos para o mapeamento do periodo refratario de c-Fos foram: PTZ1h/1h, PTZ3h/1h e PTZ6h/1h em ratos e PTZ6h/3h, PTZ 9h/3h e PTZ12h/3h nos macacos onde a primeira hora corresponde ao momento da aplicacao da 2ª dose de PTZ (apos a 1ª crise), e a 2ª hora correspondendo ao momento em que os animais foram sacrificados apos a 2ª crise. Foi feita analise do gene e proteina c-fos por meio do PCR em tempo real e imunohistoquimica no cortex motor, piriforme e cingulado. Resultados: Tantos ratos quanto macacos apresentaram inicio de expressao de c-Fos em 0,5h apos crise. No entanto, o padrao de expressao proteica entre esses animais foram distintos: em ratos, o pico de expressao se deu entre 1h e 2h apos a crise, retornando aos niveis basais apos 6h em todas as regioes. Nos macacos o pico de expressao foi de 1h a 3h apos a crise e retorno aos niveis basais de 9 a 12h. Em relacao ao mapeamento do periodo refratario de c-Fos, observamos: nos ratos um periodo refratario de expressao proteica com duracao de ate 6h, enquanto que os macacos exibem refratariedade em ate 12h apos o primeiro estimulo. Porem, nao houve diferenca de expressao genica de c-fos entre esses grupos, demonstrando um controle pos-transcricional do mecanismo de inducao da refratariedade.Conclusao: A diferenca do padrao de expressao da proteina nos roedores e primatas demonstra um aspecto funcional da bioquimica cerebral diferenciada entre as especies que pode nos ajudar a entender a maior complexidade cognitiva dos primatas em relacao aos roedores em vista da ampla relacao de c-Fos com tarefas cognitivas e de aprendizagem / Introduction: Intense activation of neurons triggers the appearance of immediate genes, including c-fos. This gene encodes a nuclear protein, c-Fos, that isrelated to various signal cascades involved in biochemical processes such as neuronal plasticity, cell growth and mitosis. Objective: Here we investigated the expression pattern and the refractory period of c-Fos in rats ́ and monkeys ́ brains, after stimulation with pentylenetetrazol. Methods: 55 rats (Wistar) and 50 monkeys (Callithrix jacchus) were sacrificed at various times after PTZ - induced seizure. The groups for mapping the c-fos expression pattern were: control group (animals without seizure); PTZ group: 0.5 h, 1, 2, 3, 6, 9 and 12h. The groups for mapping the c-fos refractory period were: PTZ1h/1h, PTZ3h/1h and PTZ6h/1h in rats and PTZ6h/3h, PTZ 9h/3h and PTZ12h/3h in monkeys. The first hour refers to the application time of the 2nd dose of PTZ after the first seizure and the 2nd hour refers to the time when the animals were sacrificed after the 2nd seizure. RNA and protein expression were assessed by real- time PCR and immunohistochemistry in motor, cingulate and piriform cortex. Results: Rats and monkeys already showed c-Fos expression at 0.5 h after seizure. Yet, the pattern of protein expression differed between rats and monkeys: in rats, the expression peaked in 1 to 2h after the seizure, returning to baseline in 6 hours in all regions. In monkeys, the expression peaked in 1 to 3h after the seizure and returned to basal levels only in 9 to 12h. Regarding the refractory period of c-Fos, we observed: in rats, a refractory period of protein expression during up to 6h, while monkeys exhibit refractoriness within 12 hours after the first stimulus. However, there were no differences in c-fos gene expression among these groups, which indicates a post - transcriptional control mechanism underlying the refractory period. Conclusion: The difference in the protein expression pattern in rodents and primates characterizes a functional aspect of brain biochemistry between these orders and my contribute for the more developed primate cognitive complexity as compared to rodents because of the relation of c-Fos with cognitive and learning tasks. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Os tripomastigotas metacíclicos de Trypanosoma cruz; expressam as glicoproteínas de superfícies GP82 e GP90 de maneira estágio-específica, as quais estão implicadas na invasão da célula hospedeira. Embora as proteínas não sejam expressam e os RNAm GP82 e GP90 fracamente detectáveis em epimastigotas, ensaios de transcrição em núcleos isolados mostraram que eles são transcritos constitutivamente nos dois estágios. Este resultado indica que o acúmulo de transcritos nas formas metacíclicas não é devido a um aumento na transcrição dos genes GP82 e GP90. Para investigar se a estabilidade dos RNAm seria a responsável pelas diferenças nos níveis destes RNAm, parasitas foram tratados com actinomicina D ou cicloheximida. Quando tratados com actinomicina D, as meia-vidas dos transcritos GP82 e GP90 foram maiores que 8 h em tripomastigotas metacíclicos e menor que 0,5 h e 2 h em epimastigotas, respectivamente. Na presença de cicloheximida, os níveis de RNAm GP82 e GP90 caíram levemente, enquanto que em epimastigotas os níveis destes RNAm aumentaram após 8 h de tratamento. Este efeito sugere um mecanismo de estabilização atuando em tripomastigotas metacíclicos e de desestabilização em epimastigotas, os quais parecem ser mediados por elementos presentes na 3' -UTR destes transcritos. Nós mostramos que a 3'-UTR da GP82 gera uma expressão maior do gene repórter GFP em tripomastigotas metacíclicos do que em epimastigotas. Consistente com este achado, análises de "northern blot" mostram que os RNAm GP82 e GP90 são mobilizados para os polissomas e conseqüentemente traduzidos apenas em tripomastigotas metacíclicos. Estes resultados sugerem que a estabilidade destes RNAm envolve interações com elementos regulatórios positivos e negativos na 3' -UTR. Estudos para melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na estabilidade dos RNAm GP82 e GP90 estão em progresso em nosso laboratório. / Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes express the developmentally regulated GP82 and GP90 glycoproteins, which are implicated in host cell invasion. Although GP82 and GP90 mRNAs and proteins are not present and the mRNAs barely detectable in epimastigotes, nuclear run-on analysis showed that they are transcribed in both stages. This result indicates that accumulation of transcripts in metacyclic forms is not due to increased transcription of the GP82 and GP90 genes. To investigate whether mRNA stability may be responsible for the differences in the steady-state levels of these mRNAs, parasites were treated with actinomycin D or cycloheximide. When treated with actinomycin D, the half-lives estimated for GP82 and GP90 transcripts were longer than 8 h in metacyclic trypomastigotes and less than 0.5 h and 2 hours in epimastigotes, respectively. In the presence of cycloheximide, the levels of GP90 and GP82 mRNA decayed slightly after 8 h in metacyclic trypomastigotes, whereas in epimastigotes the levels of these mRNAs increased. This effect suggests a stabilizing mechanism acting in metacyclic trypomastigotes and a destabilizing mechanism in epimastigotes which could be mediated by an element present in the 3’-UTR of the transcripts. We show that the 3’-UTR of GP82 causes higher expression of the green fluorescent protein reporter gene in metacyclic trypomastigotes than in epimastigotes. Consistent with this finding, northern blot analysis showed that GP82 and GP90 mRNAs were mobilized to polysomes and consequently translated, but only in metacyclic trypomastigotes. These results suggest that the stability of these mRNAs involves interactions between positive and negative regulatory elements in the 3’-UTR. Work is ongoing to better understanding the mechanisms involved in changes in GP82 and GP90 mRNA stability. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O presente trabalho mostra o envolvimento de motivos de ligação do tipo NIT2 na modulação da transcrição do gene PbGP43, que codifica um importante antígeno do patógeno humano Paracoccidioides brasiliensis. Esta investigação foi motivada pela descoberta de um elevado número de motivos do tipo GATA (ou TATC) dentro dos 2047 pb da região 5´ intergênica do PbGP43 do isolado Pb339, presentemente clonado e sequenciado neste trabalho. Este fragmento de 2047 pb contém 23 sítios NIT2, que formam 4 “clusters” putativos, dois deles idênticos. Nossa análise foi baseada em ensaios de EMSA (“electrophoretic mobility shift assay”) usando sondas selecionadas e ensaios de PCR em tempo real do gene PbGP43 de culturas de P. brasiliensis expostas a, ou depletadas, de sulfato de amônio e glutamina. Os resultados sugerem que pelo menos alguns motivos NIT2 podem ser funcionais e que o PbGP43 é modulado por fontes primárias de nitrogênio. Nós mapeamos 4 oligonucleotídeos contendo motivos TATC que formaram complexos DNA-proteína possivelmente envolvendo um fator NIT2. Esta afirmação é baseada nas seguintes observações: i) eles formaram bandas de maior intensidade nos ensaios de EMSA com extrato de células que cresceram na ausência de sulfato de amônio; ii) uma mutação pontual no núcleo TATC (para GATC) diminuiu a intensidade das bandas formadas e iii) todos os complexos migraram de forma semelhante. Tanto sulfato de amônio quanto glutamina provocaram diminuição no acúmulo de mRNA do PbGP43, sendo que o efeito pôde ser revertido quando o sal foi retirado do meio. Esta modulação foi vista não só em Pb339, mas também nos isolados Pb3 e Pb18. Os oligonucleotídeos usados para iniciar a reação para amplificação dos 2047 pb da região 5´ intergênica do PbGP43 usando DNA do isolado Pb339 também amplificaram um fragmento de tamanho similar usando DNA do Pb18 e de seis outros isolados. Para os isolados Pb2, Pb3, Pb4 e Pb5 os amplicons foram de ~1500 pb e para Pb9 e Pb17 foi de ~3000 pb. No Pb18, esta sequência é 98% idêntica à de Pb339. No Pb3, além do amplicom de menor tamanho, o número de motivos NIT2 e “clusters” é menor. Ensaios de gene repórter conduzidos em A. nidulans mostraram que os primeiros 480 pb da região 5´ intergênica não só foram responsáveis pela transcrição do gene, mas também continham os elementos necessários para a regulação negativa na presença de sulfato de amônio como fonte de nitrogênio. Além de terem sido testadas fontes de nitrogênio na modulação do PbGP43, o efeito da adição de glicose e soro fetal bovino também foi analisado. Nas condições testadas, o aumento de glicose de 0,18 para 1,5% levou a uma queda no acúmulo de mRNA do gene, no entanto, o contrário foi visto quando a concentração do açúcar subiu de 1,5 para 3%. Para o soro fetal bovino, não houve alteração significativa. Por fim, o mapeamento de elementos de transcrição da região proximal ao ATG (-1 a –326 pb) pelas técnicas de DNAse I footprinting e EMSA levaram à identificação de três regiões de proteção localizadas entre os nucleotídeos –216 e –260 da região promotora proximal. Este é o primeiro relato de modulação por fontes de nitrogênio primárias do gene PbGP43. / The present work shows the involvement of NIT2-like binding motifs in transcription modulation of the PbGP43 gene, which encodes an important antigen from the human pathogen Paracoccidioides brasiliensis. This investigation was motivated by the finding of a high number of GATA (or TATC)-like motifs within the first 2,047 nucleotides of the PbGP43 5’ intergenic region from Pb339 isolate, which has been presently cloned and sequenced. This fragment contains 23 NIT2- like sites, which form 4 putative clusters, two of them identical. Our analysis was based on electrophoretic mobility shift assay (EMSA) with selected probes and real time reverse transcription (RT)-PCR of PbGP43 from P. brasiliensis cultures exposed to, or depleted of, ammonium sulfate and glutamine. The results suggested that at least some NIT2-like motifs may be functional and that PbGP43 is modulated by nitrogen primary sources. We have mapped 4 oligonucleotides containing TATC motifs that formed DNA-protein complexes possibly involving a NIT2-like factor. This suggestion is based on the following observations: i) they formed more intense EMSA bands with extracts from ammonium sulfate-depleted cells; ii) a point mutation in the TATC core (to GATC) decreased shifted band intensity; iii) all the complexes migrated similarly. Both ammonium sulfate and glutamine provoked rapid decrease in PbGP43 mRNA accumulation, but this effect could be reversed upon salt depletion. This kind of modulation was observed not only in Pb339, but also in Pb3 and Pb18. The oligonucleotides that prime amplification of a 2,047-bp PbGP43 intergenic fragment using Pb339 DNA elongated a fragment of similar size with template from Pb18 and six other isolates, while for Pb2, Pb3, Pb4 and Pb5 the amplicon was ~1,500 bp and for Pb9 and Pb17 it was ~3,000 bp. The Pb18 genome sequence of this amplicon is 98% identical to that of Pb339. In Pb3, the number of NIT2-like motifs and clusters is lower. Gene reporter assays conducted in Aspergillus nidulans WG355 showed that the first -480 bp of the PbGP43 5´intergenic region are responsible for promoter activation and contains the minimal elements responsable for down regulation of gene when tested in minimal medium containing sodium nitrate as the only nitrogen source. Besides nitrogen sources, alterations in the concentration of glucose and addition of fetal serum bovine (FSB) in the medium were tested. In our conditions, when glucose concentration increased from 0,18 to 1,5%, mRNA accumulation decreased. The opposite was seen when concentration raised from 1,5 to 3%. FSB, on the other hand, did not alter PbGP43 expression. When the proximal promoter region was mapped by DNAse I footprinting and EMSA, we identified three protected regions localized between – 216 and –260 bp far from the initial codon (ATG). This is the first report on PbGP43 transcription modulation with primary nitrogen sources. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A Doenca de Alzheimer e uma das causas mais comuns de demencia na populacao idosa. Esta doenca e caracterizada por um complexo processo neurodegenerativo que afeta diversos genes e proteinas. Desta forma, genes diferencialmente expressos tem sido investigados como possiveis biomarcadores para condicoes tais como o envelhecimento e a Doenca de Alzheimer. Objetivos: A expressao dos genes LR11, SNAP25 e SIRT1, envolvidos respectivamente com processamento da proteina precursora ƒÀ-Amiloide, transmissao sinaptica e neuroprotecao, foram quantificados em tecido cerebral e sanguineo. Alem disso, tambem foi comparada a expressao entre estes dois tecidos a fim de identificar marcadores sistemicos que pudessem estar correlacionados ao cerebro. Metodos: A quantificacao de RNAm foi realizada por meio de qRT-PCR em tres regioes cerebrais post mortem (cortices entorrinal e auditivo e hipocampo) de 10 pacientes com Doenca de Alzheimer e 10 idosos saudaveis, assim como em leucocitos de sangue periferico de 25 jovens, 20 idosos saudaveis e 35 pacientes com Doenca de Alzheimer. Foi utilizado o metodo ƒ¢ƒ¢CT e a formula 2-ƒ¢ƒ¢CT foi empregada no calculo da quantificacao relativa. Resultados: A quantificacao do RNAm de LR11 nao diferiu entre as regioes cerebrais de pacientes com Doenca de Alzheimer e de idosos saudaveis. Em leucocitos, porem, sua expressao foi cerca de tres vezes maior em pacientes com Doenca de Alzheimer e idosos saudaveis em relacao ao grupo de jovens. Em relacao ao gene SIRT1, sua expressao foi duas vezes maior em pacientes com Doenca de Alzheimer do que em idosos saudaveis para as tres regioes cerebrais estudadas. Em leucocitos, por sua vez, a quantificacao do RNAm de SIRT1 nao diferiu entre os tres grupos estudados. Alem disso, leucocitos de sangue periferico apresentaram maior expressao dos genes LR11 e SIRT1 quando comparados ao cerebro. Para o gene SNAP25, foi observada ausencia de expressao em leucocitos de sangue periferico. Em relacao ao tecido cerebral de idosos saudaveis, o cortex entorrinal e o hipocampo apresentaram menor expressao de SNAP25 do que o cortex auditivo. Alem disso, a quantificacao relativa de SNAP25 nas regioes cerebrais de pacientes com Doenca de Alzheimer variou entre 34 e 39% do total de expressao observada em idosos saudaveis. Conclusoes: Os resultados deste estudo indicaram alguns potenciais marcadores para o envelhecimento e para a Doenca de Alzheimer. O nivel de expressao de LR11 pode ser considerado um marcador de envelhecimento em tecido sanguineo. A maior expressao de SIRT1 no cerebro de pacientes com Doenca de Alzheimer sugere que este gene possa estar envolvido em mecanismos compensatórios nos estágios tardios da doença. A expressão cerebral dos genes LR11 e SIRT1 não se correlacionou com a de leucócitos, não sendo possível utilizá-los como biomarcadores sistêmicos da doença. O gene SNAP25 não se expressou em tecido sanguíneo na DA, desse modo, não foi indicado como biomarcador para a doença nesse tecido. No cérebro, porém, a diminuição de sua expressão em pacientes com DA sugere disfunção sináptica e de neurotransmissão associada à doença. / Alzheimer Disease is the most common cause of dementia in elderly people. This disorder is characterized by a complex neurodegenerative process affecting multiple genes and proteins. Therefore, efforts have been made in identifying differentially expressed genes to be used as biomarkers in conditions such as aging and Alzheimer fs Disease. Purpose: Quantitative expression analysis of LR11, SNAP25 and SIRT1 genes, involved respectively in APP processing, synaptic transmission and neuroprotection, were investigated in brain and blood tissues. Furthermore, the expression between both tissues was also compared in order to find systemic markers that could represent the brain. Methods: mRNA quantification was performed using qRT-PCR in three post mortem brain regions (entorhinal and auditory cortices and hippocampus) of 10 Alzheimer fs Disease patients and 10 healthy elderly as well as in peripheral blood lymphocytes of 25 young, 20 healthy elderly and 35 Alzheimer fs Disease patients. We used the ƒ¢ƒ¢CT method in the analysis and the 2-ƒ¢ƒ¢CT formula to calculate the relative quantification. Results: LR11 mRNA quantification did not differ significantly concerning brain regions between Alzheimer fs Disease and healthy elderly subjects. However, in lymphocytes, its expression was threefold higher in Alzheimer fs Disease and healthy elderly subjects in comparison to the young group. Regarding SIRT1 gene, its expression was twofold higher in Alzheimer fs Disease patients than in healthy elderly for all brain regions. In lymphocytes, however, SIRT1 mRNA quantification was not significantly different among the three studied groups. Furthermore, lymphocytes showed a higher gene expression than brain regions for both LR11 and SIRT1 genes. In addition, a lack of SNAP25 expression was observed in blood lymphocytes. In brain tissues of the healthy elderly group, SNAP25 mRNA quantification was lower in the entorhinal cortex and hippocampus than in the auditory cortex. Furthermore, relative quantification of SNAP25 mRNA in brain regions of Alzheimer fs Disease patients was 34-39% of the total expression observed in the healthy elderly group. Conclusions: Our results presented some potential markers of Alzheimer fs Disease and aging processes. LR11 expression may be considered an age-related marker in blood tissue. The higher SIRT1 expression in Alzheimer fs Disease patients f brain suggested that this gene might be involved in compensatory mechanisms in the late stages of Alzheimer fs Disease. Both LR11 and SIRT1 brain expression was not correlated with blood expression, not being possible to consider them as systemic biomarker of the disease. Furthermore, it was not possible to use SNAP25 gene as a biomarker in blood once it was not expressed in this tissue. However, in the Alzheimer’s Disease patients’ brain, the decrease of SNAP25 expression might suggest an impairment of the synaptic function and neurotransmission found in the disease. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:35:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 natalia_gomes_ioc_mest_2014.pdf: 3321973 bytes, checksum: 59b3c4b51a637c1e44229ae143291433 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas é uma doença negligenciada causada pelo protozoário parasita Trypanosoma cruzi, o qual afeta cerca de 6-8 milhões de pessoas em áreas endêmicas da América Latina. As diferentes cepas envolvidas na infecção, e sua distribuição regional, tem sido sugeridas como causa das diferentes manifestações clínicas, resposta ao diagnóstico e eficácia terapêutica. A ecto-NTPDase é uma enzima localizada na superfície externa da membrana plasmática do T.cruzi, que hidrolisa nucleotídeos tri e difosfatados. Estudos anteriores têm relacionado esta enzima à infectividade e virulência de tripanosomatídeos, além de sugerir um papel importante na captação de purinas pelos parasitos. Neste trabalho avaliamos os níveis de mRNA para a TcNTPDase-1 por RT-PCR, em diferentes isolados do parasito (Dm28c- T.cruzi I; Y- T.cruzi II; 3663- T.cruzi III; 4167- T.cruzi IV; LL014- T.cruzi V; CL-14- T.cruzi VI- avirulenta), em formas não-infectantes (epimastigotas) e infectantes (tripomastigotas e amastigotas). Os ensaios de PCR em Tempo Real foram realizados com oligonucleotídeos desenhados para amplificar uma sequência de 111pb do gene TcNTPDase-1 e, como controles endógenos, uma sequência de 268pb do gene da TcCalmodulina e uma sequência de 100pb do gene TcGAPDH foram utilizados. Nós observamos que epimastigotas das cepas Y, 3663, 4167 e LL014 apresentaram os mesmos níveis de expressão do gene TcNTPDase-1 que o clone CL-14, avirulento Por outro lado, o clone Dm28c expressou 7,2\F0B11,5 vezes mais o gene desta enzima que o clone CL-14. Além disso, observamos que as formas infectantes tripomastigota e amastigota apresentaram, respectivamente, uma expressão 22,5\F0B15,6 e 16,3\F0B13,8 vezes maior que a forma epimastigota. Observamos também que durante a curva de crescimento de formas epimastigotas a 28°C e 37°C a expressão deste gene aumenta gradativamente com o tempo de cultivo, sendo mais pronunciado a 37°C, sugerindo que o choque-térmico e o longo período de cultivo pode aumentar a expressão do gene da TcNTPDase-1. Em conjunto, nossos dados sugerem que a TcNTPDase-1 estaria envolvida nos processos de infectividade do T.cruzi, bem como adaptação do parasita a temperatura do hospedeiro vertebrado. Devido sua importância para o T.cruzi, a TcNTPDase-1 apresenta potencial para ser avaliada como possível alvo para quimioterapia da Doença de Chagas / Chagas disease is a negl ected illness caused by the parasite protozoan Trypanosoma cruzi , which affects 6 - 8 million people in endemic areas of Latin America . The distinct strains involved in infection, in conjunction with the regional distribution, have been suggested to cause di fferent clinical manifestations and therapeutic efficiency in Chagas Disease. The ecto - NTPDase is an apyrase located on the outer surface of T. cruzi plasma membrane - that hydrolyzes tri - and/or di - phosphate nucleotides . Previous studies related this enzyme to the infectivity and virulence of the parasite , and suggest an important role in the uptake of purines . In this study, we evaluate the mRNA levels for the e cto - NTPDase I by RT - PCR in distinct isolated parasites (Dm28c - T. cruzi I; Y - T. cruzi II; 3663 - T. cruzi III; 4167 - T. cruzi IV; LL014 - T.cruzi V ; CL - 14 - T. cruzi VI - avirulent ) , in non - infective forms (epimastigotes) and infective forms (amastigotes and trypomastigotes) . The Real Time PCR assays were performed with primers designed to amplify a 111b p seq uence in the TcNTPDase - 1 gene and, as endogenous controls, a 268bp sequence in the TcCalmoduline gene and a 100bp sequence in the Tc GAPDH gene were used. We observed that the epimastigotes of strain s Y, 3663, 4167 e LL014 expressed the same levels of the g ene of TcNTPDase - 1 that the CL - 14 clone, avirulent. On the other hand, the Dm28c clone expressed 7 . 2  1 . 5 times higher the gene of this enzyme that the C L - 14 clone. Surprisingly, w e observed that the trypomastigote and amastigote presented expression levels , respectively, 22 . 5  5 . 6 and 16 . 3  3 . 8 time s higher than the epimastigote form. Moreover, following the epimastigotes growth curve at 28°C e 37°C , we also observed that the expression of TcNTPDase - 1 increases with the days of growth, and this increase is mo re pronounced at 37°C , suggesting that heat shock and long - term cultivation could increase TcNTPDase - 1 gene expression . In conjunction, our results suggest the role of TcNTPDase - 1 on T. cruzi infectivity and adjustment to stress conditions s uch as nutrients starvation and heat shock. Due to its importance for T. cruzi , TcNTPD ase - 1 has the potential to be e valuated as a possible target for chemotherapy of Chagas Disease .

NEPOMUCENO, D. R. Clonagem e expressão de uma lectina de Artocarpus incisa L. (Frutalina) em Escherichia coli. 2008. 81 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2008. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-27T19:23:51Z No. of bitstreams: 1 2008_dis_drnepomuceno.pdf: 815376 bytes, checksum: 17de51e5080e91f90b2ad84ac669dbba (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-02-27T19:42:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_dis_drnepomuceno.pdf: 815376 bytes, checksum: 17de51e5080e91f90b2ad84ac669dbba (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-27T19:42:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_dis_drnepomuceno.pdf: 815376 bytes, checksum: 17de51e5080e91f90b2ad84ac669dbba (MD5) Previous issue date: 2008 / The lectins constitute biotechnological tools of fundamental importance in hystochemical and cytochemical studies for the detection of tissue glycoconjugates. Among their applications are the identification of membrane receptors and the detection of neoplastic characteristic structures. Frutalin, an -D-galactose-binding lectin from Artocarpus incise seeds, has already been used in the hystochemical detection of thyreoid and breast neoplasia. In this work was made a study of the cloning and expression of the frutalin gene in Escherichia coli Origami (DE3) cells and was determined the three-dimensional structure of this protein through homology modeling. The frutalin gene cloning was accomplished from the product on RT-PCR with seeds in distinct stages of development of the Artocarpus incisa fruits. Twelve clones were obtained, from which five were sequenced. The frutalin gene was expressed in E. coli using the pET15b expression vector. A recombinant lectin (rFrutalin) was expressed by growing the bacteria in the presence of isopropyl -D-thiogalactopyranoside 1mM. All the recombinant lectin was found in an insoluble aggregated form as inclusion bodies. The recombinant lectin had a higher molecular mass (19,2 kDa) than the native lectin (15 kDa) as estimated by SDS-PAGE and Western blot analyses, showing that the recombinant single chain Frutalin is not processed in E. coli cells. The models generated for the clones obtained indicate that the mutations do not change the molecules active sites. Mutations in the clones obtained suggest the occurrence of isoforms of this protein. / As lectinas constituem ferramentas biotecnológicas de fundamental importância em estudos histoquímicos e citoquímicos para a detecção de glicoconjugados nos tecidos. Entre estas aplicações, destacam-se a identificação de receptores de membrana e a detecção de estruturas características de neoplasias. A Frutalina, uma lectina -D-galactose-ligante encontrada em sementes de Artocarpus incisa, já foi utilizada na detecção histoquímica de lesões malignas de mama e tireóide. No presente trabalho foi realizada a clonagem e expressão do gene da frutalina em células de Escherichia coli Origami (DE3) e foi determinada a estrutura tridimensional dessa proteína através da modelagem por homologia. A clonagem do gene da frutalina foi realizada a partir do produto amplificado da RT-PCR de sementes em diferentes estágios de maturação dos frutos de A. incisa. Foram obtidos 12 clones, dos quais 5 foram seqüenciados. A lectina recombinante foi expressa como cadeia única, formada pela cadeia beta com 20 resíduos, ligada a um peptídeo de ligação com quatro resíduos, e a cadeia alfa com 133 resíduos. A expressão da lectina foi indicada pelo aparecimento de uma banda protéica com massa molecular aparente de 19,2 kDa, superior a da lectina nativa (15 kDa), após a indução com IPTG 1mM. A lectina recombinante foi mantida exclusivamente em corpos de inclusão e foi reconhecida imunologicamente por anticorpos policlonais anti-Frutalina. Os modelos gerados para os clones obtidos indicam que as mutações ocorridas não alteram os sítios de ligação a carboidratos das moléculas. As mutações nos clones obtidos sugerem a ocorrência de isoformas dessa proteína.