O segundo mensageiro cGMP está envolvido em diversas funções celulares incluindo a visão em mamíferos. Embora trabalhos anteriores mostrassem variações nos níveis de cGMP durante o ciclo de vida de Blastocladiela emersonii e evidências da existência de enzimas específicas envolvidas na sua síntese (guanilato ciclase) e degradação (cGMP fosfodiesterase), nenhum genoma de fungo publicado até o momento mostrou a existência de genes codificando estas enzimas. Este fato é atribuído por evolucionistas à completa perda de motilidade dos fungos em geral, já que cGMP está primordialmente associado a células com cílios. Blastocladiomicetos, como Blastocladiella, apresentam células móveis em pelo menos um estágio do seu ciclo de vida, o que poderia explicar a existência dessa via nesses fungos. Uma investigação no banco de ESTs de B. emersonii revelou a existência de cDNAs codificando parte de prováveis guanilato ciclases (BeGC1, BeGC2 e BeGC3) e uma possível cGMP fosfodiesterase (BePDE). Assim, este trabalho buscou confirmar a existência destas enzimas e caracterizar a sinalização por cGMP em B. emersonii. A proteína recombinante selvagem correspondente ao domínio catalítico de BePDE mostrou atividade de degradação sobre cGMP e a mutação E389A foi capaz de alterar a especificidade por cGMP. Com o sequênciamento do genoma de B. emersonii obteve-se as sequências completas das guanilato ciclases. Em BeGC2 não foi possível identificar o ligante responsável por sua ativação. Em BeGC3, a presença de um domínio Heme-Pas sugeriu sua ativação por óxido nítrico. A presença de um domínio rodopsina em BeGC1 sugeriu sua ativação por luz. Experimentos de microscopia por imunofluorescência localizaram BeGC1 no \"eyespot\", BeGC2 no capacete nuclear e BeGC3 no citoplasma de zoósporos de B. emersonii. Verificamos também que zoósporos realizam fototaxia em direção à luz verde e que a adição de hidroxilamina, inibidor de rodopsina, ou do inibidor de guanilato ciclase LY83583 tem efeito negativo na fototaxia, bem como impede o aumento dos níveis de cGMP observado em zoósporos expostos à luz verde. O bloqueio da síntese de retinal por Norflurazon também inibiu a fototaxia sendo esta restaurada quando adicionamos retinalA1. Estes dados, juntamente com o fato de o domínio rodopsina de BeGC1 ser a única rodopsina presente no genoma, indicam que BeGC1 é responsável pela fototaxia nos zoósporos de B. emersonii. O genoma do fungo apresenta ainda um possível canal de potássio ativado por cGMP (BeCNG1) localizado na membrana plasmática de zoósporos, similar ao canal regulado por cGMP envolvido na visão em humanos. Ensaios de microfluorimetria também evidenciaram a presença de um canal ativado por cGMP relacionado com o influxo de potássio e a motilidade dos zoósporos. Um modelo para a via de sinalização da fototaxia em B.emersonii foi proposto e comparado com a sinalização presente na visão de mamíferos, destacando a existência de cGMP e rodopsina em ambos os processos e sugerindo uma possível origem comum. Portanto, os resultados obtidos suportam a existência da sinalização por cGMP em B. emersonii, além de indicar o papel dessa sinalização na fototaxia dos zoósporos, sendo esta a primeira via de sinalização por cGMP caracterizada em fungos. / The second messenger cyclic GMP is involved in a wide array of cellular processes including vision in mammals. Although previous studies demonstrated changes in cGMP levels during the life cycle of Blastocladiela emersonii and evidences of specific enzymes involved in its synthesis (guanylyl cyclase) and hydrolysis (cGMP-phosphodiesterase), no fungal genome published so far shows the presence of genes encoding these enzymes. Evolutionists attribute the absence of cGMP signaling pathways in higher fungi to the sedentary life style of these organisms, since cGMP is primarily associated with ciliated cells. However, blastocladiomycetes like Blastocladiella, have motile cells in at least one stage of their life cycle, which could explain the existence of this pathway in these primitive fungi. Inspection of B. emersonii EST data bank, revealed cDNAs encoding part of three putative guanylyl cyclases (BeGC1, BeGC2 e BeGC3) and one possible cGMP phosphodiesterase (BePDE). Thus, the purpose of this study was to confirm the existence of these enzymes and characterize the cGMP signaling pathway in this model. The recombinant protein containing the wild type catalytic domain of BePDE presented activity towards hydrolysis of cGMP and the E389A mutation of this domain changed the cGMP specificity of this enzyme. The complete nucleotide sequence of the guanylyl cyclases were obtained by sequencing of B. emersonii genome. In BeGC2 we were unable identify the ligand responsible for its activation, but in BeGC3, the presence of a Heme-Pas domain suggested its activation by nitric oxide. The presence of a rhodopsin domain in BeGC1 suggested its activation by light. Immunofluorescence microscopy localized BeGC1 in the \"eyespot\" structure, BeGC2 in the nuclear cap and BeGC3 in the cytoplasm of zoospores of B. emersonii. We found that Blastocladiella zoospores performed phototaxis toward green light and photobleaching of rhodopsin function using hydroxylamine prevented both phototaxis and the increased cGMP levels observed when zoospores were exposed to green light. The same effect was observed using the guanylyl cyclase inhibitor LY83583. Inhibition of retinal synthesis using Norflurazon prevented the phototaxis response, which could be restored by zoospore complementation with retinalA1. The BeGC1 gene is the only rhodopsin found in the draft assembly of B. emersonii genome, which indicates that BeGC1 is responsible for phototaxis observed in zoospores. We also found in the genome a possible cGMP-activated potassium channel (BeCNG1), localized in the plasma membrane of the zoospores, which is similar to the cGMP-activated channel involved in human vision. In addition, microfluorimetry assays revealed the presence of a cGMP-activated potassium channel involved in potassium influx and zoospore motility. The signaling model of B. emersonii phototaxis was proposed and compared with the mammalian vision system, with cGMP and rhodopsin acting in both signaling pathways, suggesting a common origin. Altogether our data indicate that Blastocladiella emersonii has a cGMP signaling system involved in phototaxis, being the first cGMP signaling pathway characterized in fungi.

Orientador: Gilberto de Nucci / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-10T06:11:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lorenzetti_Raquel_D.pdf: 2089930 bytes, checksum: f6ed8b98e678ffdfc6051c645efc8b4b (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: No presente trabalho foi padronizado um novo método para a dosagem da atividade de fosfodiesterase in vitro, por HPLC-MS/MS. Este novo método conseguiu apresentar exatidão, precisão, sensibilidade e rapidez nas análises; monitorando os nucleotídeos (AMP, GMP, AMPc e GMPc). O desenvolvimento de novos fármacos derivados de um protótipo aponta para a obtenção de moléculas com um melhor perfil farmacocinético ou uma melhor relação estrutura-atividade. Atualmente o sildenafil é considerado o principal fármaco para o tratamento de disfunção erétil. Neste trabalho, avaliaram-se novos compostos denominados análogos de sildenafil (carbonato de lodenafil, dímero uréia e dímero uretana). Os análogos foram analisados quanto à atividade em PDE5 e agregação plaquetária humana, in vitro. Foi determinada a estabilidade destes compostos, em meio ácido e plasma humano, in vitro, além de seus possíveis metabólitos em microssomas e hepatócitos de rato in vitro, e os seus parâmetros farmacocinéticos via intravenosa e oral, em cão, in vivo. Os resultados mostraram que os análogos de sildenafil inibem a atividade de PDE e não inibem a agregação plaquetária do mesmo modo que o sildenafil in vitro, no entanto potencializam a ação do doador de NO (SNP). Os análogos de sildenafil foram estáveis em meio ácido e em plasma humano. No ensaio de metabolização, os dímeros uréia e uretana não foram metabolizados, entretanto o carbonato de lodenafil foi metabolizado principalmente em lodenafil, in vitro. O carbonato de lodenafil é rapidamente biotransformado em lodenafil, após administração v.i. e v.o. em cão. Concluiu-se que este trabalho apresenta um novo método de dosagem de PDEs e uma nova perspectiva terapêutica para a disfunção erétil, representada pelo carbonato de lodenafil, o qual inibe concentração-dependente a atividade de PDE5 / Abstract: In the present work a new method for the dosage of the activity of phosphodiesterase was standardized in vitro, for HPLC-MS/MS. This new method obtained to present exactness, precision, sensitivity, and rapidity in the analyses; monitoring the nucleotides (AMP, GMP, cAMP and cGMP). The development of new drug derived from an archetype points with respect to the molecule attainment with one better pharmacokinetic profile or one better relation structure-activity. Currently the sildenafil is considered the main drug for the treatment of erectile dysfunction. In this work, we evaluate new analogous called composites of sildenafil (carbonate of lodenafil, dimer urea and dimer uretana). The analogous ones had been analyzed how much the activity in PDE5 and platelet aggregation human being, in vitro. The stability of these composites was determined, in human acid way and plasma, in vitro, beyond its possible metabolites in microsomes and hepatocytes of rat in vitro, and its pharmacokinetic profile after intravenous and oral, in dog, in vivo. The results had shown that the analogous of sildenafil inhibit the activity of PDE and they do not inhibit the platelet aggregation in a similar way that the sildenafil in vitro, however potencializam the action of the giver of NO (SNP). The analogous ones of sildenafil are presented steady in human acid way and plasma. In the metabolization assay, metabolization of dimer urea and dimer uretana was not observed, however the lodenafil carbonate was metabolizado mainly in lodenafil, in vitro. The lodenafil carbonate quickly is biotransformation in lodenafil, after administration v.i. and v.o. in dog. We conclude that this work presents a new method for analyze activity of PDEs and a new therapeutically perspective for the erectile dysfunction, represented for lodenafil carbonate, which inhibits concentration-dependent the activity of PDE5 / Doutorado / Doutor em Farmacologia

Orientador: Heitor Moreno Junior / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T19:55:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Melo_SilviaElainedeSousaFerreiraCarvalhode_D.pdf: 6801672 bytes, checksum: d5d157af717b53ac33305c8ec554a2d0 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: O óxido nítrico (NO) é um mediador biológico multifuncional que serve como molécula chave em muitos processos fisiopatológicos, sintetizado nas células endoteliais em resposta a estímulos fisiológicos ou patológicos. Sua síntese se dá a partir da clivagem do terminal nitrogênio-guanidina do aminoácido L-arginina, em uma reação catalizada pela enzima óxido nítrico sintase (NOS). Há três isoformas de NOS: a NOS endotelial (eNOS), a NOS neuronal (nNOS) e a NOS induzível (iNOS). A eNOS e a nNOS são isoformas expressas constitutivamente nas células endoteliais vasculares e nas células neuronais, respectivamente; e a iNOS que a forma induzível, expressa em células inflamatórias após a indução por citocinas e outros mediadores inflamatórios. Após sua síntese o NO se difunde para as células do músculo liso vascular ativando a enzima guanilato ciclase solúvel (GCs), que converte guanosina-tri-fostato (GTP) em guanosina-3¿,5¿-monofosfato cíclica (GMPc), um segundo mensageiro para seus diversos efeitos biológicos, dentre os quais o relaxamento da musculatura lisa vascular. A síntese de NO pode ser inibida por vários compostos análogos à L-arginina, como L-NMMA, L-NAA, L-NAME e L-NIO de forma dose-dependente. A inibição crônica da síntese de óxido nítrico pela administração crônica de L-NAME é um modelo complexo e bem estabelecido de hipertensão arterial e miocardiopatia hipertensiva. É caracterizado por elevação da pressão arterial (PA) de forma severa, redução na freqüência cardíaca, no fluxo coronário e débito cardíaco (DC), aumento da resistência vascular periférica total (RVPT), diminuição do relaxamento vascular e alterações na contratilidade cardíaca, hipertrofia cardíaca, aumento do tamanho cardiomiócito, remodelamento miocárdico e microvascular com fibrose perivascular, sendo que o índice peso cardíaco/peso corporal e peso ventricular esquerdo/peso corporal estão usualmente aumentados. As fosfodiesterases são enzimas que degradam os nucleotídeos cíclicos GMPc e AMPc nas suas formas inativas. São conhecidas 11 famílias de enzimas (PDE1 ¿ PDE11) que diferem com relação ao padrão distribuição, especificidade de substrato, regulação pelas PKs e proteínas ligantes. Estão envolvidas em diversos processos fisiológicos e patológicos, tais como ereção peniana, asma, hipertensão pulmonar, aterosclerose, insuficiência cardíaca e diabetes. Consequentemente, os inibidores seletivos de PDE são interessantes e promissores alvos farmacológicos. Os inibidores das PDEs inpedem a degradação do AMPc, GMPc, elevando seus níveis intracelulares. Esses inibidores mimetizam as estruturas do AMPc e GMPc, mas não são degradados. Sildenafil é um inibidor seletivo da PDE5 induzindo o e relaxamento do músculo vascular liso e têm sido utilizados com sucesso no tratamento da disfunção erétil. A base racional para este projeto é a hipótese de que o sildenafil, por inibir de forma seletiva a PDE5 e conseqüentemente aumentar a disponibilidade de GMPc, possa ter efeitos cardiovasculares benéficos na inibição crônica da síntese de NO que reduz os níveis de GMPc no músculo cardíaco e vascular. Para isso foram estudados 4 grupos experimentais divididos aleatoriamente em: CONTROLE, L-NAME, SILDENAFIL e SILDENAFIL + L-NAME, durante 8 semanas de tratamento. Analisamos as alterações hemodinâmicas através das medidas da pressão arterial média, débito cardíaco, freqüência cardíaca e resistência vascular. As análises histológicas foram feitas através de técnicas morfométricas para determinação do diâmetro de miócito, lesões miocárdicas e espessura da camada média vascular e análises imunohistológicas. Nossos resultados demonstraram que a administração crônica de sildenafil altera os padrões hemodinâmicos e histolólgicos do modelo de miocardiopatia hipertensiva induzida pela inibição da síntese de NO por L-NAME. A inibição da PDE5 restaurou parcialmente os padrões hemodinâmicos, avaliados através da PA, DC e RVPT, além de protege parcialmente o miocárdio e músculo vascular liso contra as lesões e remodelamento cardiovascular característicos deste modelo experimental. A biodisponibilidade de GMPc, nos animais do grupo L-NAME + sildenafil, foi totalmente restaurada após 8 semanas de tratamento e a expressão das enzimas PDE3 e PDE5 estavam modificadas no músculo vascular liso e nos discos intercalares dos miócitos. Dessa forma, concluimos que o sildenafil, através da inibição da PDE5, aumentando a biodisponibilidade do GMPc, resulta em um efeito cardioprotetor e antiproliferativo contra as alterações cardiovasculares descritas no modelo de miocardiopatia hipertensiva induzida pela inibição crônica da síntese de NO em ratos Wistar / Abstract: Many of the physiological responses to nitric oxide (NO) are mediated by cyclic 5'-guanosine monophosphate (cGMP), the intracellular levels of which are regulated by phosphodiesterase type 5 (PDE5). In situations of reduced NO formation, the inhibition of PDE5 by selective inhibitors such as sildenafil could be beneficial in restoring physiological functions by enhancing the intracellular levels of cGMP. In this study, we evaluated the effects of sildenafil on the hemodynamic and histological alterations induced by the chronic treatment of rats with Nw¿nitro-L¿arginine¿methyl ester (L-NAME). After 8 weeks of concomitant treatment with sildenafil and L-NAME, arterial blood pressure was significantly lower (P<0.05) than in L-NAME treated rats. The fall in blood pressure was associated with a slight reduction in the total peripheral vascular resistance (P<0.05). Sildenafil partially restored the decrease in cardiac output seen in L-NAME-treated rats. Morphologically, sildenafil reduced the total area of the myocardial lesions and attenuated the cardiomyocyte and vascular smooth muscle remodeling seen with L-NAME. These results show that sildenafil reversed the deleterious hemodynamic and morphological alterations associated with L-NAME-induced hypertension. This beneficial effect was probably mediated by an increase in cardiac and vascular cGMP levels as reflected in circulating plasma cGMP levels / Doutorado / Doutor em Farmacologia

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O objetivo do estudo foi verificar os efeitos do carbonato de lodenafil no processo de consolidaÃÃo Ãssea nos fÃmures de ratos reduzidos com fio de Kirshner. Os fatores vasculares sÃo extremamente importantes para a formaÃÃo do calo Ãsseo. O carbonato de lodenafil causa efeitos vasodilatadores, pertence ao grupo dos inibidores da fosfodiesterase seletiva para o tipo 5 (PDE5), enzima que hidrolisa monofosfato de guanosina cÃclico (GMPc). O GMPc induz o relaxamento da musculatura lisa, sendo utilizado no tratamento da disfunÃÃo erÃtil. Foram utilizados 36 ratos machos, adultos, da linhagem Wistar, com o peso mÃdio de 300g. Todos os animais foram submetidos a cirurgia em que era realizada a fratura da diÃfise femoral com uma guilhotina romba. Os animais foram divididos em 2 grupos: o grupo lodenafil, que recebeu, via oral, doses diÃrias de carbonato de lodenafil (10mg/kg) e o grupo controle. Os animais foram sacrificados com 7, 14 e 28 dias de pÃs-operatÃrio. Houve duas mortes, dois falsos trajetos do fio e em trÃs animais nÃo foi estabelecida a fratura. Foram realizados estudo radiogrÃfico com filme de mamÃgrafo para analisar a densidade Ãptica e Ãrea do calo Ãsseo, medida em mm e estudo histolÃgico, utilizando amostras coradas com picrosirius red sob a luz poralizada do microscÃpio, para quantificar a formaÃÃo de colÃgeno tipo I e tipo III na regiÃo cortical prÃxima a fratura e no calo Ãsseo. A densidade de colÃgeno tipo I na regiÃo cortical do fÃmur prÃximo à fratura verificada no grupo lodenafil foi significantemente menor que a observada no grupo controle com 28 dias de consolidaÃÃo Ãssea (**P = 0,0028). Os resultados encontrados nÃo sÃo consistentes o suficiente para afirmar que este fÃrmaco exerce algum efeito na consolidaÃÃo Ãssea. Verificou-se que o Carbonato de lodenafil nÃo influenciou no processo de consolidaÃÃo Ãssea nos fÃmures de ratos reduzidos com fio de Kirshner. / The study was to investigate the effects of Lodenafil Carbonate in the process of bone healing in femurs of rats with reduced KirshnerÂs wire. The vascular factors are extremely important for the formation of callus. Lodenafil Carbonate cause vasodilatory effects, belongs to the group of selective phosphodiesterase type 5(PDE5) inhibitors, that enzyme inhibits cyclic guanosine monophosphate (GMPc) and relaxation of smooth muscles and are used to treat erectile dysfunction. It used 36 male rats, adult male rats, with the average weight of 300g. All animals underwent surgery in which fractures to the femoral shaft with a blunt guillotine. The animals were divided into 2 groups: lodenafil group, wich received oral doses of carbonate lodenafil (10mg/kg) and the control group. The animals were sacrificed at 7, 14 and 28 days postoperatively. There were two deaths, two false paths of the wire and three animals was not established fracture. Were performed radiographic studies with film mammography to analyze the optical density and area of callus, measured in mm  and histological study, using samples stained with picrosirius red under microscope light polarization, to quantify formation of collagen type I and type III in the cortical region near the fracture and callus. The density of type I collagen in the cortical region of the femur near the fracture observed in group lodenafil was significantly lower than that observed in the control group at 28 days of bone (** P = 0.0028). The results are not consistent enough to say that this drug has an effect on bone healing. It was found that the carbonate lodenafil not influence the process of bone healing in femurs of rats with reduced wire Kirshner.

Introdução: Vários são os fatores que alteram a atividade sexual de homens e mulheres. Com o envelhecimento observa-se aumento das queixas de desejo hipoativo feminino e de disfunção erétil. Visto que o homem e sua parceira constituem um sistema dinâmico, antes do advento dos inibidores da fosfodiesterase eles se adaptavam às condições disfuncionais do casal. A eficácia aliada a poucos efeitos colaterais e à facilidade de administração da sildenafila e, posteriormente, da vardenafila e tadalafila, revolucionou o tratamento da disfunção erétil. Por outro lado, até a presente data, a terapêutica medicamentosa com testosterona para o desejo sexual hipoativo de mulheres, ainda gera controvérsias. Objetivo: Avaliar o uso de androgênio, utilizado para tratamento das queixas de desejo sexual hipoativo em mulheres, comparando dois períodos, ou seja, pré e após o aparecimento iPDE 5. Os efeitos colaterais e as divergências em relação a este tratamento também serão analisados. Método: Foram selecionados estudos em inglês, português e espanhol, publicados entre 1988 e os dias atuais, ou seja, na década pré-advento dos inibidores da fosfodiesterase 5 e após. A busca dos artigos foi feita em periódicos indexados nas bases Lilacs, Cochrane, Embase e Medline/PubMed, utilizando-se os seguintes descritores e suas combinações: sexualidade (sexuality), desejo sexual hipoativo em mulheres (female hypoactive sexual desire disorder), testosterona (testosterone), terapia androgênica em mulheres (androgen therapy in women). Discussão: Embora haja evidência sobre a efetividade do tratamento com testosterona para desejo hipoativo em mulheres, este uso ainda gera muitas controvérsias. Resultados: O número de estudos randomizados sobre uso de testosterona para tratamento de DSH feminino aumentou de 10%, comparando o período compreendido entre 1988 e 1998, para 90% entre 1999 e 2012. Todos os estudos randomizados analisados demonstraram benefícios sobre a resposta sexual, melhorando a libido, a excitação e/ou o orgasmo. Porém, como tiveram seguimento por um período máximo de 24 semanas, os riscos dessa administração não foram esclarecidos. Conclusão: A partir de 1988, ou seja, após a liberação comercial dos inibidores da fosfodiesterase do tipo 5, para tratamento da disfunção erétil, houve um aumento significativo do número de pesquisas com a finalidade de avaliar o uso de testosterona em mulheres com desejo hipoativo. Porém, ainda são necessários estudos de longo prazo para que os riscos e os benefícios, desta administração, sejam esclarecidos / Introduction: There are several factors that alter the sexual activity of both men and women. With age, an increase in complaints about hypoactive feminine desire and erectile dysfunction can be observed. Since the man and his partner constitute a dynamic system, before the advent of phosphodiesterase inhibitors, they would adapt to the dysfunctional conditions of the couple. The efficacy with few collateral effects and the easy administration of sildenafil and later, vardenafil and tadalafil, has revolutionized the treatment of erectile dysfunction. On the other hand, until now, the drug therapy with testosterone for hypoactive sexual desire of women still generates controversies. Objective: Assess the use of androgen, used for treating complaints of hypoactive sexual desire in women, comparing two periods, that is, before and after the emergence of iPDE 5. Side effects and divergences regarding this treatment are also analyzed. Method: Studies in English, Portuguese and Spanish were selected, published between 1988 and the present, that is, in the decade before the advent of phosphodieterase 5 inhibitors and after this fact. The search for papers was made in indexed journals on Lilacs, Cochrane, Embase and Medline/PubMed data bases, using the following descriptors and their combinations: sexuality, female hypoactive sexual desire disorder, testosterone or androgen therapy in women. Discussion: Although there is evidence on the effectiveness of treatment with testosterone for hypoactive desire in women, this use still generates many controversies. Results: The number of randomized studies on the use of testosterone for the treatment of female HSD has increased 10%, comparing the period between 1988 and 1998, to 90% between 1999 and 2012. All randomized studies analyzed showed benefits on the sexual response, improving libido, excitation and/or orgasm. However, since they were followed for a maximum of 24 weeks, the risks of this dosage were not clarified. Conclusion: From 1988, that is, after the commercial release of phosphodiesterase type 5 inhibitors, for the treatment of erectile dysfunction, there was a significant increase in the number of papers with the purpose of evaluating the use of testosterone in women with hypoactive desire. However, there is the need of long-term studies in order to clarify the risks and benefits of this use

Submitted by Eunice Novais (enovais@uepg.br) on 2018-09-06T16:39:14Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Nubia Nascimento.pdf: 1296891 bytes, checksum: 1fb7f4ddd43a4591eeb9f1b8e95bb14f (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-06T16:39:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Nubia Nascimento.pdf: 1296891 bytes, checksum: 1fb7f4ddd43a4591eeb9f1b8e95bb14f (MD5) Previous issue date: 2018-05-28 / O cilostazol é um inibidor seletivo da fosfodiesterase III que atua como antiagregante plaquetário e vasodilatador. Faz parte do tratamento clínico da doença aterosclerótica carotídea extracraniana,apresentando benefícios para o adequado fluxo sanguíneo local.Devido à suacaracterística lipofílica,é um excelente fármaco para o estudo do desenvolvimento de sistemas de liberação modificada, que objetivam melhorar a disponibilidade biológica. A aplicação de tecnologias em formulações, como nanosuspensões, caracteriza uma estratégia atrativa para melhorar a ação de compostos pouco solúveis em água como o Cilostazol. Este trabalho avalioua ação do Cilostazolnanoencapsulado na túnica média da artéria carótida esquerda e no perfil lipídico de ratos Wistar. Os animais foram divididos em 4 grupos, que receberam soluções de nanocápsulas contendo cilostazol, nanocápsulas sem cilostazol, solução de propilenoglicol e cilostazol pesado.Foi observada diferença entre a espessura da carótida em micrômetros, entre os grupos que receberam o cilostazolnanoencapsulado e o grupo que recebeu a solução de propilenoglicol [70.22(9.2±47-81)IC95% 62-72] (P 0,019), sendo a maior espessura observada no grupo que recebeu o cilostazolnanoencapsulado. Não houve diferença em relação à celularidade em números absolutos, entre os grupos. Em relação ao perfil lipídico, o grupo que recebeu propilenogicol apresentou valores maiores de HDL comparativamente ao grupo que recebeu a solução de cilostazolnanoencapsulado [56.85(10.5±37.7-83.7)IC95% 52.56-61.38] (P0,01). O nível de triglicerídeos em mg/dL foi maior no grupo que recebeu o cilostazolpesado em relação ao grupo que recebeu a solução de nanocápsulas [116,92(56.37±45-266)IC95% 74.15-132.33] (P0,01). O cilostazol pesado apresentou melhores resultados em relação ao perfil lipídico. A apresentação do cilostazolnanoecapsulado não demonstrou ser adequada para o tratamento da doença carotídea extracraniana devido ao fato de aumentar o perfil lipídico dos animais estudados. A estrutura da nanocápsula, por conter lipídios em seu interior, piorou o perfil lipídico. Os achados laboratoriais foram condizentes com os achados histopatológicos. / Cilostazol is a selective inhibitor of phosphodiesterase III that acts as a platelet antiaggregant and vasodilator. It is part of the clinical treatment of extracranial atherosclerotic carotid disease, presenting benefits for adequate local blood flow. Due to its lipophilic characteristics, it is an excellent drug for the study of the development of modified release systems, which aim to improve biological availability. The application of technologies in formulations, such as nanosuspensions, characterizes an attractive strategy to improve the action of compounds little soluble in water like Cilostazol. This study evaluated the effect of nanoencapsulated Cilostazol on the left carotid artery layers and in the lipid profile of Wistar rats. The animals were divided into 4 groups, which received solutions of nanocapsules containing cilostazol, nanocapsules without cilostazol, solution of propylene glycol and heavy cilostazol. Differences were observed between carotid thickness in micrometers between groups receiving nanoencapsulated cilostazol and the group receiving the propylene glycol solution (70.22 (9.2 ± 47-81) 95% CI 62-72) (P <0.019), with the highest thickness observed in the group receiving nanoencapsulated cilostazol. There was no difference in cellularity in absolute numbers between the groups. Regarding the lipid profile, the group receiving propylene glycol had higher values of HDL in mg/dL, compared to the group that received the nanoencapsulated cilostazol solution [56.85 (10.5 ± 37.7-83.7) 95% CI 52.56-61.38] (P 0.01). The level of triglycerides in mg/dL was higher in the group that received the heavy cilostazol compared to the group that received the nanocapsule solution [116 (56.37 ± 45-116.92) CI95% 74.15-132.33] (P 0.01). The heavy cilostazol presented better results in relation to the lipid profile. The presentation of nanoecapsulated cilostazol has not been shown to be adequate for the treatment of extracranial carotid disease due to the fact that it increases the lipid profile of the animals studied. The structure of the nanocapsule, as it contained lipids, worsened the lipid profile. Laboratory findings were consistent with histopathological findings.

Introdução: A hipertensão arterial sistêmica (HA) pode estar associada à diminuição na produção e liberação do óxido nítrico derivado do endotélio (NO). O uso do sildenafil leva ao aumento de monofosfato de guanosina cíclica (GMPc), um importante mediador de NO. Contudo, pouco se sabe sobre os efeitos da inibição da fosfodiesterase tipo 5 (PDE5) na monitorização da pressão arterial 24-h (MAPA), pressão arterial durante exercício, noraepinefrina (Nor) e capacidade ao exercício, principalmente após transplante de coração (TX). Métodos: Nós estudamos 22 pacientes pós TX, os quais foram randomizados, tomando dose única de sildenafil (50mg) ou placebo (50mg), aproximadamente uma hora antes de iniciar o protocolo. No dia 1, os pacientes realizaram avaliação clínica, teste cardiopulmonar de caminhada de seis minutos (TES) seguido de teste de esforço cardiopulmonar (TE), Após o término dos testes em esteira, foi colocado o MAPA. Determinamos em repouso (rep), último minuto do TES (6) e pico do TE (Ex): FC (bpm) PAS e PAD (mmHg), VO2(ml/kg/min), Slope VE/VCO2, tempo de exercício (TE, min), distância (TES, Km) e Nor (pg/ml). No dia 2 o protocolo foi repetido, realizando-se o cross-over. Dezessete pacientes apresentavam HA. Resultados: (Pl e Sil respectivamente), Sil reduziu (p<0.05): PAS-rep(138±7 vs 122±18); PAD-rep(83±12 vs 78±12); PAS-6(156± 20 vs 137± 22); PAD-6(82±13 vs 77±14); PAS-Ex(155± 27vs 124±36); PAD-Ex(79±16 vs 66± 16); PAS 24-h(121±10 vs 114±9), PAD 24-h(80±6 vs 76±5), PAS vigília(122±11 vs 115±9), PAD vigília(81± 6 vs 76±5) e PAS noturna(119±12 vs 112±10), PAD noturna(78±7 vs 73±8); e aumentou Nor-repouso(483±165 vs 622±211). Sil não alterou rep, 6 e EX: FC, VO2 e Slope. Conclusão: O ciclo NO-cGMP parece desempenhar papel importante no controle da pressão arterial em TX. Sendo que, a inibição da PDE5 parece apresentar efeitos benéficos no controle da hipertensão arterial em TX, podendo ser utilizada concomitantemente a terapia anti-hipertensiva usual. / Background: Systemic hypertension (SH) can be associated with a decrease in endothelium-dependent nitric oxide (NO). Sildenafil determines increment in cyclic guanosine monophosphate (cGMP) that a mediator of NO. However, little is known about the effects of PDE5 inhibition on 24-hour ambulatory (ABP) and exercise blood pressure, noreprinephrine (Nor) and exercise capacity, specially after heart transplantation (HT). Methods: We studied 22 HT pts that on the 1st day underwent a cardiopulmonary (CP) self-controlled treadmill 6walk test(6) and, after, an ECG monitored CP treadmill maximal exercise test(Ex) within 60 and 90 min after oral Sildenafil (Sil,50mg) or placebo(Pl) given at random, and ABP. We determined at basal position(b), last min of 6 and the peak Ex the HR(bpm), SBP and DBP (mmHg), VO2(ml/kg/min), Slope VE/VCO2, exercise time(ET, min), distance(D, Km) and Nor(pg/ml). Also, after CP tests 24-h SBP and DBP were monitored. It was repeated on the 2nd day when the cross-over was done. Seventeen pts had SH. Results: (Pl and Sil respectively), Sil reduced (p<0.05): b- SBP(138±7 vs 122±18); b-DBP(83±12 vs 78±12); 6-SBP(156± 20 vs 137± 22); 6-DBP(82±13 vs 77±14); Ex-SBP(155± 27vs 124±36); Ex-DBP(79±16 vs 66± 16); 24-h SBP(121±10 vs 114±9) and DBP(80±6 vs 76±5), daytime SBP(122±11 vs 115±9) and DBP(81± 6 vs 76±5) and nighttime SBP(119±12 vs 112±10) and DBP(78±7 vs 73±8); and increase b-Nor(483±165 vs 622±211). Sil did not change in b, 6 and EX; HR, Nor, VO2 and Slope. Conclusion: NO-cGMP pathway seems to play a role in blood pressure control in HT. The PDE5 inhibition could have potential beneficial effects on hypertensive HT in addition to antihypertensive therapy.

INTRODUÇÃO: A hipertensão arterial pulmonar associada a cardiopatias congênitas (HAP-CCg) é um tipo específico de doença vascular pulmonar com várias complicações. Os pacientes com HAP-CCg avançada são considerados inoperáveis e podem apresentar hipoxemia crônica e eritrocitose secundária devido ao desvio de sangue da direita para a esquerda através das comunicações cardíacas. O presente estudo teve como objetivo analisar a resposta a dois inibidores de fosfodiesterase 5 (iPDE 5), a saber, sildenafila e tadalafila, administrados por seis meses. Os fármacos haviam sido previamente aprovados para uso na HAP em geral. No entanto, a literatura é escassa no que diz respeito à sua utilização especificamente na HAP-CCg. Propusemo-nos a investigar potenciais efeitos destes fármacos além de suas ações como vasodilatadores. MÉTODOS: Foram incluídos 31 pacientes com HAP-CCg avançada (idade entre 10 e 54 anos). A maioria apresentava redução na saturação sistêmica de oxigênio, com hematócrito elevado. A sildenafila e a tadalafila foram administradas por via oral (respectivamente, 20 mg três vezes ao dia e dose única diária de 40 mg). A capacidade física foi avaliada pela distância percorrida em 6 minutos (teste de caminhada de 6 minutos, protocolo American Thoracic Society). A qualidade de vida relacionada à saúde foi avaliada utilizando-se o questionário genérico SF-36. Níveis circulantes de marcadores de disfunção microvascular foram analisados por ensaios imunoenzimáticos. Todas as medidas foram realizadas na condição basal, e aos três e seis meses de tratamento com iPDE 5. Utilizando casuística ampliada com análise de dados tanto de forma retrospectiva como prospectiva, investigamos variáveis com possível valor prognóstico. RESULTADOS: Os tratamentos com ambos os fármacos foram associados à melhora da capacidade física (classe funcional e distância percorrida em 6 minutos, p < 0,05), hematócrito e nível de hemoglobina (p < 0,05), e qualidade de vida relacionada à saúde (componentes físico e mental, p < 0,05). Comparados ao grupo controle, na condição basal, os pacientes apresentaram níveis plasmáticos elevados de beta-tromboglobulina (beta-TG, p=0,002), selectina P (p=0,018), ativador do plasminogênio tipo tecidual (t-PA, p=0,005) e do antígeno do fator de von Willebrand (VWF:Ag, p=0,005); a trombomodulina mostrou-se significantemente reduzida (TM, p < 0,001). A administração de tadalafila foi seguida de melhora no nível de beta-TG (p=0,004), t-PA (p=0,003) e TM (p=0,046), enquanto a selectina P modificou-se apenas com a sildenafila (p=0,034). O VWF:Ag mostrou-se com melhora significante, porém transitória, no grupo tratado com sildenafila (p=0,019). Usando casuística ampliada que incluiu pacientes de estudos anteriores de nosso grupo (coorte estendida de 75 indivíduos), analisamos dados coletados no início do seguimento para todos eles, assim como outros relacionados ao tratamento. Uma série de variáveis clínicas e laboratoriais foram testadas quanto à sua possível correlação com a sobrevida livre de evento (seguimento de nove anos). Nesta parte do estudo, os pacientes receberam não apenas iPDE 5 como tratamento para HAP. Alguns deles receberam antagonistas dos receptores de endotelina isoladamente, enquanto outros receberam estes medicamentos (bosentana, ambrisentana) em combinação com iPDE 5. Após realização de análises univariada, bivariada e multivariada foi possível a identificação de quatro preditores de prognóstico desfavorável: 1, menor tempo de exposição a fármacos específicos para HAP (p < 0,001); 2, classe funcional avançada na admissão (p=0,010); 3, função sistólica ventricular direita deprimida (p=0,010); e 4, níveis circulantes elevados de VWF:Ag (p=0,013). Menor tempo de exposição aos medicamentos específicos para HAP foi caracterizado como preditor independente de desfechos. CONCLUSÕES E COMENTÁRIOS: Com base nestas observações, concluímos que os iPDE 5 são importantes no manejo da HAP-CCg avançada. Os efeitos foram observados não apenas na capacidade física e na qualidade de vida, mas também em marcadores biológicos de disfunção microvascular, potencialmente relacionados à progressão e/ou complicações da doença. Além disso, as observações em longo prazo sugeriram que maior tempo de exposição aos fármacos para HAP (incluindo iPDE 5) foi benéfico, enfatizando a necessidade de instituição precoce das terapias. O fato de o estudo ter sido realizado apenas com fármacos de administração oral torna os resultados relevantes no que diz respeito a regiões onde o acesso a tratamentos específicos para HAP é limitado a tais modalidades / INTRODUCTION: Pulmonary arterial hypertension associated with congenital heart disease (CHD-PAH) is a particular form of pulmonary vascular disease with a number of complications. Patients with advanced CHD-PAH are deemed inoperable, and may present with chronic hypoxemia and secondary erythrocytosis due to right-to-left shunting across the cardiac communications. The present study was aimed at analyzing the response to 2 phosphodiesterase type 5 inhibitors (PDE5is), namely sildenafil and tadalafil, which were administered for 6 months. The drugs had been previously approved for management of PAH in general. However, there has been scarce literature on their use in the specific setting of CHD-PAH. We wished to investigate potential effects beyond their actions as vasodilators. METHODS: Thirty-one patients with advanced CHD-PAH were enrolled (age 10 to 54 years). Most of them had systemic oxygen desaturation with elevated hematocrit. Sildenafil and tadalafil were administered orally (respectively, 20 mg t.i.d and single daily dose of 40 mg). The physical capacity was assessed by registering the 6-minute walked distance (6-minute walk test, American Thoracic Society protocol). Health-related quality of life was assessed using the SF-36 generic questionnaire. Circulating levels of microvascular dysfunction markers were analyzed by enzyme-linked immunoassays. All measurements were performed at baseline, 3 months and 6 months of PDE5i administration. Using a larger patient population with retrospective as well as prospective data analysis, we looked for potential predictors of prognosis. RESULTS: Both therapies were associated with improvement of the physical capacity (functional class and 6-minute walked distance, p < 0.05), hematocrit and hemoglobin level (p < 0.05), and health-related quality of life (physical and mental components, p < 0.05). Compared to controls, patients had elevated baseline plasma levels of beta-thromboglobulin (beta-TG, p=0.002), P-selectin (p=0.018), tissue-type plasminogen activator (t-PA, p=0.005) and von Willebrand factor antigen (VWF:Ag, p=0.005), while thrombomodulin was importantly reduced (TM, p < 0.001). Tadalafil administration was followed by improvement of beta-TG (p=0.004), t-PA (p=0.003) and TM level (p=0.046), while P-selectin was improved by sildenafil only (p=0.034). VWF:Ag improved significantly, but only transiently in the sildenafil group (p=0.019). Using an extended population which included additional patients from previous studies of ours (the extended cohort consisted of 75 individuals), we analyzed data collected at the beginning of follow-up for all subjects, and treatment-related data as well. A number of clinical and laboratory parameters were tested for their possible correlation with event-free survival (9-year survival analysis). In this part of the study, patients were on monotherapy or combination therapy with PDE5is (sildenafil or tadalafil) and endothelin receptor antagonists (bosentan or ambrisentan). Univariate, bivariate and multivariate analyses were used to identify four predictors of a more worrisome prognosis: 1, a shorter time of exposure to specific PAH therapies (p < 0.001); 2, an advanced functional class at entry (p=0.010); 3, a depressed right ventricular systolic function (p=0.010); and 4, high circulating levels of VWF:Ag (p=0.013). A shorter exposure to PAH therapies was characterized as an independent predictor of poor outcome. CONCLUSIONS AND COMMENTS: Our observations point towards beneficial effects of PDE5is in advanced CHD-PAH. Importantly, the observed effects were not only on the physical capacity, and quality of life, but also biological markers of microvascular injury potentially related to disease progression and/or complications. Furthermore, long-term patient observation showed that a longer exposure to PAH drugs (including PDE5is) was beneficial, thus emphasizing the need for early initiation of therapies. Because only oral drugs were used, results may be relevant for countries and regions with limited access to PAH-specific medications

A doença de Niemann-Pick tipo C (NPC) é uma esfingolipidose autossômica recessiva que se caracteriza pelo acúmulo lisossômico de colesterol não-esterificado em vários tecidos, resultando em neurodegeneração progressiva, hepatoesplenomegalia e paralisia ocular vertical, entre outros sintomas. Sua manifestação ocorre geralmente entre a metade da infância e a adolescência. A morte ocorre geralmente até a terceira década de vida. Associado à sintomatologia clínica, o diagnóstico de NPC é realizado através do teste de Filipin em fibroblastos cultivados, que demonstra um intenso padrão de fluorescência perinuclear, consistente com o acúmulo de colesterol nãoesterificado. Alguns pacientes, referidos como NPC variantes, apresentam quadro clínico compatível com NPC, mas resultados inconclusivos nos testes bioquímicos, com fluorescência não característica no teste de Filipin, tornando problemático o diagnóstico. O objetivo deste trabalho foi desenvolver técnicas objetivas capazes de auxiliar na confirmação do diagnóstico de NPC, quando um fenótipo apresentar característica indefinida/variante ao teste de Filipin, tais como: quantificação do padrão de fluorescência perinuclear quanto ao número de pixels em pacientes com fenótipo clássico (NPC cl) e variante (NPC var) de NPC, comparando-os entre si e com controles saudáveis (CS); medida da quantidade de colesterol citoplasmático em fibroblastos dos dois grupos de pacientes; medida da atividade das enzimas esfingomielinase ácida (ASM), quitotriosidase (QT), beta-glicosidase ácida (GBA) e beta-galactosidase (GLB). Todos estes parâmetros foram comparados com aqueles de CS. Os resultados mostraram que a quantificação da fluorescência do colesterol no teste de Filipin nos três grupos estudados através do número de pixels da imagem, é um método prático e não subjetivo que demonstrou uma diferença significativa entre o acúmulo de colesterol intracelular em CS, NPC cl e NPC var, confirmando a eficácia do método para o esclarecimento de padrões duvidosos. A dosagem de colesterol intracelular em fibroblastos de NPC apresentou-se sete vezes maior no padrão clássico e quatro vezes maior no variante, do que aquela encontrada nos CS. Com esses dados, a dosagem intracelular de colesterol mostra-se um bom parâmetro quantitativo para auxiliar no teste de Filipin quando este apresentar padrão de fluorescência apenas moderado. A medida da atividade da ASM tanto em leucócitos quanto em SPF não apresentou diferenças estatisticamente significativas entre os grupos estudados, embora seja aparente a diminuição na atividade desta enzima no fenótipo NPC cl. Com os valores obtidos para a medida da atividade da QT em plasma e SPF, verificamos que não houve diferença significativa entre os dois grupos NPC mas sim entre estes e os CS, demostrando que tanto os indivíduos com o fenótipo clássico quanto com o variante possuem uma atividade aumentada desta enzima. A análise da atividade da GBA em leucócitos não apresentou diferenças significativas entre os três grupos, embora sua atividade em NPC cl pareça maior do em CS. Já na análise em SPF, esta diferença foi estatisticamente confirmada. A atividade da GLB em leucócitos não apresentou diferenças entre os grupos estudados, embora esta pareça maior nos grupos NPC do que em CS. / Niemann-Pick disease Type C (NPC) is an autosomal recessive sphingolipidosis which is characterized by a lysosomal accumulation of unesterified cholesterol in various tissues, resulting in progressive neurodegeneration, hepatosplenomegaly and vertical eye paralysis, among other symptoms. Its onset occurs commonly between middle childhood and adolescence. Death occurs usually until the third decade of life. Along with the clinical symptoms, the diagnosis of NPC is accomplished by Filipin test in cultured fibroblasts, showing an intense perinuclear staining pattern, which is consistent with the accumulation of unesterified cholesterol. Some patients, referred to as NPC variants, present a clinical picture of NPC, but inconclusive results in biochemical tests, with no characteristic fluorescence in Filipin test, which makes the diagnosis problematic. The objective of this study was to develop objective techniques that can assist in confirming the diagnosis of NPC, when the phenotype shows undefined/variant characteristics to Filipin test, such as: quantification of perinuclear fluorescence pattern based on pixels' luminosity pattern in patients with classical (NPC cl) and variant (NPC var) NPC phenotype, comparing them among themselves and with healthy controls (CS); the amount of cytoplasmic cholesterol in fibroblasts of both groups of patients; measurement of the activity of the enzymes acid sphingomyelinase (ASM), chitotriosidase (CT), beta-glucosidase acid (GBA), and beta-galactosidase (GLB). All of these parameters were compared with those of CS. The results showed that the fluorescence quantitation of cholesterol in the Filipin test, for the three studied groups, by counting the number of image pixels, is a practical and non-subjective method, which showed a significant difference between the accumulation of intracellular cholesterol in CS, NPC cl and NPC var, confirming its effectiveness to clarify dubious patterns. Measures of intracellular cholesterol in NPC fibroblasts showed seven times higher in classic and four times higher in variant pattern, than that found in CS. With these data, the dosage of intracellular cholesterol appears to be a good parameter to aid in the quantitative Filipin test when it presents only a moderate fluorescence pattern. The measurement of ASM activity in both leukocytes and in SPF did not show statistically significant differences between the groups, despite the remarkable decrease in the enzyme's activity in NPC cl phenotype. With the data obtained for QT's activity in plasma and SPF, we found that there was no significant difference between the two NPC groups, but a significant one between the NPC and the CS, demonstrating that both individuals with the classical phenotype and with the variant one have an increased activity of this enzyme. The analysis of GBA activity in leukocytes showed no significant differences among the three groups, although its activity in NPC cl seemed to be greater than in CS. In the SPF analysis, this difference was statistically confirmed. The activity of GLB in leukocytes did not differ between the groups, although it seems greater in the NPC group than in CS.

Submitted by Carlos Alberto Arcaro Filho (carlos_arcaro@hotmail.com) on 2018-07-13T23:08:25Z No. of bitstreams: 1 Tese Final - Carlos Alberto Arcaro Filho.pdf: 7378512 bytes, checksum: cb295c066a7be41be3508e2daf64d24f (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Irani Coito null (irani@fcfar.unesp.br) on 2018-07-16T13:17:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 arcarofilho_ca_dr_arafcf_int.pdf: 7378512 bytes, checksum: cb295c066a7be41be3508e2daf64d24f (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-16T13:17:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arcarofilho_ca_dr_arafcf_int.pdf: 7378512 bytes, checksum: cb295c066a7be41be3508e2daf64d24f (MD5) Previous issue date: 2018-04-27 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Considerando os avanços no conhecimento acerca dos mecanismos que controlam o metabolismo de proteínas na musculatura esquelética que permitiram a busca por novas opções para o tratamento das atrofias musculares, o presente estudo teve como objetivo a compreensão do potencial antiproteolítico de inibidores de fosfodiesterase, PDE (pentoxifilina, inibidor não-seletivo de PDE; rolipram, inibidor seletivo de PDE4) em músculos esqueléticos de ratos submetidos à atrofia muscular devido à insuficiência insulínica (diabetes mellitus experimental), com ênfase na elucidação da participação de componentes da sinalização do AMP cíclico (AMPc) nesta resposta. Ratos normais e diabéticos (60 mg/kg de estreptozotocina, administração intravenosa) foram tratados com salina (NS e DS) ou com 2 mg/kg de rolipram (NROL e DROL), ou com 25 mg/kg de pentoxifilina (NPTX e DPTX) durante 3 dias, por via intraperitoneal. Após três dias de tratamento, músculos soleus e extensor digitorum longus (EDL) foram removidos, pesados, congelados e processados para diversas análises: (i) conteúdo de AMPc (ensaio imunoenzimático); (ii) atividades das proteases proteassoma, calpaínas e caspase-3 (uso de substratos específicos fluorigênicos); (iii) níveis proteicos e/ou níveis de fosforilação de componentes das vias proteolíticas, efetores intracelulares sinalizatórios e fatores de transcrição (Western blotting); (iv) determinação dos níveis séricos de insulina e citocinas pró-inflamatórias. Foram realizados experimentos ex-vivo, para verificar a ação direta dos fármacos no controle da proteólise muscular e ativação de efetores intracelulares, via incubações dos músculos na presença de rolipram ou de agonistas de EPAC (Exchange protein directly activated by cAMP) e de PKA (proteína quinase dependente de AMPc), proteínas efetoras ativadas pelo AMPc. Também foram realizados experimentos no Laboratório do Prof. Dr. Marco Sandri, no Venetian Institute of Molecular Medicine, Padova, Itália, para a avaliação do papel de PDE4D no controle do processo autofágico-lisossomal em músculos esqueléticos de camundongos jejuados. Os tratamentos de animais diabéticos com rolipram (DROL) ou com pentoxifilina (DPTX) promoveram uma redução nas atividades do proteassoma e calpaínas em soleus e EDL, bem como nos níveis de componentes-chave do sistema proteolítico ubiquitina-proteassoma (MuRF-1, atrogin-1, conjugados poliubiquitinados), e aumento nos níveis de calpastatina (inibidor das calpaínas). Interesante ressaltar que o grupo DROL apresentou redução na atividade e níveis proteicos de caspase-3, em ambos os músculos, enquanto que o grupo DPTX apenas em músculos EDL. Contribuindo com a redução observada na atividade de caspase-3, houve uma redução nos níveis de Bax (proteína pró-apoptótica) e aumento nos níveis de Bcl-2 (proteína anti-apoptótica) em ambos os músculos de animais DROL. Animais diabéticos tratados com salina (DS) apresentaram aumento nas atividades das três proteases, bem como nos níveis de componentes participantes destes processos proteolíticos. Animais normais e diabéticos tratados com salina (NS e DS) apresentaram níveis de AMPc basais e semelhantes entre si, tanto em soleus quanto em EDL, enquanto que os tratamentos de ratos normais e diabéticos com pentoxifilina (NPTX e DPTX) ou rolipram (NROL e DROL) promoveram aumentos de AMPc, em ambos os músculos. Um dos mecanismos que podem estar envolvidos na inibição da proteólise muscular após aumentos nas concentrações de AMPc envolve a proteína EPAC, responsável por integrar a sinalização do AMPc e a sinalização insulínica via ativação da quinase AKT. Animais diabéticos tratados com pentoxifilina ou com rolipram apresentaram aumento nos níveis proteicos de EPAC 1 e na fosforilação de AKT, quando comparados ao grupo DS. Observamos também um aumento na fosforilação inibitória de fatores de transcrição FoxO 1 e 3a em ambos os músculos de animais DROL. Podemos sugerir que parte das ações de rolipram que culminaram em ativação de AKT e inibição de FoxO na musculatura esquelética possam estar associadas aos aumentos observados nos níveis circulantes de insulina em animais DROL. Investigamos, apenas nos animais tratados com rolipram, a possibilidade de participação da proteína PKA no controle da proteólise muscular. Em animais DROL houve ativação da PKA, verificada tanto pelo aumento na fosforilação de substratos de PKA, bem como do fator de transcrição CREB, em soleus e EDL. Vale destacar que animais DS apresentaram níveis reduzidos de p-CREB e de substratos fosforilados por PKA em soleus e EDL. Animais diabéticos tratados com os inibidores de PDE apresentaram uma diminuição de citocinas pró-inflamatórias séricas (TNF-, PTX e ROL; IL-1, ROL) e aumento nos níveis de insulina sérica (ROL) em relação aos animais DS. Nos estudos ex vivo, as incubações de músculos soleus e EDL com rolipram levaram a uma redução da proteólise total, bem como aumento na fosforilação de substratos de PKA e de AKT. Músculos soleus e EDL incubados com agonistas de EPAC apresentaram aumento na fosforilação de AKT, enquanto que a incubação com agonista de PKA promoveu aumento na fosforilação dos substratos de PKA (em ambos os músculos) e aumento na fosforilação de AKT (apenas em EDL), quando comparados aos músculos incubados na ausência do fármaco. Nos estudos para compreensão do papel de PDE4D no controle do processo autofágico-lisossomal, observou-se que o silenciamento gênico da PDE4D em músculos tibialis anterior promoveu uma preservação da massa muscular e da área da fibra em animais jejuados, quando comparados ao músculo controle. Músculos flexor digitorium brevis, silenciados para PDE4D, apresentaram diminuição na expressão de proteínas-chave do processo autofágico-lisossomal, tais como LC3 e p62. Estes resultados evidenciam os mecanismos que podem estar envolvidos na ação direta de inibidores de PDE no controle do metabolismo proteico muscular esquelético, via ativação de duas vias dependentes de AMPc: (i) a via PKA/CREB, que pode participar do controle da transcrição de Bcl-2 e calpastatina, bem como na inativação direta de caspases, inibindo assim os processos proteolíticos dependentes de caspase-3 e calpaínas, (ii) a via EPAC/AKT, via fosforilação e inibição de FoxO 1 e 3A, regulando a expressão dos atrogenes (MuRF-1 e atrogin-1) e promovendo uma diminuição na atividade do sistema ubiquitina-proteassoma. Além disso, o tratamento com inibidores de PDE diminuem o processo inflamatório e aumentam os níveis circulantes de insulina, ações que podem contribuir para os efeitos antiproteolíticos. Evidências iniciais também sugerem que PDE4D participa no controle do sistema autofágico-lisossomal na musculatura esquelética. Todos estes resultados indicam que PDE participam no controle de processos proteolíticos, portanto inibidores de PDE emergem como uma opção interessante na ativação da sinalização do AMPc na musculatura esquelética, com vistas à utilização futura no tratamento de quadros de perda de massa muscular durante situações de atrofia. / Considering the advances in the knowledge of the mechanisms controlling the protein metabolism in skeletal muscles that allowed the discover of new options for the treatment of muscle atrophies, the present study aimed to understand the antiproteolytic potential of phosphodiesterase (PDE) inhibitors (pentoxifylline, a non-selective PDE inhibitor; rolipram, a selective PDE 4 inhibitor), in skeletal muscles of rats submitted to muscle atrophy due to insulin insufficiency (experimental diabetes mellitus), with emphasis on the elucidation of the participation of cyclic AMP (cAMP) signaling components. Normal and diabetic rats (60 mg/kg streptozotocin, intravenous administration) were treated intraperitoneally with saline (NS and DS) or with 2 mg/kg rolipram (NROL and DROL) or with 25 mg/kg pentoxifylline (NPTX and DPTX) for 3 days. After three days of treatments, soleus and extensor digitorum longus (EDL) muscles were removed, weighed, frozen and processed for several analyzes: (i) cAMP content; (ii) activities of proteasome, calpain and caspase-3 (use of specific fluorigenic substrates); (iii) protein levels and/or phosphorylation levels of components of proteolytic pathways, intracellular signaling effectors and transcription factors (Western blotting); (iv) determination of serum insulin and proinflammatory cytokines levels. Ex vivo experiments were performed to verify the direct action of the drugs in the control of muscle proteolysis and activation of intracellular effectors, via muscle incubations in the presence of rolipram or agonists of EPAC (Exchange protein directly activated by cAMP) and PKA (cAMP-dependent protein kinase), intracellular effectors activated by cAMP. Experiments were also carried out in the Laboratory of Prof. Dr. Marco Sandri at the Venetian Institute of Molecular Medicine, Padova, Italy, for the evaluation of the role of PDE4D in controlling the autophagic-lysosomal process in skeletal muscles of starved mice. Treatments of diabetic animals with rolipram (DROL) or pentoxifylline (DPTX) promoted a reduction in the activities of proteasome and calpain in soleus and EDL, as well as reduced the levels of key components of the ubiquitin-proteasome system (MuRF-1, atrogin-1, polyubiquitinated conjugates), and increased the levels of calpastatin (calpain inhibitor). Interestingly, DROL rats showed a reduction in the activity and in the protein levels of caspase-3 in both muscles, whereas DPTX rat had reductions only in EDL muscles. Contributing to the reduction in caspase-3 activity, it was observed a reduction in the content of Bax (pro-apoptotic protein) and an increase of Bcl-2 (anti-apoptotic protein) in both muscles of DROL rats. Diabetic animals treated with saline (DS) showed an increase in the activities of the three proteases, as well as increases in the levels of components belonging to these proteolytic processes. Normal and diabetic animals treated with saline (NS and DS) had basal and similar levels of cAMP in both soleus and EDL, whereas the treatments of normal and diabetic rats with pentoxifylline (NPTX and DPTX) or with rolipram (NROL and DROL) promoted increases in cAMP in both muscles. One of the mechanisms that may be involved in the muscle proteolysis inhibition after increases in cAMP involves the EPAC protein, responsible for integrating the cAMP and the insulin signaling pathways via AKT activation. Diabetic animals treated with pentoxifylline or with rolipram showed an increase in the protein levels of EPAC 1 and in the phosphorylation of AKT, when compared with the DS group. We also observed an increase in the phosphorylation (inhibitory) of FoxO 1 and 3a in both muscles of DROL rats. It can be suggested that part of the rolipram actions causing AKT activation and FoxO inhibition in skeletal muscles may be associated with the increases in the circulating levels of insulin observed in DROL animals. It was investigated, only in animals treated with rolipram, the possible involvement of PKA in the control of muscle proteolysis. DROL rats had activation of PKA, verified both by the increase in the phosphorylation of PKA substrates, as well as in the phophorylation of the transcription factor CREB, in soleus and EDL. DS rats had decreased levels of p-CREB and of the PKA substrates, in soleus and EDL. Diabetic animals treated with PDE inhibitors showed a decrease in serum proinflammatory cytokines (TNF-, PTX and ROL; IL-1, ROL) when compared with DS. In ex vivo studies, incubations of soleus and EDL with rolipram caused a reduction of the total proteolysis as well as an increase in the phosphorylation of PKA substrates and and of AKT. Soleus and EDL muscles incubated with EPAC agonist showed increased in the AKT phosphorylation, whereas incubation with PKA agonist promoted an increase in the phosphorylation of PKA substrates (in both muscles) and and increase in the AKT phosphorylation (EDL), when compared with muscles incubated in the absence of the drugs. In studies to understand the role of PDE4D in the control of the autophagic-lysosomal process, it was observed that the PDE4D gene silencing in anterior tibialis muscles caused a preservation of the muscle mass and fiber area in fasted animals when compared with control muscle. Flexor digitorium brevis muscles, silenced for PDE4D, showed a decreased expression of key proteins of the autophagic-lysosomal process, such as LC3 and p62. These results suggested the mechanisms that may be involved in the direct action of PDE inhibitors in the control of skeletal muscle protein metabolism, through activation of two cAMP-dependent pathways: (i) the PKA/CREB pathway, which may participate in transcriptional control of Bcl-2 and calpastatin, as well as causing direct inactivation of caspases, thus inhibiting the proteolytic processes dependent on caspase-3 and calpains, (ii) the EPAC/AKT pathway, via phosphorylation and inhibition of FoxO 1 and 3a factors, regulating the expression of atrogenes (MuRF-1 and atrogin-1) and promoting a decrease in activity of ubiquitin-proteasome system. Treatments with PDE inhibitors also decreased the inflammatory process and increased the circulating linsulin levels, which may be contributing to the antiproteolytic responses. Initial evidence also suggests that PDE4D participates in the control of the autophagy-lysosomal system in skeletal muscles. All these results indicate that PDE participate in the control of proteolytic processes, therefore PDE inhibitors emerge as an interesting option to activate the cAMP signaling in the skeletal muscles, which may be used in the future in treatments muscle mass loss during atrophy situations. / FAPESP: Processo 2013/18861-2 / FAPESP: Processo 2014/12202-0 / FAPESP: Processo 2017/02348-5