Este estudo teve como objetivos: investigar o método mais adequado para detecção de fungos associados às sementes de cana-de-açúcar; fazer o levantamento dos fungos associados às sementes e incidência; correlacionar a incidência fúngica nessas sementes e o ambiente onde foram produzidas; efeitos que fungos associados às sementes têm em sementes e plântulas; patogenicidade dos fungos mais freqüentes e sintomas que podem causar; determinar a sensibilidade dos principais fungos a fungicidas; determinar a fitotoxicidade de sementes e plântulas a fungicidas e propor o tratamento fungicida mais adequado para produção de plântulas vigorosas, sem sintomas, para os programas de melhoramento. Para avaliar o método mais adequado de detecção dos fungos, realizaram-se análises sanitárias utilizando combinações entre recipientes, substratos e regimes de luz. Para levantamento dos fungos associados e da incidência em sementes, realizaram-se análises sanitárias das sementes de 29 amostras e as incidências fúngicas obtidas foram comparadas com os dados climáticos do local onde foram produzidas as sementes. Os possíveis efeitos dos fungos às sementes e plântulas foram estudados por testes de sanidade e germinação de sementes, observando-se quais condições se apresentavam as sementes e plântulas que haviam incidência fúngica. A patogenicidade dos fungos, encontrados com maior freqüência, foi avaliada por inoculação de sementes através do contato com cultura em meio colonizado pelo fungo, posterior distribuição das sementes em substrato estéril e avaliação da emergência de plântulas e total de plântulas com sintomas e tipos de sintomas. Por meio de ensaios de fungitoxicidade in vitro , estudou-se a sensibilidade dos fungos, mais freqüentemente detectados em sementes, a nove fungicidas nas doses de 1, 10 e 100 ppm e determinação da ED50. Os fungicidas mais eficientes foram avaliados, in vivo, quanto a sua fitotoxicidade por meio da pulverização, em diferentes doses, em sementes distribuídas em substrato estéril. Foram avaliados: emergência, altura da parte aérea e comprimento da raiz das plântulas, total de plântulas com sintomas de fitotoxicidade e outros tipos de sintomas. Ao final, realizou-se validação, pulverizando-se o fungicida eficiente in vitro e não fitotóxico em sementes de cana-deaçúcar. Os resultados encontrados foram: a) o método escolhido para realização das análises sanitárias foi o de placas de Petri de plástico com papel de filtro como substrato e incubação a 28 ± 2°C sob regime de luz alternada (12h luz branca fluorescente/ 12h escuro); b) os gêneros fúngicos mais freqüentemente presentes nas sementes de cana-de-açúcar foram Bipolaris, Cladosporium, Curvularia, Fusarium e Phoma; c) não foi constatada relação entre incidência fúngica e ambiente de produção das sementes; d) a condição de semente de cana-de-açúcar mais comumente encontrada com presença de fungos associados foi a não germinada, independentemente do fungo avaliado. Houve baixa porcentagem de sintomas necróticos na parte aérea e raiz, no entanto, quando ocorreram, estavam associados às incidências dos fungos Bipolaris sacchari, Curvularia GM1, Fusarium verticillioides e Phoma herbarum; e) os gêneros considerados altamente patogênicos foram Bipolaris e Curvularia, considerando-se os demais medianos, pouco/ não patogênicos; f) os fungicidas de maiores eficiências de inibição, principalmente dos fungos patogênicos, foram triadimenol e fludioxonil + metalaxil-M; g) o fungicida não fitotóxico e que apresentou efeito estimulante nas doses utilizadas foi o fludioxonil + metalaxil-M. Quando esse fungicida foi aplicado na validação, as doses avaliadas não foram suficientes para se detectar diferença significativa benéfica, de acordo com as variáveis analisadas. / The present study had as objectives: to investigate the most adequate method to detect sugarcane seedborne fungi; to do the survey of the seedborne fungi and of the incidence; to correlate the fungi incidence in the seeds and the conditons where they were produced; to evaluate the possible effects that seedborne fungi have on seeds and seedlings; to verify the pathogenicity of the most frequent ones and the symptoms that they can cause; to determine the sensitivity of the main fungi to fungicides; to determine the seeds and seedlings phytotoxicity to fungicides and to propose the most adequate fungicidal treatment to the production of vigorous seedlings, without symptoms, to the breeding programs. To assess the most adequate method to detect seedborne fungi, health tests using different combinations between containers, substrates and light regimen, were done. To do the survey of seedborne fungi and their incidence on seeds, seed health tests of 29 samples and the fungical incidence obtained were compared with the climatic data from where the seeds were produced. The effects that seedborne fungi have on seeds and seedlings were studied by health and seed germination tests and the conditions of seeds and seedlings with fungi incidence were observed. The fungi pathogenicity, found in a higher frequency, was assessed by seed inoculation through contact with medium colonized by the fungi, than the seeds were distributed on sterilized substrate and the seedlings emergency and total seedlings with symptoms and kind of symptoms were assessed. By in vitro fungitoxicity assays, the sensitivity, of the most frequently detected fungi, to nine fungicides in the doses of 1, 10 and 100 ppm, was studied and ED50. The phytotoxicity in vivo, of the most efficient fungicide was done by spraying different doses on seeds distributed on sterilized substrate. Emergency, seedling height of aerial part and length of the root, total of seedlings with phytotoxicity symptoms and other kind of symptoms were assessed. A validation, in vitro, was done by spraying the efficient and non phytotoxic fungicide on sugarcane seeds. Obtained results were: a) the chosen method for health tests was the plastic Petri plates with filter paper as substrate and incubation at 28 ± 2°C under 12h alternating cycles of light and darkness; b) the fungi genera most frequently present on sugarcane seeds were: Bipolaris, Cladosporium, Curvularia, Fusarium and Phoma; c) the relation between fungical incidence and seed production conditions had not been noticed; d) the most commonly sugarcane seed conditon found with seedborne fungi was the not-germinated, independently of the assessed fungi. Low percentage of necrotic symptoms on aerial part and root where observed, however, when occurred, it was associated to the incidence of the fungi Bipolaris sacchari, Curvularia GM1, Fusarium verticillioides and Phoma herbarum; e) the genera considered highly pathogenic were Bipolaris and Curvularia. The other fungi were considered of median pathogenicity or little/not pathogenic; f) the fungicides with a higher inibition efficiency to most pathogenic fungi, were triadimenol and fludioxonil + metalaxil-M; g) fludioxonil + metalaxil-M was not a phytotoxic fungicide and presented stimulant effect on used doses. When this fungicide was applied on the validation, the assessed doses were not enough to detect beneficial significant differences, in agreement with the analyzed variables.

O experimento foi conduzido em condições de campo, durante o ano agrícola de 2002/2003 no Pólo Regional Centro Sul, pertencente à Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios (APTA), localizado no município de Piracicaba - SP, com o objetivo de identificar os elementos climáticos mais importantes no desenvolvimento da ramulose em três grupos de cultivares com característica distintas de reação ao patógeno. A semeadura foi realizada no dia 8/12/02 utilizando os seguintes materiais genéticos: Coodetec 406, Coodetec 407, SureGrow 618, Fibermax 966, Fibermax 986, BRS AROEIRA, Fabrika, Makina, MO 99405, IAPAR 227-918, IAC 01-639, PR 99-123, Stoneville 474, DeltaOpal, CNPA ITA 90 e IAC 24. O delineamento experimental utilizado foi o de blocos ao acaso, com 16 tratamentos e 6 repetições. As parcelas foram constituídas de uma linha de 5 metros de comprimento e espaçadas de 0,90m, com 7 plantas/metro. Para garantir a ocorrência da ramulose na área experimental, foram realizadas três inoculações aos 22 (06/01), 29 (13/01) e 43 (27/01/03) dias após a emergência. Visando obter resultados extrapoláveis para outras cultivares em estudos futuros de melhoramento genético e epidemiológicos, os genótipos foram agrupados conforme a reação ao patógeno em resistente, medianamente resistente e suscetível. Os grupos foram estabelecidos através do procedimento matemático de regressão linear entre as notas médias dadas a doença em cada genótipo versus o tempo. Os resultados permitiram concluir que a ramulose possui comportamento de crescimento atípico de doenças foliares, sendo esse comportamento ajustado pelo modelo monomolecular e que cultivares com maior característica de resistência, são mais dependentes de condições climáticas ideais ao patógeno para que ocorra o desenvolvimento da ramulose. Contrariamente, cultivares com menor característica de resistência, são menos dependentes de condições climáticas ideais ao patógeno para que ocorra o desenvolvimento da ramulose. / The experiment was carried out under field conditions in the South Central Regional Pole of the Agribusiness Technology Agency of Sao Paulo - APTA (Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios), located in Piracicaba -SP, during the 2002/2003 growing season. The purpose of this work was to identify the most important climatic elements for the development of ramulosis in three groups of cotton cultivars showing distinct characteristics regarding the reactions to the pathogen. Seeding was conducted in December 8, 2002, using the following genetic materiaIs: Coodetec 406, Coodetec 407, SureGrow 618, Fibermax 966, Fibermax 986, BRS AROEIRA, Fabrika, Makina, MG 99405, IAPAR 227-918, IAC 01-639, PR 99-123, Stoneville 474, DeltaOpal, CNPA ITA 90 and IAC 24. The experimental design was randomized blocks with 16 treatments and 6 replications. Plots consisted of 5-meter rows 0.90m apart, with 7 plants/m. Three inoculations were carried out, on the 22nd (Jan 6), 29th (Jan 13) and 43rd (Jan 27) days after emergence of plants, in order to ensure the occurrence of ramulosis in the experimental area. The genotypes were grouped according to their reaction to the pathogen and classified as resistant, moderately resistant and susceptible, so that the results could be extrapolated to other cultivars in future genetic improvement and epidemiologic studies. The groups were established through linear regression among the average disease scores for each genotype versus time. Based on the results, it was concluded that ramulosis shows a growth pattern atypical for foliar diseases, fitting the monomolecular model, and that the disease is more dependent on ideal climatic conditions for its development when attacking more resistant cultivars. On the other hand, less resistant cultivars are less dependent on the ideal climatic conditions for the pathogen and, consequently, for the development of ramulosis.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-06T17:42:20Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1006529 bytes, checksum: 7480e1c923178c38b0f2c5a20b2d49e7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-06T17:42:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1006529 bytes, checksum: 7480e1c923178c38b0f2c5a20b2d49e7 (MD5) Previous issue date: 2016-09-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os fungos fitopatogênicos são um grupo importante de microrganismos responsáveis por perdas significativas na agricultura em todo o mundo. A capacidade que alguns apresentam de infectar todas as partes da planta, bem como a capacidade de sobrevivência no solo os torna um importante grupo de fitopatógenos. O controle de doenças causadas por fungos geralmente requer medidas que utilizam tratamentos químicos, o que gera um impacto ambiental e à saúde humana. Micovírus são vírus que infectam fungos. Alguns micovírus apresentam capacidade de tornar seus hospedeiros hipovirulentos e ainda são capazes de transferir essa propriedade a outros isolados compatíveis. O controle de fungos fitopatogênicos com micovírus constitui uma alternativa que pode reduzir o uso do controle químico. Além disso, pode ser eficaz contra doenças para as quais não há controle químico nem plantas resistentes disponíveis. Assim o objetivo desse trabalho foi acessar a diversidade de micovírus associada a fungos fitopatogênicos e estudar o impacto desses vírus sobre a fisiologia dos hospedeiros. Foi investigada a presença de micovírus em isolados fúngicos obtidos em coleções de culturas, feira livre e também do campo em plantas sintomáticas. Dos 42 isolados fúngicos analisados, 11 (26%) continham dsRNA. Todos com distintos padrões de dsRNA, observados por eletroforese em gel de agarose. Em um isolado de Chalara elegans, agente causal da podridão negra em raiz, foi detectado presença de partículas icosaédricas com 33 nanômetros de diâmetro. SDS-PAGE a partir do purificado viral revelou a presença de três proteínas estruturais com massa molecular estimada em 38, 40 e 45 kDa. Também foi realizada a caracterização molecular e biológica de um micovírus obtido a partir do fungo Sclerotinia sclerotiorum isolado Ss24, agente causal do mofo branco, doença presente em diversas espécies de plantas. O genoma possui 2.700 nucleotídeos e apresenta uma única sequência aberta de leitura (ORF) que codifica uma RNA polimerase dependente de RNA, com domínios conservados na superfamília de RdRps de mitovirus, um grupo de vírus que replica em mitocôndrias das células hospedeiras. Análises filogenéticas indicam que o vírus detectado é um novo membro do gênero Mitovirus. Análise do perfil de bandas de dsRNA obtido a partir do isolado Ss24 sugere que há uma co-infecção por mais de um micovirus. Uma linhagem isogênica obtida por reprodução sexuada do isolado Ss24 revelou um padrão diferente do seu parental. Ambos, parental (Ss24) e isolado isogênico (Ss24MVF) foram comparados quanto produção de escleródios, ácidos totais, ácido oxálico, taxa de crescimento, morfologia e pigmentação das colônias e patogenicidade em plantas de Phaseolus vulgaris, Capsicum annuum e Nicotiana benthamiana. Os resultados revelaram que o isolado Ss24 foi severamente debilitado em todas as características fisiológicas analisadas quando comparado com o isolado Ss24MVF. Maior concentração de mitocôndrias nas hifas também foi observado no isolado Ss24. Em conjunto estes resultados confirmam que os vírus que infectam fungos estão distribuídos nas diferentes espécies de fungos. A presença de determinados segmentos de dsRNA pode conduzir o fenótipo da hipovirulência em fungos. Uma análise mais aprofundada sobre as características destes micovírus podem levar ao desenvolvimento de ferramentas para estudos sobre os mecanismos de patogenicidade dos fungos, bem como a utilização desses vírus como agentes de controle biológico. / The phytopathogenic fungi are an important group of microorganisms responsible for significant losses in agriculture throughout the world. The ability that some have to infect all parts of the plant, as well as the ability to survive in the soil becomes an important phytopathogens group. The control of disease caused by fungi usually requires measures using chemical treatments leading an environmental impact and to human health. Mycovirus are viruses that infect fungi. Some mycovirus present ability to make their hipovirulentos hosts and are still able to transfer that property to other compatible isolated. The control of pathogenic fungi with mycovirus is an alternative that can reduce the use of chemical control. Furthermore, it may be effective against diseases for which no chemical control or resistant plants available. So the aim of this study was to access the mycovirus diversity associated with pathogenic fungi and to study the impact of these viruses on the physiology of the host. The presence of mycovirus in fungal isolates from culture collections, free fair and also the field in symptomatic plants was investigated. Of the 42 fungal isolates analyzed, 11 (26%) contained dsRNA. All isolates showed patterns different dsRNA observed by agarose gel electrophoresis. A strain Chalara elegans, the causal agent of black rot on root was detected the presence of icosahedral particles 33 nanometers in diameter. SDS-PAGE from purified viral revealed the presence of three structural proteins with molecular weight estimated at 38, 40 and 45 kDa. Was performed the molecular and biological characterization of a mycovirus obtained from the fungus Sclerotinia sclerotiorum strain Ss24, causal agent of white mold, disease present in several plant species. The genome has 2.700 nucleotides and a single open reading frame sequence (ORF) encoding a RNA-dependent RNA polymerase with conserved domains of the superfamily of RdRps mitovirus, a group of viruses that replicate in mitochondria of host cells. Phylogenetic analysis indicate that the virus detected is a new member of the genus Mitovirus. Analysis of the profile segments dsRNA obtained from strain Ss24 suggests that there is coinfection by more than one mycovirus. An isogenic strain obtained by sexual reproduction (Ss24MVF) revealed a different pattern of their parent strain. Both Ss24 and isogenic strains Ss24MVF were compared for sclerotia, total acid, oxalic acid production, growth rate, morphology and pigmentation of colonies and pathogenicity in plants of Phaseolus vulgaris, Capsicum annuum and Nicotiana benthamiana. The results revealed that the strain Ss24 was severely impaired in all analyzed physiological characteristics compared with the single Ss24MVF. Higher concentration of mitochondria in hyphae were observed on strain Ss24. Together, these results confirm that viruses that infect fungi are distributed in different species of fungi. The presence of certain segments of dsRNA can drive the phenotype of hypovirulence fungi. A detailed analysis of the characteristics this is mycovirus can lead to the development of tools for studies on fungi pathogenic mechanisms, and the use of these viruses as biological control agents.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-20T18:33:23Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 20005358 bytes, checksum: 1121af69167ca6262a2059e1892c3134 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-20T18:33:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 20005358 bytes, checksum: 1121af69167ca6262a2059e1892c3134 (MD5) Previous issue date: 2003-12-12 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Em Magnaporthe grisea, agente causal da brusone, mutagênese insercional mediada por transformação tem constituído estratégia para a identificação de genes essenciais para a patogenicidade em arroz. A técnica REMI, integração mediada por enzima de restrição, merece destaque em virtude da eficiência de transformação e da predominância de integrações simples. Visando a implantação de programa de mutagênese insercional em M. grisea, os objetivos deste trabalho incluíram: (1) adequar as condições para a obtenção e regeneração de protoplastos do ascomiceto, (2) estabelecer sistema de transformação REMI em M. grisea, avaliando o potencial dos protoplastos e do vetor pAN7-1 e (3) selecionar e caracterizar mutantes com patogenicidade alterada em plantas de arroz. Produção eficiente de protoplastos foi alcançada com o uso simultâneo de 10 mg de Lysing Enzymes e 10 mg de Cellulase Onozuka R10 em 3 mL de MgSO 4 a 1,2 M / NaH 2 PO 4 a 0,01 M (pH = 5,8). Protoplastos de M. grisea I-22 liberados com 3 horas de hidrólise enzimática apresentaram maior capacidade de regeneração da parede celular. Quando expostos ao vetor pAN7-1, os protoplastos foram prontamente transformados para a resistência à higromicina. Quando pAN7-1- HindIII foi usado para transformar I-22 na presença de HindIII, a freqüência de transformantes foi 1,1 a 8,1 vezes superior ao tratamento sem a adição da endonuclease de restrição. No geral, a melhor concentração de HindIII foi 5 unidades/reação de transformação. A partir de testes de patogenicidade envolvendo 125 transformantes, principalmente gerados por REMI, foi possível selecionar cinco mutantes com alterações consistentes na patogênese. Dois desses mutantes, T108 e T93, causaram poucas lesões em folhas de arroz, enquanto o mutante T251 não foi patogênico. A alteração na patogenicidade de T108 foi acompanhada pela menor capacidade de desenvolvimento in vitro. Quando inoculado em plantas de arroz, o mutante T41 apresentou agressividade reduzida, caracterizada por lesões arredondadas de tamanho limitado. Por sua vez, o período de incubação para o mutante T72 foi mais longo do que o do isolado selvagem. Além disso, atrasos consideráveis na germinação de conídios e na formação de apressórios foram detectados em T72. Os mutantes T93 e T251 apresentaram fenótipos semelhantes quando em cultura, caracterizados pela pigmentação marrom. Análises Southern blots de quatro mutantes indicaram que em 50 % dos casos, T108 e T251, apenas uma cópia de pAN7-1 se integrou em um único sítio no genoma. No mutante T251 ocorreu evento REMI propriamente dito. Os mutantes T41 e T93 apresentaram padrões de integração mais complexos. / Transformation mediated-insertional mutagenesis of phytopathogenic fungi is an important tool to identify genes involved in pathogenicity. An improved version of this method is the restriction enzyme mediated integration, or REMI. We chose REMI to begin an insertional mutagenesis project in M. grisea. In this work, were reported the: (1) protoplasts production and regeneration of M. grisea, (2) transformation of protoplasts with pAN7-1 mediated by restriction enzyme and (3) identification and characterization of five transformants with pathogenicity defects in rice, at the phenotypic and molecular levels. The highest protoplasts production was obtained with Lysing Enzymes plus Cellulase Onozuka R-10 and the osmotic buffer MgSO 4 at 1.2 M / NaH 2 PO 4 at 0.01 M (pH = 5.8). The highest regeneration frequency was obtained with protoplasts produced after 3 hours of incubation. The I-22 protoplasts were readily transformed for hygromycin resistance. When pAN7-1-HindIII was used to transform fungal protoplasts in the presence of the HindIII, the transformation efficiency was increased 1.1 to 8.1-fold. The optimal HindIII concentration for enhanced transformation corresponded to 5 unit/transformation mix. Out of 125 transformants screened for the ability to infect rice plants, five showed changes in pathogenicity. The T108 and T93 mutants caused few lesions in rice leaves, while the T251 mutant was non-pathogenic. The alteration in pathogenicity of T108 was accompanied by reduced development in culture. The T41 mutant caused small and limited round lesions. The incubation period of the T72 mutant was longer than of wild type. Furthermore, late germination and appresorium formation was detected in the T72 mutant. The T93 and T251 mutants had similar phenotypes, characterized by a brown-pigmented colony. Four mutants (T41, T93, T108 and T251) were examined by Southern blots. The T108 and T251 mutants contained one copy of the vector integrated at a single site in the genome. REMI event occurred in the T251 mutant. More complex integration events were observed in the T41 and T93 mutants. / Tese importada do Alexandria

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-24T12:31:48Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 486412 bytes, checksum: ea7846af4d8a5809764bfecb46fb6ed2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-24T12:31:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 486412 bytes, checksum: ea7846af4d8a5809764bfecb46fb6ed2 (MD5) Previous issue date: 2003-12-17 / A sigatoka negra, causada pelo fungo Mycosphaerella fijiensis, ocasiona perdas que oscilam entre 50 a 100% na produção de bananeira e bananeira-da-terra. Visando obter informação sobre epidemias da sigatoka negra em ambas as musáceas, realizaram-se dois experimentos. No primeiro, avaliaram-se os componentes epidemiológicos: períodos de incubação e latente médio; severidade aos 24 e 40 dias; freqüência de infecção; intervalo, em dias, para atingir a severidade máxima; dias transcorridos do aparecimento de sintomas até atingir a severidade máxima; e as áreas abaixo da curva da severidade e da porção necrosada. Verificou-se que M. fijiensis não foi específico para bananeira ou bananeira-da-terra e que as populações variam quanto à agressividade. A inoculação artificial em mudas pode ser usada para avaliar componentes de resistência de diferentes genótipos à doença. No segundo experimento, estudou-se o progresso da doença em plantações comerciais de bananeira 'Williams' e bananeira-da-terra 'Barraganete', durante as épocas seca e chuvosa. Independentemente da época avaliada, os valores de área abaixo da curva da severidade estimados para bananeira foram maiores que para bananeira-da-terra. Na época chuvosa, o progresso da doença foi maior que na época seca. Em bananeira-da-terra, detectou-se correlação significativa da severidade e o número de horas semanais com temperatura entre 24 e 28°C e umidade relativa maior de 90%, quando se consideraram os valores das variáveis climatológicas registrados quatro e três semanas antes da severidade, nas épocas seca e chuvosa, respectivamente. Não se detectou correlação significativa de severidade e intensidade de precipitação pluviométrica, nas duas épocas avaliadas. Este é o primeiro relato de estudos de sigatoka negra em bananeira-da-terra no Equador, nas épocas seca e chuvosa. É, também, o primeiro estudo de componentes epidemiológicos de isolados equatorianos de M. fijiensis. Os resultados obtidos serão importantes para subsidiar o manejo da sigatoka negra, bem como programas de melhoramento que visem obter resistência a M. fijiensis. / Black sigatoka, caused by the fungus Mycosphaerella fijiensis, is the most important leaf disease of banana and plantain crops, causing 50 to 100% production losses. To generate information regarding black sigatoka epidemics on both Musacea, two experiments were conducted. In the first, isolates of M. Fijiensis obtained from diseased leaves of banana and plantain from several regions of Ecuador, were inoculated in banana and plantain plantlets. The following epidemic components were evaluated: mean incubation and latent periods, initial severity, infection frequency, number of lesions/leaf area, days to reach maximum severity, area under disease progress curve for severity, and area under disease progress curve of leaf necrosis. Regarding all components, it was found that M. fijiensis was not specific for either banana or plantain, and that there is variability in fungal aggressiveness. It was concluded that artificial inoculation of M. fijiensis in plantlets can be used in evaluating disease resistance components of different genotypes. In the second experiment, disease progress was studied in commercial crops of banana 'Williams' and plantain 'Barraganete', during dry and rainy seasons. In both seasons, area under disease progress curve (AUDPC) on banana was higher than AUDPC for iplantain. Values of AUDPC in plantain were higher in the rainy season than in the dry season. Correlation analysis was done between weather variables and disease severity in plantains. Disease severity was not correlated with temperature, relative humidity, or precipitation. Significant correlation was detected between severity and both number of hours with temperature ranging from 24 to 28° C and relative humidity higher than 90%, when these variables were registered four or three weeks before severity assessment, in either dry or rainy seasons, respectively. This is the first report of epidemiological studies of Black Sigatoka in plantains in the dry and rainy seasons, in Ecuador. It is also the first study of aggressiveness components of M. fijiensis, which may become important to assist future breeding programs to obtain resistance against the pathogen. / Dissertação importada do Alexandria

LOPES NETO, Antônio Viana. Atividade fungistática de uma quitinase recombinante do feijão de corda [Vigna unguiculata (L.) (Walp.)] contra Lasiodiplodia theobromae Pat. (Griff. e Maubl.), agente causal da resinose do cajueiro (Anacardium occidentale L.). 2014. 57 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2014. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-08T13:45:57Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_avlopesneto.pdf: 1483564 bytes, checksum: 0e776910b7f818898df5c2fc18bff4ec (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:18:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_avlopesneto.pdf: 1483564 bytes, checksum: 0e776910b7f818898df5c2fc18bff4ec (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:18:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_avlopesneto.pdf: 1483564 bytes, checksum: 0e776910b7f818898df5c2fc18bff4ec (MD5) Previous issue date: 2014 / The aim of this work was to evaluate the biological activity of a recombinant chitinase (rVuChi) from cowpea (Vigna unguiculata) against the phytopathogenic fungus Lasiodiplodia theobromae. The recombinant protein was expressed in Pichia pastoris, collected and purified after 72h of induction, using a chitin affinity chromatography. The chitinase was eluted from the affinity chromatography using 0.1 M acetic acid. Enzymatic assay was performed against the synthetic substrate (colloidal chitin) in order to determine the activity of the purified recombinant protein. The chitinase displayed a specific activity of 5,637.32 U/mg of protein. Biological tests were performed. In these tests three different isolates of L. theobromae, identified as CNPAT CCJ-127, CNPAT CCJ-166 and CNPAT CCJ-184, were used and the experiments were performed on triplicate. The fungal isolates were obtained from the collection of work from the laboratory of plant pathology from the Embrapa Agroindústria Tropical (Fortaleza-CE, Brasil). In all biological assays the fungicide Carbomax 500 SC® (Carbendazim) at a concentration of 2 mL/L and sterile distilled water were used as positive and negative controls, respectively. A total of 50, 100 and 300 µg of recombinant chitinase (rVuChi) was used in all tests. The first test was based on the disk diffusion methodology using filter paper in which the effects of the protein on the mycelium growth, as well as the formation of an inhibition zone on the fungal hyphae were investigated. The second test was based on the diffusion assay in agar. Photographs were used to register the observations. The rVuChi showed moderate to strong fungistatic activities on the mycelial growth of all L. theobromae isolates when used at 100 and 300 µg in the disk diffusion assay. CNPAT CCJ-127 was the most resistant specimen to the rVuChi fungistatic action, as observed by the lower impact of the protein on it is mycelial growth. In the agar diffusion test the amount of 300 µg was the most effective, as observed in the disk diffusion test. In addition, the effect of the protein was most pronounced on the isolates CNPAT CCJ-166 and CNPAT CCJ-184 and less impacting on CNPAT CCJ-127. The recombinant chitinase rVuCHi showed to be an inhibitor of the mycelial growth of three L. theobromae isolates. The fungistatic effects of the protein described here may be due to its ability to degrade chitin, a structural biopolymer that makes part of the cell wall of several phytopathogenic fungi, including L. theobromae. Once this is only a scientific speculation, more studies need to be made to definitely reveal the mechanism of action of rVuChi on L. theobromae. / O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade biológica de uma quitinase recombinante (rVuChi) de feijão-caupi (Vigna unguiculata) contra o fungo fitopatogênico Lasiodiplodia theobromae. A proteína recombinante foi expressa em Pichia pastoris, coletada e purificada após 72h de indução, utilizando cromatografia de afinidade em matriz de quitina. A quitinase foi eluída a partir da cromatografia de afinidade com ácido acético a 0,1 M. Ensaio enzimático foi realizado contra o substrato sintético (quitina coloidal), a fim de determinar a atividade da proteína recombinante purificada. A quitinase apresentou atividade específica de 5.637,32 U/mg de proteína. Testes biológicos foram realizados. Nestes testes três diferentes isolados de L. theobromae, identificados como CNPAT CCJ-127, CNPAT CCJ-166 e CNPAT CCJ-184, foram utilizados e os experimentos foram realizados em triplicata. Os isolados fúngicos foram obtidos da coleção de trabalho do Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Agroindústria Tropical (Fortaleza-CE, Brasil). Em todos os ensaios biológicos o fungicida Carbomax 500 SC® (Carbendazim), a uma concentração de 2 mL/L, e água destilada estéril foram utilizados como controles positivos e negativos, respectivamente. Um total de 50, 100 e 300 µg de quitinase recombinante (rVuChi) foi utilizado em todos os testes. O primeiro ensaio foi baseado na metodologia de difusão em disco de papel de filtro em que foram investigados os efeitos da proteína sobre o crescimento do micélio, bem como a formação de halo de inibição sobre o crescimento micelial do fungo. O segundo ensaio foi baseado no ensaio de difusão em ágar. Fotografias foram usadas para registrar as observações. A quitinase rVuChi mostrou efeito fungistático variando de moderado a forte sobre o crescimento micelial de todos os isolados de L. theobromae, particularmente quando usada nas doses de 100 e 300 µg, no ensaio de difusão em disco. CNPAT CCJ-127 foi o isolado mais resistente à ação fungistática de rVuChi, como observado pelo menor impacto da proteína em seu crescimento micelial. No teste de difusão em ágar a quantidade de 300 µg foi a mais efetiva, da mesma forma como observado para o de difusão em disco de papel de filtro. Além disso, o efeito da proteína foi mais pronunciado nos isolados CNPAT CCJ-166 e CNPAT CCJ-184 e menos impactante no isolado CNPAT CCJ-127. A quitinase recombinante rVuCHi mostrou ser um inibidor do crescimento micelial de três diferentes isolados de L. theobromae. Os efeitos fungistáticos da proteína aqui descritos podem ser devido à sua capacidade de degradar quitina, um biopolímero estrutural que faz parte da parede celular de vários fungos fitopatogênicos, incluindo L. theobromae. Entretanto, mais estudos precisam ser conduzidos para revelar os possíveis mecanismos de ação de rVuChi sobre L. theobromae.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-12-17T14:22:48Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 774323 bytes, checksum: b6cf6fb63a7b4fe8f1931ff6b345b7f3 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-17T14:22:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 774323 bytes, checksum: b6cf6fb63a7b4fe8f1931ff6b345b7f3 (MD5) Previous issue date: 2009-02-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Desde o contato inicial até o estabelecimento dos sintomas da doença, C. lindemuthianum regula a expressão diferencial de genes essenciais para a patogenicidade que vão possibilitar a colonização do tecido hospedeiro e a finalização do seu ciclo de infecção. Nesse trabalho, o gene pacCl, que codifica o regulador transcricional de resposta ao pH ambiental, foi isolado e caracterizado estrutural e funcionalmente. Uma sequência de 2.546 pb foi isolada do banco genômico de C. lindemuthianum, correspondente ao gene pacCl. Esta sequência apresenta uma ORF de 1.746 pb, codificando, portanto, uma proteína de 581 resíduos de aminoácidos. Foram identificados na sequência, três íntrons putativos, contendo 60, 58 e 74 pb, cada um deles. O alinhamento múltiplo da sequência deduzida da proteína, com as sequências disponíveis nos bancos de dados, demonstrou elevado grau de identidade e similaridade da proteína identificada com o regulador transcricional PacC/Him101 de fungos filamentosos e leveduras, respectivamente. Além disso, a proteína PacCl se mostrou eficiente como marcador filogenético em fungos, pois agrupou de forma coerente os organismos taxonomicamente relacionados. A hibridização de DNA usando o gene pacCl como sonda, mostrou que o gene encontra- se em uma única cópia no genoma de C. lindemuthianum. Do mesmo modo, a análise do mutante Mutpac2 por hibridização de DNA, confirmou que o gene pacCl havia sido inativado por um evento de recombinação homóloga do tipo troca gênica. Por fim, a técnica de PCR quantitativo em tempo real mostrou que o gene pacCl é expresso em todas as fases do ciclo de infecção, porém, os maiores níveis foram encontrados no final da fase necrotrófica. Pode-se sugerir que um dos fatores responsáveis por esse aumento, seja a alcalinização do tecido vegetal, decorrente do envelhecimento do tecido, e/ou até mesmo da própria atividade do fungo, que em muitos casos secreta substâncias alcalinizantes, como por exemplo, amônia. / From the initial contact to the establishment of the symptoms of the disease, C. lindemuthianum regulates the differential expression of the genes that are essential to the pathogenicity and will make possible the colonization of the host tissue and the conclusion of its infection cycle. In this study, the pacCl gene codifying the transcriptional regulator of the response to the environmental pH was isolated and structurally and functionally characterized. A 2.546 pb sequence was isolated from the genomic bank of C. lindemuthianum, corresponding to the gene pacCl. This sequence shows an ORF with 1.746 pb, therefore codifying a protein containing 581 residues of amino acids. In the sequence, three putative introns containing 60, 58 and 74 pb each one were identified. The multiple alignment of the protein-deduced sequence with the sequences available in the data file showed both high identity level and similarity of the protein identified with the PacC/Him101 transcriptional regulator of filamentous fungus and yeasts, respectively. In addition, the PacCl protein was shown to be efficient as a phylogenetic marker in fungus, since it coherently grouped those taxonomically related organisms. The DNA hybridization by using the pacCl gene as probe showed the gene is found in one single copy in the genome of C. lindemuthianum. In the same way, the mutant Mutpac2 analysis by hybridization of DNA corroborated the gene pacCl was inactivated by an event of the genic exchange-type homologous recombination. Finally, the quantitative PCR technique in real time showed the pacCl gene to be expressed in all phases of the infection cycle, but the highest levels were found at the end of the necrotrophic phase. It can be suggested that one of the factors responsible for this increase to be the alkalization of the vegetal tissue due to the aging of the tissue and/or even from the activity of the fungus, since in many cases it secretes some alkalinizing substances such as the ammonia.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-05-17T16:34:29Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1067848 bytes, checksum: 64d84327afd892d02d4f3159ea5bf588 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-17T16:34:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1067848 bytes, checksum: 64d84327afd892d02d4f3159ea5bf588 (MD5) Previous issue date: 2011-02-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Neste trabalho, seis diferentes cepas fúngicas isoladas de plantações de eucalipto foram avaliadas quanto aos seus potenciais para produção de enzimas lignocelulolíticas visando suas aplicações em processos biotecnológicos, mais precisamente, processos de sacarificação da biomassa. Os fungos Pycnoporus sanguineus, Trametes sp. J2, Trametes sp J5, isolado J-129 (um basidiomiceto não identificado), Chrysoporthe cubensis e Cylindrocladium pteridis foram cultivados em meio líquido (ML) e meio semi- sólido (MSS) contendo farelo de trigo, sabugo de milho, polpa Kraft e celulose microcristalina (Avicel) como fonte de carbono. Após 4, 8 e 12 dias de fermentação os extratos enzimáticos produzidos foram coletados e analisados para determinação das atividades de xilanase, endoglicanases, β-glicosidases, lacases e celulase total (FPase). Pycnoporus sanguineus apresentou as maiores atividades para FPase (polpa Kraft-MSS) e lacase (farelo de trigo-ML) sugerindo que este microrganismo pode ser utilizado como um eficiente produtor de ambos os grupos de enzimas: cellulases e ligninases. Chrysoporthe cubensis propiciou as maiores atividades para endoglicanase e β-glicosidase (farelo de trigo-SSF). Sendo assim, foi demonstrado pela primeira vez que C. cubensis possui um grande potencial para produção de enzimas (principalmente celulases) para aplicação em processos de sacarificação da biomassa. As maiores atividades xilanolíticas foram encontradas em extratos produzidos pelo fitopatógeno C. pteridis, o qual foi apto a secretar quantidades incomuns de xylanase (aproximadamente 150000 U L -1 ) quando cultivado em meio semi-sólido usando farelo de trigo como substrato. Pycnoporus sanguineus e C. cubensis secretaram as maiores atividades celulolíticas e por isto os extratos enzimáticos produzidos por estes microrganismos foram caracterizados e subseqüentemente aplicados em testes de sacarificação da biomassa. Além de celulases e xilanases, P. sanguineus e C. cubensis também mostraram uma marcante capacidade para secretar atividades de α-arabinofuranosidase, α-galactosidase, β-mananase e poligalacturonase. Além disto, baixas atividades para β-xilosidase e β-manosidase também foram detectados em ambos os extratos enzimáticos. As atividades celulolíticas (endoglicanase, FPase e β-glicosidase) e xilanolíticas produzidas por P. sanguineus e C. cubensis foram caracterizadas em relação a pH e temperatura ótimos e foi observado que todas as atividades enzimáticas analisadas foram maximamente ativas quando incubadas em uma faixa de pH entre 3,5 e 4,5. Os valores de temperaturas ótimas variaram entre 50 e 60 °C. Além disto, todas as atividades enzimáticas foram altamente estáveis nas temperaturas de 40 e 50 °C tendo mantido mais de 70 % de suas atividades residuais após 48 h de incubação. Os extratos celulolíticos de P. sanguineus e C. cubensis foram aplicados em experimentos de sacarificação utilizando bagaço de cana, previamente submetido à pré-tratamento ácido ou básico, como substrato e os resultados de sacarificação foram comparados com aqueles obtidos utilizando- se uma preparação comercial de celulases. O uso de pré-tratamento ácido foi pouco eficiente na remoção da lignina junto ao bagaço de cana e como conseqüência disso observou-se um baixo rendimento de sacarificação quando este substrato foi utilizado, independentemente do extrato enzimático aplicado. Por outro lado, quando bagaço pré-tratado com base foi utilizado como substrato, elevadas taxas de hidrólise foram observadas. Considerando-se a produção de equivalentes açúcares redutores, foram observados rendimentos de sacarificação de 89,0, 60,4 e 64,0 % após 72 h de reação nos ensaios conduzidos com extrato de C. cubensis, extrato de P. sanguineus e com a preparação de celulases comercial, respectivamente. A produção de glicose também foi avaliada e, similarmente, se observou uma maior liberação deste monossacarídeo nos ensaios realizados com extrato do fungo C. cubensis (52,7 %). Para os ensaios de sacarificação utilizando extrato de P. sanguineus e celulase comercial a produção de glicose observada correspondeu a 22,6 e 36,6 % do rendimento teórico possível, respectivamente. Os resultados obtidos sugerem que as seis cepas fúngicas avaliadas neste trabalho têm grande potencial como produtoras de enzimas para aplicações em processos biotecnológicos. Os extratos celulolíticos de P. sanguineus e C. cubensis demonstraram um grande potencial para serem utilizados em processos de sacarificação da biomassa uma vez que o desempenho de hidrólise observado para estes extratos foi similar ou superior àquele observado em ensaios utilizando-se uma preparação de celulases comercial. / In this work, six different fungi strain isolated from eucalyptus plantations were evaluated in relation to their ability to produce ligninolytic enzymes to biotechnological application, specifically, biomass saccharification for bioethanol production. The fungi Pycnoporus sanguineus, Trametes sp. J2, Trametes sp J5, isolated J-129 (a Basidiomycete unidentified), Chrysoporthe cubensis e Cylindrocladium pteridis were cultivated in submerged fermentation (SmF) or in solid state fermentation (SSF) using wheat bran, corn cobs, Kraft pulp or microcrystalline cellulose (Avicel) as carbon source. After 4, 8 and 12 days of fermentation, the enzymatic extract produced were analyzed in relation to xylanase, endoglucanase, β-glucosidase, laccase and total cellulase (FPase) activities. The white-rot Basidiomycete P. sanguineous presented the highest FPase (Kraft pulp-SSF) and laccase (wheat bran-SmF) activities, suggesting that this microorganism could be used as an efficient producer for the two groups: cellulases and ligninases. Chrysoporthe cubensis presented the highest endoglucanase and β-glucosidase (wheat bran-SSF) activities. Therefore, for the first time, it was demonstrated that C. cubensis has a great potential to enzyme production (mainly cellulases) that could be applied in biomass saccharification processes. The highest xylanolytic activities were detected in enzymatic extracts produced by the plant pathogenic C. pteridis, which was able to secrete uncommon amounts of xylanase activity (approximately 150000U L -1 ) when cultivated in SSF using wheat bran. P. sanguineus and C. cubensis were able to secrete the highest amounts of cellulolytic activities and therefore the enzymatic extracts produced by these microorganisms were characterized and subsequently applied in biomass saccharification experiments. Besides cellulases and xylanases, P. sanguineus and C. cubensis were also able to produce α-arabinofuranosidase, α-galactosidase, β-mananase and polygalacturonase. It was also detected low activities of β-xylosidase and β-mannosidase in both enzymatic extracts. The cellulolytic activities(endoglucanase, FPase and β-glucosidase) and xylanolytic activities produced by P. sanguineus and C. cubensis were characterized in relation to pH and temperature and it was observed that all activities were maximized in a pH range of 3.5-4.5. The optimum temperatures for those enzymes varied between 50 and 60 °C. Besides, all enzymatic activities were highly stable at 40 and 50 °C, maintaining more than 70 % of its residual activities after 48 h of pre incubation at the aforementioned temperatures. The enzymatic extracts from P. sanguineus and C. cubensis were employed in saccharification experiments using acid-treated or alkali-treated sugarcane bagasse as substrate. The saccharification results were compared to those obtained employing a commercial cellulase. The acid pretreatment presented low efficiency in lignin removal from sugarcane bagasse and as a consequence, it was observed a low yield of saccharification when acid-treated bagasse was hydrolyzed, independently from the cellulase extract utilized. On the other hand, when alkali-treated sugarcane bagasse was used as substrate for saccharification, high hydrolysis rates were observed. Considering equivalent reducing sugars production, it was observed saccharification yields of 89.0, 64.4 and 64.0 % after 72 h of hydrolysis reaction using extract from C. cubensis, extract from P. sanguineous and a commercial cellulase, respectively. The glucose production was also evaluated and, similarly it was observed a higher yield in the saccharification using extract from C. cubensis (52.7 %) than in those using extract from P. sanguineous (22.6 %) or commercial cellulase (36.6 %). The results obtained suggest that the six fungi strains evaluated in this work present a great potential to produce enzymes for application in biotechnological processes. The cellulolytic extracts from P. sanguineous and C. cubensis demonstrated a great potential to be employed in biomass saccharification processes, since their observed hydrolysis performances were similar or superior to that observed performance for commercial cellulase. / Tese antiga

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-06-14T16:51:19Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 937597 bytes, checksum: 629ff63769e0f8099579bb5bef469601 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-14T16:51:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 937597 bytes, checksum: 629ff63769e0f8099579bb5bef469601 (MD5) Previous issue date: 2005-05-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O objetivo deste trabalho foi testar metodologia para determinação do grau de deterioração fúngica nos grãos de soja e amendoim causada por invasão de espécies de Aspergillus durante o armazenamento, e avaliar o uso do óleo essencial de mostarda na diminuição desta deterioração, e o seu efeito na qualidade dos grãos. Os grãos de soja e amendoim foram ajustados a 4 diferentes conteúdos de água e, em seguida os grãos de soja foram inoculados com suspensão de conídios de A. glaucus e A. ochraceus, e os grãos de amendoim inoculados com suspensão de A. glaucus e A. flavus. Amostras dos grãos inoculados, em cada conteúdo de água, foram armazenados na presença e ausência de atmosfera modificada pelo óleo essencial de mostarda (OEM), à temperatura de 25 ± 1oC, no escuro. As avaliações foram realizadas com os grãos de soja aos 7, 15, 45, 75 e 135 dias de armazenamento e com os grãos de amendoim aos 15, 30, 60 e 90 dias, constando de determinação de ácidos graxos livres, acidez total dos grãos, conteúdo de ergosterol, unidades formadoras de colônias (UFC ́s), teste de blotter e emergência de plântulas em areia. A utilização da metodologia de quantificação dos AGL dos grãos de soja e amendoim durante o armazenamento mostrou-se viável como parâmetro indicativo de deterioração fúngica dos grãos, pois os resultados obtidos foram correlacionados com os teores de ergosterol desses grãos, que por sua vez, permitiu o conhecimento da intensidade de colonização fúngica e conseqüentemente de deterioração. Principalmente nos grãos de amendoim esses resultados foram mais evidentes devido à maior colonização interna das reservas lipídicas. A acidez total dos grãos sugerida como possível indicador de deterioração fúngica, foi então correlacionada com o conteúdo de ergosterol e com o teor de ácidos graxos livres, mostrando-se viável para separar lotes de grãos de soja deteriorados. Os ácidos graxos livres, a acidez total e o conteúdo de ergosterol foram mais acentuados nos grãos com conteúdos de água mais elevados ao longo do armazenamento. A emergência de plântulas de soja foi negativamente correlacionada com o aumento do conteúdo de água dos grãos e o tempo de armazenamento A utilização do óleo essencial de mostarda na forma de vapor proporcionou inibição na germinação dos conídios, mas na concentração utilizada não foi eficiente para inibir a colonização nos grãos durante o armazenamento. Concentrações mais altas do óleo essencial de mostarda podem ter maior efeito na colonização, pois poderá alcançar o interior da massa dos grãos armazenados. / The objective of this work was to test methodology for determination of the degree of fungic deterioration in the peanut and soybean grains caused for invasion of species of Aspergillus during the storage, and to evaluate the use of the essential oil of mustard in the reduction of this deterioration, and its effect in the quality of the grains. The grains of soybean and peanut had been adjusted the 4 different water contents and, after that the soybean grains had been inoculated with suspension of conidium of Aspergillus glaucus and A. ochraceus, and the grains of peanut inoculated with suspension of A. glaucus and A. flavus. Samples of the inoculated grains, in each water content, had been stored in presence and absence of atmosphere modified for the essential oil of mustard (EOM), to the 25 ± 1oC of temperature, in the dark. The evaluations had been carried in grains of soybean to the 7, 15, 45, 75 and 135 days of storage and with the grains of peanut to the 15, 30, 60 and 90 days, consisting of determination of free fatty acid (FFA), total acidity of the grains, content of ergosterol, colony forming units (CFU), blotter test and emergency of seedlings in sand. The use of the methodology of quantification of the FFA of the grains of soybean and peanut during the storage revealed viable as indicative parameter of fungic deterioration of the grains, therefore the gotten results had been correlated with texts of ergosterol of these grains, that in turn, consequently allowed the knowledge of the intensity of fungic settling and of deterioration. Mainly in the peanut grains these results had been evident due to bigger internal settling of the lipidic reserve. The total acidity of the grains suggested as possible pointer of fungic deterioration, then was correlated with the content of ergosterol and the text of acid greasy free, revealing viable to separate lots of spoiled grains of soybean. Acid greasy the free ones, the total acidity and the content of ergosterol more had been accented in the grains with raised water contents more to the long one of the storage. The emergency negative of seedlings of soybean was correlated with the increase of the water content of the grains and the storage time the use of the essential oil of mustard in the vapor form provided inhibition in the germination of the conidium, but in the used concentration it was not efficient to inhibit the settling in the grains during the storage. Higher concentrations of the essential oil of mustard can have greater effect in the settling, therefore it will be able to reach the inside of the mass of the stored grains. / Tese antiga.

BATISTA, A. B. Caracterização estrutural da Mo-CBP3, uma albumina 2S de sementes de Moringa oleifera lamarck e seu modo de ação contra fungos fitopatogênicos. 2013. 154 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-10-01T19:25:40Z No. of bitstreams: 1 2013_tese_abbatista.pdf: 2920619 bytes, checksum: 53b139142aa57c4f39cd5e7163871406 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2014-10-06T23:10:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tese_abbatista.pdf: 2920619 bytes, checksum: 53b139142aa57c4f39cd5e7163871406 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-06T23:10:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_tese_abbatista.pdf: 2920619 bytes, checksum: 53b139142aa57c4f39cd5e7163871406 (MD5) Previous issue date: 2013 / Mo-CBP3 is a chitin-binding protein purified from Moringa oleifera seeds that displays broad inhibitory activity against phytopathogenic fungi. In this work, we report new structural features of Mo-CBP3 that reveal a correlation between its structural stability and antifungal activity. In addition, to gain better insights into the mechanisms by which this protein acts as an antifungal agent, its ability to induce the endogenous production of reactive oxygen species and to trigger morphologic and ultrastructural alterations were analysed using Fusarium solani as a model. F. solani is an easy-to-handle and fast-developing species, making it ideal for in vitro assays, and it holds relevance as a phytopathogenic fungus that attacks economically important crop plants. To fully explore the biosafety of Mo-CBP3 as a chemical agent against fungi, its cytotoxic effects on eukaryotic cells were also investigated. Mo-CBP3 is a chitin-binding protein of 18.0 kDa, according to SDS-PAGE. However, by mass spectrometry analysis, it was observed that this protein consists of multiple isoforms with molecular masses ranging between 12.2 and 12.3 kDa. Mo-CBP3 is composed by two polypeptide chains of 5.0 and 9.0 kDa, named A and B chain, respectively. The B chain contains the following NH2-terminal sequence CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ while the A chain has a blocked NH2-terminal residue. cDNA encoding the B chain was obtained with primers of its NH2-terminal sequence. In silico analyses of nucleotide and deduced amino acid sequences confirmed the presence of isoforms and molecular mass of Mo-CBP3 and identified potential sites of O-glicosylation and phosphorilation. Moreover, similarities between Mo-CBP3 and other M. oleifera proteins as well as 2S albumins were detected. The secondary structure of Mo-CBP3 showed 30.3% α-helices, 16.3% β-sheets, 22.3% turns and 30.4% unordered forms. In the fluorescence spectroscopy, excitation of Mo-CBP3 solution at 280 nm and 295 nm gave emission maxima at 303 and 309 nm, respectively. The Mo-CBP3 structure is highly stable and retains its antifungal activity regardless of temperature and pH. Mo-CBP3 (0.05-0.1 mg/mL) was able to inhibit the conidia germination of several phytopathogenic fungi, including F. solani, F. oxysporum, Colletotrichum musae and C. gloeosporioides. Similarly, Mo-CBP3 was inhibitory to the mycelial mass development of F. solani at 0.05 mg/mL and has both fungistatic and fungicidal effects, depending on the concentration used. Binding of Mo-CBP3 to the fungal cell surface is achieved, at least in part, via electrostatic interactions, as 150 mM NaCl abolished its inhibitory effect. Mo-CBP3 induced the production of reactive oxygen species and caused in F. solani cells a marked loss of asymmetry, deformations and deep wrinkles in comparison to control cells. Disorganisation of the endomembrane system and condensation and shrinkage of cytosol with increased vacuolation and the loss of normal structure and content were also observed. Mo-CBP3 did not show haemolytic activity and it was not capable to alter de viability of both MCF-7 and Caco-2 cells, suggesting that this protein is not toxic for human cells. Based on its high stability and broad-spectrum efficacy against important phytopathogenic fungi at low inhibitory concentrations and absence of cytotoxicity to human cells, Mo-CBP3 has great potential in the development of new antifungal drugs or in transgenic crops with enhanced resistance to fungi. / Mo-CBP3 é uma proteína ligante à quitina, purificada de sementes de Moringa oleifera, com amplo espectro de ação contra fungos fitopatogênicos. No presente trabalho, novas propriedades estruturais da Mo-CBP3 são descritas, revelando correlação entre sua estabilidade estrutural e atividade antifúngica. Em adição, para melhor compreensão dos mecanismos pelos quais essa proteína exerce ação antifúngica, sua habilidade de induzir a produção endógena de espécies reativas de oxigênio e de causar alterações morfológicas e ultraestruturais foi analisada, usando Fusarium solani como modelo. F. solani é uma espécie de fácil manuseio e desenvolvimento rápido, ideal para ensaios in vitro, e de relevância, por se tratar de um fungo que ataca culturas economicamente importantes. Com foco na utilização segura da Mo-CBP3 como agente químico contra fungos, seus efeitos citotóxicos sobre células eucarióticas também foram investigados. Mo-CBP3 é uma proteína ligante à quitina de 18,0 kDa, de acordo com PAGE-SDS. Todavia, análise por espectrometria de massas revelou que essa proteína consiste de múltiplas isoformas com massas moleculares variando entre 12,2 e 12,3 kDa. Mo-CBP3 é composta por duas cadeias polipeptídicas de 5,0 e 9,0 kDa, denominadas de cadeia A e cadeia B, respectivamente. A cadeia B contém a sequência NH2-terminal representada por CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ, enquanto que a cadeia A tem o resíduo NH2-terminal bloqueado. cDNA codificador da cadeia B foi obtido com iniciadores sintetizados a partir de sua sequência NH2-terminal. Análises in silico das sequências de nucleotídeos e de aminoácidos deduzida confirmaram a presença de isoformas e massa molecular da Mo-CBP3 e identificaram sítios potenciais de O-glicosilação e fosforilação. Além disso, similaridades entre Mo-CBP3 e outras proteínas de M. oleifera, bem como com albuminas 2S, foram detectadas. A estrutura secundaria da Mo-CBP3 é composta por 30,3% α-hélices, 16,3% folhas β, 22,3% voltas e 30,4% estruturas ao acaso. Na espectroscopia de fluorescência, excitações de uma solução da Mo-CBP3 a 280 nm e 295 nm produziram emissão máxima a 303 e 309 nm, respectivamente. A estrutura da Mo-CBP3 é altamente estável, se apresentando indiferente às mudanças de temperatura e pH. Mo-CBP3 (0,05-0,1 mg/mL) se mostrou capaz de inibir a germinação de conídios de vários fungos fitopatogênicos, incluindo F. solani, F. oxysporum, Colletotrichum musae e C. gloeosporioides. Similarmente, Mo-CBP3 (0,05 mg/mL) foi capaz de inibir o crescimento micelial de F. solani e apresentou tanto efeito fungistático como fungicida, dependendo da concentração usada. Ligação da Mo-CBP3 à superfície de células fúngicas ocorre, pelo menos em parte, via interação eletrostática, já que NaCl 0,15 M aboliu seu efeito inibitório. Mo-CBP3 induziu a produção de espécies reativas de oxigênio e causou perda de assimetria e deformações em células de F. solani. Desorganização do sistema de endomembranas, condensação do citosol e aumento de vacuolização também foram observados. Mo-CBP3 não mostrou atividade hemolítica e nem foi capaz de alterar a viabilidade das células MCF-7 e Caco-2, sugerindo que essa proteína não é tóxica para células humanas. Com base na alta estabilidade e no amplo espectro de ação contra fungos fitopatogênicos em baixas concentrações e, também, na ausência de citotoxicidade para células humanas testadas, Mo-CBP3 tem grande potencial para desenvolvimento de novas drogas antifúngicas ou na produção de plantas transgênicas mais resistentes a fungos.