Na última década tem sido possível reconstruir o genoma de bactérias e arquéias presentes em comunidades microbianas de ambientes naturais a partir de dados metagenômicos. Isso tem revolucionado nosso entendimento sobre a topologia da árvore da vida e a descoberta de novas capacidades metabólicas, bem como auxiliado na identificação mais acurada de genes de interesse industrial, visto que os dados estão mais completos e menos fragmentados. Com base neste contexto, o objetivo geral deste projeto foi reconstruir o genoma de bactérias ligadas a degradação de biomassa vegetal em comunidades microbianas da compostagem, focando em análises de diversidade de enzimas de Glicosil Hidrolases (GHs), a partir de dados de sequências metagenômicas gerados no projeto temático processo 11/50870-6. Para alcançar os nossos objetivos, foram desenvolvidos pipelines computacionais com softwares já disponíveis na literatura e foram utilizados dois conjuntos principais de dados de sequenciamento massivo (um conjunto de dados seriados que engloba inúmeros estágios do processamento da compostagem e um conjunto de dados do metagenoma de um consórcio microbiano celulolítico e termofílico construído a partir de amostras da compostagem). Foram reconstruídos 13 genomas (sete genomas em amostras dos dados seriados e seis genomas na amostra do consórcio microbiano), sendo identificado no mínimo quatro novas espécies. As análises baseadas em filogenômica indicam a presença de pelo menos uma nova classe dentro do filo Firmicutes, uma nova espécie da família Paenibacillaceae e a reconstrução pela primeira vez do genoma da espécie Bacillus thermozeamaize. Também foram identificadas 33 lacunas/ilhas metagenômicas (IMs). Essas regiões apresentaram genes diretamente ligados a biossíntese de polissacarídeos do envelope celular, pseudogenes e proteínas hipotéticas. Algumas dessas proteínas estão diretamente ligadas ao reconhecimento de bacteríofagos durante a fase de infecção viral. A presença de IMs também indica uma divergência entre as populações microbianas presentes na compostagem com a espécie de referência. Quanto ao potencial de degradação de biomassa vegetal, todos os microrganismos apresentam genes com potencial para degradação de material lignocelulolítico durante o processamento de diferentes estágios da compostagem, indicando a importância do papel funcional dessas bactérias na compostagem. / In the last decade it has been possible to reconstruct Bacteria and Archaea genomes that are in natural microbial communities from metagenomic samples. This has revolutionized our understanding of the topology of the tree of life and the discovery of new metabolic functions, as well as aided in more accurate identification of industrial bioprospecting genes, since the genomic data are more complete and less fragmented. Based on this background, the aim of this project was to reconstruct the bacterial genomes linked to plant biomass degradation in composting communities, focusing on diversity analysis of Glycosyl Hydrolases (GHs) from metagenomic sequence data generated in the Thematic Project (Process 11/50870-6). To achieve our objectives, computational pipelines have been developed (this pipelines were based on software already available in the literature) and we use these pipelines in two massive data sets generated by high-throughput sequencing (one data set of time series compost sample which includes several stages of the composting process and other data set from a cellu- lolytic and thermophilic microbial consortium). Thirteen genomes were reconstructed (seven genomes from time series metagenomic data and six genomes from microbial consortium). At least four new species have been identified, and the analyzes based on phylogenomic inferences indicate the presence of at least one new class of Firmicutes phylum, and a new Paenibacillaceae family and the reconstruction for the first time the Bacillus thermozeamaize genome. They also identified 33 gaps/metagenomic Islands (IMs). These gaps had genes directly linked to polysaccharide biosynthesis of the cell envelope, pseudogenes and hypothetical proteins. Some of these proteins are directly linked to the bacteriophage during the recognition phase of viral infection. The presence of gaps also indicates a divergence between microbial populations present in the compost with the reference genome. All microbial genomes reconstructed in this studyhave genes linked to lignocellulolytic potential degradation during the different stages of composting process, indicating the functional role this bactéria in this environment.

La transferencia horizontal de genes (HGT) ha sido uno de los temas más debatidos en biología evolutiva durante las últimas dos décadas debido a que esto ha desafiado considerablemente nuestra visión acerca de la historia evolutiva de los genomas. En el caso de organismos procariotas como las bacterias, la adquisición de genes de otros individuos alejados filogenéticamente les ha permitido producir genomas extraordinariamente heterogéneos y dinámicos cambiando por tanto, la ecología y la patogenicidad de las especies bacterianas (Maiden 1998; Gogarten et al., 2002; Ochman et al., 2000). En eucariotas también se ha registrado la ocurrencia de eventos de HGT, los cuales incluyen a un gran número de genes provenientes de varios donadores en los rotíferos de la clase Bdelloidea (Gladyshev et al., 2008) o la transferencia de genes de la bacteria intracelular Wolbachia dentro del genoma de sus hospederos artrópodos (Hotopp et al., 2007). En plantas, el modelo mejor conocido sigue siendo el del género Agrobacterium cuyo mecanismo de infección involucra la transferencia e integración de una región del plásmido Ti al genoma de la célula vegetal. El impacto de este hallazgo ha tenido grandes aplicaciones en diversos campos de la biología vegetal, agricultura y biotecnología. Sin embargo, el descubrimiento de secuencias homólogas al T-DNA del plásmido Ri de Agrobacterium rizhognenes en el genoma de especies del género Nicotiana (White et al., 1983; Furner et al., 1986), Daucus carota “zanahoria” (Spano et al., 1982) y Convulvus arvensis (Tepfer, 1982) han evidenciado que la ocurrencia de este tipo de eventos actúan como una fuerza significativa en la evolución de genomas eucariotas (Richardson y Palmer, 2007; Bock, 2010; Talianova y Janousek, 2011). La importancia de estos hallazgos incrementa la necesidad de realizar más investigaciones para entender el mecanismo de flujo horizontal de genes a través de bacterias en la evolución de plantas superiores, por lo que el presente trabajo de tesis pretende identificar y caracterizar la presencia de secuencias homólogas al T-DNA del plásmido Ti de Agrobacterium spp. en el genoma de Ipomoea batatas (L.) Lam “camote” y especies silvestres relacionadas, con el fin de evidenciar la ocurrencia de eventos de HGT en este género y el posible impacto de este hallazgo en su evolución. / Tesis

Seleção balanceadora é definida como aquela que aumenta a variabilidade genética de populações em relação ao esperado sob neutralidade. Uma expectativa sobre seus efeitos é a redução da diferenciação populacional nos genes onde atua. Contudo, regimes que mantêm conjuntos distintos de alelos em diferentes populações poderiam resultar em aumento de diferenciação populacional. Com o objetivo de compreender melhor os efeitos da seleção balanceadora sobre a distribuição da variação genética entre populações, investigamos a diferenciação populacional em genes dos Antígenos Leucocitários Humanos (HLA, do inglês, Human Leukocyte Antigen), que são os genes mais polimórficos do genoma humano e o exemplo mais clássico de seleção balanceadora em humanos. As proteínas HLA são responsáveis pela apresentação de peptídeos aos linfócitos T, mediando uma etapa crítica da resposta imune. A vantagem da manutenção de variação nesses genes está possivelmente associada à capacidade de resposta a uma maior diversidade de patógenos. Neste estudo, analisamos dados do projeto 1000 Genomas (1000G), que sequenciou indivíduos de diferentes populações usando sequenciamento de nova geração (NGS, do inglês, Next Generation Sequencing). Essa técnica de sequenciamento é conhecidamente problemática quando aplicada a regiões altamente polimórficas, como os genes HLA. Por isso, avaliamos a confiabilidade dos genótipos e frequências alélicas estimados a partir dos dados do 1000G nos genes HLA, utilizando como padrão ouro dados de sequenciamento Sanger de 930 das 1092 amostras do 1000G. Encontramos um viés de superestimativa da frequência do alelo referência em alguns polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs, do inglês, Single Nucleotide Polimorphisms), indicando que viés de mapeamento é uma causa importante de erros nos dados do 1000G. Esses resultados são relevantes para a compreensão dos desafios do uso de dados de NGS em outras regiões de alta diversidade. Usando os resultados dessa análise, excluímos de nosso estudo de diferenciação populacional sítios com estimativas de frequências alélicas pouco confiáveis nos dados do 1000G. Em uma segunda etapa de controle metodológico, demonstramos o efeito do uso de dados ricos em variantes raras em estudos de diferenciação populacional. Controlando para esse efeito, e usando apenas sítios que demonstramos ser confiáveis em nossos dados, descobrimos que a diferenciação populacional de SNPs nos genes HLA é menor que a diferenciação de SNPs em outras regiões do genoma. Esse resultado aponta para um papel predominante de pressões seletivas globais na distribuição da variação genética de HLA entre populações. Contudo, apresentamos também evidências de que a diferenciação populacional de haplótipos nos genes HLA pode ser maior do que a observada no nível dos SNPs, sugerindo que pressões locais podem influenciar a distribuição de haplótipos entre populações. Nossos achados indicam que é possível reconciliar baixa diferenciação populacional em SNPs com maior diferenciação em haplótipos, possivelmente sujeitos a pressões seletivas locais. / Balancing selection is defined as any kind of selective regime that increases genetic variability in populations relative to what is expected under neutrality. Theory predicts that balancing selection reduces population differentiation. However, balancing selection regimes in which different sets of alleles are maintained in different populations could increase population differentiation. To better understand the effects of balancing selection on the distribution of genetic variation among populations, we investigated population differentiation at the Human Leukocyte Antigen (HLA) genes, which are the most polymorphic genes in the human genome, and constitute the most striking example of balancing selection in humans. The HLA molecules are responsible for the presentation of peptides to T cells, thus mediating a critical step of the immune response. The advantage of maintaining variation in those genes through balancing selection is possibly related to the increased ability of the immune system to respond to a wider variety of pathogens. In this study, we analysed the public dataset of the 1000 Genomes project (1000G), which sequenced 1092 individuals from different populations using Next Generation Sequencing (NGS) technologies. These sequencing techniques are known to be problematic when applied to highly polymorphic genomic regions, such as the HLA genes. Therefore, we evaluated the reliability of genotype calls and allele frequency estimates of the SNPs reported by 1000G at HLA genes, using Sanger sequencing data of 930 of the 1092 1000G samples as a gold standard. We found a bias towards overestimation of reference allele frequency for some single nucleotide polymorphisms (SNPs), indicating mapping bias is an important cause of error in frequency estimation in the 1000G data. These results provide insights into the challenges of using of NGS data at other genomic regions of high diversity. Using the results of this analysis, we selected a list of sites that have reliable allele frequency estimates in the 1000G data to be used in our population differentiation study. In another methodological control, we demonstrate the effect of using a dataset rich in rare variants in population differentiation studies. Controlling for this effect, and using only the sites which we demonstrated that were reliable, we found that population differentiation of single nucleotide polymorphisms (SNPs) at the HLA genes is lower than that of SNPs in other genomic regions. This suggests a predominant role of global selective pressures in shaping the distribution of variation at the HLA genes among populations. However, we also show evidence that population differentiation of HLA haplotypes may be higher than what we observe at the SNP level, suggesting that local selective pressures may influence the distribution of haplotypes among populations. Altogether, our results indicate that it is possible to reconcile low population differentiation at the SNP level - as predicted by theory - to higher differentiation at haplotypes, which are possibly under local selective pressures.

Doctor en Ciencias de la Ingeniería, Mención Ingeniería Química y Biotecnología / Streptomyces leeuwenhoekii C34 es una nueva cepa que fue aislada desde la laguna Chaxa ubicada en el Desierto de Atacama, Chile. Esta cepa produce metabolitos especializados con actividad contra Staph. aureus resistente a meticilina (MRSA): chaxamicinas y chaxalactinas. La secuencia genómica de S. leeuwenhoekii C34 se obtuvo mediante las tecnologías de Illumina Miseq y PACbio RS II SMRT. El genoma se utilizó para identificar clústers de genes biosintéticos (BGCs) que codifican para metabolitos especializados a través de minería de genomas, y para desarrollar un modelo a escala genómica (GSM) para estudiar las rutas de biosíntesis de producción de metabolitos especializados. Se encontraron 34 BGCs en el genoma de S. leeuwenhoekii C34, más un BGC ubicado en el plásmido pSLE2. Se encontró tres BGCs para lazo-péptidos. Específicamente, se identificó el producto del BGC del lazo-péptido 3 en el sobrenadante de S. leeuwenhoekii C34 cultivado en medio TSB/YEME y se expresó exitosamente en el huésped heterólogo S. coelicolor M1152. Se confirmó que este lazo-péptido era el mismo que la chaxapeptina, recientemente descrita para S. leeuwenhoekii C58. Por otra parte, se identificó un BGC de 64 kb (locus 1083651 a 1147687) que codifica para un híbrido trans-AT PKS/NRPS. Es probable que el producto de este BGC sea un compuesto halogenado debido a la presencia de un gen, sle09470, que codifica para una enzima cloradora. Para estudiar este clúster de genes, se desarrollaron diferentes cepas derivadas de S. leeuwenhoekii. También, el BGC se clonó en huéspedes heterólogos: S. coelicolor M1152, M1154 and S. albus. A través de análisis de HPLC MS/MS y comparación de perfiles de metabolitos, se identificó un grupo de compuestos con patrón clorado, sin embargo se descartaron como posibles productos del BGC ya que además de encontrarse en las cepas de S. leeuwenhoekii también se encontraron en muestras de S. coelicolor M1152. Por otra parte, se detecto un metabolito con una señal de m/z 611.53 [M + H]+ solamente en las muestras de S. leeuwenhoekii M1614 ( chaxamycin BGC) y M1619 ( chaxamycin BGC; sle09560). Se requieren msá estudios para confirmar si los metabolitos expresados diferencialmente corresponden a un producto del híbrido transAT-PKS/NRPS BGC. Para construir el GSM de S. leeuwenhoekii C34 se desarrolló una interfaz basada en python, que permite: buscar genes de Streptomyces asociados a reacciones en la base de datos KEGG, realizar BLAST local contra S. leeuwenhoekii C34, comparar los dominios de proteínas, descargar información de los metabolitos, construir el GSM y realizar simulaciones usando COBRApy. Las rutas biosintéticas de chaxamicinas, chaxalactinas, desferrioxaminas, ectoina y el producto del híbrido transAT-PKS/NRPS BGC (híbrido PK-NP) se incluyeron en el modelo. El modelo, iVR1007, consiste de 1722 reacciones, 1463 metabolitos y 1007 genes, y se validó usando información experimental de crecimiento en diferentes fuentes de carbono, nitrógeno y fósforo, mostrando un 83.7 % de precisión. El modelo se usó para encontrar deleción y sobre-expresión de genes no intuitivas que predicen un aumento en la producción de precursores de chaxamicinas, chaxalactinas e híbrido PK-NP. Las modificaciones predichas podrán ser usadas para realizar ingeniería metabólica de S. leeuwenhoekii C34 para incrementar la producción de metabolitos especializados.

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-29Bitstream added on 2014-08-13T18:01:11Z : No. of bitstreams: 1 000736017_20140829.pdf: 268216 bytes, checksum: d24c916cb4f2f5d62140603bab304a45 (MD5) Bitstreams deleted on 2014-10-03T16:24:43Z: 000736017_20140829.pdf,Bitstream added on 2014-10-03T16:27:41Z : No. of bitstreams: 2 000736017_20140829.pdf.txt: 31163 bytes, checksum: e21dedff28a6a8d49196eb12ad922ee5 (MD5) 000736017.pdf: 1092117 bytes, checksum: 23730ac0c228da8c6df28821beccf960 (MD5) Bitstreams deleted on 2014-10-03T16:33:17Z: 000736017.pdf,Bitstream added on 2014-10-03T16:43:31Z : No. of bitstreams: 2 000736017_20140829.pdf.txt: 31163 bytes, checksum: e21dedff28a6a8d49196eb12ad922ee5 (MD5) 000736017.pdf: 1092117 bytes, checksum: 23730ac0c228da8c6df28821beccf960 (MD5) Bitstreams deleted on 2014-10-03T16:48:57Z: 000736017.pdf,Bitstream added on 2014-10-03T16:49:48Z : No. of bitstreams: 1 000736017.pdf: 1092117 bytes, checksum: 23730ac0c228da8c6df28821beccf960 (MD5) Bitstreams deleted on 2014-10-27T11:47:13Z: 000736017.pdf,Bitstream added on 2014-10-27T11:48:06Z : No. of bitstreams: 1 000736017.pdf: 1092117 bytes, checksum: 23730ac0c228da8c6df28821beccf960 (MD5) / As β-defensinas são as proteínas mais amplamente estudadas dentre as três subfamílias das defensinas, uma vez que possuem extensa atividade antimicrobiana e são produzidas por vários tipos de células epiteliais, fornecendo assim proteção às membranas das células do hospedeiro. Em mamíferos, além de sua atividade antimicrobiana, essas proteínas atuam na maturação do espermatozoide, na capacitação espermática, na proteção do espermatozoide contra a resposta imune da fêmea e na expressão diferenciada e específica nos tecidos reprodutivos, sugerindo assim, uma importante função na reprodução e na fertilidade. O painel de linhagens celulares híbridas irradiadas (painel RH) construído para o genoma do búfalo (BBURH5000) vem sendo utilizado com sucesso nos estudos de mapeamento dos cromossomos bubalinos. A estratégia do mapeamento RH, ou seja, a utilização do painel RH associado a análises estatísticas, determina a ordem linear de marcadores nos cromossomos, sendo uma importante ferramenta para a construção de mapas físicos de alta resolução do genoma, e também na construção de mapas comparativos entre espécies. O presente trabalho teve por objetivo utilizar o painel BBURH5000 para mapear um conjunto de genes das β-defensinas no cromossomo 14 bubalino (BBU14) e a construção de um mapa comparativo in silico entre o BBU14 e seu homólogo em bovino. Para tal, foram testados com DNA bubalino, sequências de iniciadores para PCR provenientes de oito genes das β-defensinas, localizados no cromossomo 13 bovino (BTA13), o qual é homólogo ao BBU14. Do total de marcadores testados, seis amplificaram produtos de PCR adequados ao mapeamento utilizando o painel BBURH5000. No entanto, dois marcadores foram excluídos na etapa de genotipagem. A frequência de retenção dos marcadores no painel apresentou uma variação de 16,66% com o marcador BBD125 a 20,00% com ... / The β-defensins are proteins most widely studied of the three subfamilies of defensins, because have extensive antimicrobial activity and are produced by several types of epithelial cells, thereby providing protection to the membranes of host cells. In mammals, in addition to their antimicrobial activity, these proteins act in the maturation of spermatozoa, in sperm capacitation, in protecting the sperm against the female immune response and specific and differential expression in reproductive tissues, thus suggesting an important role in reproduction and fertility. The radiation hybrid panel (RH panel) constructed for buffalo genome (BBURH5000) has been successfully used in mapping studies of buffalo chromosomes. The RH mapping strategy, in other words, use of RH panel associated statistical analysis, determines the linear order of markers on chromosomes and is an important tool for the construction of physical maps of high resolution genome and also in the construction of comparative maps between species. The present study has the purpose to use the BBURH5000 panel to map a set of β-defensins genes on buffalo chromosome 14 and the construction of a comparative map in silico between BBU14 and homologous bovine. To this end, we tested buffalo DNA sequences of primers for PCR from eight genes of β-defensins, located on bovine chromosome 13 (BTA13), which is homologous to BBU14. Of the markers tested, six amplified suitable PCR product to the mapping using BBURH5000 panel. However, two markers were excluded in step genotyping. The retention frequency of markers on the panel presented a variation of 16.66% with a marker BBD125 to 20.00% with markers BBD119 and BBD122. The comparative analysis in silico between the BBU14 RH map and the sequence map of BTA13 allowed to indicate the location of these markers on buffalo chromosome 14

O circovírus suíno tipo 2 (PCV2) é o principal agente envolvido na Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos Suínos (SMDS). Na maioria dos países onde a suinocultura tem expressiva importância econômica, a SMDS vem causando sérios prejuízos. Com o objetivo de contribuir para a caracterização genética de isolados brasileiros de PCV2, duas amostras autóctones foram clonadas e seqüenciadas na íntegra. Para tanto, o genoma viral foi extraído de tecidos de animais com SMDS e amplificado pelo método denominado “amplificação em círculo rolante com múltiplos primers” (ACRMP). Ambas seqüências apresentaram 1.767 nucleotídeos e diferiram entre si em apenas um nucleotídeo. A análise filogenética destas duas seqüências mostrou maior identidade com o grupo (1A) formado por isolados holandeses, franceses e chineses. Um isolado brasileiro previamente sequenciado, de Minas Gerais, foi classificado em outro grupo e a seqüência diferiu em até 16 nucleotídeos em relação aos isolados do Rio Grande do Sul. Na etapa seguinte desses estudos, visando o futuro desenvolvimento de vacinas, um dos genomas aqui seqüenciados foi transfectado em células de testículo de suíno (ST). Antígenos virais nas células transfectadas foram detectados por imunoperoxidase, demonstrando assim a infecciosidade do clone produzido. Entretanto, o clone infeccioso obtido não foi capaz de multiplicar-se a ponto de fornecer massa antigênica que viabilizasse a produção de uma vacina. Em vista disso, realizou-se uma tentativa de criar uma linhagem celular persistentemente infectada. Para isso, o DNA de PCV2 foi novamente transfectado em células ST com um plasmídeo contendo o gene de resistência a geneticin, visando a seleção de colônias celulares resistentes. Após a transfecção, porém, observou-se um efeito negativo na formação de colônias resistentes a esta droga. Este efeito foi dose-dependente em relação à quantidade de DNA de PCV2, o que impossibilitou o estabelecimento de uma linhagem celular persistentemente infectada. Isto pode estar relacionado com a expressão da proteína da ORF3 que induz apoptose ou à indução de citocinas, como interferons, embora outros mecanismos não possam ser excluídos, como efeito tóxico do alto número de cópias de genomas de PCV2. Analisando os resultados obtidos durante a realização destes estudos, conclui-se que as amostras de PCV2 circulantes no Brasil apresentam de identidade alta (99,09 %). / Porcine circovirus type 2 is the main etiological agent implicated in the postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in pigs. In countries with considerable swine production, PMWS is a major cause of economic losses. In order to perfom a genetic analysis on Brazilian PCV2 isolates, two PCV2 isolates inform the state of Rio Grande do Sul - Brazil, were cloned and fully sequenced. Viral genomes were extracted from tissues of animals with PMWS and amplified using multiply-primed rolling circle amplification (MPRCA). Both PCV2 sequences were 1,767 nucleotides long and differed in only one nucleotide from each other. Phylogenetic analysis of both sequences showed the highest sequence identity with a group of viruses (group 1A) that also harbors many Dutch, French and Chinese isolates. This suggests that the Brazilian PCV2 isolates examineed here might have been imported from one of such countries. Interestingly, a Brazilian isolate from Minas Gerais previously sequenced by others, was observed to belong to another group of PCV2 isolates and differs at 16 different sites from the isolates from Rio Grande do Sul. In order to develop a vaccine, one of the isolates here sequenced was transfected into swine testis (ST) cells. Viral antigens were detected in the transfected ST cells by immunoperoxidase, indicating that such PCV2 clone could give rise to infectious virus. However, the cloned virus was not able to multiply to high titers, what would be a major drawback in vaccine development. In attempting to solve this problem, the development of a PCV2- persistently infected cell line was targeted. PCV2 DNA was cotransfected with a plasmid carrying the geneticin resistance gene in order to allow clone selection by identification of geneticin resistant cells. However, the PCV2 DNA had a negative effect on the number of geneticin resistant colonies. Interestingly, this negative effect of PCV2 DNA was dose dependent and for this reason, it was not possible to establishing a persistently infected cell line. This might be linked to ORF3 protein expression, which induces apoptosis or production of interferon. Analyzing the results obtained in this study, the Brazilian PCV2 isolates had high identity (99.05 %).

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-09-05T16:40:12Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5411841 bytes, checksum: 2b648d950b659d781e03951504351692 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-05T16:40:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5411841 bytes, checksum: 2b648d950b659d781e03951504351692 (MD5) Previous issue date: 2015-07-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O advento das tecnologias de sequenciamento de nova geração possibilitou avanços significativos no campo do conhecimento dos genomas dos organismos. Com a redução dos custos de sequenciamento e aumento na rapidez do processamento das amostras, o número de genomas sequenciados e disponíveis em bancos de dados cresceu exponencialmente. Paralelamente, ocorreu um aumento na propagação de erros associados à anotação das sequências, que gera um impacto negativo em pesquisas posteriores baseadas nestes dados. A revisão da anotação e a comparação entre as informações disponíveis em bancos de dados públicos com experimentos de validação oferece uma alternativa para a correção desses erros. Neste contexto, este trabalho realizou a re- anotação e padronização de 14 genomas de leveduras de interese biotecnológico e disponíveis em bancos de dados públicos. Para facilitar a análise, os genomas foram separados em dois grupos: o grupo 1 (11 linhagens de Saccharomyces cerevisiae) e o grupo 2 (3 espécies de Kluyveromyces). Após a re-anotação, os proteomas preditos foram submetidos ao algoritmo de agrupamento OrthoMCL, para identificação de grupos de ortólogos e parálogos. As sequências ortólogas desses organismos, juntamente com comparações por similaridade com o banco de dados NR e com o banco de domínios conservados CDD, possibilitou a criação de bancos de dados locais com uma grande riqueza de informações, como link de acesso para os resultados do BLAST . Análise dos dados dos genomas permitiu a comparação da família de proteínas álcool desidrogenase (ADH) dentro dos grupos. Na linhagem S. cerevisiae JAY 291 não foi possível identificar o gene ADH7. Adicionalmente, o grupo 2 não possui sequências similares ao ADH5. / The advent of new generation sequencing technologies has made capable substancial advances at genomes organism knowledge field. Lower sequencing costs along with faster sample processing, has grown a number of sequenced genomes and available databases exponentially. At the same time, associated annotation sequences errors became more common, causing a negative impact for upcoming researchs based on those databases. Review of annotation and comparison between available public databases with validation experiments offer an alternative solution for error repairs. In this context, this research performed a re-annotation and standarization of 14 yeast genomes of biotechnological interest and available on public database domain. In order to facilitate analysis, genomes were separated in two groups: group 1 (11 Saccharomyces cerevisiae strains) and group 2 (3 Kluyveromyces species). After their re- annotation, predicted proteomes were submitted to the clustering algorithm OrthoMCL for identification of orthologues and paralogues groups. The orthologues sequences of those organisms along with similarity comparisons with NR database and conserved domain database CDD, enabled the creation of local databases with an abundance of information, such as acess link to BLAST results. Genome data analysis made possible the comparison of alcohol dehydrogenase family (ADH) within the groups. The S. cerevisiae JAY 291 strain was not able to identify gene ADH7. Additionallly, group 2 does not have similarity sequences to ADH5.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2014-08-06T18:05:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327726.pdf: 2295961 bytes, checksum: c15e851f205c598b58bb4eaa370c09f8 (MD5) Previous issue date: 2014 / O sequenciamento do genoma plastidial de coníferas vem sendo realizado por meio do isolamento do DNA total, seguido por amplificações do DNA plastidial através de PCR de longo alcance. Esse método de sequenciamento é mais trabalhoso do que o sequenciamento a partir DNA plastidial. O sequenciamento do genoma plastidial permite a realização de várias análises comparativas, como estudos filogenéticos, filogeografia, evolução e estrutura, localização de regiões repetidas, identificação de sítios de edição de RNA, entre outras. Dessa forma, o presente trabalho visou desenvolver um protocolo de isolamento de cloroplastos e DNA plastidial em coníferas e sequenciar o genoma plastidial do Podocarpus lambertii. O protocolo foi desenvolvido a partir da Araucaria angustifolia e Araucaria bidwilli (Araucariaceae), P. lambertii (Podocarpaceae) e Pinus patula (Pinaceae). O protocolo se baseia no isolamento plastidial a partir de um tampão salino, seguido por gradiente salino de Percoll. Essas duas estratégias combinadas, reduziram a contaminação e aumentaram o rendimento do DNA plastidial. O DNA plastidial foi sequenciado em sequenciador Illumina MiSeq, obtendo-se uma cobertura média do genoma de: 24,63 para A. angustifolia, 135,97 para A. bidwilli, 1196,10 para P. lambertii e 64,68 para P. patula. O genoma plastidial do P. lambertii é formado por 133.734 pb e apresentou a perda de uma das regiões invertidas repetidas. O genoma contém 118 genes únicos e 1 tRNA duplicado (trnN-GUU). Estruturalmente, o genoma plastidial do P. lambertii apresenta quatro grandes inversões de aproximadamente 20.000 pb quando comparado ao Podocarpus totara. O genoma plastidial do P. lambertii apresenta um total de 28 repetições em tandem e 156 simple sequence repeat (SSRs). Os resultados obtidos são inovadores uma vez que um protocolo viável para o isolamento de DNA plastidial de coníferas com alta qualidade e quantidade de DNA foi obtido. Adicionalmente, a sequência do genoma plastidial do P. lambertii revelou diferenças estruturais significativas, mesmo em relação à outra espécie do mesmo gênero. Os diversos SSRs encontrados no genoma plastidial do P. lambertii podem ser avaliados como regiões polimórficas intraespecíficas, que podem levar, entre outros, a estudos filogenéticos com maior sensibilidade.<br> / Abstract : Plastid genome sequencing protocols for conifer species have been based mainly on long-range PCR, which is known to be time-consuming and difficult to implement than sequencing from isolated plastid DNA. Plastid genome sequencing are useful for several comparative analyzes, as phylogeny, phylogeography, evolution and structure, location of repeated regions, identification of RNA editing sites, among others. Thus, this study aimed to develop a protocol for chloroplast and plastid DNA isolation in conifers and sequence the chloroplast genome of Podocarpus lambertii. The protocol was developed using Araucaria angustifolia and Araucaria bidwilli (Araucariaceae), P. lambertii (Podocarpaceae) and Pinus patula (Pinaceae) species. The protocol is based on plastid isolation with saline buffer followed by saline Percoll gradient. These two combined strategies reduced contamination and increased the plastid DNA yield. The plastid DNA was sequenced in MiSeq Illumina sequencer, and the average genome coverage were 24.63 to A. angustifolia, 135.97 to A. bidwilli, 1196.10 to P. lambertii, and 64.68 to P. patula. The chloroplast genome of P. lambertii is 133.734 bp in length and lacks one of the inverted repeat regions. The genome contains 118 unique genes and one duplicated gene, the tRNA (trnN-GUU). Structurally, the plastid genome of P. lambertii shows four large inversions of approximately 20,000 bp compared to Podocarpus totara. The plastid genome of P. lambertii shows a total of 28 tandem repeats and 156 simple sequence repeat (SSR). Results show that this improved protocol is suitable for enhanced quality and yield of chloroplasts and cpDNA isolation from conifers. Additionally, the sequence of the plastid genome of P. lambertii revealed significant structural differences, even in relation to other species of the same genus. The various SSRs found in the plastid genome of P. lambertii can be evaluated for intraspecific polymorphic regions, which may allow highly sensitive phylogeographic and population structure studies, as well as phylogenetic studies of species of this genus.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Jurídicas. Programa de Pós-Graduação em Direito. / Made available in DSpace on 2012-10-21T07:19:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / O presente trabalho versa sobre o direito de conhecer a ascendência biológica como uma dimensão do direito à identidade pessoal. Sua análise foi realizada a partir do referencial do vínculo intergeracional apreendido pela construção do princípio ético da responsabilidade. A abordagem realizada representa uma crítica ao enfoque tradicionalmente realizado, que se limita à relação de filiação, objetivando estabelecer, em determinadas situações, uma relação necessária entre o vínculo genético e o vínculo da filiação. O primeiro capítulo trata do advento da "era genômica", pontuando seus riscos e benefícios e introduzindo conceitos técnico-científicos que possuem natureza instrumental nesse trabalho. O segundo capítulo versa sobre o princípio ético da responsabilidade na geração da vida por meio de uma perspectiva relacional, defendendo a necessidade de ascensão ética na abordagem da presente temática. No terceiro capítulo foi realizada uma abordagem panorâmica dos textos normativos, com o objetivo de identificar as correntes quanto à consagração do direito de conhecer a própria ascendência genética, bem como identificar questões jurídicas que devem ser superadas para a sua plena proteção, tais como a admissão do princípio do anonimato nos processos de adoção e de reprodução assistida e a admissão da submissão compulsória ao exame genético. No quarto capítulo, considerando o direito à identidade pessoal como critério norteador para a delimitação do direito à ascendência biológica, partiu-se para a análise da construção e apreensão de sua multidimensionalidade. Investigou-se a natureza jurídica do direito de conhecer a ascendência biológica, investigou-se sobre sua natureza jurídica, a partir da teoria dos direitos da personalidade para encontrar nos direitos fundamentais o campo mais apropriado para o seu desenvolvimento. A revelação dessa natureza permitiu analisar os fenômenos dos encontros e desencontros entre descendência biológica e filiação, evidenciando-se a condição de direito autônomo e não como parecia concluir a construção doutrinária tradicional como mero elemento norteador para o estabelecimento do vínculo da filiação. Ao final, buscou-se enfrentar questões que obstaculizam o pleno reconhecimento e efetivação do direito à ascendência biológica, identificadas na abordagem normativa realizada. A conclusão reflete acerca da necessidade da abordagem ética desse direito para se alcançar a sua exata delimitação.

Made available in DSpace on 2015-07-13T12:10:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-17. Added 1 bitstream(s) on 2015-07-13T12:25:14Z : No. of bitstreams: 1 000835692.pdf: 541240 bytes, checksum: bec6b6659cf4eaceddcb3c897b0c930f (MD5) / Em bovinos da raça Brahman criados no Brasil a diversidade genética pode diminuir ao longo dos anos e pode ser ainda menor para animais estabulados, além disso, espera-se que a variância fenotípica de características reprodutivas pode ser pouco explicada pela variância genética. Portanto, objetivou-se avaliar o comportamento da diversidade genética durante um período de 18 anos e de animais estabulados por meio da análise de pedigree e estimar os parâmetros genéticos para as características idade ao primeiro parto (IPP), intervalo entre partos (IEP), reconcepção (REC) e habilidade de permanência (HABP) em bovinos da raça Brahman, visando o desenvolvimento de estratégias de seleção para o progresso genético da raça. O pedigree foi analisado de três maneiras: considerando toda a informação de pedigree (Pt); dividindo as informações de pedigree em dois períodos de 1994 a 2004 (P1) e de 2005 a 2012 (P2), de acordo com nível médio endogâmico; e dividindo os dados de pedigree de acordo com a condição de criação dos animais, a pasto (Ppasto) e estabulado (Pest). Os valores dos coeficientes endogâmicos (F) foram de 0,31%, 0,07%, 0,50%, 0,30% e 0,22% para Pt, P1, P2, Ppasto, Pest, respectivamente. Os intervalos de geração (IG) para Pt, P1, P2, Ppasto, Pest foram de 4,73, 3,35, 4,50, 4,65, 4,81 anos, respectivamente. Para os resultados dos parâmetros com base na probabilidade de origem do gene: número de fundadores (Nf), número efetivo de fundadores (fe), número efetivo de ancestrais (fa) e número efetivo de genomas remanescentes (fg), fe > fa > fg em todas as situações e ocorreu uma diminuição nos valores dos parâmetros estimados entre períodos (P1 e P2) e entre condição de criação (Ppasto e Pest). As razões fe/fa e fg/fe foram próximas de 1, indicando que não houve gargalo genético e que o processo de deriva genética foi pequeno. Para estimar os parâmetros... / The genetic diversity in Brahman cattle in Brazil may decrease over the years and can be even lower for stabled animals, moreover, it is expected that the phenotypic variance of reproductive characteristics can be little explained by genetic variance. The aims of this study were to evaluate the behavior of genetic diversity over a period of 18 years and stabled animals by pedigree analysis and estimates genetic parameters for ge at first interval (IPP), calving interval (IEP), reconception (REC) and stayability (HABP) reproductive traits of Brahman cattle in Brazil, aiming to develop selection strategies for genetic progress of breed. The pedigree was analyzed in three ways: considering all the pedigree information (Pt); dividing the pedigree information in two periods from 1994 to 2004 (P1) and from 2005 to 2012 (P2), according inbreeding; and dividing the pedigree data according to breeding management of animals on pasture (Ppasto) and stabled (Pest). Coefficient inbreeding (F) values were 0,31%, 0,07%, 0,50%, 0,30% and 0,22% for Pt, P1, P2, Ppasto, Pest, respectively. Generation intervals (IG) values for Pt, P1, P2, Ppasto, Pest were 4,73, 3,35, 4,50, 4,65, 4,81 years, respectively. For the results of the parameters based on the probability of gene origin: number of founders (Nf), effective number of founders (f e ), effective number of ancestors (f a ) and founder genome equivalents (f g ), in all situations f e > f a > f g and there was a decrease in values of estimated parameters between periods (P1 e P2) and between breeding management (Ppasto e Pest). Values close to 1 observed for f e /f a and f g /f e show no genetic bottleneck and the process of genetic drift was small. For estimate the genetic parameters for reproductive traits, two-trait analyzes were used, using the linear animal model for IEP and IPP and the animal threshold model for REC and HABP. The mean heritability were ...