Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Heloisa Sobreiro Selistre de Araujo / Banca: Ana Paula Ulian de Araujo / Resumo: Neste trabalho foi realizado o isolamento do cDNA e do gene que codifica a proteína semelhante à Pho85p de Saccharomyces cerevisiae, em Neurospora crassa. Um fragmento de 1,1 kb correspondendo à seqüência nucleotídica do gene em N. crassa foi amplificado e confirmado por sequenciamento, o qual foi utilizado no rastreamento de uma biblioteca de cDNA de N. crassa, resultando em um plasmídeo contendo a ORF que codifica a Ncpho85 e as seqüências upstream e downstream à ORF. Este inserto foi seqüenciado, a ORF isolada apresentou 1014 bp, a região upstream contém 304 bp e a downstream 561 nucleotídeos. Após sequenciamento do cDNA, a seqüência polipeptídica da proteína foi comparada com outras proteínas semelhantes à Pho85p de fungos miceliares, leveduriformes além de S. cerevisiae. Esta ORF isolada foi utilizada no rastreamento de uma biblioteca genômica de N. crassa, possibilitando o isolamento de um plasmídeo contendo a seqüência genômica, o qual foi submetido a sequenciamento. No inserto foi possível confirmar a presença do intron (de 89 bp) no nucleotídeo 69, confirmando os dados existentes no banco de dados de N. crassa. A expressão do gene foi analisada ao longo do crescimento do fungo, em diferentes meios de cultivo, através de experimentos de Northern blot. A presença de duas bandas de hibridização, uma de 2,2 kb e uma 2,7 kb foi observada em todos os experimentos realizados. Um pico de expressão dos dois transcritos ocorreu no tempo de 12 horas, sendo mais evidente para o transcrito de menor tamanho, o qual seria o transcrito do cDNA isolado anteriormente. Resultados preliminares da expressão da proteína ao longo do crescimento do fungo foram obtidos por Western blot. Apenas uma banda da proteína foi observada, a qual apresentou o tamanho aproximado de 40 kDa, próximo ao tamanho da proteína NcPHO85, deduzida a partir da seqüência do cDNA. / Abstract: In this study we performed the isolation of the cDNA and the gene that codes for the Pho85p-like protein from Saccharomyces cerevisiae in Neurospora crassa. A fragment of 1.1 kb corresponding to the nucleotide sequence of the gene from N. crassa was amplified by PCR and confirmed by DNA sequencing. This fragment was used to screen a N. crassa cDNA library resulting in a plasmid containing the ORF plus and the upstream and downstream regions. The insert from the plasmid was sequenced and the ORF showed to have 1014 bp, whereas the upstream and downstream regions had 304 bp and 561 bp, respectively. After sequencing the cDNA, the polypeptide sequence was compared to the same protein from mycelial fungi and yeasts. The isolated ORF was used to screen a N. crassa genomic library leading to the isolation of a plasmid containing the genomic sequence. After DNA sequencing the insert showed the presence of an intron (89 bp) starting at nucleotide 69. This result was in agreement with the information from the N. crassa database. Gene expression analysis during the vegetative growth in different media was performed by Northern blot. Two hybridization bands were observed in the experiments, one of 2.2 kb and another one of 2.7 kb. The maximum expression of both transcripts happened at 12 h of growth, this was more pronounced for the smaller transcript, which probably is the transcript of the isolated cDNA. Preliminary results of protein expression during vegetative growth were obtained by Western blot analysis. Only one band with approximately 40 kDa was observed, the expected size for the NcPHO85 protein sequence deduced from the cDNA sequence. In order to evaluate the role of this protein in glycogen metabolism and in other cellular functions in N. crassa we started the gene inactivation. / Mestre

Hoje a criação de avestruz ((Struthio camelus, Linnaeus 1758)) é uma atividade de grande potencial, porém não existem padrões definidos sobre a histologia do seu fígado, que é um órgão de grande importância no metabolismo, o conhecimento de sua histologia e anatomia pode contribuir para a detecção de doenças e deficiências nutricionais que influenciam no crescimento e desenvolvimento do animal. Os objetivos desta pesquisa são: Estudar a anatomia e histologia do fígado e a ramificação de sua artéria hepática, veia porta hepática e ducto biliar. Para a realização da parte macroscópica foram utilizados quinze avestruzes com idades entre 12 e 18 meses (com peso médio em torno de 80 a 100 kg), provenientes do abatedouro Don Pig, situado próximo à cidade de Botucatu no estado de São Paulo. Os animais foram abatidos com pistola pneumática e posteriormente submetidos a sangria. Foram injetadas com látex a artéria hepática, o ducto biliar e a veia porta. O fígado dos avestruzes apresentam dois lobos (direito e esquerdo). No caso o direito é maior que o esquerdo e ambos são subdivididos em dorsal, intermédio e ventral. Além disso, amostras do fígado foram processadas para a observação em microscopia de luz e microscopia eletrônica de transmissão (MET). A hematoxilina e eosina (H.E), picrossírius, Gordon e Sweets, Sudan black e o ácido peródico de Schiff (PAS) são colorações usadas respectivamente para observar a morfologia do fígado, colágeno, fibras reticulares, gordura e glicogênio. Foram encontrados os espaços porta- hepáticos (artéria hepática, veia porta e ducto biliar e as veias centrolobulares). O glicogênio presente mostrou a média de 5,68%. O conteúdo lipídico, conferiu um aspecto goticular compatível com um quadro de esteatose hepática e a média obtida foi de 9,83%. Foi encontrado colágeno ao redor dos espaços porta-hepáticos, artérias centrolobulares e capilares sinusóides e a média foi de 14,71%. Encontrou-se também fibras reticulares ao redor dos capilares sinusóides e a média foi de 5,96%. Quanto à MET notou-se que no citoplasma dos hepatócitos desses animais existem numerosas mitocôndrias, glicogênio, muitas gotas de gordura, alguns lisossomos, retículo endoplasmático granular ao redor das mitocôndrias, algumas células estreladas, eritrócitos, núcleo, célula em degeneração e o canalículo biliar ao centro. Provavelmente o quadro sugestivo de esteatose é resultante do estado nutricional dos animais, já que nenhum outro aspecto relevante foi encontrado. Como estas aves são destinadas ao abate, sua alimentação é formulada para que os animais apresentem rápido desenvolvimento e alto ganho de peso, provavelmente com níveis de lipídios acima do necessário, causando uma deposição de micelas de gordura nos hepatócitos. Estes resultados demontraram que os hepatócitos dos avestruzes são muito simulares as outras aves apesar de também serem muito similares na estrutura das células do fígado de mamíferos. / At present the ostrich (Struthio camelus) breeding has been showing a great economical potential, although yet there are not distinct patterns about the histology of its liver, which is an organ of key importance in terms of metabolism. The knowledge of its histology and anatomy can help the detection of diseases and nutritional deficiencies that affect the growth and development of this bird. The aims of this work are to study the liver anatomical and histological structure and the branching of the hepatic artery, hepatic portal vein and bile duct. In the macroscopic study 15 ostriches with an average age of 12-18 months and average weight of 80-100 Kg, proceeding from Don Pig Abatteur, located next to Botucatu, São Paulo, were used. The birds were slaughtered with air gun and subsequently submitted to bleeding. The hepatic artery, the bile duct and the hepatic portal vein were injected with latex. The ostrich liver presents two lobules (right and left), being the right one larger than the left and both are subdivided into dorsal, intermediate and ventral. Liver samples were processed for light and electron transmission microscopic studies. Hematoxilin and eosin (HE), picrosirius, Gordon and Sweets, Sudan black and Schiff periodic acid (PAS) were respectively used to observe the liver morphology, collagen, reticular fibers, lipids and glycogen. The liver portal spaces were determined (hepatic artery, portal vein, bile duct and centrolobular veins). An average of 5.68% of glycogen was observed. The lipidic content provided a droplet aspect compatible to hepatic esteatosis, with an average of 9.83%. Collagen fibers around the liver portal spaces, centrolobular arteries and sinusoidal cappilaries were detected, at an average of 14.71%, as well as reticular fibers located in the vicinity of sinusoidal capillaries with an average of 5.96%. Through transmission electron microscopy we noticed in the hepaticyte cytoplasm the presence of numerous mithocondria, glycogen, several lipidic droplets, some lysosomes, granular endoplasmatic reticulum around the mithocondria, some stellate cells, erythrocytes, nucleus and degenerating cells, besides the central biliary canaliculus. The suggestive steatotic results might result from the animals nutritional status, once no other relevant aspect was detected. The birds are slaughtered for food comsumption and their ration is balanced striving for faster growth and higher weight gains, which are achieved through extra lipidic levels, motivating deposition of lipidic micelles in the hepatocytes. Our results demonstrated that ostrich and other birds hepatocytes are very similar.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica / Made available in DSpace on 2012-10-25T20:16:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / O uso de plantas medicinais representa uma alternativa aos tratamentos clássicos realizados com fármacos industrializados. Os compostos fenólicos, principalmente os flavonóides, têm apresentado propriedades farmacológicas importantes, representando um alvo terapêutico promissor. Precursores de flavonóides, como as chalconas, também tem despertado interesse dos pesquisadores quanto a possíveis efeitos na diabetes. O objetivo do presente trabalho foi estudar a atividade anti-hiperglicêmica de frações e compostos isolados e/ou sintetizados a partir das fontes naturais. Os flavonóides isolados foram avaliados na atividade das ?-glicosidases. A espécie Ilex paraguariensis foi estudada quanto às propriedades fitoquímicas e biológicas na curva de tolerância à glicose e em modelos de diabetes induzidos experimentalmente, conteúdo de glicogênio hepático e muscular, inibição das enzimas ?-glicosidases e propriedades anti glicação. O estudo dos análogos de chalconas compreende a avaliação da glicemia de animais normais hiperglicêmicos e diabéticos submetidos ao tratamento com estes compostos, conteúdo de glicogênio, efeito nas dissacaridases intestinais, além do estudo do mecanismo de ação dessas estruturas na captação de glicose pelo músculo sóleo, comparando com o efeito da insulina e secreção de insulina. Para tanto, foram utilizados ratos Wistar machos entre 50-55 dias de idade. Para a realização da curva de tolerância à glicose as coletas de sangue foram realizadas nos tempos 0, 15, 30, 60 e 180 min. Nos ensaios para determinação do conteúdo de glicogênio os tecidos foram retirados dos ratos após 3 h do tratamento. As atividades das dissacaridases intestinais foram realizadas a partir de homogenatos da porção duodeno do intestino delgado. Os flavonóides rutina, quercetina, canferol e canferitrina reduziram a atividade das dissacaridases similarmente à acarbose, adicionando o intestino como alvo destes compostos na regulação da homeostasia da glicose. As infusões e frações da Ilex paraguariensis reduziram a glicemia de ratos hiperglicêmicos, sendo que a fração acetato de etila garantiu índices glicêmicos semelhantes aos verificados em ratos normoglicêmicos. A fração n-butanol aumentou o conteúdo de glicogênio do fígado de ratos tratados, inibiu as enzimas maltase, sacarase e lactase e a fração acetato de etila reduziu a atividade da enzima maltase. As frações da Ilex paraguariensis preveniram o processo de glicação em 7, 14 e 28 dias de incubação, sendo verificado em 28 dias conteúdo glicado quase inexistente para as frações e infusões. Finalmente, as frações promoveram a secreção de insulina em diferentes tempos. Sendo assim, é sugerido que a espécie Ilex paraguariensis atue de forma secretagoga de insulina e, alternativamente, reduz a elevação da glicemia através da diminuição da absorção de glicose intestinal. As chalconas quinolínicas foram estudadas na curva de dose apresentando efeito dose-dependente, onde a dose de 20 mg/ kg dos análogos atingiram níveis glicêmicos próximos aos valores basais. Adicionalmente, QC4 e QC11 promoveram a redução da glicemia de animais diabéticos, aumentaram a captação de glicose pelo músculo sóleo, além do conteúdo de glicogênio muscular e hepático, sugerindo múltiplos alvos de ação para estas quinolonas. QC10 reduz a atividade da enzima maltase. Com exceção da QC2, as demais quinolonas promoveram a secreção de insulina em diferentes tempos. Sendo assim, além da ação secretagoga de insulina, estes compostos também possuem potencial efeito insulinomimético.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2009. / Made available in DSpace on 2012-10-24T10:45:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 270185.pdf: 5270255 bytes, checksum: 1644e312aa568d935e5c5bff4668b466 (MD5) / A diabetes é considerada uma patologia complexa e multifatorial de elevada morbidade e mortalidade e, por esse motivo, é considerada um problema significativo de saúde pública mundial. É caracterizada por distúrbios no metabolismo de carboidratos, proteínas e lipídios resultantes da absoluta ou relativa insuficiência na secreção e/ou ação da insulina. A classificação da diabetes melito está baseada na etiologia da doença e a divide clinicamente em duas formas básicas: tipo 1 e tipo 2 sendo que, a diabetes melito tipo 2 é a forma prevalente da doença estando presente em 90 a 95% dos casos. Muitas plantas são conhecidas na medicina popular de diferentes culturas pelas propriedades hipoglicemiantes e pelo uso crescente no tratamento da diabetes. Flavonóides são compostos fenólicos, derivados de plantas, que apresentam diversas propriedades e cujo potencial terapêutico é cada vez mais investigado. O presente trabalho teve como objetivos estudar os efeitos do extrato bruto, frações e compostos isolados das folhas da Averrhoa carambola na glicemia, na secreção de insulina e no conteúdo de glicogênio em ratos normais hiperglicêmicos. Além disso, estudar o mecanismo de ação do canferol-3-neohesperidosídeo, obtido da Cyathea phalerata, bem como da apigenina-6-C- -L-fucopiranosídeo (composto 1) e da apigenina-6-C-(2"-O- -L-ramnopiranosil)- -L-fucopiranosídeo (composto 2) na síntese de glicogênio muscular e na captação de glicose e comparar com o efeito estimulatório da insulina. Para tanto, foram utilizados ratos Wistar machos entre 50-55 dias de idade. Para a realização da curva de tolerância à glicose as coletas de sangue foram realizadas nos tempos zero, 15, 30, 60, 120 e 180 minutos. Nos ensaios para a determinação do conteúdo de glicogênio os tecidos foram retirados dos animais após 3 h da administração dos flavonóides. A síntese de glicogênio muscular e a captação de glicose foram estudadas após a incubação do músculo sóleo com os respectivos flavonóides e/ou insulina, na presença ou não de diferentes inibidores e do radioisótopo no período de 1 h. O extrato bruto, as frações acetato de etila, n-butanol e os flavonóides apigenina-6-C- -L-fucopiranosídeo (composto 1) e apigenina-6-C-(2"-O- -L-ramnopiranosil)- -L-fucopiranosídeo (composto 2) reduziram significativamente a glicemia de ratos normais hiperglicêmicos e potencializaram a secreção de insulina induzida por glicose. Além disso, os compostos 1 e 2 aumentaram o conteúdo de glicogênio no músculo sóleo e fígado após os tratamentos. A síntese de glicogênio foi estimulada significativamente pelo canferol-3-neohesperidosídeo e pela apigenina-6-C- -L-fucopiranosídeo. Este aumento foi mediado através da via da PI3K-PKB-GSK-3 e MAPK-PP1. A apigenina-6-C-(2"-O- -L-ramnopiranosil)- -L-fucopiranosídeo (composto 2) estimulou a captação de glicose no músculo sóleo através de uma via, pelo menos parcialmente comum, à via de sinalização da insulina. Os resultados da ação dos flavonóides estudados neste trabalho na regulação da homeostasia da glicose, em estudos in vivo e in vitro, demonstram o potencial efeito insulino-mimético e/ou anti-hiperglicêmico destes compostos.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia / Made available in DSpace on 2013-06-25T19:45:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 309548.pdf: 4712083 bytes, checksum: 1e0a3781fbbeb47dd57377a6e8ce818b (MD5) / A insulina é o principal hormônio anabólico responsável pelo controle da captação, utilização e armazenamento dos nutrientes celulares como carboidratos, proteínas e lipídios, sendo essencial para a manutenção da homeostasia da glicose, o crescimento e diferenciação celular. Defeitos na ação e/ou na secreção de insulina podem levar à hiperglicemia, característica da diabetes melito. A diabetes melito é uma patologia complexa e multifatorial de elevada morbidade e mortalidade e, por esse motivo, é considerada uma epidemia, caracterizando um problema de saúde pública mundial. Muitas plantas são conhecidas na medicina popular de diferentes culturas pelas propriedades hipoglicemiantes e tem um uso crescente no tratamento da diabetes. Os compostos fenólicos derivados de plantas, especialmente os flavonóides, apresentam diversas propriedades e tem um potencial terapêutico muito investigado. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar o efeito de extratos e frações de Bacharis articulata (carqueja) e de Musa x paradisiaca (banana), assim como do flavonóide rutina, na homeostasia da glicose em modelos experimentais in vivo e in vitro. As duas espécies foram avaliadas quanto às atividades anti-hiperglicêmica e/ou hipoglicemiante na curva de tolerância à glicose e em modelos de diabetes induzidos experimentalmente, como a secreção de insulina, o conteúdo de glicogênio hepático e muscular, a inibição das enzimas ?-glicosidases e a propriedade anti-glicação, assim como o conteúdo de flavonóides. Além disso, foi estudado o mecanismo de ação da rutina na captação de glicose e de cálcio em músculo sóleo, e também a secreção de insulina in vivo e o mecanismo de ação da rutina na captação de cálcio em ilhotas pancreáticas isoladas. Para tanto, foram utilizados ratos Wistar machos entre 50-55 dias de idade. Para a realização da curva de tolerância à glicose as coletas de sangue, para determinação da glicose e insulina sérica, foram realizadas nos tempos zero, 15, 30, 60, 120 e 180 minutos. Nos ensaios para a determinação do conteúdo de glicogênio os tecidos foram retirados dos animais 3 h após os tratamentos. As atividades das dissacaridases intestinais e a propriedade anti-glicação foram realizadas in vitro. A captação de 14C-glicose e de 45-cálcio (45Ca2+) foi estudada após a incubação do músculo sóleo com a rutina. As ilhotas pancreáticas foram isoladas e incubadas com 45Ca2+ e rutina, na presença ou não de diferentes inibidores e ativadores. Os extratos brutos, as frações n-butanol e residual aquosa de B. articulata e de M. x paradisiaca reduziram significativamente a glicemia de ratos normais hiperglicêmicos e potencializaram a secreção de insulina induzida por glicose. Além disso, observou-se um aumento no conteúdo de glicogênio no músculo sóleo e fígado após os tratamentos, principalmente com as frações n-butanol das duas espécies vegetais. Os extratos e as frações reduziram a atividade da maltase e preveniram a glicação. A rutina estimulou a captação de glicose e cálcio no músculo, estimulando a captação de glicose através da ativação de uma via insulinomimética e uma via independente da sinalização clássica da insulina. Além disso, a rutina estimulou a secreção de insulina in vivo e a captação de cálcio em ilhotas pancreática isoladas, atuando como um potencial agente secretagogo de insulina. Desta forma, apoiado nos resultados obtidos neste trabalho, propõe-se que as espécies vegetais, Baccharis articulata e Musa x paradisiaca, e o flavonóide rutina aqui estudados possam regular a homeostasia da glicose. Os mecanismos envolvem a inibição da enzima que permite a absorção intestinal da glicose, a inibição da glicação, o estímulo da secreção de insulina e o aumento na utilização de glicose pelos tecidos periféricos, evidenciando que estas duas espécies e a rutina podem atuar por múltiplos mecanismos de ação para regular a homeostasia da glicose e colaborar na prevenção das complicações da diabetes. / Insulin is the main anabolic hormone responsible for controlling the uptake, use and storage of cellular nutrients such as carbohydrates, proteins and lipids. It is essential for the maintenance of glucose homeostasis, growth and cellular differentiation. Defects in action and / or secretion of insulin may lead to hyperglycemia, which characterizes diabetes mellitus. Diabetes mellitus is a complex and multifactorial disease with high morbidity and mortality, therefore is considered epidemic causing a public health problem worldwide. Many plants are known in folk medicine of different cultures for their hypoglycemic properties showing an increasing use in the treatment of diabetes. The plant-derived phenolic compounds, especially flavonoids, have several properties and their therapeutic potential has been investigated. The aim of this study was to characterize the effect of extracts and fractions of Baccharis articulata ("carqueja") and Musa x paradisiaca ("banana"), as well as the flavonoid rutin, in glucose homeostasis using in vivo and in vitro experimental models. Antihyperglycemic and / or hypoglycemic activity in the curve of glucose tolerance and in models of experimentally induced diabetes, insulin secretion, the hepatic glycogen content and muscle, inhibition of the enzymes á-glucosidases and anti-glycation property were investigated, as well as the content of flavonoids. In addition, was also studied the mechanism of action of rutin in glucose and calcium uptake in soleus muscle, and also the in vivo insulin secretion and the mechanism of action of rutin on calcium uptake in rat isolated pancreatic islets. For in vivo experiments, Wistar male rats with 50-55 days of age were used. To glycemia and serum insulin determination blood samples were collected at zero, 15, 30, 60, 120 and 180 min in glucose tolerance curve. Tissues were removed from animals 3 h after oral administration of treatments to determine glycogen contents. The intestinal disaccharidases activities and anti-glycation property were performed in vitro. The glucose and calcium uptake was studied after incubation of the soleus muscle with rutin, in the presence or not of different inhibitors and of 14C-glucose or calcium (45Ca2+). The pancreatic islets were isolated and incubated with 45Ca2+ and rutin in the presence or absence of various inhibitors or activators. The crude extracts and n-butanol and residual aqueous fractions of B. articulata and of M. x paradisiaca showed potential anti-hyperglycemic activity in hyperglycemic normal rats and potentiated glucose-induced insulin secretion. Additionaly, it was observed an increase on glycogen content in muscle and liver after treatments, mainly with the n-butanol fractions of two species. The extracts and fractions reduced the activity of maltase and prevented glycation. Also, rutin stimulated glucose and calcium uptake in soleus muscle, stimulating glucose uptake via activation of an insulin-mimetic and an insulin-independent signaling pathways. Additionally, rutin stimulated insulin secretion in vivo and calcium uptake in isolated pancreatic islets, as a potential insulin secretagogue agent. Thus, these results suggest that Baccharis articulata, M. x paradisiaca and rutin are able to regulate glucose homeostasis. The mechanisms involve the inhibition of the enzyme that allows the intestinal absorption of glucose, the inhibition of glycation, the stimulation of insulin secretion and increase in glucose utilization by peripheral tissues showed that these plant species and rutin may act by multiple mechanisms of action to regulate glucose homeostasis, thereby contributing to the prevention of diabetes-related complications.

Made available in DSpace on 2016-02-05T18:29:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-04-30. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-05T18:33:41Z : No. of bitstreams: 1 000854430_20160430.pdf: 194642 bytes, checksum: bb81f6467dc8e778046a85b1a3883c0d (MD5) Bitstreams deleted on 2016-05-04T13:08:34Z: 000854430_20160430.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-05-04T13:09:35Z : No. of bitstreams: 1 000854430.pdf: 866908 bytes, checksum: 304d39176d6ab7c06503c5a80740a3e6 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A Deficiência da Enzima Ramificadora de Glicogênio (Glycogen Branching Enzyme Deficiency [GBED] em equinos é uma doença hereditária recessiva fatal, caracterizada principalmente por abortos, natimortos e nascimento de potros fracos. A GBED é causada por uma mutação no gene GBE1. Não existem dados acerca da existência de animais com esta mutação no Brasil. O objetivo deste estudo foi verificar a prevalência de animais portadores do alelo mutante da GBED em cavalos da raça Quarto de Milha utilizados em cinco modalidades esportivas equestres no Brasil. Amostras de sangue e pêlo foram obtidas de 740 animais. Após purificação do DNA, foram realizados as reações de PCR, sequenciamento direto automatizado e análise das sequências. Dos 740 animais testados 59 foram considerados heterozigotos para a mutação responsável pela GBED representando uma frequência de 7,97% na população estudada. As prevalências de heterozigotos foram maiores nas linhagens de apartação (20%) e rédeas (10%), seguidos por tambor/baliza (5%) e conformação (3%), não foram encontrados heterozigotos para a modalidade de corrida. Os resultados demostram que a mutação está presente no rebanho brasileiro de cavalos Quarto de milha, e sugere que a doença (homozigotos recessivos) pode estar presente de forma silenciosa. Portanto a GBED deve ser considerada no diagnóstico diferencial nos casos de abortos e morte neonatal em cavalos da raça Quarto de milha no Brasil, e medidas de prevenção da transmissão da mutação devem ser estabelecidas / The deficiency of glycogen branching enzyme [GBED] in horses is a fatal recessive hereditary disease, mainly characterized by abortions, stillbirths and birth of weak foals. The GBED is caused by a mutation in the gene GBE1. The aim of this study was to determine the prevalence of mutation carriers causing GBED in a population of Quarter horse animals used in five equestrian sports practiced in Brazil. Samples of blood and were obtained from 740 animals. After DNA purification, PCR reactions, automated direct sequencing and sequence analysis were performed. Of the 740 animals tested 59 were considered heterozygous for the mutation responsible for GBED representing a prevalence of 7.97% in the population studied. The prevalences of heterozygotes were higher in cutting (20%) and reining (10%) subgroups, followed by barrel racing (5%) and halter (3%), were not found heterozygous for the racing subgroup. The results demonstrate that the mutation is present in the Quarter horse Brazilian herd, and suggests that the disease (homozygous recessive) may be present without being noticed. So the GBED should be considered in the differential diagnosis in cases of abortion and stillbirths in Brazilian Quarter horses and strategies should be developed to prevent transmission of the mutation

Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-18Bitstream added on 2014-12-02T11:21:06Z : No. of bitstreams: 1 000773336_20190218.pdf: 311514 bytes, checksum: 3013fb73613f9ad6df44d3e85824afe7 (MD5) / O fungo filamentoso Neurospora crassa é um organismo modelo amplamente utilizado para estudos de diversos aspectos da biologia dos eucariotos. Nosso laboratório tem utilizado este fungo para estudar os mecanismos moleculares e bioquímicos envolvidos na regulação do metabolismo de glicogênio. A avaliação de uma coleção de linhagens mutantes individualmente nocauteadas em genes que codificam fatores de transcrição permitiu identificar várias proteínas potencialmente envolvidas na regulação do metabolismo de glicogênio do fungo N. crassa. Dentre as proteínas, o fator de transcrição FLBC foi identificado como uma possível proteína regulatória do metabolismo de glicogênio. A linhagem mutante apresentou alterações no perfil de acúmulo de glicogênio e na expressão do gene gsn em relação à linhagem selvagem, quando submetidas a estresse térmico. Estudos preliminares realizados anteriormente em nosso laboratório mostraram severas alterações morfológicas na linhagem flbCKO, como reduzida capacidade de conidiação, com a presença de poucos microconídios, formação de hifas aéreas reduzidas, morfologia das extremidades das hifas alterada, aspecto e morfologia alterados das colônias e produção acentuada do pigmento melanina, indicando que a proteína FLBC desempenha importante papel no desenvolvimento do fungo. O fator de transcrição FLBC, objeto de estudo deste trabalho, é uma proteína homóloga às proteínas FlbC e FLE1 dos fungos Aspergillus nidulans e Podospora anserina, respectivamente, ambas envolvidas nos processos de conidiação e desenvolvimento dos fungos. O objetivo deste trabalho foi realizar uma caracterização funcional detalhada deste fator de transcrição em N. crassa. Análises de expressão gênica mostraram níveis elevados do transcrito flbC durante o crescimento vegetativo do fungo e após a indução do desenvolvimento assexual. A linhagem nocaute mostrou uma desregulação... / The filamentous fungus Neurospora crassa is a model organism widely used for studies of several aspects of the biology in eukaryotes. We have been studying the molecular and biochemical mechanisms involved in glycogen metabolism regulation in this fungus. The screening of a knocked-out strains set in genes encoding transcription factors has identified many proteins likely involved in the regulation of glycogen metabolism in the fungus N. crassa. Among the proteins, the transcription factor FLBC was identified as a regulatory protein of the glycogen metabolism. The mutant strain showed changes in the glycogen accumulated and in the gsn gene expression when compared to the wild-type strain under heat stress. Preliminary studies carried out in our laboratory showed severe morphological changes in the strain flbCKO, such as reduced ability to conidiate, presence of a few microconidia, reduced production of aerial hyphae, altered morphology of hyphae tips, changes in the colonies morphology and high production of the pigment melanin, suggesting that FLBC plays an important role in the fungus development. The transcription factor FLBC, object of study in this work, is the Aspergillus nidulans and Podospora anserina FlbC/FLE1 homologous protein, respectively, both involved in conidiation and fungal growth. The purpose of this study was to perform functional characterization of this transcription factor in N. crassa. Analysis of gene expression showed high levels of the transcript flbC during vegetative growth and after induction of asexual development. The knockout strain presented a misregulation in the accumulation of reserve carbohydrate (glycogen and trehalose) during vegetative growth accumulating higher levels of both carbohydrates as compared to the wildtype strain. Analysis of gene expression in the strains wild-type and flbCKO showed that gdn (encoding for debranching enzyme) and gpn (encoding glycogen phosphorylase) genes are...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-01-30Bitstream added on 2014-06-13T18:09:18Z : No. of bitstreams: 1 avaca_js_me_araiq.pdf: 1586941 bytes, checksum: 07a6c5702a63cebb17218e18a8aa2449 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Neste trabalho foi realizado o isolamento do cDNA e do gene que codifica a proteína semelhante à Pho85p de Saccharomyces cerevisiae, em Neurospora crassa. Um fragmento de 1,1 kb correspondendo à seqüência nucleotídica do gene em N. crassa foi amplificado e confirmado por sequenciamento, o qual foi utilizado no rastreamento de uma biblioteca de cDNA de N. crassa, resultando em um plasmídeo contendo a ORF que codifica a Ncpho85 e as seqüências upstream e downstream à ORF. Este inserto foi seqüenciado, a ORF isolada apresentou 1014 bp, a região upstream contém 304 bp e a downstream 561 nucleotídeos. Após sequenciamento do cDNA, a seqüência polipeptídica da proteína foi comparada com outras proteínas semelhantes à Pho85p de fungos miceliares, leveduriformes além de S. cerevisiae. Esta ORF isolada foi utilizada no rastreamento de uma biblioteca genômica de N. crassa, possibilitando o isolamento de um plasmídeo contendo a seqüência genômica, o qual foi submetido a sequenciamento. No inserto foi possível confirmar a presença do intron (de 89 bp) no nucleotídeo 69, confirmando os dados existentes no banco de dados de N. crassa. A expressão do gene foi analisada ao longo do crescimento do fungo, em diferentes meios de cultivo, através de experimentos de Northern blot. A presença de duas bandas de hibridização, uma de 2,2 kb e uma 2,7 kb foi observada em todos os experimentos realizados. Um pico de expressão dos dois transcritos ocorreu no tempo de 12 horas, sendo mais evidente para o transcrito de menor tamanho, o qual seria o transcrito do cDNA isolado anteriormente. Resultados preliminares da expressão da proteína ao longo do crescimento do fungo foram obtidos por Western blot. Apenas uma banda da proteína foi observada, a qual apresentou o tamanho aproximado de 40 kDa, próximo ao tamanho da proteína NcPHO85, deduzida a partir da seqüência do cDNA. / In this study we performed the isolation of the cDNA and the gene that codes for the Pho85p-like protein from Saccharomyces cerevisiae in Neurospora crassa. A fragment of 1.1 kb corresponding to the nucleotide sequence of the gene from N. crassa was amplified by PCR and confirmed by DNA sequencing. This fragment was used to screen a N. crassa cDNA library resulting in a plasmid containing the ORF plus and the upstream and downstream regions. The insert from the plasmid was sequenced and the ORF showed to have 1014 bp, whereas the upstream and downstream regions had 304 bp and 561 bp, respectively. After sequencing the cDNA, the polypeptide sequence was compared to the same protein from mycelial fungi and yeasts. The isolated ORF was used to screen a N. crassa genomic library leading to the isolation of a plasmid containing the genomic sequence. After DNA sequencing the insert showed the presence of an intron (89 bp) starting at nucleotide 69. This result was in agreement with the information from the N. crassa database. Gene expression analysis during the vegetative growth in different media was performed by Northern blot. Two hybridization bands were observed in the experiments, one of 2.2 kb and another one of 2.7 kb. The maximum expression of both transcripts happened at 12 h of growth, this was more pronounced for the smaller transcript, which probably is the transcript of the isolated cDNA. Preliminary results of protein expression during vegetative growth were obtained by Western blot analysis. Only one band with approximately 40 kDa was observed, the expected size for the NcPHO85 protein sequence deduced from the cDNA sequence. In order to evaluate the role of this protein in glycogen metabolism and in other cellular functions in N. crassa we started the gene inactivation.

Made available in DSpace on 2016-09-27T13:40:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2002. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-27T13:45:38Z : No. of bitstreams: 1 000164825.pdf: 1273680 bytes, checksum: e20dc9f06fccaf20d38ac2598619675c (MD5) / Este trabalho teve por objetivos avaliar as respostas sistêmicas induzidas pela injeção intraperitoneal de 3,0 mg/kg de lipopolissacrídeo (LPS) de Escherichia coli e os eventuais efeitos da suplementação alimentar com cromo trivalente. Para tanto foram utilizados 300 pacus Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887) pesando em média 80 g; distribuídos em 20 aquários e cinco tratamentos, quais sejam um grupo Controle, não suplementado e que não recebeu LPS; um grupo que recebeu somente LPS e outros três, CRa, CRb e CRc que receberam LPS e dois, quatro e seis partes por milhão de cromo trivalente na ração. Material para determinação de hematócrito, concentração plasmática de cortisol e glicose, concentração de glicogênio hepático, índice hepatossomático e avaliação histológica de brânquias foram colhidos antes e um, dois, quatro, nove, 14, 19 e 24 dias após a injeção do LPS. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial 5 x 8, com 4 repetições representadas pelos aquários. Os resultados demonstraram que os níveis de cortisol circulantes aumentaram em todos os grupos assim como houve incremento do estoque de glicogênio hepático. O hematócrito não apresentou diferença significativa e as brânquias apresentaram ligeiras modificações estruturais / This work had for objectives to evaluate the response systemic induced by the injection intraperitoneal of 3,0 mg/kg of lipopolissacharideo (LPS) of Escherichia coli and the eventual effects of the alimentary supplementation with mixed trivalent chromium to the ration. Were used three hundred fish Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887), weighing 80 g on average.; distributed in 20 aquariums and five treatments, which are a group control, non supplemented and that didn't receive LPS; a group that received only LPS and other three, CRa, CRb and CRc that received LPS and two, four six parts for millions of trivalent chrome in the ration. Material for haematocrit determination, concentration cortisol plasmático and glucose, concentration of hepatic glycogen, index hepatosomático and modifications in the branchial structure were appraised by histology picked before and a, two, four, nine, 14, 19 and 24 days after the injection of LPS. The experimental design was randomized entirely, in a 5 x 8 factorial. The results demonstrated that the levels of circulating cortisol increased in all the groups as well as there was increment of the stock of hepatic glycogen. The haematocrit didn't present significant difference and the gills presented quick structural modifications

Orientador: Gabriel Hessel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-09T01:55:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Banin_MarciaRegina_M.pdf: 2211563 bytes, checksum: e16e20135efbf828907adc92ed40ba6b (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Racional - As doenças de depósito de glicogênio compreendem um grupo de doenças geneticamente determinadas e classificadas em 11 tipos, de acordo com as deficiências enzimáticas identificadas. Há pouca informação sobre a evolução dessas doenças. Objetivos - Descrever as características clínicas e laboratoriais, na admissão e evolução, de pacientes com doença de depósito de glicogênio. Pacientes e métodos ¿ Participaram do estudo 22 pacientes com diagnóstico de glicogenose hepática, sendo 11 (50%) do sexo feminino. O estudo foi descritivo e longitudinal. A ficha de coleta de dados constituiu-se de informações iniciais de: quadro clínico, peso, estatura, índice de massa corporal (IMC) e resultados dos exames laboratoriais (hemograma, enzimas hepáticas, colesterol total e frações, triglicérides, glicemia, ácido úrico, uréia e creatinina). Selecionou-se os momentos 1 (admissão), 3 (12 meses de evolução) e 7 (36 meses de evolução) para coleta dos seguintes dados: peso, estatura, IMC, ácido úrico, glicemia, colesterol e triglicérides. Também, foram comparados os resultados de antropometria e exames bioquímicos dos pacientes em dois momentos: admissão e última consulta. Para as variáveis peso e estatura, calculou-se o Z escore sendo considerado déficit quando o valor se situava abaixo do segundo desvio padrão. A velocidade de crescimento foi calculada a partir da 2ª e 1ª consulta (V1) e a partir da última e penúltima consulta (V2). A taxa de aderência foi determinada pela porcentagem de absenteísmo das consultas da seguinte forma: boa: se absenteísmo menor que 20%; regular: se absenteísmo entre 20% e 40% e ruim: se absenteísmo maior que 40%. Utilizou-se como teste estatístico a análise de variância e os testes de Kruskal-Wallis, Mann-Whintney e Wilcoxon, sendo o nível de significância adotado de 5%. Resultados - A média da idade de início dos sintomas foi de 10,7 meses e do diagnóstico de 28,18 meses. O tempo médio de seguimento foi de 105 meses. As manifestações clínicas iniciais mais freqüentes foram: hepatomegalia em 21 (95%), abdômen protuberante em 19 (86%), face de boneca em 14 (64%), diarréia em 10 (45%) e história de hipoglicemia em 8(36%). Nos exames laboratoriais, observou-se, na maioria dos casos, aumento das enzimas hepáticas, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia e hipoglicemia. Na admissão, o déficit de peso/idade foi de 26% (5/19) e de estatura/idade foi de 35% (7/20). Não houve diferença estatística na comparação do Z escore de peso/idade, estatura/idade, índice de massa corporal e exames laboratoriais na admissão, com 12 e 36 meses. Entre a admissão e a última consulta, observou-se diferença significativa no índice de massa corporal, enzimas hepáticas, glicemia e triglicérides, o que não aconteceu com Z escore de peso/idade, estatura/idade e os exames de ácido úrico e colesterol. A taxa de aderência foi considerada boa em 64% dos pacientes. Na comparação da velocidade de crescimento, observou-se tendência de aumento comparando V1 com V2. Conclusões ¿ Houve demora no encaminhamento ao centro de referência para o diagnóstico das glicogenoses. As manifestações clínicas mais freqüentes foram abdômen protuberante e hepatomegalia e as alterações laboratoriais mais significativas foram a elevação dos triglicérides, colesterol e diminuição da glicemia. Na evolução, não houve diferença nos parâmetros antropométricos, mas uma tendência de melhora de velocidade de crescimento. O tratamento melhorou o desarranjo metabólico / Abstract: Background ¿ Glycogen storage diseases comprise a group of genetic diseases determined and classified into 11 types, according to the identified enzymatic deficiency. There is little information regarding the disease evolution. Aim ¿ Describe clinical and laboratorial characteristics in the admission and evolution of patients with glycogen storage disease. Patients and methods ¿ Twenty-two patients with hepatic glycogen diagnosis participated in the study, 11 (50%) of which were female. The study was descriptive and longitudinal. The collected data file consisted of admission information: clinical features, weight, height, body mass index (BMI) and laboratorial exam results: hemogram, hepatic enzymes, total cholesterol and fractions, triglycerides, glycemia, uric acid, urea and creatin. Afterwards, the following phases were selected: 1 (admission), 3 (12 months of evolution) and 7 (36 months of evolution) for the weight, height, BMI and laboratorial tests: uric acid, glycemia, total cholesterol and triglycerides. The antropometric data, hepatic enzymes and mentioned tests were compared during 2 moments: admission and last appointment of each patient. The score Z was utilized to evaluate the weight and height of patients, considered if the standard deviation was under 2. The growth velocity was calculated among the second and first consult and the last and the penultimate consult. The adherence percentage was determined by the appointment absence percentage: Good: absenteeism minor 20%; regular: absenteeism major 20% and minor 40%; bad: absenteeism major 40%. The statistical tests applied were ANOVA, Kruskal-Wallis, Mann-Whintney, and Wilcoxon. The significance level was 5%. Results - The mean time during the first symptoms was 10,73 months and the mean time up to diagnosis was 28,18 months. The mean time of follow-up was 105 months. The most frequent initial clinical manifestations were: hepatomegaly in 21 (95%), protuberant abdomen in 19 (86%), doll face in 14 (64%), diarrhea in 10 (45%) and history hypoglycemia in 8 (36%). In the admission the deficit of the weight to age was 26% (5/19) and height to age was 35% (7/20), In the initial biochemical tests showed elevation of hepatic enzymes, hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia, hypoglycemia. There was no statistical difference among the score Z weight to age, score Z height to age, body mass index and laboratorial tests of admission within 12 and 36 months. Significant differences were observed in BMI, hepatic enzymes, glycemia and triglycerides between the first and the last appointments, opposing to the score Z weight to age, score Z height to age, uric acid and cholesterol exam results. In the comparison of the growth velocity there was elevation tendency between the V1 and V2. There was difference significative of the growth velocity among the first and second versus the penultimate and the last consult. The adherence percentage was considered good in 64%. Conclusions - The patients delayed in seeking the reference center for glycogenosis early diagnosis. The most frequent clinical manifestations were protuberant abdomen, hepatomegaly, elevation of triglycerides and cholesterol, and glycemia reduction. In the evolution, there wasn¿t difference statistic in the antropometric parameters, but there was improvement tendency on the growth velocity. The treatment has improved the metabolic derangement / Mestrado / Saude da Criança e do Adolescente / Mestre em Saude da Criança e do Adolescente