O transplante (Tx) de ilhotas pancreáticas (IP) é uma atraente alternativa para o tratamento do diabetes melito tipo 1. No entanto, para evitar a rejeição há necessidade de imunossupressão. Uma nova idéia de tolerância surge a partir do paradoxo imunológico, onde a mãe, imunologicamente competente, não rejeita o embrião durante a gravidez. Uma das hipóteses é que células da placenta expressam a molécula IDO, a qual protege o embrião do ataque imunológico materno. O objetivo do estudo foi analisar o efeito da indução da expressão da IDO em IP em transplante experimental de IP. Para tanto, as seguintes etapas de padronização foram necessárias. Etapa 1: Padronização da perfusão e digestão do tecido pancreático de rato e determinação do método para a purificação das IP, comparando-se diferentes gradientes de densidade: descontínuo de Ficoll, contínuo de Ficoll e contínuo de iodixanol. Foi demonstrado que o gradiente contínuo de iodixanol fornece maior pureza e maior número de IP íntegras e funcionais. Etapa 2: Padronização do Tx experimental de IP sob a cápsula renal para avaliação do número mínimo de IP transplantadas para reverter o diabetes induzido por estreptozotocina, definido como glicemia >300mg/Kg. Foram transplantadas entre 200 a 3.000 IP por experimento. A rejeição das IP foi analisada pela sobrevida das IP (permanência da glicemia <300mg/dL), tanto em Tx isogênico (Lewis-Lewis) como em alogênico (Sprague-Dawley-Lewis). Para reverter o diabetes foram necessárias no mínimo 2.500 IP. No transplante entre ratos isogênicos (n=6) não houve rejeição das IP. Já no transplante entre animais alogênicos (n=12), as IP apresentaram uma curta sobrevida pós-Tx (11±1 dias; p<0,01 vs. Tx isogênico). Dez dias pós-Tx, houve um grande infiltrado de macrófagos e linfócitos T no enxerto alogênico e uma diminuição significativa da expressão de insulina (p<0,001 vs. Tx isogênico). Etapa 3: Construção do vetor de expressão para IDO. A partir de RNA extraído de placenta de rata no 10º dia de gestação, foi amplificada a seqüência completa do cDNA para IDO, utilizando-se RT-PCR. Em seguida, o cDNA para IDO foi inserido em vetor de expressão (vetor-IDO). Etapa 4: Transfecção do vetor-IDO nas IP. O vetor-IDO foi introduzido nas IP através de lipofecção (Lipofectamina 2000), testando-se diferentes concentrações do vetor-IDO (0, 0,5, 1 e 10 ng/uL) e diferentes períodos de incubação (1h, 15h e 24h). A expressão de IDO nas IP foi confirmada por RT-PCR e imuno-histoquímica. A incubação com 10 ng/uL de vetor-IDO durante 24h foi eficaz para induzir a expressão de IDO nas IP, confirmada a nível de RNAm (RT-PCR) e de proteína (imuno-histoquímica). A eficiência da transfecção em nível funcional foi confirmada pela degradação de triptofano em cultura (dosagem de triptofano por HPLC). Etapa 5: Onze transplantes alogênicos (Sprague-Dawley-Lewis) com IP transfectadas com vetor-IDO foram realizados para analisar o efeito da IDO. Três animais foram sacrificados para análise de imuno-histoquímica e 8 animais foram acompanhados por 45 dias. A sobrevida das IP transfectadas com vetor-IDO foi significativamente maior comparada com a sobrevida de IP não-transfectadas (p<0,01). O estudo conclui que a expressão da IDO protege as IP aumentando a sobrevida das IP. / Transplantation (Tx) of pancreatic islets (PI) is an attractive alternative of treatment for type 1 diabetes mellitus. However, continuous immunossupression is necessary in order to avoid allograft rejection. A new idea of tolerance is based on the immunological paradox, during pregnancy, in that the mother, immunologically competent, does not reject the semi-allogeneic fetus. The hypothesis is that the placenta produces IDO molecules, which protect the embryos against the maternal immunologic attack. The aim of this study was to analyze the effect of the induction of the IDO expression into PI in an experimental model of PI transplantation. The following steps for standardization were necessary. Step 1: Besides the standardization of the rat pancreas perfusion and digestion, the best method for purification of the PI was determined, comparing several density gradients: Ficoll discontinuous, Ficoll continuous and iodixanol continuous. The iodixanol continuous gradient was able to provide high purity and a high number of intact and functional PI. Step 2: The transplantation of the PI between rats was established determining the minimal number of PI to reverse the diabetes (glycemia > 300mg/dL) induced by streptozotocin. In addition, the rejection was analyzed by PI survival (time with glycemia <300mg/dL) in syngeneic (Lewis-Lewis) and allogeneic (Sprague-Dawley-Lewis) transplantation. To reverse the diabetes at least 2,500 PI were necessary. Transplantation between syngenic rats (n=6) disclosed no rejection of the PI. In the allogeneic transplantation (n=12), the PI had a short survival (11±1 days). Ten days post-Tx, a higher number of macrophages and T lymphocytes were observed in the grafts, accompanied by very low insulin expression. Step 3: The expression vector for IDO was constructed from RNA extracted from rat placenta. RT-PCR was carried out to amplify the IDO cDNA, which was inserted into expression vector (IDO vector). Step 4: The IDO vector was introduced into PI through lipofection (Lipofectamine 2000) analyzing several concentrations of the IDO vector (0, 0.5, 1.0 and 10 ng/uL) and several periods of incubation (1h, 15h e 24h). The IDO expression in PI was confirmed by RT-PCR and immunohistochemistry. The incubation with 10 ng/uL of IDO vector during 24h was efficient to induce IDO expression in PI. The function of the IDO was confirmed by tryptofan degradation in culture (measurement of tryptofan by HPLC). Step 5: Eleven allogenic transplants (Sprague-Dawley to Lewis) of PI expressing IDO were performed to analyze the effect of the IDO in the rejection. Eight animals were accompanied for 45 days, whereas three were sacrificed after 10 days for immunohistochemistry analysis. Finally, the survival of the PI expressing IDO was significantly higher than nontransfected PI. The study concludes that the induction of the IDO into PI protects the PI increasing the PI survival.

INTRODUÇÃO: O papel da linfangiogênese no transplante renal em humanos é desconhecido até o momento. As poucas publicações disponíveis acerca do assunto revelam resultados controversos. O presente estudo visa a avaliar a influência dos vasos linfáticos sobre aspectos clínicos e patológicos no transplante renal. MÉTODOS: Biópsias de indicação clínica de pacientes submetidos a transplante renal com enxertos oriundos de doadores falecidos na Unidade de Transplante Renal do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo de janeiro de 2007 a dezembro de 2009 foram selecionadas e os dados clínicos destes pacientes foram coletados do banco de dados. Estas biópsias foram classificadas de acordo com a Classificação de Banff. Reação imuno-histoquímica foi empregada para identificar vasos linfáticos, linfócitos T, linfócitos B e macrófagos. Análise histomorfométrica foi empregada para quantificar estes quatros elementos e a fibrose intersticial cortical. RESULTADOS: A presença de vasos linfáticos foi significativamente mais intensa em biópsias com rejeição aguda mediada por linfócitos T e com distúrbios infecciosos (nefropatia do poliomavírus e pielonefrite), quando comparadas à expressão de linfáticos com biópsias sem rejeição e com biópsias com fibrose intersticial e atrofia tubular de etiologia indeterminada. Biópsias com expressão de vasos linfáticos apresentaram escores semiquantitativos da Classificação de Banff mais altos. Os linfócitos B túbulo-intersticiais apresentaram maior concentração em amostra com presença de vasos linfáticos. A linfangiogênese não demonstrou influência sobre desfechos clínicos relevantes, como função renal e sobrevida do enxerto. CONCLUSÃO: O presente estudo associa a linfangiogênese com distúrbios inflamatórios túbulo-intersticiais do enxerto (rejeição aguda mediada por linfócitos T e infecções) e com infiltrado de linfócitos B. No entanto, a expressão de linfáticos não foi associada à influência sobre a função e a sobrevida do enxerto / INTRODUCTION: The role of lymphangiogenesis in human kidney allograft is currently unknown. Controversial results have arisen from few publications available. This study intends to evaluate the influence of lymphatics on relevant clinical and pathological aspects of renal transplantation. METHODS: Clinically indicated biopsies from patients who underwent renal transplantation with allografts from deceased donors at the Renal Transplantation Unit of the Clinics Hospital of the University of São Paulo Medical School from January of 2007 to December of 2009 were selected and clinical data of these patients were retrieved from the database. These biopsies were classified according to the Banff Classification. Immunohistochemistry was used to identify lymphatic vessels, T lymphocytes, B lymphocytes, and macrophages. Morphometric analysis was employed to quantify their expression and cortical interstitial fibrosis. RESULTS: Lymphatic vessel formation was significantly higher in biopsies with acute T-cell mediated rejection and infectious disorders (polyomavirus-associated nephropathy and pyelonephritis) compared with no rejection and interstitial fibrosis and tubular atrophy without evidence of any specific etiology. Biopsies with expression of lymphatics presented higher levels of semiquantitative scores of the Banff Classification. B lymphocytes infiltrate was more intense in biopsies with lymphatics compared with those without the vessels. Lymphangiogenesis had no effect on important clinical parameters examined (graft function and graft survival two years post transplant). CONCLUSION: The present results associate lymphangiogenesis with kidney allograft tubulointerstitial inflammation (ATCMR and infectious disorders) and with B lymphocytes infiltrate. However, the presence of lymphatic vessels was not associated with any influence on graft function and survival

Lung transplantation is the only therapeutic approach for patients presenting end-stage pulmonary failure. Despite progress made in organ preservation and immunosuppression, primary graft dysfunction and obliterative bronchiolitis still hamper short-term and long-term outcomes, respectively. Interleukin-17 recently emerged as a major actor in several immuno-inflammatory disorders. Clinical and experimental evidence also suggest the implication of interleukin-17 or type 17 CD4+ T cells in lung rejection. We therefore investigated the contribution of this cytokine to graft pathology in a murine model of tracheal transplantation that recapitulates pathological features of lung rejection including the development of obliterative airway disease.<p>We first demonstrated that interleukin-17 contributes to inflammatory lesions in the early phase post-transplantation. Interleukin-17 was found to be produced by &61543;&61540;+ T cells and CD4+ T cells infiltrating the graft and interleukin-17 neutralization significantly reduced the development of epithelial lesions together with inhibition of interleukin-6 and heat-shock-protein 70 gene transcription.<p>We then investigated the contribution of interleukin-17 to obliterative airway disease. Although interleukin-17 did not play a dominant role in absence of immunosuppression, it was found to contribute to airway pathology in animals receiving cyclosporin A. Under this treatment, we first observed dramatic changes in the composition of the lymphocyte populations infiltrating the graft: the numbers of CD8+ T cells producing interferon-&61543; and type 1 CD4+ T cells were dramatically decreased while the numbers of type 17, and also type 2 CD4+ T cells were unaffected. The pathological relevance of these findings was first demonstrated by the prolongation of graft survival afforded by the depletion of CD4+ T cells in cyclosporin A-treated animals. Furthermore, graft rejection was also delayed in mice genetically deficient in either interleukin-17 or interleukin-4, providing evidence that type 17 and type 2 CD4+ T cells actively contribute to graft rejection in cyclosporin A-treated recipients. On the other hand, parallel experiments in interferon-&61543;-deficient mice revealed that interferon-& / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

This work discusses the role of CT in the etection and quantification of chronic allograft rejection in patients after lung transplantation and provides solutions to the technical challenges involved with this approach. / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La rapamycine est un inhibiteur de la voie mTOR dont la propriété immunosuppressive est reconnue pour son action préférentielle sur les lymphocytes T effecteurs et sa capacité à favoriser l’expansion de lymphocytes T régulateurs (Treg) et d’autres cellules immunosuppressives. En transplantation hépatique, la rapamycine a été retirée de l’arsenal thérapeutique dans le traitement de novo du rejet aigu, suite aux résultats obtenus et décrits au sein du « Rapamune Liver Transplant Study Group » qui a conclu à une forte incidence de thromboses de l’artère hépatique. Des travaux récents montrent que l’introduction retardée d’une immunosuppression après une greffe permet de créer, dans certains cas, une fenêtre d’opportunité pour freiner la réponse allogénique initiée. Cette nouvelle configuration pourrait remettre en de question l’utilisation en jeu des inhibiteurs de mTOR en transplantation hépatique. L’objectif de ma thèse a été d’évaluer l’efficacité d’un traitement court et retardé par la rapamycine dans un modèle de greffe hépatique immunogène chez le rat. Notre étude montre qu’un traitement de 8 jours débuté à J4 post transplantation permet de prolonger de manière significative la survie des animaux greffés en améliorant la fonction des greffons. De plus, l’analyse cellulaire des organes lymphoïdes secondaires, montre une prédominance de cellules myéloïdes suppressives (MDSC) et de lymphocytes CD8+CD45RClow à un stade précoce chez les animaux tolérants et dont le taux reste stable à un stade tardif sans modifications majeures du pourcentage de Treg CD4+CD25+Foxp3+ . Ainsi, nos résultats suggèrent un effet protecteur de la rapamycine lorsqu’elle est administrée de façon retardée et courte dans un modèle de greffe hépatique et dont le mécanisme d’induction de tolérance ne semble pas être dépendant des Treg. Cette approche permet de reconsidérer la place de la rapamycine en transplantation hépatique et suggère d’évaluer quelles sont les populations cellulaires impliquées dans le maintien de tolérance. / Rapamycin is an mTOR pathway inhibitor with immunosuppressive property recognized for its preferential action on effectors T cells and its ability to promote the expansion of regulatory T cells (Treg) and other immunosuppressive cells. In liver transplantation, rapamycin has been removed from the therapeutic arsenal for the treatment of de novo acute rejection, following the results of "Rapamune Liver Transplant Study Group" which concluded of a high incidence of thrombosis of the hepatic artery. Recent studies show that the delayed introduction of immunosuppression following transplantation creates, in some cases, a window of opportunity to curb the allogeneic response initiated. This therapeutic approach has restored hope in the future of mTOR inhibitors in liver transplantation. The aim of my thesis was to evaluate the efficacy of a delayed and short course rapamycin treatment in an immunogenic liver transplantation model in rats. Our study shows that treatment of 8 days started at day 4 post-transplantation can significantly prolong the survival of grafted animals by improving the function of the grafts. Cellular analysis of secondary lymphoid compartments shows a predominance of myeloid suppressor cells (MDSC) and CD8+CD45RClow T cells at early stage in tolerant animals and the rate remains stable at a late stage without any major changes in the frequency of CD4+CD25+Foxp3+ Treg. Thus, our preliminary results suggest a protective effect of rapamycin when administered at delayed and short way in a liver transplantation model. Early induction mechanism does not appear to be Treg-dependent. This approach allows to reconsider the place of rapamycin and the cell population involved in the maintenance of tolerance.

INTRODUÇÃO: A rejeição constitui-se em uma das principais causas de mortalidade após o transplante cardíaco pediátrico. O peptídeo natriurético tipo B (BNP), tem sido estudado como método no diagnóstico de rejeição aguda principalmente em pacientes adultos submetidos ao transplante cardíaco. OBJETIVOS: Avaliar o peptídeo natriurético tipo B no diagnóstico de rejeição aguda em crianças submetidas ao transplante cardíaco ortotópico, avaliar o papel do BNP como método adicional não invasivo na elucidação diagnóstica da doença coronariana após transplante e comparar parâmetros clínicos, ecocardiográficos e hemodinâmicos em relação à biópsia endomiocárdica no diagnóstico de rejeição cardíaca aguda. MÉTODOS: Foram coletadas 50 amostras de BNP de 33 crianças em pós-operatório de transplante cardíaco e analisados dados de idade, sexo, cor, grupo sangüíneo, painel imunológico, tempo de evolução após o transplante, sintomatologia, imunossupressão utilizada, número de rejeições, dados ecocardiográficos e parâmetros hemodinâmicos. Os grupos foram divididos em pacientes com rejeição e pacientes sem rejeição. RESULTADOS: Foram analisadas 50 amostras consecutivas de 33 crianças, durante período de 17 meses. A idade mediana foi de 10,1 anos, com predomínio do sexo feminino (54%) e da cor branca (85%). No momento da dosagem de BNP o tempo médio pós-transplante foi 4,3 anos. A biópsia endomiocárdica diagnosticou nove rejeições em oito pacientes (27%), sendo três com grau 3 A, cinco com grau 2 e um com rejeição humoral. No momento da biópsia, a maioria dos pacientes encontrava-se assintomática. O nível sérico de BNP teve mediana de 77,2 pg/ml, sendo 144,2 pg/ml no grupo com rejeição e 62,5 pg/ml no grupo sem rejeição, com p = 0,02. Análise de curva ROC mostra que níveis sangüíneos de BNP maiores que 38 pg/ml apresentam sensibilidade de 100% e especificidade de 56% na detecção de rejeição cardíaca. Os níveis de BNP foram maiores que 100 pg/ml nos pacientes com doença coronariana, com mediana de 167,5 pg/ml, em relação à 15 mediana de 40,5 pg/ml dos pacientes que não apresentaram doença coronariana. A curva ROC mostra ponto de corte de 90 pg/ml como ideal para diagnóstico de doença coronariana, com p = 0,01. Os parâmetros hemodinâmicos não foram diferentes entre os grupos com rejeição e sem rejeição. A sensibilidade do ecocardiograma para detecção de rejeição foi de 44% e especificidade de 90%, com p= 0,02. CONCLUSÕES: Pacientes podem apresentar-se assintomáticos durante episódio de rejeição aguda. O nível sérico de BNP apresentou diferença estatisticamente significante no grupo com rejeição, podendo ser método adicional no diagnóstico de rejeição cardíaca. A doença coronariana esteve associada com níveis elevados de BNP, independente da presença de rejeição aguda. O ecocardiograma mostrou baixa sensibilidade para o diagnóstico de rejeição cardíaca, mas alta especificidade. A avaliação dos parâmetros hemodinâmicos não apresentou neste estudo correlação com os resultados de biópsia. / INTRODUCTION: The rejection is one of the main causes of mortality after pediatric heart transplant. B natriuretic peptide has been used as a diagnostic method for rejection mainly in adult patients after heart transplantation. OBJECTIVE: To correlate BNP levels collected at the moment of endomyocardial biopsy with rejection, to evaluate BNP as an additional method for coronary artery disease and to compare clinical, echocardiograph assessment and hemodynamic parameters with endomyocardial biopsy findings. METHODS: There were 50 BNP blood samples from 33 children submitted to orthotopic cardiac transplantation. Analyzed parameters included: age, gender, race, blood type, reactive panel, functional class, immunosuppressive regimens, number of rejection episodes, echocardiography findings and hemodynamic parameters. The patients were divided in two groups: with rejection and without rejection. RESULTS: Thirty three children with a median age of 10.3 years (54% female) were studied at median time of 4.2 years after heart transplantation. Endomyocardial biopsy diagnosed nine rejection episodes (27%): three were grade 3A; five were grade 2 and one was humoral rejection. At the moment of biopsy most patients were asymptomatic. Average BNP level was 77.2 pg/ml (144.2 pg/ml in the patients with rejection and 65.8 pg/ml in the group without rejection, p=0.02). BNP level was increased in humoral rejection and in patients with coronary artery disease. ROC curve demonstrates BNP levels over 38 pg/ml to present 100% sensibility and 56% specificity to detect acute rejection. The levels of BNP were higher than 100 pg/ml in most of the patients with coronary artery disease (median of 167.5 pg/ml compared with a 40.5 pg/ml in patients without coronary artery disease). The curve ROC shows a critical cut off value for the diagnosis of coronary artery disease at the level of 90 pg/ml in, with p = 0.01. The hemodynamic parameters did not show significant differences between the patients with rejection and the group without rejection. The echocardiogram presented 44% sensibility and a 17 90% specificity to detect the rejection episode (p = 0.02). CONCLUSIONS: Children could be asymptomatic at allograft rejection episodes. BNP level was significantly elevated in children with the allograft rejection episode and may add a valuable information for the rejection assessment. Also, the higher BNP levels associated with coronary artery disease may contribute for its surveillance. Although the echocardiography presented low sensibility to screen for acute rejection episodes, its high specificity enhances its role to structural and functional alterations. The hemodynamic parameters did not contribute for the diagnosis nor presented correlation with the biopsy findings.

Introdução: A doença vascular do coração transplantado, consiste em um processo inflamatório proliferativo que compromete o sucesso a longo prazo do transplante cardíaco e não há prevenção ou tratamentos efetivos. Uma nanoemulsão lipídica (LDE) pode carregar agentes quimioterápicos na circulação e concentrá-los nos enxertos cardíacos dos coelhos. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do paclitaxel combinado a LDE;do metotrexate combinado ao LDE e a associação de ambos quimioterápicos ao LDE nos corações transplantados. Método: 28 coelhos alimentados com dieta com teor de 0,5% de colesterol e submetidos a transplante cardíaco herotópico foram tratados com ciclosporina (dose 10 mg/kg/ dia por via oral) e alocados em 4 grupos de 7 animais.Um grupo recebeu a associação de Metotrexate e LDE endovenosa (4 mg/kg/semana); segundo grupo recebeu por via endovenosa a combinação de Paclitaxel e LDE; o terceiro grupo recebeu a associação de LDE com metotrexate e paclitaxel; grupo controle que recebeu somente solução salina intravenosa. Os animais foram sacrificados 6 semanas após o procedimento. Foram realizadas análises da morfologia,histologia,imunohistoquímica e análise da expressão gênica do enxerto e dos corações nativos. Resultado: Em comparação com o grupo controle,coelhos transplantados e tratados com paclitaxel associado ao LDE apresentaram redução em 50% de estenose em artérias coronárias. Já nos grupos que usaram metotrexate associado a LDE ou paclitaxel combinado com metotrexate e associado a LDE, houve redução em 18% da estenose coronariana em relação ao grupo controle,mas a diferença não apresentou significância estatística.Nos três grupos tratados, houve redução do infiltrado macrofágico. No grupo que recebeu metotrexate associado a LDE,a expressão gênica de fatores pró-inflamatórios( TNF-alfa; MCP1; IL 18; VCAM-1 e MMP-12) foi reduzida drasticamente; enquanto a expressão de agentes anti-inflamatórios(IL 10 por exemplo) aumentou. Nos outros dois grupos (LDE+paclitaxel e LDE+paclitaxel e metotrexate) não houve influência consistente na expressão de genes pró e anti-inflamatórios. Conclusão: A associação paclitaxel e LDE promoveu melhora importante na vasculopatia dos enxertos.A associação metotrexate e LDE e a metotrexate mais palcitaxel e LDE reduziram a estenose de coronárias porém sem significância estatística. O infiltrado macrofagocítico foi reduzido nos três grupos tratados. Tais resultados podem servir de ponte para novos ensaios clínicos / Background: Coronary allograft vasculopathy is an inflammatory-proliferative process that compromises the long-term success of heart transplantation and currently has no effective prevention and treatment. A lipid nanoemulsion (LDE) can carry chemotherapeutic agentsin the circulation and concentrates them in the heart graft in rabbits. The aim of this study was to investigate the effects of paclitaxel (PACLI) binded tire parentesis to LDE, methotrexate (MTX) binded to LDE and the association of both particles in transplanted heart. Methods: Twenty eight rabbits fed 0,5% cholesterol diet and submitted to heterotopic heart transplantation were treated with cyclosporine A (10mg/kg/daily orally) and allocated to four groups of 7 animals. One group was treated with intravenous LDE-MTX (4mg/kg B.W., weekly); a second with LDE-paclitaxel, the third one with association of LDE-PACLI with LDE-MTX and the control group received only weekly intravenous saline solution. Animals were sacrificed 6 weeks later for morphometric, histological, immunohistochemical and gene expression analysis of the graft and native hearts. Results: Compared to controls, grafts of LDE-PACLI treated rabbits showed 50%reduction of coronary stenosis and in the LDE-MTX and LDE-MTX/PACLIstenosiswas around 18% less than control but this difference was not statistically significant. In the 3 treatment groups macrophage infiltration was decreased. In LDE-MTX group, gene expression of pro-inflammatory factors TNF-?, MCP-1, IL-18 and VCAM-1, and MMP-12 was strongly diminished whereas expression of anti-inflammatory IL-10 increased. In the other two treatment, groups (LDE-PACLI and LDE-PACLI/MTX) there was not a consistent influence in pro and anti-inflammatory gene expression. Conclusions: LDE-PACLI promoted strong improvement of the cardiac allograft vasculopathy. LDE- MTX and LDE -MTX/PACLI decreased coronary stenosis but without statistic significance. Macrophage infiltration was decrease in the three treatment groups. This new preparation maybe candidate for future clinical trials

Introdução: A Doença Vascular do Enxerto (DVE), um processo envolvendo fatores de natureza inflamatória e proliferativa, é a principal causa de morte após o Transplante Cardíaco (TxC), com incidência acima de 50 % ao fim do quinto ano. É possível que a intervenção farmacológica nesses fatores possa resultar na inibição da proliferação de células musculares lisas vasculares e melhora da DVE. Neste sentido, em trabalho anterior desta Instituição, o paclitaxel, agente antiproliferativo usado no tratamento do câncer, foi capaz de regredir as lesões ateromatosas em coelhos com aterosclerose induzida por dieta rica em colesterol. Naquele trabalho, o paclitaxel foi concentrado nas lesões utilizando-se uma nanopartícula lipídica, parecida com a lipoproteína de baixa densidade (LDL), mas sem a parte protéica, denominada LDE. Tendo em vista as dificuldades do tratamento da DVE em pacientes e da grande importância dessa doença para o êxito do procedimento, novas alternativas terapêuticas devem ser procuradas, e o uso do paclitaxel associado à LDE pode ser uma rota interessante, tendo em vista que as bases inflamatórias e proliferativas da DVE são semelhantes às da doença cardiovascular aterosclerótica, onde a LDE-paclitaxel mostrou-se eficiente. Objetivos: Verificar se o tratamento com LDE-Paclitaxel reduz a incidência e o grau de DVE de coelhos submetidos a transplante cardíaco heterotópico. Analisar a biodistribuição da LDE em coelhos submetidos a transplante cardíaco heterotópico. Método: TxC heterotópico em posição cervical foi realizado utilizando-se 21 coelhos da raça New Zealand vermelhos como doadores e 21 coelhos brancos como receptores (peso ± 3 kg). Os coelhos receptores receberam dieta com acréscimo de 0,5 % de colesterol e ciclosporina A na dose de 10 mg/kg/dia via oral como imunossupressor. Foram divididos em 2 grupos: um grupo, constituído de 11 animais, foi tratado com LDE-Paclitaxel na dose de 4 mg/kg/semana, durante 6 semanas, por via endovenosa. O outro grupo (controle) compôs-se de 10 animais tratados com 3 mL de solução fisiológica por via endovenosa, semanalmente, durante 6 semanas. A biodistribuição da LDE foi determinada em 4 animais do grupo controle, injetando-se a LDE marcada com éter de colesterol radioativo 24 h antes do sacrifício, seguindose a contagem de radioatividade nos corações e outros tecidos após extração lipídica. Após o sacrifício dos animais, retiraram-se os corações nativo e transplantado para análise histológica com coloração H/E e Verhoeff-van Gieson. A área transversal das artérias coronárias foi estimada pela medida da lamina elástica interna e da área do lúmen. A porcentagem de estenose foi calculada da diferença entre área do lúmen do vaso e a área da lamina elástica interna. Análise estatística com ANOVA e o teste T, com valor p <= 0,05 considerado significante. Resultados: A captação da LDE pelo coração transplantado foi quase 4 vezes maior do que no coração nativo (p<=0,0001). Nos animais tratados com LDE-paclitaxel, houve uma dramática melhora no status das artérias coronárias dos corações transplantados, ocorrendo um acentuado aumento de 3 vezes na área da luz dos vasos (p<=0,031) e de redução da estenose em 45% (p<=0,0008). Conclusões: A LDE é capaz de concentrar-se no coração transplantado, o que possibilita o direcionamento do paclitaxel para o enxerto. O tratamento com LDE-paclitaxel reduziu acentuadamente a DVE, o que pode abrir uma nova perspectiva para o controle da doença vascular do enxerto. / Introduction: Cardiac Allograft Vasculopathy (CAV), a process involving factors of inflammatory and proliferative nature, is the leading cause of death after heart transplantation (HT), with incidence above 50% after the fifth year. It is possible that pharmacological intervention on these factors may result in inhibiting the proliferation of vascular smooth muscle cells and improves the CAV. Thus, in previous studies of this institution, paclitaxel, an antiproliferative agent used in cancer treatment, was able to recede the atheromatous lesions in rabbits with atherosclerosis induced by high cholesterol diet. In that study, paclitaxel was concentrated in the lesions using a lipid nanoparticle, similar to low density lipoprotein (LDL) but without the protein part, called LDE. Given the difficulties of the treatment of CAV in HT patients and the great importance of this disease to the success of the procedure, new therapeutic alternatives must be sought, and the use of paclitaxel associated to LDE can be an interesting route, given that the bases inflammatory and proliferation of CAV are similar to those of atherosclerotic cardiovascular disease, where the LDE-paclitaxel was efficient. Objectives: To determine whether treatment with LDE-paclitaxel reduces the incidence and degree of CAV in rabbits undergoing heterotopic heart transplantation. To analyze the biodistribution of LDE in rabbits undergoing heterotopic heart transplantation. Methods: Heterotopic HT in cervical position was performed using 21 New Zealand red rabbits as donors and 21 white rabbits as recipients (weight ± 3 kg). The receptors rabbits were fed regular chow with added 0.5% cholesterol and with cyclosporine A, 10 mg / kg / day orally as immunosuppressants. They were divided into two groups: one consisting of 11 animals was treated with LDE-paclitaxel at a dose of 4 mg / kg / week for 6 weeks intravenously. The other group (control) was composed of 10 animals treated with 3 ml of saline intravenously weekly for six weeks. The biodistribution of LDE was determined in four control animals, by injecting the LDE labeled with radioactive cholesteryl ether 24 h before sacrifice, followed by radioactivity count in the hearts and other tissues after lipid extraction. After sacrificing the animals, we excised the native and transplanted hearts for histological staining with H / E and Verhoeff-van Gieson. The cross-sectional area of the coronary arteries was estimated by measuring the internal elastic lamina and the lumen area. The percentage of stenosis was calculated from the difference between the area of the vessel lumen and the area of internal elastic lamina. Statistical analysis with ANOVA and T test with p value <= 0.05 was considered significant. Results: The uptake of LDE for the transplanted heart was almost fourfold higher than in the native heart (p<=0.0001). In animals treated with LDE-paclitaxel, there was a dramatic improvement in the status of the coronary arteries of the transplanted hearts, indicating by a marked increase of three times of the vascular lumen area (p<=0.031) and reduction of stenosis in 45% (p<=0.0008). Conclusions: The LDE is able to concentrate on the transplanted heart, which enables the targeting of paclitaxel to the graft. Treatment with LDE-paclitaxel markedly reduced CAV in the transplanted heart, which may open a new perspective for control of Cardiac Allograft Vasculopathy.

A tolerância operacional (TO) é um raro fenômeno que ocorre em indivíduos transplantados, que permanecem com função estável do aloenxerto, sem rejeição, após a suspensão de drogas imunossupressoras, por pelo menos um ano. A compreensão de mecanismos envolvidos na tolerância operacional poderá contribuir para a elaboração de novas terapias imunorreguladoras, na clínica do transplante. Investigamos se, no estado de tolerância operacional, há um perfil funcional diferencial de resposta imune celular antígeno-específica, dirigida a três grupos de antígenos relevantes no alotransplante: aloantígenos do doador (peptídeos HLA-DR), antígenos de patógenos (peptídeos do CMV - citomegalovírus) e autoantígenos (peptídeos da Hsp60 - Proteína de choque térmico 60, com funções imunológicas, imunorreguladora (REGULA) e pró-inflamatória (INFLAMA). Analisamos a produção de citocinas (por Luminex) e a proliferação de diferentes subpopulações de células T CD4+ (por FACS), com funções, predominantemente, REGULA ou INFLAMA, frente aos três tipos de antígenos, comparativamente entre TO (n=6) e Rejeição Crônica (RC: n=8), indivíduos com função estável do enxerto, usando imunossupressores (EST: n=8) e indivíduos saudáveis (SAU: n=7). Em concordância com nossa hipótese, a resposta celular é modulada, de forma diferencial, na tolerância operacional, ocorrendo um desvio funcional da resposta a peptídeos HLA-DR do doador para um perfil REGULA, enquanto é preservado o perfil INFLAMA na resposta a peptídeos do patógeno (CMV). Apesar das diferenças nas respostas aos peptídeos do CMV entre TO e RC (p=0,02 e p=0,02 para citocinas e subpopulações regula e p=0,008 e p=0,003 para citocinas e subpopulações inflama), houve preservação do perfil INFLAMA na TO, em relação ao estado fisiológico, com indução/aumento das citocinas inflamatórias IL-1B, IL-17, IFNy, MCP-1 e MIP-1B, com algum grau de inibição de citocinas imunorreguladoras, e inibição da proliferação de células Tregs, sugerindo serem importantes mecanismos na preservação da imunocompetência, na tolerância operacional. Na resposta celular a autoantígenos, destacamos o peptídeo N6 que induziu um perfil significativamente diferente na TO (mais REGULA), em relação à RC (mais INFLAMA) (p=0,001 para citocinas regula; p=0,04 para citocinas inflama), principalmente pelo aumento/indução da produção de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, na TO, sugerindo que o peptídeo N6 possa ter uma contribuição nos mecanismos na TO, favorecendo a produção dessas citocinas com atividade imunorreguladora. Considerando a diferença significativa do perfil funcional de resposta aos aloantígenos do doador entre TO (REGULA) e RC (INFLAMA) (p=0,0007 para citocinas regula e p < 0,0001 para citocinas inflama), principalmente pela inibição das citocinas próinflamatórias, como IL-1B, IL-8, IL-12, IL-17, G-CSF, IFN-y e MCP-1, na TO, concluímos que o desvio REGULA da via indireta de alorreconhecimento dirigida a peptídeos HLA-DR do doador, com inibição dessas citocinas, tenha um papel importante nos mecanismos envolvidos na tolerância operacional. Em conclusão os mecanismos em curso na tolerância operacional, modulam a resposta celular antígeno-específica dirigida a desafios antigênicos no transplante, envolvendo o desvio REGULA da resposta a peptídeos HLA-DR do doador, a participação da autoimunidade imunorreguladora à Hsp60, ao mesmo tempo em que há preservação da resposta inflamatória a patógenos / Operational tolerance (OT) is a rare phenomenon, taking place in transplanted individual who do not reject, following the complete withdrawal of immunosuppressive drugs for at least one year. Understanding the mechanisms involved in operational tolerance will contribute to opening new pathways for the development of novel immunoregulatory therapies, in transplantation. We investigated whether the state of operational tolerance displays a functionally differential profile of the antigen-specific cellular response, directed to three groups of antigens, relevant in the context of allotransplantation: donor alloantigens (HLA-DR peptides), pathogen-derived antigens (cytomegalovirus peptides - CMV) and autoantigens (peptides derived from the Hsp60 - selfantigen displaying immunoregularory (REG) and proinflammatory (INFLAMMA) properties). We determined cytokine production (by Luminex) and the proliferative response of different CD4+ T cell subsets (by FACS), displaying predominantly REG or INFLAMMA activities, in response to the three types of antigens, comparing OT (n=6) with Chronic Rejection (CR: n=8), individual with stable graft function, taking conventional immunosuppression (Sta: n=8), and healthy individuals (HI: n=7). In concordance with our hypothesis, the cellular immune response is differentially modulated in operational tolerance, giving rise to an immunoregulatory deviation in the response to HLA-DR donor peptides, preserving the proinflammatory response to pathogen peptides (CMV). Despite significant differences in the responses to CMV peptides, between OT and CR (p=0.02 and p=0.02 for REG cytokines and CD4+ subsets; p=0.008 and p=0.003 for INFLAMMA cytokines and CD4+ subsets), OT is able to preserve the INFLAMMA response in relation to the physiologic state (HI). This INFLAMMA profile of the response to CMV peptides is maintained by the induction/increase of the proinflammatory cytokines, IL-1B, IL-17, IFN-y, MCP-1 and MIP-1B, some inhibition of REG cytokines and inhibition of Treg proliferation, suggesting that these are important mechanisms in the preservation of immunocompetence to deal with pathogens, in OT. In the cellular response to autoantigens, we highlight the N6 peptide that induced a differential profile in OT (REG profile) compared to CR (INFLAMMA profile) (p=0.001 for REG cytokines; p=0.04 for INFLAMMA cytokines), due to the induction/increase of IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, in OT, suggesting that N6 may contribute to the underlying mechanisms in OT, favoring the production of these immunoregulatory cytokines. Taken the marked differences in the response to donor alloantigens, between OT (predominantly REG) and CR (predominantly INFLAMMA) (p=0.0007 for REG cytokines and p < 0.0001 for INFLAMMA cytokines), due to the inhibition of the proinflammatory cytokines, IL-1B, IL-8, IL- 12, IL-17, G-CSF, IFN-y and MCP-1, in OT, we conclude that the immunoregulatory deviation in the indirect pathway of allorecognition, directed to donor HLA-DR peptides, leading to the inhibition of these cytokines, has an important role in the mechanisms of tolerance. In conclusion, the ongoing immunoregulatory mechanisms in operational tolerance, modulate the antigenspecific cellular response to relevant antigenic challenges in allotransplantation, involving a REG deviation in the response to donor HLA-DR peptides, together with the participation of immunoregulatory autoimmunity to Hsp60, while preserving the proinflmammatory response to pathogens

A rejeição ao aloenxerto mediada por mecanismos celulares ou humorais representa uma importante complicação no pós-transplante renal. Estudos anteriores demonstraram que o depósito de C4d peritubular é um marcador de rejeição mediada por anticorpos. A técnica padrão ouro para a pesquisa de C4d é a imunofluorescência em criostato. No entanto, o manuseio do material congelado implica em algumas limitações custo-operacionais, particularmente em nosso meio. Nos casos de rejeição mediada por anticorpos é de relevância patogenética a análise da participação de linfócitos B e plasmócitos, pois são as células responsáveis pela produção de anticorpos. Considerando que até o momento o envolvimento de linfócitos B e plasmócitos no processo de rejeição foi pouco investigado, no presente estudo também será analisada a expressão de CD20 e CD138 em biópsias renais, para caracterização destes componentes celulares. Portanto, o objetivo do presente estudo foi analisar a detecção do fragmento C4d por meio de 4 diferentes técnicas, além de analisar o infiltrado de linfócitos B e plasmócitos em biópsias de enxerto renal, correlacionando estes achados com o C4d peritubular. Foram analisadas 107 biópsias de 82 pacientes submetidos a transplante renal. A pesquisa do C4d foi realizada utilizando-se as técnicas de imunofluorescência [IF] (em cortes de criostato e de parafina) e imuno-histoquímica [IH] (em cortes de criostato e de parafina), enquanto que as pesquisas dos linfócitos B e plasmócitos foram realizadas pela técnica de IH em cortes de parafina utilizando-se os anticorpos anti-CD20 e anti-CD138, específicos para linfócitos B e plasmócitos, respectivamente. Com relação à detecção de C4d, as técnicas com maior índice de concordância com a IF-criostato, considerada padrão-ouro, foram IH-criostato (75,6% dos casos apresentaram resultados coincidentes, r=0,72; p<0,0001) e IF-parafina (73%, r=0,59; p=0,0001), enquanto a taxa de concordância na técnica de IH-parafina foi de apenas 51,4% (r=0,35; p=0,03). Analisando a evolução clínica, a sobrevida do enxerto renal em 3 anos pós-biópsia foi menor no grupo C4d positivo comparado ao grupo C4d negativo (67% vs 96%, respectivamente, p=0,01). A prevalência de linfócitos B (CD20+) foi de 54% das biópsias de enxerto renal. A análise histológica do infiltrado de linfócitos B revelou 2 padrões distintos de infiltrado: padrão de células isoladas (74%) e padrão nodular (26%). O padrão nodular esteve associado a uma menor sobrevida do enxerto renal em 3 anos pós-biópsia (61% vs 89% no grupo CD20 negativo; p=0,03; e 61% vs 87% no grupo padrão de células isoladas; p=0,03). A prevalência de plasmócitos (CD138+) em biópsias de enxerto renal foi de 59%. O infiltrado plasmocitário não esteve associado a uma pior evolução clínica do transplante. A análise da correlação entre C4d peritubular, linfócitos B e plasmócitos demonstrou que o número de células CD20+ e CD138+ foi significativamente maior nos casos C4d positivos comparados aos casos C4d negativos (CD20+: 155±53 vs 26±7 cels/mm2, respectivamente; p=0,001; CD138+: 46±22 vs 4±1 cels/mm2, respectivamente; p=0,002). O presente estudo concluiu que o depósito peritubular de C4d e o infiltrado de linfócitos B, em especial o padrão nodular, estão associados a uma evolução clínica desfavorável do transplante renal. Outra conclusão importante é que há uma associação positiva entre os infiltrados de linfócitos B e de plasmócitos com o C4d peritubular, sugerindo um possível papel destas células responsáveis pela produção de anticorpos na ativação do sistema complemento in situ. Finalmente, as técnicas de IH-criostato e IF-parafina podem ser consideradas técnicas alternativas à técnica de IF-criostato para a detecção do C4d / Allograft rejection mediated by cellular or humoral mechanisms represents an important complication after kidney transplantation. Capillary C4d deposition was recognized as a specific and independent prognostic marker of antibody mediated rejection. The gold standard technique for C4d detection is the immunofluorescence in cryostat sections. However, this technique involves some operating and costs limitations, particularly in Brazil. In antibody mediated rejection, the analysis of B lymphocytes and plasma cells is of pathogenetic relevance since these cells are responsible for antibody production. Considering that the involvement of B lymphocytes and plasma cells in the rejection process is not clear, in this study the CD20 and CD138 expression in kidney biopsies will be also analyzed. Therefore, the aim of the present study was to analyze the C4d detection by 4 different techniques and the infiltration of B lymphocytes and plasma cells in renal allograft biopsies, correlating these findings with the capillary C4d deposition. One hundred and seven biopsies of 82 renal transplant patients were analyzed. C4d was evaluated by immunofluorescence (IF) and immunohistochemistry (IHC) techniques in frozen and paraffin sections (obtained from the same patients), whereas B-lymphocytes and plasma cells were evaluated by immunohistochemistry in paraffin sections using specific antibodies anti-B Lymphocytes (CD20) and anti-plasma cells (CD138). Regarding the C4d detection, the techniques with higher concordance rate with frozen-IF, considered the gold standard, were the frozen-IHC technique (85.4% of cases showed coincident results, r=0.72; p<0.0001) and the paraffin-IF technique (73%, r=0.59; p=0.0001), whereas the concordance rate in the paraffin-IHC technique was only 51.4% (r=0.35; p=0.03). The clinical follow up analysis demonstrate that C4d positive group was associated with a poor graft survival at 3 years post-diagnosis (67% vs 96% in C4d negative group; p=0.01). The histological analysis of mature B cells (CD20+) infiltrate showed 2 distinct patterns: scattered cells and clusters. The cluster pattern was associated with poor graft survival at 3 years (61% vs 89% in the CD20 negative group; p=0.03; and 61% vs 87% in the CD20+ scattered pattern group; p=0.03). The plasma cells infiltrate was not associated with a worse clinical transplant outcome. The analysis of the capillary C4d and B lymphocytes correlation demonstrate that the number of CD20+ and CD138+ cells was significantly higher in C4d positive cases (CD20+: 155±53 vs 26±7 cells/mm2, respectively; p=0.001; CD138+: 46±22 vs 4±1 cells/mm2, respectively; p=0.002). This study concluded that C4d capillary and mature B cells (clusters pattern) are associated with worse graft survival. Another important conclusion is a positive association between B lymphocytes (mature B cells and plasma cells) and capillary C4d, suggesting a possible role of these cells, responsible for antibodies production, in the in situ complement system activation. Finally, the frozen-IHC and paraffin-IF techniques may be considered alternative to frozen-IF technique for C4d detection