Las estrategias biotecnológicas presentan un alto potencial para el control de plagas de insectos; una de ellas, es el silenciamiento de genes mediado por ARN de interferencia (ARNi), que se aplica contra genes importantes en la viabilidad del insecto. Entre las principales ventajas, se menciona, su uso como alternativa de los pesticidas, además de poder desarrollarse para un ataque específico contra la especie blanco. Para una futura implementación en campo, se debe contar con una serie de pasos técnicos estandarizados, entre los cuales involucra la producción de ARN de doble cadena (ARNdc), que es la molécula inductora del mecanismo de ARNi. En este trabajo se presenta una metodología de clonación de genes para la síntesis de ARNdc en bacterias a partir de secuencias de genes del insecto Prodiplosis longifila Gagné, plaga principal de los cultivos de espárrago en el Perú. Se utiliza la técnica TA cloning, en la que se aprovecha la actividad transferasa terminal de la enzima polimerasa de Thermus aquaticus para modificar los productos de PCR. El vector modificado para esta técnica se obtuvo a partir del vector LITMUS 38i, al que se linearizó y se le agregó un nucleótido de timina. Los resultados muestran que la metodología permitió clonar, en corto tiempo, secuencias provenientes de 18 genes del insecto, resultando así en una metodología conveniente para su uso en la producción de ARNdc en estrategias de ARNi. / Tesis

Propone un nuevo conjunto de 10 polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) utilizando un total de 249 genomas de Mycobacterium tuberculosis (MTB), que por primera vez se seleccionaron basándose en el principio de inclusión/exclusión (IE) utilizando datos de Spoligotyping y filogenia, seguido de la selección de SNPs no sinónimos presentes en clúster de grupos ortólogos (COG) más conservados de cada genotipo de MTB. La asignación del genotipo utilizando el nuevo conjunto de 10 SNPs fue validado con 34 genomas de MTB adicionales y los resultados mostraron una correlación del 100% con sus genotipos ya conocidos. Nuestro conjunto de 10 SNPs no ha sido reportado previamente y abarca los genotipos de MTB que son más prevalentes en todo el mundo. Este conjunto de SNPs proporciona una resolución superior a las técnicas actuales y podría ser utilizado en epidemiología molecular con marcadores resistentes a fármacos, determinando los factores de riesgo en la transmisión de la tuberculosis en diferentes poblaciones para desarrollar estrategias para el control de esta enfermedad. / Tesis

Explora la genética poblacional de Plasmodium vivax en la comunidad de Santa Emilia (Iquitos, Loreto), una comunidad aislada en medio de la Amazonía Peruana. Para ello, se realizó un seguimiento de un año a un total de 213 habitantes de la comunidad, a partir de los cuales se seleccionaron 103 muestras, y se identificó una elevada proporción de infecciones asintomáticas (74%) y no detectables por microscopía (72%). A pesar del aislamiento geográfico, la diversidad genética encontrada en Santa Emilia (He=0.61) fue comparable con la reportada en otras localidades de la Amazonía que presentan menores restricciones de flujo génico. No obstante, también se encontró niveles significativos de desequilibrio de ligamiento (ISA=0.19, p<0.001). Diversos análisis de estructuración y diferenciación genética revelaron la presencia de 4 subpoblaciones de P. vivax en Santa Emilia, y a su vez se detectó la ocurrencia de expansiones clonales. Los hallazgos de este estudio sugieren que Santa Emilia representaría un riesgo importante para la reintroducción y mantenimiento de la malaria en otras localidades de la Amazonía Peruana, por lo cual sería necesario la implementación de estudios a mayor escala y la combinación de distintas estrategias para el control de la enfermedad. / Tesis

La malaria causada por Plasmodium vivax es la más predominante en los diferentes casos reportados en el Perú, siendo característico las infecciones asintomáticas y las muestras con baja parasitemia. La poca cantidad de ADN parasitario que se recupera de muestras de baja parasitemia de P. vivax (sub-microscópicas) limita la inclusión de esta población parasitaria en estudios de genética y genómica de poblaciones. La subestimación de la diversidad genética sesga el entendimiento de la transmisión de P. vivax, especialmente en condiciones de baja endemicidad, donde las infecciones sub-microscópicas son predominantes. Diferentes métodos han sido desarrollados para sobrellevar este problema, siendo la Amplificación selectiva del genoma completo (SWGA) una herramienta promisoria. Sin embargo, su efectividad aún no ha sido reportada en muestras de baja parasitemia de P. vivax. El objetivo de la tesis fue optimizar y estandarizar preliminarmente el método SWGA en muestras sub-microscópicas o de baja concentración de ADN de P. vivax. Para ello, se modificaron las condiciones del ciclado y componentes del método propuesto por Cowell et al. (2017) para mejorar el enriquecimiento de ADN parasitario, se calculó la cantidad mínima de ADN para una amplificación genómica exitosa, se evaluó la fidelidad del SWGA y se aplicó el método optimizado en ADN almacenado (-20°C) de 20 muestras de campo. Primero se modificaron diferentes componentes y parámetros del método SWGA, se cuantificó el ADN parasitario y humano por PCR tiempo real antes y después de la amplificación genómica; así se calculó el enriquecimiento del ADN parasitario. El método optimizado permitió que las muestras del panel (muestras simuladas) incrementaran su concentración de ADN parasitario (>805 veces) y porcentaje de ADN parasitario (>218 veces) en comparación a su estado inicial. La concentración mínima de ADN parasitario, para generar una amplificación genómica exitosa de más 1200 moléculas/µL, fue 1.29 moléculas/µL. Luego de la aplicación del método SWGA optimizado, el 97.22% de todos los alelos no presentaron diferencias en sus tamaños y solo hubo una pérdida de datos del 3.57%. El 80% de la muestras de campo tuvieron una amplificación genómica exitosa. Se demostró que el método optimizado mejoró su desempeño en el enriquecimiento del ADN de P. vivax a partir de ADN total, provenientes de muestras de baja densidad parasitaria, y así permitió una mayor cobertura de las muestras para ser incluidas en los análisis genéticos. / International Center of Excellence for Malaria Research / VLIR-UOS / Universidad Peruana Cayetano Heredia (Lima) / Tesis

El desarrollo neural ocurre mediante el proceso de neurulación originando el sistema nervioso central y la médula espinal. Durante este proceso las células de la cresta neural (CCN) son especificadas en la región más dorsal del tubo neural; posteriormente, las CCN delaminan del epitelio neural, migran a diferentes regiones del embrión y se diferencian en diversos tipos celulares. Defectos en el desarrollo del tubo neural y de las CCN generan desórdenes congénitos como espina bífida, encefalocelia, y neurocristopatías (paladar-labio hendido, albinismo, entre otras). Una vitamina importante durante el desarrollo embrionario temprano es el folato, el cual se encuentra en el sistema circulatorio en forma de 5-metiltetrahidrofolato (5-MTHF) e ingresa a la célula por medio del receptor de membrana FOLR1 y el transportador RFC1. El 5-MTHF participa en la síntesis de nucleótidos y en la generación de Sadenosilmetionina (SAM) para la metilación de ácidos nucleicos y proteínas. La metilación de ácidos nucleicos y proteínas son importantes mecanismos de regulación epigenética durante el normal desarrollo embrionario de los vertebrados. Considerando lo dicho se plantea determinar el efecto epigenético de la deficiencia del folato en el desarrollo del tubo neural y de las CCN. Para esto realizamos la pérdida de función del receptor FOLR1 y transportador RFC1 mediante el uso de los morfolinos FolR1spMO y RFC1spMO en embriones de pollo. Posteriormente se evalúan los niveles de 5mC en el ADN y 6mA en el ARN mediante dot blots, observando una clara disminución en ambas marcas epigenéticas. El análisis de expresión del marcador de CCN Sox10 en embriones inyectados evidenció una disminución en el número de CCN. Adicionalmente, el marcador neural Sox2 presentó una expresión ectópica en el territorio de las CCN. Estos resultados muestran que la deficiencia de folato afecta la metilación global del ADN y ARN generando un cambio en el destino celular de los progenitores de las CCN hacia un destino neural. Los resultados obtenidos pueden sentar las bases para un mejor entendimiento y desarrollo de tratamientos capaces de prevenir o disminuir las anomalías ocasionadas por la deficiencia de folato en mujeres embarazadas. / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Determina la participación de la proteína ADAM17 en la muerte de células germinales masculinas meióticas y post-meióticas inducida por shock térmico y etopósido, la cual cobra mayor importancia en la salud pública de la sociedad moderna debido al incremento a la exposición cotidiana a altas temperaturas en los testículos, así como tratamientos con medicamentos contra el cáncer. Con la finalidad de establecer una relación con los seres humanos y lograr extrapolar los resultados, emplea un modelo animal, el ratón. Para ello se cuenta con individuos machos de ratón de 21 días de edad para cada grupo a evaluar, de los genotipos salvaje, heterocigoto y Knock-out para la metaloproteasa ADAM17 en células germinales meióticas y post-meióticas. Intentado simular una exposición aguda a altas temperaturas como a tratamiento con etopósido. Con los resultados de este trabajo se espera aportar información científica en este problema de salud pública que aún no está resuelto. / Tesis

Se caracterizó genéticamente 136 peruanos mestizos de las regiones norte, centro y sur del Perú, empleando un conjunto de 30 marcadores autosómicos no codificantes de inserción y deleción denominados INDELs. Se evaluó la diversidad genética como una medida de la heterosigosidad media en la población y se obtuvieron las frecuencias alélicas y genotípicas para los 30 marcadores estudiados. De los análisis de varianza molecular (AMOVA) y distancias genéticas entre poblaciones (Fst) no se observó diferencias significativas entre los grupos norte, centro y sur del Perú, pero si una alta diversidad genética a nivel de individuos (97.86%), es decir que la población mestiza del Perú se presenta en estos análisis como una unidad poblacional sin subestructura genética. Ninguno de los 30 marcadores INDELs mostraron desviaciones al Equilibrio de Hardy–Weinberg. Por otro lado los análisis de estructura poblacional en el Perú no muestran algún grado de agrupamiento que evidencie subestructura, sin embargo a una escala intercontinental se realizó una comparación con datos que emplearon el mismo sistema de marcadores en la población de España, País Vasco y Uruguay resultando un valor de K igual a 02 (dos), donde se observa que el Perú se muestra como un grupo poblacional con muy poco componente genético español a diferencia de Uruguay donde el componente español es predominante. De estos resultados se infiere que la población peruana posee mayormente un componente genético americano nativo que podría ser andino o amazónico. Adicionalmente se evaluó los parámetros estadísticos de interés forense. Este sistema de 30 marcadores muestra un alto Poder de Discriminación ( 99.99999999%) y una baja probabilidad de coincidencia (0.00000000001426561820), estas variables son importantes en genética forense ya que posee una alta capacidad de discriminar un perfil genético de ADN de otro que se haya encontrado en la misma escena del crimen, adicionalmente al poseer una baja probabilidad de coincidencia significa que la probabilidad de que dos individuos no relacionados tengan el mismo perfil genético en la escena del crimen es prácticamente cero. / Tesis

Determina la capacidad virulenta de una cepa aislada de la vesícula biliar de un cuy, con signos compatibles con salmonelosis, para identificar sus genes asociados a virulencia y resistencia a antibióticos. En este estudio, el genoma completo de S. Typhimurium cepa VET1 se sometió a un análisis in silico, que comenzó con el secuenciamiento mediante la plataforma Illumina HiSeq para generar lecturas de 2 × 101 pb. La calidad de los datos se verificó con FASTQC y los adaptadores fueron recortados con Trimmomatic. Las lecturas fueron ensamblados usando Velvet v.1.2.10 y se generaron 149 contigs con una cobertura de 111.0x, que dio como resultado un tamaño total del genoma de 4 905041 pb, con un contenido de G + C del 52.14%. La anotación génica mostró 4 885 genes, de los cuales 4 630 fueron CDS y 255 ARN, incluyendo 2 de ARNr, 56 ARNr y 197 ARNnc. Usando PHASTER, se identificaron tres regiones de profagos, incluyendo Gifsy-2, 118970_sal3 y RE-2010. La cepa VET1 fue asignada a ST19 utilizando el tipo de secuencia multilocus (MLST). Se identificó un total de 244 factores de virulencia. Entre ellos, 78 pertenecían a genes codificadores del sistema de secreción tipo 3 (T3SS), 68 a genes codificadores de la adherencia fimbrial y 51 a genes que codifican flagelos. Se consultó la base de datos CARD para identificar genotipos relacionados con la resistencia en el genoma de S. Typhimurium VET1. Se identificaron un total de 16 proteínas relacionadas a resistencia antimicrobiana, que pertenecen a 6 familias diferentes de genes de resistencia a antibióticos. Este estudio mostró que la cepa VET1 alberga genes que codifican adhesinas, proteínas flagelares, T3SS, sistemas de adquisición de hierro y genes de resistencia a antibióticos que pueden explicar la patogenicidad, capacidad de colonización y persistencia en el cuy. La existencia de elementos genéticos móviles sugiere que esta cepa podría adquirir y transferir material genético. El análisis genómico comparativo entre VET1 y otras cepas de Salmonella proporcionaría información fructífera para comprender la especificidad del huésped y desarrollar medidas de control contra la infección por S. Typhimurium. / Perú. Ministerio de la Producción. Programa Nacional de Innovación para la Competitividad y Productividad (Innóvate Perú) / Tesis

Busca aplicar la metodología del Código de Barras utilizando dos regiones del ADN cloroplastídico y una región nuclear para identificar varias especies de los géneros Piper y Cinchona distribuidas a lo largo del territorio peruano. Se trabajó con material fresco y herborizado, que fue colectado y procesado por el Museo de Historia Natural de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Se analizaron 209 muestras de herbario y 118 muestras frescas colectadas en 7 departamentos del Perú. Al usar de manera individual los marcadores rbcL y matK, la distancia genética interespecifica usando el modelo de evolución de Kimura de 2 parámetros (K2p) no fue significativa para ninguno de los dos géneros (distancia de K2p ≤ 0,01), por lo que se procedió a combinar las dos regiones, mejorando ligeramente la variabilidad entre especies para ambos géneros (distancia de K2p ≤ 0,015). La región del genoma nuclear ITS2 fue incluida en el análisis dando como resultado un mayor poder discriminativo entre las especies del género Piper teniendo una distancia genética ≥ 0,05. En contraste, las especies del genero Cinchona siguieron presentando poca variabilidad interespecifica. Nuestros resultados indicarían que el empleo de los marcadores Barcode universales rbcL y matK, serían insuficientes para discriminar entre especies de los géneros Piper y Cinchona, siendo necesario el uso adicional de una o más regiones para tener un mejor valor discriminativo. / Tesis

Lepidium meyenii, Walpers, conocido mundialmente como “maca”, es un tubérculo nativo de los Andes del Perú, que vive en regiones a más de 4000 msnm. Es reconocida mundialmente y ha sido objeto de numerosos estudios por muchas propiedades terapeúticas, afrosidiacas, entre otras que se le atribuyen; siendo alguna de estas ya verificadas científicamente. Su participación como inmunomodulador también ha sido estudiada, llegándose a encontrar efectos protectores, anticancerígenos; sin embargo, aún existe controversia sobre su participación en procesos inflamatorios. Es por eso que el objetivo de la presente investigación fue verificar su efecto sobre la producción de mRNA y secreción de TNF-α, una citoquina clave en los procesos inflamatorios, además de otros intermediarios como óxido nítrico (NO) y anión superóxido en células mononucleares de sangre periférica humana. Para esto se preparó un extracto metanólico (EM), partiendo de harina de hipocótilo deshidratado del ecotipo morado de maca. Se realizaron pruebas de viabilidad, a través de la reducción del MTT. El óxido nítrico fue medido utilizando la reacción de Peter Griess, mientras que el “estallido respiratorio” fue cuantificado a partir de la reducción del nitroblue tetrazolio (NBT). La expresión génica y secreción de TNF-α fueron evaluadas por un análisis cualicuantitativo a partir de PCR convencional, y ELISA tipo sándwich, respectivamente. Los resultados mostraron que el EM no afectó la viabilidad celular, ni estimuló significativamente la producción del anión superóxido. Sin embargo, se demostró un aumento dosis-dependiente de la producción de NO y TNF-α. Los hallazgos sugieren que los metabolitos secundarios que contiene el EM estimulan la respuesta inmune innata celular, siendo necesarias futuras investigaciones que complementen estos hallazgos. / Tesis