Resumo: O estresse por calor é considerado um dos fatores de maior impacto na criação de frangos de corte, já que exerce grande influência no desempenho e na qualidade da carcaça, bem como no perfil de expressão de genes relacionados ao crescimento e desenvolvimento animal. Assim, o presente trabalho objetivou verificar o efeito da temperatura e da restrição alimentar no desempenho, composição de carcaça e nos padrões de expressão de genes envolvidos na regulação do crescimento e desenvolvimento (GHR, IGF-I e IGF-IR), aos 21 e 42 dias de idade dos frangos de corte pela técnica de PCR quantitativo em tempo real. Os resultados evidenciaram que a restrição alimentar imposta pela exposição ao calor reduziu o desempenho e rendimento de peito e aumentou o rendimento de coxas+sobrecoxas. O estresse por calor e o consumo de ração alteraram o rendimento de asas, mas não influenciaram o rendimento de carcaça e de gordura abdominal. O calor aumentou o teor de extrato etéreo no peito e nas asas e diminuiu o de matéria mineral nas coxas+sobrecoxas. Independente da temperatura de criação, a restrição alimentar exerce um efeito negativo na expressão do gene do GHR no fígado das aves jovens, sem maiores reflexos na expressão do gene do IGF-I. O estresse térmico afeta a expressão dos genes hepáticos GHR e IGF-I somente nas aves adultas, as quais apresentam perfil inverso ao das aves restritas pelo "pair-feeding". A reação de amplificação do gene IGF-IR apresentou formação de produtos de amplificação inespecíficos, assim como formação de estruturas secundárias das moléculas dos iniciadores (dímeros e "hairpins"), o que impossibilitou a análise dos resultados / Abstract: Heat stress is considered one of greatest impact factors on broiler chicken production, once that it has great influence on the performance and carcass quality, as well as on the expression profile of genes related to growth and animal development. Thus, the present work had the objective of verifying the effect of temperature and food restriction on the performance, carcass composition and expression pattern of genes involved in the growth regulation and development (GHR, IGF-I and IGF-IR), at 21 and 42 days of age of the broilers using the PCR quantitative real-time technique. The results showed that the food restriction imposed by heat exposure, affected negatively the performance and breast yield and, positively, the tight and drumstick yield. The heat stress and feed intake altered the yield of wings, but did not affect carcass yield and abdominal fat. The heat increased both ether extract content in the breast and wings and reduced the mineral matter content in the tights and drumsticks. Independent of temperature, in the young bird's livers, food restriction endorses a negative effect on the GHR gene expression, without greatest reflects on IGF-I expression. Only on adult bird's, thermal stress affects the expression of GHR and IGF-I hepatic genes, that exhibit an inverse profile of restricted pair-feeding birds. The amplification reaction of IGF-IR gene showed both formation of nonspecific amplification products, as well as secondary structures of the primers of the molecules (dimerous and hairpins), precluding the analysis of results / Orientador: Renato Luís Furlan / Coorientador: Luiz Roberto Furlan / Banca: João Martins Pizauro Júnior / Banca: Poliana Fernanda Giachetto / Mestre

Resumo: Formigas cortadeiras do gênero Atta, popularmente conhecidas como saúvas, são as mais derivadas dentro da tribo Attini. Apresentam grande importância ecológica, porém, pelo hábito de cortarem folhas para manutenção do fungo simbionte e pelo enorme tamanho das colônias, causam muitos prejuízos às lavouras, pastagens e plantações, sendo consideradas pragas agrícolas. Atta laevigata Smith, 1858 apresenta vasta distribuição pelo Brasil e é responsável pela herbivoria de inúmeras plantas dicotiledôneas, gramíneas e espécies nativas de diferentes biomas. O presente trabalho teve como objetivos a caracterização parcial do transcriptoma e do genoma mitocondrial de A. laevigata. Foram caracterizadas 2006 sequências únicas do transcriptoma, a partir de uma biblioteca de cDNA preparada com indivíduos inteiros da formiga. Entre essas sequências, 16 provavelmente representam genes com grande número de transcritos. Esses 16 genes estão relacionados a três funções celulares: (i) conservação de energia através de reações redox na mitocôndria; (ii) estrutural, pelo citoesqueleto e músculos; (iii) regulação da expressão gênica e metabolismo. Considerando o estilo de vida e processos biológicos chaves para essas formigas, 146 sequências foram identificadas com base na sua utilização para o controle de cortadeiras pragas. A partir de dados da biblioteca de cDNA e procedimentos envolvendo primer walking, o genoma mitocondrial de A. laevigata foi parcialmente caracterizado, apresentandose com 17920 pb, maior, portanto, do que outros já descritos em Hymenoptera, mesmo considerando-se a impossibilidade de determinação da sequência de uma pequena porção do mtDNA, envolvendo a região controle, uma parte do 12S e os tRNAs S1, V e M. Como já descrito para outros mitogenomas, o de A. laevigata apresentou alto conteúdo AT, os mesmos 13 genes codificadores... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Leafcutter ants from Atta genus, popularly known as "saúvas", are the most derived of the tribe Attini. They have major ecological importance, but, because of their habit of cutting leaves for the maintenance of the symbiotic fungus and the huge colony size, they impose severe economic damages to plantations, pastures, and agriculture, being considered as agriculture pests. Atta laevigata shows wide distribution in Brazil and it is responsible for the herbivory of many dicots, grass, and native species from different biomes. The present work aimed to characterize the transcriptome and the mitochondrial genome of A. laevigata. 2,006 unique sequences of the transcriptome were characterized from a cDNA library constructed with whole individuals. Among those sequences, 16 are likely from genes with high number of transcripts. Those 16 genes are related with three cellular functions: (i) energy conservation through redox reactions in mitochondria; (ii) cytoskeleton and muscle structuring; (iii) regulation of gene expression and metabolism. Based on lifestyle and key biological processes of these ants, 146 sequences were identified with potential use for controlling pest leafcutters. Using data from cDNA library and primer walking proceedings, the mitochondrial genome of A. laevigata was partially characterized with 17,920 bp, being larger than the others already described for Hymenoptera. A small part of the mtDNA was not sequenced, including the control region, a portion of 12S and tRNAs S1, V, and M. As described before for other mitogenomes, A. laevigata mtDNA displayed high AT contain, the same 13 proteincoding genes and the two ribosomal subunits with length and location according to the hypothetic ancestral mitogenome. Rearrangements were found for the tRNAs, but the most remarkable difference were the high number and longer length of intergenic regions presented in the mtDNA... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Maurício Bacci Júnior / Coorientador: Henrique Ferreira / Banca: Flavio Henrique da Silva / Banca: Marco Antonio del Lama / Banca: Mariana Lúcio Lyra / Banca: Klaus Hartmann Hartfelder / Doutor

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Ricardo Luiz Moro de Sousa / Banca: José Moacir Marin / Banca: Eduardo Hilário / Banca: Maria da Glória Buzinaro / Resumo: Foram realizadas a clonagem e expressão do gene da nucleoproteína (N) de uma estirpe vacinal de referência M41 do vírus da bronquite infecciosa (VBI), como proteína recombinante de fusão, contendo uma cauda de poli-histidina na extremidade carboxi-terminal, em 2 sistemas hospedeiros; na levedura metilotrófica, Pichia pastoris e na bactéria Escherichia coli. A proteína N derivada de um isolado variante do VBI de surtos a campo no Brasil, também foi expressa em E. coli. As características bioquímicas e imunoquímicas de tais proteínas recombinantes, foram determinadas, tendo sido evidenciado maior eficiência de produção no sistema hospedeiro constituído por E. coli, comparativamente ao sistema composto por P. pastoris. Uma vez obtidas, caracterizadas e purificadas, através da técnica de cromatografia de afinidade em resina de níquel-sepharose, as preparações de proteína N recombinante expressas em E. coli e derivadas ou da estirpe de referência M41 ou do novo isolado de campo no Brasil, foram utilizadas de forma bem sucedida, como antígenos alvo de ensaios indiretos de ELISA, que foram aplicados na detecção e mensuração de anticorpos dos isótipos IgG e IgM em aves infectadas com estirpes homóloga ou variantes do VBI. Foi, também, investigada a atividade imunogênica da proteína N recombinante em aves, que depois de imunizadas e re-imunizadas com essas proteínas recombinantes, produziram no soro sanguíneo e na secreção lacrimal quantidades elevadas de anticorpos anti-VBI específicos, mas não desenvolveram proteção efetiva contra o desafio com a estirpe homóloga desse vírus. Concluindo, a proteína N recombinante do VBI expressa pela E. coli possui elevada imunogenicidade, no sentido de induzir altos níveis de anticorpos específicos, e reatividade cruzada com proteínas N de outras variantes desse vírus, tendo um grande potencial de ser aplicada em ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Two host systems, represented by Escherichia coli and Pichia pastoris were used for cloning and protein expression of the nucleoprotein (N) gene of M41 strain of infectious bronchitis virus (IBV) as a fusion recombinant protein containing a poli-histidine tag. The N protein from a new variant Brazilian field isolate was also cloned and expressed by E. coli system. The biochemical and immunochemical properties of these recombinant N proteins were determined and higher efficiency on protein production was achieved by using the E. coli expression system. Both recombinant N proteins expressed by E. coli were purified in nickel-sepharose resin and used as antigen in indirect ELISA methods for the detection of IgG and IgM antibodies in birds infected with homologous and variant IBVs. The immunogenicity of N recombinant protein was also evaluated by immunizing and re-immunizing birds and high antibody levels were generated in lachrymal secretion and serum, but no effective protection against challenge with homologous virulent stain of IBV was induced. Concluding, the recombinant N IBV protein expressed by E. coli is highly immunogenic for inducing specific and crossreactive antibodies, and can be applied in the immuno-diagnosis of IB / Doutor

Resumo: Sabendo que o processo de transformação do músculo em carne no estágio postmortem é largamente governado pela proporção de distintos tipos de fibras, e tendo em vista a necessidade de suprir as demandas do setor da pecuária bem como as exigências do consumidor por um produto de maior qualidade, inclusive da carne, o presente projeto objetivou relacionar a maciez da carne do músculo Longissimus dorsi (LD) com a expressão gênica e protéica das isoformas da cadeia pesada da miosina (MHC) em dois grupos genéticos de bovinos. Foram analisados 28 bovinos jovens de dois grupos genéticos, 14 Nelores e 14 Canchins. Os animais receberam a mesma dieta, o mesmo manejo no mesmo ambiente, com a finalidade de mantê-los no mesmo estado fisiológico. Atingindo o tempo pré-estabelecido de confinamento de 140 dias, os animais foram abatidos e amostras do músculo LD foram coletadas para análise da maciez da carne e também para a quantificação das expressões gênicas e protéicas das isoformas de MHC através das técnicas de RT-qPCR e de separação eletroforética (SDS-PAGE) respectivamente. O grupo Canchim apresentou maior maciez da carne em relação ao grupo Nelore em ambas as metodologias utilizadas, força de cisalhamento e índice de fragmentação miofibrilar, bem como uma menor expressão gênica da isoforma de MHC 2X. Foi verificada uma correlação negativa da expressão das isoformas 2A e 2X e uma correlação positiva da expressão da isoforma de MHC Slow com a maciez da carne nos dois grupos genéticos. Os resultados sugerem que a menor maciez da carne do grupo Nelore em relação ao grupo Canchim possa estar relacionada com a maior expressão gênica da isoforma de MHC 2X no grupo Nelore / Abstract: Knowing that the meat tenderness process that turns muscle in meat on postmortem are largely governed by the proportion of different fiber types, and in view of the need to supply the needs of livestock industry and consumer demands for a higher quality product, including meat, this project aimed to relate meat tenderness of Longissimus dorsi muscle (LD) with gene and protein expression of myosin heavy chain (MHC) isoforms in two genetic groups of cattle. Twenty-eight steers of two genetic groups, 14 Nellores and 14 Canchins were used. The animals received the same feed, the same management in the same environment, in order to keep them in the same physiological state. After 140 days of feedlot, the animals were slaughtered and LD muscle samples were collected for meat tenderness analysis and also for gene and protein expression quantification of MHC isoforms using RT-qPCR and electrophoretic separation (SDS-PAGE) technique, respectively. The Canchim group had better meat tenderness in relation to Nellore group in both methodologies used, shear force and myofibrillar fragmentation index and lower MHC 2X isoform gene expression. It was observed a negative correlation between 2A and 2X isoforms expression and a positive correlation of MHC Slow isoform expression to meat tenderness in the two genetic groups. The results suggest that lower meat tenderness of Nellore group in relation to Canchim group may be related to higher gene expression of MHC 2X isoform in Nellore group / Orientador: Henrique Nunes De Oliveira / Coorientadora: Maeli Dal Pai Silva / Banca: Robson Francisco Carvalho / Banca: Rafael da Costa Cervieri / Mestre

Resumo: O tumor renal é a mais letal das doenças urológicas. É uma doença histologicamente heterogênea, sendo o carcinoma renal de células claras o subtipo histológico mais comum. Embora a nefrectomia e imunoterapia sejam tratamentos bem estabelecidos, aproximadamente 30% dos pacientes tratados são acometidos por metástases. Alterações na expressão gênica e na inativação transcricional, devido ao mecanismo de metilação, são evidentes em células cancerosas. A metilação do DNA é um evento epigenético intimamente relacionado com o silenciamento da expressão gênica, e está envolvida em vários processos, dentre eles, a carcinogênese. Dessa forma, este trabalho teve como objetivos investigar se os genes selecionados, GPC3, CRABP2, KTN1 e ADAM23 apresentam expressão alterada nas amostras tumorais, verificar se a expressão gênica está associada com a progressão tumoral, e analisar o padrão de metilação de ilhas CpGs. Os quatro genes selecionados foram validados pela técnica de PCR em Tempo Real. Para validação desses genes foram utilizadas 35 amostras de carcinoma renal de células claras e 35 amostras de córtex renal normal. Os genes GPC3, CRABP2, KTN1 e ADAM23 apresentaram redução de expressão significativa em amostras de carcinoma renal de células claras quando comparadas ao pool de amostras de córtex renal normal. Observou-se que a redução da expressão do gene ADAM23 está diretamente relacionada com o avanço do estadiamento tumoral. Foi observada uma freqüência elevada de hipermetilação do gene ADAM23, entretanto, não houve associação do padrão de metilação com os dados clínicos. A análise da expressão gênica e dos mecanismos responsáveis pela inativação transcricional dos genes CRABP2, KTN1 e ADAM23, estudados pela primeira vez em carcinoma renal, e GPC3, podem fornecer informações relevantes para o conhecimento e desenvolvimento do carcinoma renal de células claras. / Abstract: The renal tumor, which is the most lethal of urological diseases, is a histologically heterogeneous disease, and the clear cell renal cell carcinoma the most common histological subtype. Although the treatment of nephrectomy and immunotherapy are established, approximately 30% of patients are affected by metastases. Changes in gene expression and transcriptional inactivation, due to the methylation mechanism are evident in cancer cells. The DNA methylation is an epigenetic event closely related to the silencing of gene expression, and is involved in several cases, including the carcinogenesis. The aim of this study was to investigate the gene expression of GPC3, CRABP2, KTN1 and ADAM23, check if gene expression was associated with tumor progression and analyze methylation pattern of CpG island. The four selected genes were validated by the quantitative RT-PCR. Thirty five samples of clear cell renal cell carcinoma and 35 samples of normal renal cortex were used for validation. The genes GPC3, CRABP2, KTN1 and ADAM23 showed significant reduction of expression in samples of clear cell renal cell carcinoma when compared to a pool of samples of normal renal cortex. It was observed that the lower expression of ADAM23 is directly related to the advancement of the tumor staging. Despite the high frequency of hypermethylation of ADAM23, there was no association with the methylation pattern of the clinical data. The analysis of gene expression and the mechanisms responsible for the transcriptional inactivation of genes CRABP2, KTN1 and ADAM23, first studied in clear cell renal cell carcinoma, and GPC3, may provide relevant information for the clear cell renal cell carcinoma understanding and development. / Orientador: Paula Rahal / Coorientador: Paulo Peitl Júnior / Banca: Ana Elizabete Silva / Banca: Andréia Machado Leopoldino / Mestre

Orientador: Rosangela Zacarias Machado / Banca: Solange Maria Gennari / Banca: Aramis Augusto Pinto / Banca: Deise Aparecida de Oliveira Silva / Banca: Ana Patricia Yatsuda Natsui / Resumo: Neospora caninum é um protozoário do Filo Apicomplexa, que foi primeiramente descrito como causa de encefalomielite em filhotes caninos sorologicamente negativos para Toxoplasma gondii. Estudos anteriores neste importante hospedeiro da cadeia epidemiológica de N. caninum demonstram que as respostas de anticorpos IgG são tardiamente detectadas e que a infecção clínica é de difícil indução. Desta forma, este trabalho objetivou o estudo da imunidade de cães frente à infecção oral por N. caninum. Os resultados obtidos a partir de análises de diversos animais experimentalmente infectados indicam que os cães apresentam uma prolongada fase aguda da infecção, com eliminação de oocistos associado à queda nos níveis de linfócitos T CD4+ e CD8+ e diminuição de MHC de classe II por células apresentadoras de antígeno. Adicionalmente, os animais apresentam soroconversão instável durante o mesmo período, sendo que somente IgG1 e IgG3 foram detectados em adultos e filhotes, respectivamente, entre o 2o e 3o mês de infecção. De forma concomitante, observa-se uma predominância da expressão de citocinas imunomoduladoras como TGF 1, IL-4 e IL-10. Após dois meses de infecção, o perfil da resposta se inverte, sendo observado picos de produção dos marcadores CD4 e CD8 de linfócitos T e citocinas próinflamatórias como IFN , IL-6 e IL-12, além do aumento nos títulos de anticorpos, principalmente IgG1 e IgG4 nos cães jovens. Com base nestes resultados, conclui-se que os cães apresentam uma relação de equilíbrio com N. caninum, a qual induz nesta espécie uma modulação da resposta imunológica durante a fase de merogonia. / Abstract: Neospora caninum is an Apicomplexan parasite firstly described as the cause of encephalomyelitis in puppies serologically negative to Toxoplasma gondii. Previous reports on the parasite’s definitive host indicate a late IgG antibody response and that clinical disease is difficult to be induced. The aim of this study was to investigate canine immunity during N. caninum oral infection. The results obtained from the analysis of infected animal’s samples indicate that dogs present a protracted acute phase, with oocyst shedding correlated to a drop in CD4+ and CD8+ T cell levels, and low MHC class II expression by antigen presenting cells. Additionally, the dogs presented an unstable seroconversion pattern in the same period, with only IgG1 and IgG3 being detected in adult dogs and puppies, respectively, between the second and third months of infection. Concomitantly, dominant Th2 cytokine expression was observed, with peak expression levels of TGF 1, IL-4 and IL-10. After 2 months of infection, the immunity profile shifts towards a Th1 response, with high levels of CD4 and CD8 lymphocytary marker production and pro-inflammatory cytokine expression (IFN , IL-6 and IL-12), besides of the raise in antibody levels, especially IgG1 and IgG4 in puppies. Based in the results presented herein, we may conclude that dogs present a balanced host-parasite relationship, modulating the host immune response during N. caninum merogony. / Doutor

Resumo: A seca é, atualmente, o principal fator responsável por perdas na produção brasileira de soja. Em situações de déficit hídrico, vários mecanismos são acionados pela planta para aumentar a tolerância à seca. Conhecer esses mecanismos e como é regulada a expressão dos genes relacionados com resposta à seca, é essencial na identificação de rotas metabólicas envolvidas nos processos de defesa, e, conseqüentemente, no desenvolvimento de estratégias moleculares para obtenção de plantas mais tolerantes a essa condição. O estudo da expressão gênica em plantas requer a quantificação precisa de RNAm expressos em diferentes situações. Assim, inicialmente foram usados os eventos de soja geneticamente modificados para tolerância à seca, P58 e P1333, contendo a construção rd29a: Atdreb1a, em condições de 15% de umidade gravimétrica (UG) para hibridização em "chips" contendo 44 Kb de oligonucleotídeos, sendo possível identificar 100 genes diferencialmente expressos em cada evento, quando comparados com a planta controle. Posteriormente, foram utilizadas cultivares de soja contrastantes para a tolerância à seca, em diferentes condições de déficit hídrico no sistema de hidroponia, e construídos arranjos de cDNA a partir de biblioteca gerada, obtendo-se 145 genes diferencialmente expressos que codificam proteínas envolvidas direta elou indiretamente em rotas metabólicas de resposta a estresses bióticos e abióticos. Os grupos de genes identificados como diferencialmente expressos durante os tratamentos aplicados em ambos os experimentos foram classificados em categorias funcionais, entre eles genes envolvidos na produção de energia, fatores de transcrição, genes envolvidos em diferentes vias anabólicas e/ou catabólicas como aminoácidos, lipídeos, carboidratos e no metabolismo fotossintético, genes de respostas a estresses, genes que participam... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The drought is currently the main responsible factor for losses Brazilian soybeans production. In water stress situation, several mechanisms are triggered by the plant to increase tolerance to drought. Knowing these mechanisms and how is regulated the expression of genes related to the drought response is essential in identifying routes involved in the metabolic processes of defense, and, therefore, the development of molecular strategies to obtain more tolerant plants to this condition. The study of gene expression in plants requires the quantification of RNAm expressed in different situations. So, initially, two methodologies of DNA microarray for analysis in large scale of differential gene expression were conducted. First, soybeans events genetically modified for tolerance to drought, P58 and P1333 containing the construction rd29a: Atdreb1a under conditions of 15% gravimetric humidity (GH) were used in "chips" containing 44 Kb of oligonucleotides, being able to identify 100 differential gene expression in each event, compared with the control plant. Subsequently, contrasting cultivars to drought were used, in different conditions of water stress in the hidroponic system, and cDNA arrays were constructed, getting 145 differential gene expression that encode proteins involved directly and I or indirectly on routes of metabolic response to biotic and abiotic stresses. The groups of genes identified with differential expression during the treatments applied in both experiments were classified into functional categories, including genes involved in the production of energy, of transcription factors, genes involved in different ways anabolics and I or catabolics as amino acids, lipids, carbohydrates and the photosynthetic metabolism, gene responses to stresses, genes that participate in the synthesis of proteins, cell communication, the cell cycle, cellular transport genes with... (Complete abstract click electronic access below) / Orientadora: Eliana Gertrudes Macedo Lemos / Coorientador: Alexandre Lima Nepomuceno / Banca: Ricardo Vilela Abdelnoor / Banca: Lúcia Maria Carareto Alves / Banca: Francismar Corrêa Marcelino / Banca: João Martins Pizauro Junior / Doutor

Resumo: Foi construído um microarranjo com as 2600 ORFs identificadas no projeto de sequenciamento da bactéria Xylella fastidiosa estirpe 9a5c, e utilizado para analisar diferenças na expressão gênica global da bactéria dentro de uma laranja doce suscetível (Pera) e uma tolerante (cultivar Navelina ISA 315). Foram achados mais genes diferencialmente expressos envolvidos na degradação, reguladores, componentes de membrana, adesinas tipo fímbrias, transportadores, elementos genéticos móveis e genes de patogenicidade na variedade sintomática. Assim, na cultivar Navelina ISA 315, foram diferencialmente expressos mais genes relacionados com a resposta ao estresse, seja detoxificação de espécies reativas do oxigênio ou proteínas chaperonas, assim como uma adesina do tipo hemaglutinina. Isso sugere diferenças na agregação celular e composição do biofilme assim como um maior estresse da bactéria na cultivar tolerante, provocado pelas próprias defesas da planta ou por microrganismos endofíticos que estão competindo com a X. fastidiosa. A técnica de microarranjos foi validada pela RT-qPCR, e apresentou-se como uma ferramenta poderosa na análise das mudanças na expressão gênica da bactéria X. fastidiosa em plantas de laranja doce in vivo, apresentando uma visão mais real da natureza do que os sistemas in vitro, que não a conseguem imitar completamente. Foram levantadas neste trabalho algumas hipóteses sobre os mecanismos de patogenicidade mas no entanto, mais pesquisas ainda são necessárias para lograr melhor compreensão dos mecanismos de patogenicidade e das interações patógeno-hospedeiro / Abstract: A DNA microarray was constructed containing 2600 ORFs identified by the Genome sequencing project of Xylella fastidiosa 9a5c strain, and used to check global gene expression differences in the bacteria within a susceptible and a tolerant sweet orange plant, the variety Pera and the cultivar Navelina ISA 315, respectively. More genes related to degradation, regulation, membrane components, fimbrial adhesins, transport, genetic mobile elements and patogenicity genes were differentially expressed in Pera variety. On the other hand, in the cultivar Navelina ISA 315, more genes related to stress response, detoxification of oxygen reactive species or other substances, "heat shock" proteins, as well as an adhesin of the hemagglutinin type, suggesting differences in cellular aggregation and biofilm composition, as well as a higher estress of the bacteria in tolerant cultivar, produced either by plant defenses or by endophitic microorganisms which are competing with X. fastidiosa. This "handmade" DNA microchip was validated by RT-qPCR, and has revealed as a powerful technique for the analysis of global changes in gene expression of X. fastidiosa in sweet orange plants in vivo, generating a more real image of what is happening in nature than in vitro systems which would never reproduce nature conditions exactly. Some hypotheses were raised in this study about patogenicity mechanisms, therefore, more research is still necessary to achieve a better understanding of pathogenicity mechanisms and host-pathogen interactions / Orientador: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Coorientador: Jackson Antonio Marcondes de Souza / Banca: Marcos Antonio Machado / Banca: Marcelo Luiz de Laia / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Lucia Maria Carareto Alves / Doutor

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Aramis Augusto Pinto / Banca: Camillo Del Cistia Andrade / Resumo: A nucleoproteina do vírus da doença de Newcastle (VDN) é um dos componentes antigênicos ideais para fazer o imunodiagnóstico da DN, por ser mais conservada e possuir uma elevada imunogenicidade. A sequência completa do gene da nucleoproteína (NP) (1470 pb) da estirpe La Sota do VDN foi amplificada, nesse estudo, por RT-PCR e submetida a clonagem no vetor de expressão em Escherichia coli pETSUMO (Invitrogen). A proteína NP foi expressa sob a forma de uma proteína recombinante de fusão contendo o peptídeo SUMO e a sequência de poli-histidina, em seguida foi purificada em resina de níquel-agarose e caracterizada por SDSPAGE e Western-blotting, apresentando um peso molecular de cerca de 66kDa e reatividade com anticorpos policlonais de galinhas hiperimunizadas com esse mesmo vírus. Foi então desenvolvido um método indireto de ELISA com essa proteína (NPVDN- ELISA) para ser aplicado na detecção de anticorpos anti-virais específicos. O NP-VDN-ELISA revelou ser capaz de diferenciar amostras de soros positivos para o VDN das amostras de soros negativos e, na comparação dos resultados obtidos na análise de 125 soros de campo pelo NP-VDN-ELISA com os do teste de Inibição da Hemaglutinação (HI), foi encontrado um coeficiente de correlação significante entre estes métodos (r = 0,8345), bem como elevadas sensibilidade (89,3%), acurácia (90,4%) e especificidade (95,5%). Concluindo, a proteína NP recombinante expressa pelo sistema pET SUMO - E. coli compartilha os principais epítopos para interagir com anticorpos de galinhas produzidos contra a proteína NP do VDN, tendo, portanto, um bom potencial de ser aplicada de forma bem sucedida e com vantagens no teste de ELISA para realizar de forma mais rápida e prática, o imunodiagnóstico da DN de um maior número de amostras séricas de galinhas / Abstract: The nucleocapsid protein (NP) of Newcastle Disease Virus (NDV), is a preferred choice to develop a serologic assay on account of highly conserved sequences, and high immunogenicity. The whole open-reading-frame (orf) of NP gene from LaSota strain of NDV was amplified by RT-PCR and cloned in pETSUMO vector (Invitrogen) and Escherichia coli as cellular host. The NP protein was expressed as a fusion recombinant protein containing SUMO peptide and poly-histidine tags. This protein was easily purified in nickel-agarose resin, and characterized by SDS-PAGE and Western-blotting, showing a molecular weight of approximately 66 kDa and reactivity with polyclonal antibodies from NDV hiperimmunized chickens. The recombinant NP protein was used as antigen to develop an indirect ELISA (NP-NDVELISA) for the detection chicken anti-NDV antibodies. The capability of the recombinant NP protein to differentiate positive from normal chicken sera was evident in NP-NDV-ELISA, and by comparing this ELISA with haemagglutination-inhibition test (HI) a high and significant correlation with the haemagglutination-inhibition test (r = 0,8345), as well as high sensitivity (89,3%), specificity (95,5%) and accuracy (90,4%) were obtained. In conclusion the results indicated that the recombinant NP protein shared the main epitopes with the homologous viral protein and has a great potential to be advantageously used in the ELISA for the analysis of large number of samples in the DN immunodiagnosis / Mestre

Orientador: Ciro Moraes Barros / Resumo: Em células da teca e da granulosa, de folículos bovinos, foram detectados quatro transcritos alternativos do receptor do hormônio luteinizante (LHR). Apenas dois deles são traduzidos em proteínas funcionais com afinidades distintas em relação aos ligantes. Em humanos e símios, a isoforma completa ("full-length") tem afinidade pelo LH e hCG, enquanto que a isoforma que apresenta deleção do exon 10 tem afinidade somente pelo hCG. Além disso, isoformas com deleção do exon 3 foram observadas em ratos, embora nenhum outro estudo tenha investigado essa região do gene bovino. Objetivouse com este trabalho caracterizar o padrão da expressão do gene do LHR nas células da teca e da granulosa de folículos antrais bovinos. Ovários foram coletados em matadouro, os folículos (5-14 mm) foram dissecados e as células da teca e da granulosa separadas para extração de RNA total com Trizol. As concentrações de esteróides no fluido folicular foram determinadas por radioimunoensaio (RIE). A expressão gênica do LHR foi mensurada por RTPCR semiquantitativo com oligonucleotídeos iniciadores ("primers") específicos para amplificar o fragmento entre o final da região extracelular e o final da intracelular (LHRBC; "primers" posicionados nos exons 9 e 11). A ocorrência de transcritos alternativos oriundos do início da região extracelular (LHRA; "primers" posicionados nos exons 2 e 9) foi investigada mediante amplificação por RT-PCR. Como controle interno no PCR, utilizou-se a expressão da GAPDH. Paralelamente, células da granulosa cultivadas in vitro foram tratadas com 1 ou 10 ng de FSH no meio de cultura. Mediante RT-PCR, foi investigada a expressão das isoformas do LHRBC nas células da granulosa cultivadas e tratadas com FSH... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Growth of dominant follicle in the absence of circulating FSH and the events following the LH surge that culminate in ovulation, are dependent on the interaction between LH and its receptor (LHR). Four LHR alternative transcripts were described in theca and granulosa cells from bovine follicles. Only two of them can be translated to functional proteins (receptors coupled with G protein) with different affinities to their ligands. In humans and marmosets, the full-length isoform has affinity to both LH and hCG molecules, whereas the isoform with deletion of only exon 10 has affinity to hCG exclusively. Additionally, isoforms with deletion of exon 3 were observed in rats, although no previous report have investigated this region of the bovine gene. The objective of this study was to characterize the pattern of gene expression of the LHR in theca and granulosa cells from bovine antral follicles. Additionally, LHR expression was determined in cultured granulosa cells under FSH treatment. From ovaries collected in abattoir, antral follicles were dissected (5 to 14mm of diameter), and samples of theca and granulosa cells were obtained to total RNA extraction (Trizol protocol). Steroids concentrations in the follicular fluid were determined by RIA. Gene expression of LHR was measured by semiquantitative RT-PCR with specific primers to amplify part of extracellular region (LHRA; primers annealing on exons 2 and 9) and the fragment from the end of extracellular region, including the transmembrane domain and finishing near the end of intracellular region (LHRBC; primers annealing on exons 9 and 11). As internal control of the PCR, it was used GAPDH expression. Cultured granulosa cells were treated with 0, 1 or 10 ng of FSH (3 replicates each dose). As in vivo and positive control, theca cell sample was utilized to comparison... (Complete abstract, access undermentioned electronic address) / Doutor