Solanum lycocarpum. St.Hil. (Solanaceae) é uma planta lenhosa encontrada nos cerrados e campos cerrados do Brasil Central. É heliófila e característica de formações secundárias abertas. É conhecida popularmente como lobeira. A polpa do fruto é utilizada na produção de um fitoterápico, o polvilho-de-lobeira, amplamente empregado no controle de diabetes e de obesidade, assim como para diminuição no nível de colesterol, sendo comercializado na forma de cápsulas. A espécie é andromonóica, com produção constante de flores hermafroditas e funcionalmente masculinas. A síndrome de polinização é vibrátil e as flores são polinizadas por abelhas do gênero Xylocopa. Os frutos carnosos são consumidos por diversos animais do cerrado. Os principais dispersores das sementes são o lobo-guará, o cachorro-do-mato, a raposa-do-campo, a anta e a formiga saúva. Conhecendo-se as principais características da biologia da reprodução de S. lycocarpum e os agentes polinizadores e dispersores de sementes dessa espécie, objetivou-se com esse trabalho estudar a contribuição relativa da migração mediada por pólen e por sementes no fluxo gênico total e na estrutura genética, em quatro populações naturais de S. lycocarpum situadas na região Sudeste do estado de Goiás. A razão de fluxo de pólen e semente no fluxo gênico total foi estimada por meio da análise comparativa de marcadores microssatélites nucleares e cloroplastidiais. O sistema de reprodução e a distribuição espacial dos genótipos nas populações também foram estudados. Buscou-se, ainda, avaliar a diversidade genética em plantas situadas na margem da estrada de terra que interliga três populações, com o objetivo de inferir sobre a origem das sementes que colonizaram esse ambiente. Os 294 indivíduos amostrados foram estudados com seis locos microssatélites nucleares e seis locos microssatélites cloroplastidiais. Observou-se menor diversidade gênica com os locos nucleares ( He =0,330±0,013) do que com os locos cloroplastidiais (h = 0,947±0,012). A estimativa do número médio de haplótipos por população ( nh =28,4±2,67) mostrou que tanto as populações naturais como a margem da estrada foram fundadas por número elevado de sementes de origens diversas. Estrutura espacial dos genótipos a uma distância de até 50 m foi observada em duas populações, sendo decorrentes da dispersão de sementes espacialmente restrita. A diferenciação genética entre populações estimada com marcadores cloroplastidiais ( &#977pC=0,042) foi ligeiramente menor que a obtida com marcadores nucleares ( &#977p=0,054). A razão de fluxo gênico (mp/ms ) para o conjunto de populações foi 1,22, mostrando que nessa escala de estudo as taxas de fluxo gênico via pólen e sementes são praticamente semelhantes. A margem da estrada foi colonizada por sementes vindas das populações naturais adjacentes e a distância média de dispersão de sementes foi de cerca de 20km. S. lycocarpum é predominantemente alógama, os cruzamentos entre parentes não são comuns e o número de doadores de pólen nos cruzamentos é superior a dez. Considerando apenas a área de abrangência do presente estudo, é necessário conservar 54 populações para reter um Ne=500. Na coleta de sementes para conservação ex situ, deve-se coletar igual número de sementes de 150 a 200 matrizes para reter o Ne=500 e as matrizes devem estar distantes umas das outras mais de 50m / Solanum lycocarpum St.Hil. (Solanaceae) is a woody plant that is found in the Brazilian Cerrados (savanna fields) in Central Brazil. It is heliophile, and it features open secondary formations. It\'s popularly known as wolf\'s fruit. The meat of its fruit is used in the production of a phytomedicine, the wolf\'s fruit powder, which is traded in the form of capsules, being widely used for the control of diabetes, obesity and cholesterol levels. The species is andromonoecious, with constant production of hermaphrodite and functionally male flowers. The pollination syndrome is vibratille, and Xylocopa bees pollinate flowers. Various animals in the Cerrado consume the fleshy fruits. The main seed dispersers are the maned wolf, the bush dog, the crab-eating-fox, the tapir, and the sauba ant. The main mating features of S. lycocarpum as well as its pollinators and seed dispersing agents were used as a basis for this study. Thus, this enquiry aimed at studying the relative contribution of migration mediated by pollen and by seeds in the total gene flow and in the genetic structure of four natural populations of Solanum lycocarpum located in the Southeast region of Goiás State. The pollen to seed flow rate in the total gene flow was estimated by means of comparative analysis of nuclear and chloroplast microsatellite markers. The mating system and genotype spatial distribution in the populations were also studied. We also focused on evaluating the genetic diversity in plants located on the dirt roadside that interlinks three of the populations as a means of inferring about the origin of the seeds that colonized the environment. The 294 individuals sampled were studied with six nuclear microsatellite loci and six chloroplast microsatellite loci. The nuclear loci ( He =0,330±0,013) showed smaller gene diversity than chloroplast loci (h = 0,947±0,012). The estimation of the average number of haplotypes per population ( nh =28,4±2,67) indicated that both natural and roadside populations were founded by a great number of seeds of various origins. Genotypes\' spatial structure at distance of up 50m was detected in two of the populations, resulting from spatially restricted seed dispersion. The genetic differentiation between populations estimated with chloroplast markers ( &#977pC=0,042) were slightly smaller than that obtained with nuclear markers ( &#977p=0,054). Gene flow ratio (mp/ms ) for the set of populations was 1.22, showing that gene flow rates by pollen and seed are practically similar in the scale of this study. The roadside was colonized by seeds from adjacent natural populations, and the average seed dispersion distance was about 20 Km. S. lycocarpum is predominantly alogamic. Biparental inbreeding was not common and the number of pollen donors in the crossings was above ten. Considering only the area comprised in this study, it is necessary to preserve 54 populations to retain Ne=500. When sampling seeds for ex situ conservation, the same number of seeds must be collected from 150 to 200 mother-trees to retain Ne=500. The mother-trees must be more than 50m away from each other

A murcha bacteriana, causada por Ralstonia solanacearum, afeta principalmente as solanáceas, destacando-se as culturas da batata, berinjela, jiló, pimentão e tomate. No presente trabalho foi conduzida a caracterização molecular de isolados de R. solanacearum e sua possível relação com características relacionadas à morfologia, bioquímica, patogenicidade, agressividade e distribuição geográfica. Foram utilizados 51 isolados pertencentes à biovar 2, sendo 9 provenientes de berinjela e 42 de batata, coletados em diversas regiões brasileiras. A análise molecular permitiu separar os isolados em quatro grupos distintos de padrões de bandas para os iniciadores BOX e ERIC, e em cinco para o iniciador REP. Não foi encontrada relação dos grupos de isolados caracterizados molecularmente com tamanho de colônias, ocorrência de mutantes, produção de melanina, capacidade de colonização do sistema radicular e resistência a antibióticos/fungicidas. A identificação de isolados de batata, como biovar 2-A, e de berinjela, como biovar 2-T, com base em teste bioquímico do uso de trealose, foi confirmadas pela análise molecular. Não houve variação de agressividade entre os isolados inoculados em batata e berinjela, exceção feita ao isolado avirulento CNPH-65. Portanto, isolados das biovares 2-A e 2-T podem infectar estas duas hospedeiras com a mesma intensidade sob altas temperaturas. Para todos os isolados, o desenvolvimento da população bacteriana foi significativamente maior no sistema radicular de plantas das cultivares suscetíveis, tanto para batata como para berinjela. No entanto, dentro de cada cultivar, os isolados se comportaram de maneira semelhante, não sendo possível fazer distinção entre os mesmos. A tentativa de se associar grupos de isolados caracterizados molecularmente com os locais de origem revelou alguns aspectos interessantes. O grupo I agregou somente isolados do Paraná. No grupo II ficaram isolados da Bahia, Distrito Federal e do Paraná. No Grupo III, foram reunidos todos os isolados de berinjela e um único de batata, sendo todos procedentes do Distrito Federal. O grupo IV, de forma semelhante ao grupo II, reuniu isolados de locais diversos como Paraná, Goiás, Rio Grande do Sul e Distrito Federal. Portanto, nos grupos I e III parece haver uma tendência de relação entre grupamento molecular e local de origem, enquanto que para os grupos II e IV, isolados de características genéticas similares são provenientes de locais distintos, apontando considerável diversidade genética do patógeno. / The bacterial wilt disease caused by Ralstonia solonacearum affects mainly the solanaceous species, specially potato, eggplant, peppers, tomato and brazilian gilo (Solanum gilo). This work reports the molecular characterization of R. solanacearum biovar 2 isolates and the possible relationship of this molecular data with other characteristics related to morphology, biochemistry, pathogenicity, aggressiveness and geographical distribution. Fifty-one biovar 2 isolates were studied, 9 isolated from eggplant and 42 from potato, all of them collected from different regions of Brazil. According to the molecular analysis, the isolates were clustered in four different groups, with distinct band patterns to the primers BOX and ERIC, and five groups to the primers REP. There was no relationship between the groups clustered through molecular analyses and phenotypic characteristics, such as colony size, presence of mutants, melanin presence, capability of root system colonization and antibiotic/fungicide resistance. The identification of potato isolates as the biovar 2-A, and the eggplant isolates as biovar 2-T, based on biochemical tests using trealose were confirmed with the molecular analyses. There was no variation of aggressiveness in the isolates inoculated on potato an eggplant, except the avirulent isolate CNPH-65. Consequently, isolates of biovars 2-A and 2-T are able to infect both hosts with the same aggressiveness under high temperatures. The population of all isolates developed in significant levels at the root system of susceptible cultivars of both hosts, potato and eggplant. However, considering each cultivar tested, there was no difference between isolates. Interesting results were observed when the isolates clustered based on molecular data were associated with the geographical region of their collection. The group I clustered only the isolates collected in Paraná. The group II clustered the isolates collected in Bahia, Federal District and some in Paraná. The group III clustered all isolates from eggplant and only one of potato, all of them collected in the Federal District. The group IV, as the group II, clustered isolates from different regions, like Paraná, Goiás, Rio Grande do Sul and Federal District. These results suggest a relationship between the isolates clustered through molecular analysis in the groups II and III and their geographical region of collection. The isolates clustered in the same way, with similar genetic background in the groups II and IV, were however collected in different regions, showing the great genetic variation of this pathogen.

A utilização intensiva de germoplasma melhorado de arroz reduziu a variabilidade genética necessária no processo de seleção causando a estagnação dos níveis de produtividade. Visando aumentar a base genética das variedades comerciais ocorre uma busca por genes nos BAG´s. Para este fim, a avaliação de 144 acessos de arroz filipino provenientes do banco da ESALQ/USP foi realizada através de dezenove caracteres agromorfológicos e 15 marcadores microssatélite. As análises de agrupamento com base nos dados moleculares discriminaram um total de 3 grupos. Todos os 15 locos analisados na genotipagem dos acessos foram polimórficos, sendo encontrados 156 alelos. O número de alelos por loco variou de 3 a 20, com uma média de 10,4. Os acessos analisados possuem uma quantidade bastante significativa de alelos raros (70), sendo os genótipos 84 (Mum 1), 106 (Khao Phe Do), 68 (Khao Khane), 132 (Ku-79-1), 112 (E-Boot), 64 (Bikyat), 146 (BRS-Sertaneja), 121 (Puntas Claras), 85 (Khao Phe Py), 138 (Maraja), 133 (Unnamed), 105 (Os-6), 107 (Ba Ke Gonh) e 47 (Khao Mack Fay Khao) os que apresentaram alelos exclusivos. A heterozigosidade esperada teve seu maior valor no loco RM 257 (0,934) e seu menor valor no loco RM 277 (0,542). Os caracteres agromorfológicos foram submetidos a análises univariadas e multivariadas para a estimação da diversidade genética. Com base no teste F, diferenças significativas a 1% foram observadas em 12 das 14 variáveis quantitativas usadas no estudo. Aquelas que não apresentaram tais diferenças foram: comprimento de folha bandeira (CFB) e produtividade de grãos (PG). As duas primeiras variáveis canônicas explicaram cerca de 99,71% da variação total. Para a primeira variável as características mais importantes e de maior contribuição para a divergência foram: altura de planta na maturidade (APM) e comprimento de colmo (CC); para a segunda foram: comprimento de espigueta (CE) e número de dias para o florescimento (NDF). A análise de agrupamento reunindo dados moleculares e agromorfológicos discriminou um total de 26 grupos, dos quais os 6 primeiros foram atribuídos como os principais por abranger 69% dos acessos. Desta forma, pode-se observar a presença de maior estruturação de grupos (26), em comparação aos outros agrupamentos envolvendo apenas dados agromorfológicos (10), referentes ao primeiro ano agrícola do estudo, e dados moleculares (3). Tal fato sugere o uso da maior quantidade de dados disponíveis, os quais proporcionarão resultados mais confiáveis e completos, em termos reais. / The improved rice germplasm´s intense use, with related genitors, reduced genetic variability in breeding programs. This intense use causes stagnation of productivity. Intending to enhance genetic bases in commercial cultivars, a search for genes occurs in germplasm. This study aimed to analyze 144 philippine rice accessions, from ESALQ-USP germplasm, across using nineteen agromorphological traits and fifteen microsatellite markers. The grouping analyses, based on molecular data, found an overall of three groups. All the fifteen markers analyzed in the genotyping of the accessions were polymorphic, and 156 alleles were found. The number of alleles per locus varied from three to 20, with an average of 10,4. The analyzed accessions possess a significant amount of rare alleles (70), being genotypes 84 (Mum 1), 106 (Khao Phe Do), 68 (Khao Khane), 132 (Ku-79-1), 112 (E-Boot), 64 (Bikyat), 146 (BRSSertaneja), 121 (Puntas Claras), 85 (Khao Phe Py), 138 (Maraja), 133 (Unnamed), 105 (Os-6), 107 (Ba Ke Gonh) and 47 (Khao Mack Fay Khao), the ones that had presented exclusive alleles. The expected heterozygosity had its highest value in RM 257 (0,934) and its lowest value in RM 277 (0,542). The agromorphological traits were submitted to univariate and multivariate analyses to estimate genetic diversity. Based on F test, 1% significant difference was observed in 12 of 14 quantitative traits used on the study. The traits that didn`t present significant statistical differences were: flag leaf length (FLL) and grain productivity (GP). The first and the second canonical variables absorbed together 99,71% of the observed variation. The most important traits for the first canonical variable, which had most contributed for genetic difference, were: plant height in maturity (PHM) and culm length (CL). For the second canonical variable, grain length (GL) and number of days for flourishing (NDF), were the most important. Grouping analyzes, that brought together molecular data and agromorphological traits, found an overall of 26 groups. The main groups were the six first ones, responsible for 69% of the accessions. Using both, molecular data and agromorphological traits, it´s noticed more structural patterns grouping (26) than in any other grouping connected with the agromorphological traits from the first harvest (10) and molecular data (3). The results suggest, as much as possible, the use of available data, which offers the most completed and trustable results.

O objetivo deste estudo foi caracterizar a diversidade de Metarhizium em um plantio de cana-de-açúcar e monitorar a eficácia e persistência do isolado ESALQ 1604 de M. anisopliae, após aplicação em campo, através de técnicas moleculares. Isolados foram recuperados de amostras de solo, raiz e cigarrinha-das-raízes infectadas de duas áreas de um canavial em Iracemápolis-SP, uma com aplicação do fungo (isolado ESALQ 5310) e colheita mecânica e outra sem aplicação e colheita manual antecedida por queimada. Os isolados de insetos foram recuperados de ninfas e adultos coletados 51, 42 e 1 dia (s) antes da aplicação do fungo e 7, 30, 60 e 90 dias após a aplicação. Isolados de solo e raiz foram obtidos 90 dias pré-aplicação do fungo e 30 e 90 dias pós-aplicação. A aplicação de M. anisopliae foi realizada em 09/01/15 com suspensão de 3,72x106 conídios viáveis/mL numa vazão de 150L/ha. Nas análises moleculares também foram incluídos 22 isolados provenientes das mesmas áreas coletados em 18/12/2012. A diversidade haplotípica de Metarhizium foi obtida pela genotipagem de 10 marcadores microssatélites para 213 isolados provenientes de amostras de solos, 22 de raízes e 73 de cigarrinha-das-raízes. A identificação específica dos fungos foi obtida pelo sequenciamento do gene 5\'-TEF de 57 isolados provenientes de solos, 6 de raízes e 14 de cigarrinha-das-raízes selecionados dentre os diferentes haplótipos gerados pelas análises dos marcadores microssatélites. Dentre os 310 isolados genotipados, foram obtidos 156 haplótipos do fungo, destes, 132 provenientes de isolados de solo, 17 de raízes e 20 de cigarrinha-das-raízes. A maior diversidade haplotípica foi encontrada nos solos h=0,989 e a menor em insetos h=0,779. A divergência genética entre isolados provenientes de insetos, solos e raízes foi significativa (ΦST =0.303), sendo a maior proporção da variação dentro (69,6 %) do que entre (30,3 %) esses grupos. A mortalidade de cigarrinha-das-raízes por M. anisopliae antes da aplicação variou de 0 a 14,8% para ninfas e 7,3-18,1% para adultos. Sete dias após a aplicação, observou-se 50% de mortalidade confirmada de ninfas e 10,7% de adultos. O isolado aplicado em campo foi recuperado somente em cigarrinha-das-raízes e nas coletas 7, 30 e 60 dias pós-aplicação, compreendendo 50%, 50% e 70,5% de todos os insetos mortos por M. anisopliae, respectivamente. A população da praga reduziu após 90 dias e não foram observadas cigarrinhas infectadas nesta amostragem. No solo, foram encontradas as espécies M. robertsii (clados Mrob 1, Mrob 2 e Mrob 4), M. anisopliae (Mani 1 e Mani 2) e M. brunneum. Em raízes foram encontradas as espécies M. brunneum e M. anisopliae (Mani 2). Em adultos e ninfas de cigarrinha-das-raízes foram encontrados somente haplótipos de um único clado (Mani 2) de M. anisopliae, e o isolado ESALQ 5310 aplicado nos anos anteriores na área não foi recuperado. Os resultados obtidos neste trabalho revelam a grande diversidade haplotípica de Metarhizium spp. e o impacto das populações locais de M. anisopliae na regulação de cigarrinhas em cana-de-açúcar. / The aim of this study was to characterize the diversity of Metarhizium in a sugarcane plantation and to monitor the efficacy and persistence of the isolate ESALQ 1604 of M. anisopliae after field application, by molecular techniques. Isolates were recovered from samples of soil, root and infected spittlebugs of two areas in Iracemápolis-SP: one with application of the fungus (isolate ESALQ 5310) and mechanical harvesting and another without fungal application and manual harvest preceded by burning. The isolates from insects were recovered from nymphs and adults collected 51, 42 and 1 day (s) before application of the fungus and 7, 30, 60 and 90 days after application. Isolates of soil and root were obtained 90 days pre-application of the fungus and 30 and 90 days post-application. The application of M. anisopliae was carried out in 9/Jan/15 with suspension of 3,72 x 106 viable conidia/mL at a volume rate of 150 l/ha. In the molecular analyses, 22 isolates from the same areas collected in 18/12/2012 were also included. The haplotype diversity of Metarhizium was obtained by genotyping 10 microsatellite markers of 213 isolates from soil samples, 22 from roots and 73 from spittlebugs. The specific identification of fungi was obtained by sequencing the gene 5\'- TEF of 61 isolated from soil, 6 from root and 13 from spittlebug selected among the different haplotypes generated by analysis of microsatellite markers. Among 310 isolates genotyped, 156 haplotypes of the fungus were obtained, of these, 132 from soil isolates, 17 of root and 20 of spittlebug. The highest haplotype diversity was found in soil h=0.989 and the smallest in spittlebug h = 0.779. The genetic divergence among isolates from insect, soil and root was significant (ΦST = 0.303), being the largest proportion of the variation within (69.6%) than among (30.3%) these groups. The mortality of spittlebugs by M. anisopliae before application ranged from 0 to 14.8% for nymphs and 7.3-18.1% for adults. Seven days after application, 50% of nymph mortality and 10.7% of adult mortality was observed. The isolate applied on the field was recovered only in spittlebugs and only 7, 30 and 60 days, post-application, and accounted for 50%, 50% and 70.5% of all insects killed by M. anisopliae, respectively. The pest population reduced after 90 days and no spittlebug infected was observed in this sample date. The species and clades found in isolates from soil were M. robertsii (clades Mrob 1, Mrob 2 and Mrob 4), M. anisopliae (Mani 1 and Mani 2) and M. brunneum. In roots the species found were M. brunneum and M. anisopliae (Mani 2). In adults and nymphs of spittlebug only haplotypes of a single clade (Mani 2) of M. anisopliae were found. The isolate ESALQ 5310 applied in previous years in the area was never recovered. The results obtained in this work revelead the great diversity of haplotype Metarhizium spp. and the impact of local populations of M. anisopliae on population regulation of spittlebugs in sugarcane.

Grapevine anthracnose is an important disease, responsible for severe yield losses in humid regions around the world. This study aimed to: i: identify the causal agents of grapevine anthracnose in Brazil; ii: characterize Elsinoë ampelina isolates from Brazil and Australia by means of phylogenetic analyses, morphological features and pathogenicity tests; iii: develop an efficient method for conidial production of E. ampelina; iv: develop and validate a standard area diagram set (SADs) for assessing anthracnose severity on grapevine leaves; and v: study the temporal and spatial progression of anthracnose in a Brazilian vineyard. To identify the causal agents of the disease, leaves, stems and berries with anthracnose symptoms were collected from 38 vineyards in southern and southeastern Brazil and 39 E. ampelina and 13 Colletotrichum spp. isolates were obtained. For E. ampelina isolates, the internal transcribed spacer (ITS), histone H3 (HIS3) and elongation factor 1-α (TEF) sequences were analysed. HIS3 was the most informative region with 55 polymorphic sites. Seven Colletotrichum species were identified: C. siamense, C. gloeosporioides, C. fructicola, C. viniferum, C. nymphaeae, C. truncatum and C. cliviae. In pathogenicity tests, only E. ampelina isolates caused anthracnose symptoms on Vitis vinifera \'Moscato Giallo\' and Vitis labrusca \'Niagara Rosada\'. To characterize E. ampelina from Brazil and Australia, 35 isolates were analysed. ITS and TEF sequences of all isolates were monomorphic. The haplotype network generated from HIS3 dataset showed four distinct haplotypes. High genetic variability was observed in two Brazilian isolates, haplotype EA4, which may have lost the intron region during species evolution. Colonies showed variable coloration, wrinkled texture, absence of spores and slow growth. Brazilian isolates produced conidia larger than conidia from Australian isolates. To induce the conidial production, mycelial fragments were shake-incubated in rainwater and distilled water for 7 days. Isolates produced different concentrations of conidia and the conidial germination was more than 88.5%. In infectivity tests, conidia caused typical anthracnose symptoms on leaves. The SADs developed comprises six true colour diagrams with severity ranging from 1.1 to 27.4%. The use of the SADs improved the accuracy, precision, agreement and inter-rater reliability of the estimates conducted by 12 raters. The temporal and spatial dynamics of anthracnose was carried out in a \'Niagara Rosada\' vineyard in 2014 and 2015. The incidence of vines with diseased leaves, stems and berries and the severity disease on leaves were recorded. Anthracnose symptoms occurred rapidly after bud break and ontogenic resistance was observed for all organs assessed. The monomolecular model showed the best fit to the incidence progress. Temporal analyses suggest that the progress of anthracnose incidence and severity over time is governed mainly by the primary inoculum due to age-related resistance of the vine organs. Spatial analyses showed a predominantly random spatial pattern of diseased vines. In conclusion, this thesis presents a more in-depth understanding of the aetiology and epidemiology of an important grapevine disease. / Antracnose da videira é uma importante doença, responsável por severas perdas de produtividade em regiões húmidas em diversos locais do planeta. Este estudo objetivou: i: identificar o agente causal da antracnose da videira no Brasil; ii: caracterizar isolados de Elsinoë ampelina do Brasil e Austrália através de análises filogenéticas, morfologia e testes de patogenicidade; iii: desenvolver um método eficiente para produção de conídios de E. ampelina; iv: desenvolver e validar uma escala diagramática para avaliar a severidade de antracnose em folhas; e v: estudar o progresso temporal e espacial da antracnose em um vinhedo brasileiro. Para identificar os agentes causais da doença, folhas, ramos e bagas com sintomas de antracnose foram coletados em 38 vinhedos das regiões sul e sudeste do Brasil e 39 isolados de E. ampelina e 13 isolados de Colletotrichum spp. foram obtidos. Para isolados de E. ampelina, sequências de espaçador interno transcrito (ITS), histona H3 (HIS3) e fator de elongação 1-α (TEF) foram analisadas. HIS3 foi a região mais informativa com 55 sítios polimórficos. Foram identificadas sete espécies de Colletotrichum: C. siamense, C. gloeosporioides, C. fructicola, C. viniferum, C. nymphaeae, C. truncatum e C. cliviae. Nos testes de patogenicidade, somente isolados de E. ampelina causaram sintomas de antracnose em Vitis vinifera \'Moscato Giallo\' e Vitis labrusca \'Niagara Rosada\'. Para a caracterização de E. ampelina do Brasil e Austrália, 35 isolados foram analisados. Sequências de ITS e TEF de todos os isolados foram monomórficas. A rede de haplótipos gerada a partir de sequências de HIS3 resultou na formação de quatro haplótipos. Alta diversidade genética foi observada em dois isolados brasileiros, haplótipo EA4, sugerindo a perda do intron durante a evolução da espécie. Colônias apresentaram coloração variável, textura enrugada, ausência de esporos e lento crescimento. Isolados brasileiros apresentaram conídios maiores que conídios de isolados australianos. Para induzir a esporulação, fragmentos de micélio foram agitados e incubados em água da chuva e água destilada durante 7 dias. Isolados produziram diferentes concentrações de conídios e a germinação foi superior a 88,5%. Nos testes de infectividade, os conídios causaram sintomas de antracnose em folhas. A escala diagramática desenvolvida compreende seis diagramas em cores reais com severidade variando de 1,1 a 27,4%. O uso da escala diagramática melhorou a acurácia, precisão, concordância e reprodutibilidade das estimativas conduzidas por 12 avaliadores. A dinâmica temporal e espacial da antracnose foi conduzida em vinhedo de \'Niagara Rosada\' em 2014 e 2015. A incidência de videiras com folhas, ramos e bagas sintomáticos e a severidade em folhas foram registradas. Os sintomas de antracnose ocorreram rapidamente após a brotação sendo observada resistência ontogênica em todos os órgãos avaliados. O modelo monomolecular mostrou o melhor ajuste para o progresso da incidência. As análises temporais sugerem que o progresso da incidência e severidade durante o tempo é influenciado principalmente pelo inóculo inicial devido à resistência ontogênica dos órgãos. As análises espaciais mostraram um padrão espacial predominantemente aleatório de videiras sintomáticas. Em conclusão, esta tese apresenta uma compreensão mais aprofundada da etiologia e epidemiologia de uma importante doença da videira.

A macadâmia (Macadamia integrifolia Maiden & Betche) é uma nogueira arbórea originária das florestas tropicais australianas. Sua distribuição natural ocorre por quase toda a costa leste da Austrália. No Brasil, foi introduzida em 1931, mas sua expansão aconteceu a partir da década de 70. As variedades comerciais são originadas de duas espécies, Macadamia integrifolia e M. tetraphylla, e seus híbridos. As informações sobre pedigree são geralmente incompletas e a identificação das variedades algumas vezes não é clara. O uso de técnicas moleculares auxilia em diversas fases dos programas de melhoramento, inclusive na caracterização do material genético e seleção de parentais envolvidos nos cruzamentos. A partir do uso de técnicas moleculares (microssatélites e diversity array technology), as 28 variedades que compõe o germoplasma brasileiro foram genotipadas com a finalidade de investigar a estrutura e a divergência genética entre estas. Foram utilizados 29 primers flanqueadores de locos microssatélites e 462 marcas de diversity array technology. A análise pelo programa Structure apresentou a formação de duas subpopulações: uma com a maioria das variedades desenvolvidas no Havaí/USA e Brasil, e outra composta pelas variedades desenvolvidas na Austrália e três variedades brasileiras. A análise da diversidade genética detectou valores medianos de heterozigosidade para o conjunto de variedades ( = 0,46 e = 0,43), com indicação de um pequeno excesso de homozigoto em relação ao esperado sob Equilíbrio de Hardy-Weinberg. A estimativa do índice de fixação (F = 0,067) para o conjunto de subpopulações apresentou grande variação, porém na média, foi baixo e não diferente de zero. Os resultados também mostram que a maior parte da diversidade genética do germoplasma está dentro de subpopulações ( q = 0,041). O índice de fixação devido ao sistema reprodutivo também variou entre os locos analisados, mas na média foi igualmente baixo e não diferente de zero ( f = 0,027). Os valores das Distâncias de Jaccard variaram entre 0,00 e 0,787 enquanto que as Distâncias de Roger Modificada variaram entre 0,227 e 0,671. O dendrograma UPGMA formado pelas Distâncias de Jaccard formou três grupos enquanto que pelas Distâncias de Roger Modificada formou dois grupos, sendo possível distinguir somente o grupo externo formado pelas duas espécies de grevílea. A falta de divergência entre alguns pares de variedades foi inesperada, assim como o não agrupamento entre variedades identificadas com o mesmo nome ou que apresentam histórico de parentesco. Da mesma forma, as duas subpopulações discriminadas pelo programa Structure não formaram agrupamento específico em ambos os dendrogramas. Os resultados das análises dos Componentes Principais foram coerentes aos obtidos nos dendrogramas formando os mesmos agrupamentos. / Macadamia (Macadamia integrifolia Maiden and Betche) is a nut crop tree widespread across eastern Australia. Although has been introduced in Brazil in 1931, just in the past 20 years its cultivated area has expanded more significantly. Commercial varieties are originated from Macadamia integrifolia and M. tetraphylla, as well as its hybrids. The information on pedigree is generally incomplete and the identification of varieties is sometimes not so clear. Molecular techniques could provide genetic information useful for breeding programs, such as, the kinship (relatedness) between individuals. Molecular techniques (microsatellites and diversity array technology) was used to genotype all 28 varieties that composes Brazils germoplasma with the purpose to investigate the structure and the genetic divergence between these varieties. Twenty nine microsatellites locus and 462 markers of diversity array was used. Analysis using the Structure software showed evidence of two subpopulations: one with the majority of the varieties developed in the Hawaii/USA and Brazil, and another with varieties developed in Australia and three in Brazil. The analysis of genetic diversity detected medium values of heterozigosis ( = 0.46 and = 0.43), with indication of a small excess of homozygotes in relation the expected value under Hardy- Weinberg equilibrium. The estimate of inbreeding coefficient showed great variation (from - 0.522 to 0.558), however in the average (F = 0.067) it was low and statistically not different from zero. The results also showed that most of the genetic diversity is within subpopulations ( q = 0.041). The inbreeding due to the reproductive system varied between analyzed loci, but on average it was low and statistically not different from zero ( f = 0.027). Values of Jaccard distances ranged from 0 to 0.787, whereas the modified Rogers distances ranged from 0.227 to 0.671. UPGMA Cluster analysis from Jaccard distances formed three groups, whereas modified Rogers distances of formed two groups. In the latter, it is possible to distinguish only the external group formed by the two species from Grevilea spp. For some varieties that we expected to be clustered together were unexpected assigned to different clusters. On the other hand, for some varieties that we expected to be placed in different clusters were unexpected clustered together. Unexpected, the two subpopulations discriminated in the analysis (Structure) did not form specific groups when using both Jaccard and modified Rogers distances. The results of Principal Coordinate Analysis were coherent with the UPGMA analyses.

Análises de diversidade em feijão comum (Phaseolus vulgaris L.), envolvendo caracteres morfológicos e marcadores moleculares, têm mostrado uma estruturação em dois pools gênicos principais, um Mesoamericano e outro Andino, os quais diferem, dentre vários aspectos, quanto à morfologia e fisiologia do grão. Uma nova abordagem que vem sendo usada para estimar a variabilidade genética entre acessos de feijoeiro é a prospecção de polimorfismos de base única (SNPs), tanto em sequências arbitrárias do genoma quanto em sequências gênicas de interesse. Também, o estudo de sequências nucleotídicas que codificam proteínas importantes, tais como a faseolina e a ferro redutase, codificadas, respectivamente, pelos genes Phs e FRO1, deve permitir a geração de novos e informativos marcadores e promover um melhor entendimento da variação existente em P. vulgaris. Assim, os objetivos deste trabalho foram obter as sequências dos genes - Phs e FRO1, acessar a frequência de SNPs em regiões codantes e não-codantes de ambos os genes, e avaliar a utilidade desses polimorfismos para investigar a diversidade genética em 31 genótipos cultivados de feijão comum e um acesso de P. lunatus. Para tanto, primers específicos foram desenhados e as sequências obtidas foram alinhadas, permitindo a identificação de vários sítios polimórficos. Parâmetros moleculares foram estimados pelo software Arlequin e MEGA. As análises de agrupamento foram conduzidas através do método Neighbor-joining. Foram detectadas 361 bases polimórficas, das quais 260 foram do tipo substituição e 101, indel. A frequência de SNPs em regiões não codantes foi duas vezes maior do que em regiões traduzidas, em ambos os genes; também, a substituições do tipo transição foram mais freqüentes do que as do tipo transversão. Os polimorfismos em regiões codantes levaram à substituição de 17 aminoácidos na proteína faseolina, e 14 na enzima ferro redutase. Tais modificações incluem, na maioria das vezes, alterações de aminoácidos com propriedades similares. Vale destacar que sequência predita de aminoácidos da faseolina exibiu uma diversidade elevada entre os acessos investigados, sendo que alguns desses polimorfismos se prestaram para tipificar alguns acessos. Em contrapartida, a enzima ferro redutase exibiu um padrão de aminoácidos mais homogêneo, principalmente para os acessos andinos. As análises de agrupamento revelaram dois clusters bem definidos: um que agrupou os acessos Mesoamericanos e as cultivares brasileiras, e outro que agrupou os Andinos, sugerindo que sequências gênicas são úteis na distinção dos pools gênicos de Phaseolus. Todavia, os polimorfismos do gene -Phs permitiram uma melhor resolução das relações entre os acessos dentro de cada pool gênico, em comparação com os do gene FRO1. / Diversity analysis in common bean (Phaseolus vulgaris L.), based on morphological traits and molecular markers, has revealed the existence of two major gene pools, the Mesoamerican and Andean pools, which differ in several features, including the grain morphology and physiology. A novel approach to estimating genetic variability is in silico mining for single nucleotide polymorphisms (SNP). Arbitrary genome sequences as well as genic sequences were used for this purpose. Additionally, the investigation of nucleotide sequences that code for important proteins, such as phaseolin and iron-reductase, encoded respectively by the Phs and FRO1 genes, should allow new and informative markers to be generated, helping us to gain a better understanding of intraspecific variation in P. vulgaris. Therefore, the aims of this study were to sequence the -Phs and FRO1 genes, to assess SNP frequencies in coding and non-coding regions of both genes, and to assess the possible use of these polymorphisms for investigating the genetic diversity of 31 cultivated genotypes of common bean and one of P. lunatus. Specific primers were designed and the sequences obtained were aligned, allowing us to identify several polymorphic sites. Molecular parameters were estimated using the Arlequin and MEGA software packages. Cluster analyses were conducted using the neighborjoining method. We detected 361 polymorphic sites, consisting of 260 base substitutions and 101 indels. The frequency of SNPs in non-coding regions was twice the frequency in translated regions in both genes. In addition, the occurrence of base transitions was higher than transversions. Polymorphisms in coding regions lead to 17 amino acid substitutions in the phaseolin protein and 14 in the iron reductase enzyme. Most substitutions of this kind include changes that preserve the respective protein functions. The predicted amino acid sequence of phaseolin exhibited high diversity, and some polymorphisms allowed us to typify some accessions. In contrast, the iron reductase enzyme exhibited a more homogeneous pattern of amino acids, especially in the Andean accessions. Cluster analyses revealed two well-defined clusters, one containing the Mesoamerican accessions with the Brazilian cultivars, and another containing the Andean accessions, suggesting that gene sequences are useful for distinguishing the Phaseolus gene pools. Interestingly, the polymorphisms detected in the -Phs gene allowed better visualization of the relationships between accessions in the same pool, in comparison to FRO1.

Entre as doenças que trazem preocupações e podem causar prejuízos no setor canavieiro em todo o Brasil, destaca-se a ferrugem marrom, causada pelo fungo Puccinia melanocephala H. & P. Sydow. Essa doença ocorre em todas as regiões canavieiras do mundo, desde a Ásia e a África, de onde o complexo \"Sacharum spp.\" é originário, até as Américas e Oceania. No Brasil, a ferrugem foi detectada, pela primeira vez em 1986, no município de Capivari-SP e logo em seguida em Pernambuco e Alagoas. Desde o primeiro surgimento no Brasil, a ferrugem tem sido mantida sob controle, com grande parte das cultivares apresentando resistência. O conhecimento acerca da estrutura populacional de P. melanocephala é necessário para desenvolver estratégias satisfatórias no controle desta doença e no desenvolvimento de cultivares resistentes. A variabilidade genética entre isolados pode ser avaliada por meio de marcador molecular microssatélite e os dados podem ser usados para monitorar as populações do patógeno. Este trabalho teve como objetivo avaliar, por meio do desenvolvimento de uma biblioteca enriquecida em locos de microssatélites, a variabilidade genética entre isolados de P. melanocephala bem como avaliar a patogenicidade de isolados de diferentes regiões produtoras de cana-de-açúcar. Primeiramente, os 44 isolados de ferrugem da cana foram identificados por microscopia utilizando estruturas morfológicas dos urediniósporos. Desse total, 34 foram identificadas como P. melanocephala e 10 como Puccinia kuehnni. Por meio da construção da biblioteca enriquecida com locos microssatélites foram desenvolvidos 21 locos para ferrugem marrom, e desse total, 16 apresentaram amplificações satisfatórias e somente quatro foram polimórficos. A variabilidade genética dos isolados de P. melanocephala foi relativamente alta (HT = 0,650). A análise de agrupamento não permitiu a separação dos isolados de P. melanocephala de acordo com sua região de origem. Os índices de diversidade (DST = -0,039) e divergência (GST = -0,061) genética observados sugerem que a variabilidade genética está igualmente distribuída nas regiões estudadas, ocorrendo uma única população heterogênea. As regiões de origem dos isolados utilizadas para avaliação de patogenicidade não apresentaram variações significativas na agressividade. Os resultados obtidos no presente trabalho evidenciam que o melhoramento genético da cana-de-açúcar para resistência a ferrugem marrom deve ser conduzido em locais com clima favorável a ocorrência do patógeno, que possivelmente representam a diversidade genética presente em diferentes regiões de cultivo / Among the diseases that bring concerns and can cause losses in the sugarcane industry in Brazil, stands out the brown rust, caused by the fungus Puccinia melanocephala H. & P. Sydow. This disease occurs in all sugarcane regions of the world, from Asia and Africa, where the complex \"Sacharum spp.\" originates, to the Americas and Oceania. In Brazil, the rust was detected for the first time in 1986 in the region of Capivari-SP and soon after in the Pernambuco and Alagoas. Since the first appearance in Brazil, the rust has been brought under control, with most of the cultivars showing resistance. The knowledge about the population structure of P. melanocephala is necessary to develop suitable strategies to control this disease and the development of resistant cultivars. The genetic variability between isolates can be assessed by means of microsatellite molecular markers and data can be used to monitor populations of the pathogen. The aim of this work was to develop a library enriched for microsatellite loci in P. melanocephala and assessment of pathogenicity of isolates from three different sugarcane regions producing. First, the 44 sugarcane rust isolates were identified by microscopy using morphological structures of urediniospores. Of this total, 34 were identified as P. melanocephala and 10 as P. kuehnni. Through the construction of the library enriched with microsatellite loci were developed 21 loci brown rust of those, 16 had satisfactory PCR amplifications and only four were polymorphic. The genetic variability of isolates of P. melanocephala was relatively high (HT = 0.650). The cluster analysis did not allow the separation of isolates of P. melanocephala according to their region of origin. The index of the genetic diversity (DST = -0.039) and genetic divergence (GST = -0.061) suggest that genetic variability is equally distributed in the regions studied, occurring only a heterogeneous population. The regions of origin of isolates used for pathogenicity assessment did not show significant variations in aggressiveness. The results obtained in this work show that the genetic improvement of sugarcane for resistance to brown rust should be conducted in areas with favorable weather for the occurrence of the pathogen, which may represent the genetic diversity present in different sugarcane regions

Compétition et diversité sont des phénomènes majeurs en microbiologie. Dans le secteur de l’agroalimentaire, la compétition est à la base de la biopréservation, un procédé dont l’objectif est d’inhiber des microorganismes indésirables par l’utilisation de microorganismes compétiteurs. La diversité microbienne est quant à elle à l’origine de la diversité de produits fermentés et en particulier de la typicité des fromages. Pourtant, l’écologie de la compétition microbienne dans les aliments et le lien avec la diversité microbienne sont très mal connus. L’objectif de ces travaux de thèse était d’une part d’étudier la diversité et d’autre part la compétition chez une bactérie représentative de l’écosystème fromager. Le modèle d’étude choisi est la bactérie lactique Carnobacterium maltaromaticum. Une analyse de diversité de 21 souches de C. maltaromaticum a été réalisée par MultiLocus Sequence Typing (MLST) et a permis de compléter la structure connue de la population de C. maltaromaticum. Cette étude a permis de révéler la présence de 56 génotypes au sein d’une collection de 71 souches, montrant une grande diversité génétique au sein de cette espèce. La compétition par interférence a été étudiée par réalisation de tests de compétition à haut débit. Chaque test de compétition mettait en jeu deux souches de la collection, une souche en situation d’expédition et une souche en situation de réception. Au total 5776 tests ont été réalisés à partir de la collection de 76 souches. Les résultats ont révélé que 60% des souches inhibaient au moins une autre souche de la collection indiquant que la compétition intraspécifique est majeure au sein de l’espèce C. maltaromaticum. Par ailleurs, une grande variabilité de largeur de spectre d’inhibition et de spectre de sensibilité a été observée. Une approche d’analyse de réseau a révélé une architecture « nested » du réseau compétitif suggérant que l’inhibition dépend non seulement des caractéristiques antagonistes des souches inhibitrices mais également du niveau de sensibilité des souches réceptrices. Une analyse génomique de 26 souches de la collection a été réalisée en vue de prédire leur contenu en gènes codant la synthèse de substances antagonistes et a permis d’identifier des gènes codant potentiellement des bactériocines. En conclusion, ces travaux de thèse ont montré que l’espèce Carnobacterium maltaromaticum est d’une part caractérisée par une grande diversité génétique et que d’autre part la compétition par interférence est fréquente au sein de la population / Competition and diversity are major phenomena in microbiology. In the agri-food sector, competition is the very basis of biopreservation, a process which objective is to inhibit undesirable microorganisms through the use of microbial competitors. Microbial diversity lies at the origin of the diversity of fermented products and particularly of the typicality of cheeses. However, the ecology of microbial competition in food and the link with microbial diversity are poorly understood. The goal of this thesis was to study the diversity and the competition of a representative model bacterium of the cheese ecosystem. The study model chosen is the lactic acid bacterium Carnobacterium maltaromaticum. An analysis of the diversity of 21 strains of C. maltaromaticum was performed by MultiLocus Sequence Typing (MLST) and allowed to complete the scheme of C. maltaromaticum population structure. This study revealed the presence of 56 genotypes among a collection of 71 strains, showing a high genetic diversity within this species. Interference competition was studied by performing high-throughput competition assays. Each competition assay involved two strains, one in the position of the sender strain and the other in the position of the receiver. In total, 5776 tests were performed on a collection of 76 strains. The results revealed that 60% of strains inhibited at least one other strain of the collection, indicating that intraspecific competition is major in C. maltaromaticum. Moreover, a large variability in the width of inhibition and sensitivity spectra has been observed. A network analysis approach revealed a nested architecture of the competitive network, suggesting that inhibition depends not only on the antagonistic characteristics of the inhibitory strains but also on the level of sensitivity of the receiver strains. A genomic analysis of 26 strains from the collection was performed in order to predict their gene content encoding the synthesis of antagonistic substances, and it allowed the identification of genes potentially encoding bacteriocins. In conclusion, this thesis has shown that the species Carnobacterium maltaromaticum is characterized by a high genetic diversity and that interference competition is frequent in the population

O gene fator regulador de interferon 4 (IRF4), localizado na região cromossômica 6p25- p23, é um membro da família de fatores reguladores de interferon (IRF), um grupo de fatores de transcrição de ligação ao DNA, sendo IRF4 primariamente associado ao desenvolvimento e resposta imune e expresso exclusivamente em células do sistema imunológico e em linhagens melanocíticas. Embora muitos estudos tenham associado IRF4 a diversas condições, como melanoma e leucemia linfocítica crônica, um recente Genome-Wide Association Study (GWAS) identificou que alelos do SNP rs12203592 (intron 4) estão associados com variação fenotípica em relação à presença de sardas, pigmentação da pele, cabelos e olhos. Estudos funcionais realizados em células melanocíticas humanas e de camundongos revelaram que este SNP está diretamente envolvido na regulação da expressão de IRF4, sugerindo uma clara função na pigmentação do melanócito. Apesar destes achados, a diversidade das regiões regulatórias e codificadora de IRF4 não foi até o momento analisada em populações miscigenadas. A fim de avaliar se outros sítios de variação ao longo do gene IRF4 podem estar associados à pigmentação humana, as regiões regulatórias (promotora e 3´UTR) e codificadora (9 exons e regiões intrônicas flanqueadoras, incluindo o SNP rs12203592) foram analisadas por sequenciamento de nova geração em uma amostra miscigenada da população brasileira. A amostra populacional foi composta por 228 indivíduos não aparentados de Ribeirão Preto, estado de São Paulo, Brasil, os quais foram estratificados de acordo com a pigmentação da pele (clara, média e escura), olhos (azul, verde, castanho-claros e castanho-escuros), cabelo (ruivo, loiro-claro, loiroescuro, castanho-claro, castanho-escuro e preto) bem como em relação à presença de sardas e intensidade de cabelos grisalhos. Bibliotecas de DNA foram preparadas utilizando o Sistema de Enriquecimento de Alvo Haloplex (Agilent Technologies) e sequenciadas na plataforma MiSeq (Illumina). Os pacotes de software CutAdapt, BWA and GATK foram utilizados, respectivamente, para trimagem das sequências dos adaptadores, alinhamento e identificação de variantes. Haplótipos e alelos não identificados foram inferidos pelo método PHASE, embora a fase conhecida entre os sítios de variação (obtida pelo GATK) tenha sido levada em consideração. Um total de 105 sítios de variação foram identificados. Apenas dois deles apresentaram frequências genotípicas que não atendem ao esperado pelo equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW). Dezoito destes SNPs apresentaram forte associação a pelo menos uma característica de pigmentação. Entretanto, se a conservadora correção de Bonferroni para múltiplos testes for levada em consideração, apenas duas associações, ambas envolvendo o SNP rs12203592, permanecem significativas: a associação do alelo T com pele clara e olhos azuis. Este resultado está de acordo com estudos prévios, que reportam que o alelo rs12203592*T leva a uma menor ativação de IRF4 e a uma expressão reduzida da tirosinase, resultando em sensibilidade ao sol e olhos azuis. Foi inferido um total de 101 haplótipos, estando a distribuição destes de acordo com o esperado pelo EHW. Quando os haplótipos foram divididos em haplótipos da promotora, codificadora e 3´UTR foram observadas, respectivamente, 17, 29 e 37 diferentes combinações haplotípicas. Várias associações foram identificadas, particularmente envolvendo o haplótipo mais frequente da promotora, os dois haplótipos mais frequentes da codificadora e o haplótipo mais frequente da 3´UTR, todos associados com pele clara, olhos azuis, cabelos castanhos e cabelos grisalhos. Estes resultados sugerem que outras variantes além de rs12203592, quando consideradas em um contexto haplotípico, são associadas com a pigmentação humana. / The Interferon Regulatory Factor 4 (IRF4) gene, located at chromosomal region 6p25- p23, is a member of the interferon regulatory factor (IRF) family, a group of DNAbinding transcription factors, with the IRF4 primarily associated with immune system development and response and expressed exclusively in immune system cells and melanocytic lineages. Although many studies have shown that IRF4 is associated with many human conditions, such as melanoma and chronic lymphocytic leukemia, a recent Genome-Wide Association Study (GWAS) identified that alleles from the SNP rs12203592 (intron 4) is also associated with phenotypic variation regarding presence of freckles, hair, eye and skin pigmentation. Functional studies in human and mice melanin-containing cells revealed that such SNP is directly involved in the regulation of IRF4 expression, suggesting a clear role in melanocyte pigmentation. In spite of these findings, the regulatory and coding IRF4 diversities in admixed populations have not been evaluated so far. In order to verify if other variation sites spread across the IRF4 gene may be associated with human pigmentation, the regulatory (promoter and 3\'UTR regions) and coding (9 exons and flanking intronic regions, including the SNP rs12203592) regions were analyzed by next-generation sequencing procedures in a Brazilian admixed population sample. The population sample was composed of 228 unrelated individuals from the Ribeirão Preto area, São Paulo State, Brazil, which were stratified according to eye (blue, green, hazel, light-brown, and dark-brown), hair (red, blond, dark-blond, light-brown, dark-brown and black) and skin (light, intermediate and dark) pigmentation, as well as regarding the presence of freckles and intensity of hair greying. DNA libraries were prepared using the Haloplex Target Enrichment System (Agilent Technologies) and sequenced at the MiSeq platform (Illumina). CutAdapt, BWA and GATK software packages were used for trimming adaptor sequences, alignment and genotype calling, respectively. Missing alleles and haplotypes were inferred by using the PHASE method, although the known phase between variable sites (obtained by GATK) was taken into account. A total of 105 variation sites were identified. Only two of them presented genotype frequencies that did not fit Hardy- Weinberg equilibrium (HWE) expectations. Eighteen of these SNPs presented strong association with at least one pigmentation feature. However, if the conservative Bonferroni correction for multiple tests is taken into account, only two associations, both of them involving the rs12203592 SNP, remain significant: allele T associated with light skin and blue eyes. This result is in agreement with previous reports that the rs12203592*T allele leads to reduced IRF4 activation and reduced tyrosinase expression, leading to sun sensitivity and blue eyes. A total of 101 different haplotypes were inferred, and haplotype distribution was in agreement to HWE expectations. When haplotypes were subdivided in promoter, coding and 3\'UTR haplotypes, 17, 29 and 37 different haplotypes were observed, respectively. Various associations were identified, particularly involving the most frequent promoter haplotype, the two most frequent coding (only one of them with allele rs12203592*T), and the most frequent 3\'UTR, all of them with light skin, blue eyes, brown hair and hair greying. These results suggest that other variation sites besides rs12203592, when considered in a haplotypic background, are associated with human pigmentation.