A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma doença recessiva ligada ao cromossomo ?X?, causada pela ausência da proteína distrofina que ocorre em vários tecidos, sendo caracterizada por uma severa disfunção da musculatura esquelética ocasionando morte prematura do paciente. Embora controverso, alguns autores reportaram que o GH (hormônio do crescimento) estaria implicado no desenvolvimento da doença e poderia ser utilizado no tratamento da mesma. Desta forma, neste estudo a dosagem sérica de IGF-I (Fator I de crescimento Similar à insulina) um peptídeo GH-dependente que regula as ações do hormônio do crescimento, foi realizada no intuito de verificar se existe correlação ou não entre o desenvolvimento da doença e a concentração sérica de IGF-I. As variações nos níveis deste hormônio foram demonstradas com o decorrer da idade sendo que, nos três primeiros meses todos os animais apresentaram comportamento semelhante com aumento dos níveis de IGF-I, porém no quarto mês os animais Distróficos benignos apresentaram redução média de 34% deste hormônio, enquanto ocorreu aumento de 1% no animal não Distrófico. Ainda, as células granulares adenohipofisárias relacionadas à produção do hormônio de crescimento em cães Golden Retriever com Distrofia Muscular apresentam-se maiores do que nos cães Golden Retriever não distróficos quanto aos seguintes parâmetros (eixo longo, área seccional e volume celular). À microscopia eletrônica de transmissão observamos que as células estudadas apresentam grânulos elétron-densos de parede dupla e distribuídos por todo o citosol. Estes grânulos apresentaram-se maiores nos animais Distróficos quando comparados aos animais não Distróficos. / The Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a X linked recessive disease, caused by the absence of dystrophin which is found in a variety of tissues and characterized by a severe disfunction of the skeletal musculature that results in a premature death of the patient. Theoretically, the growth hormone (GH) is considered to be associated to the development of Muscular Dystrophy and that could be used in its treatment. Hence in this study, a IGF-I (Insulin like growth factor-I) seric dosage was performed to verify whether or not there might be a between the evolution of the disease and IGF´s seric concentration. IGF-I is a GH-peptide dependent that regulates the GH actions during the growth. Changes in IGF-I levels were recorded during the dog?s post-natal development. On the first trimester, all animals presented similar IGF-I levels, although in the fourth month, a stark 34% decrease was observed in the dystrophic animals whereas a 1% increase was seen in the healthy dog. Furthermore, the GRMD´s granule-containing cells were larger when compared to the healthy animals. The following parameters in this comparison: long axis, cross-sectional area and cell volume. The ultrastructural study showed electron-dense granules composed by a double membrane and homogeneously distributed through the cell. These granules were larger in the dystrophic animals then in healthy dogs.

No presente trabalho, cultivou-se o microrganismo Escherichia coli RR1, contendo o vetor que carrega o gene estrutural para a síntese do hormônio de crescimento humano (hGH) (baseado no promotor pL e pR do fago l sob controle do repressor termosensível cI857) em processos descontínuo e descontínuo-alimentado realizados em biorreatores com capacidade útil de 2 e 4 L. Tal cepa é auxotrófica com relação aos aminoácidos l-leucina e l-prolina e à tiamina (vitamina B1). Nos cultivos descontínuos com concentrações menores de extrato de levedura e bactotriptona em relação ao meio denominado basal, a concentração celular foi baixa, atingindo 2,4 g.L-1, com fator de conversão glicose à células de 0,25 g.g-1. Em cultivos descontínuos com aumento (em relação ao meio basal) da concentração de extrato de levedura e de bactotriptona e com adição de l-prolina, a concentração celular alcançou valores da ordem de 5,9 g.L-1 e fator de conversão glicose à células de 0,48 g.g-1, simultaneamente à maior formação de acetato (2,5 g.L-1), este último prejudicial ao processo. Contudo, este resultado de crescimento celular não se repetiu devido a mudança do lote de células utilizado entre o primeiro e o segundo conjunto de ensaios. Os cultivos descontínuos-alimentados foram realizados com diferentes formas de alimentação bem como diferentes composições de solução de alimentação. Uma alimentação contínua com velocidade exponencial e composição semelhante à do meio, pareceu ser a mais favorável, levando à concentração celular final de 9,2 g.L-1 e fator de conversão glicose a células, na fase descontínua-alimentada, de 0,36 g.g-1. Os ensaios com indução térmica não foram eficientes provavelmente devido à problemas na detecção das concentração de glicose existente no instante inicial da ativação da síntese do hGH. Esta glicose presente pode ter prejudicado a formação do hGH por conseqüência do processo fermentativo causado pelo aumento da temperatura e pela presença de elevada concentração de nutrientes complexos. O meio de cultivo utilizado possivelmente não supriu as necessidades metabólicas da célula para a síntese do hormônio de crescimento humano e em nenhum dos cultivos com indução térmica houve a produção de hGH. / In the present work, the host Escherichia coli RR1, having the vector with the structural gene for human growth hormone (hGH) synthesis, based on pL or pR promoters from bacteriophage l under the control of the thermosensitive repressor cI857, was cultivated in batch and fed-batch cultures in bioreactors with working volumes of 2 and 4 L. This host has amino acids (l-leucine and l-proline) and thiamine (Vitamin B1) auxotrophy. Batch cultures under low yeast extract and bacto-tryptone concentrations (relative to the basal medium) resulted in a low biomass yield (2.4 g.L-1) and cell yield on glucose (0.25 g.g-1). Increasing these concentrations and adding l-proline to the medium led to higher biomass formation (5.9 g.L-1), cell yield on glucose (0.48 g.g-1) and acetate high levels (2.5 g.L-1), which were harmful to the process. However, these results of cellular growth were not reproducible due to different cell stocks applied. The fed-batch cultures were performed under different feeding strategies and different nutrients concentrations of the feeding solution. A continuous exponential feeding rate with growth medium-like composition seemed to be the most favorable, reaching final cellular concentration of 9.2 g.L-1 and yield on glucose on fed-batch mode of 0.36 g.g-1. The heat-shock runs were not efficient probably due to problems in detection of glucose concentration existing on initial instant of hGH activation synthesis. Glucose interferes with the hGH synthesis because the fermentation caused by temperature shift and presence of high complex nutrients concentration. The culture medium used, probably was not able to supply cell metabolic needs for the human growth hormone synthesis and in no other temperature-induced experiment the hGH production was observed.

Este estudo analisa a expressão dos subtipos de receptores da somatostatina (SSTR) em 39 adenomas secretores de GH. Em 19 pacientes acromegálicos, a resposta clínica, laboratorial e radiológica ao análogo da somatostatina (AS) octreotide-LAR foi comparada à expressão dos SSTR. O SSTR mais freqüentemente expresso foi o SSTR5, seguido pelos SSTR3, SSTR2, SSTR1 e SSTR4. O SSTR1 e SSTR2 foram mais expressos nos pacientes que normalizaram GH e IGF-I. Houve correlação positiva entre o grau de redução tumoral e a expressão dos SSTR1, SSTR2 e SSTR3. Portanto, AS específicos para os SSTR´s poderão contribuir para o tratamento de acromegálicos resistentes aos AS atualmente disponíveis / This study aimed to analyze the expression of somatostatin receptor subtypes (SSTR) in 39 GH-secreting pituitary adenomas. In 19 acromegalics the clinical, laboratorial and radiological responses to the somatostatin analog (SA) octreotide-LAR were compared to SSTR´s expression. The most expressed SSTR was SSTR5, followed by SSTR3, SSTR2, SSTR1 and SSTR4. SSTR1 and SSTR2 were more expressed in patients who achieved GH and IGF-I normalization. There was a positive correlation between the degree of tumor reduction with SSTR1, SSTR2 and SSTR3 expression. Therefore, the development of specific SA could contribute to treatment improvement in resistant acromegalics patients to available SA

As distrofias musculares (DM) se caracterizam por degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. Dentre estas, a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), constitui doença letal ligada ao cromossomo X, caracterizada pela ausência de distrofina na membrana das fibras musculares, afetando um em cada 3.000 meninos nascidos vivos, sendo que a maioria será confinada à cadeira de rodas a partir dos 6 anos de idade e com sobrevida, sem cuidados especiais, em torno dos 25. Apesar do uso de técnicas modernas de diagnóstico, ainda não existe tratamento eficaz para essas doenças. Alguns trabalhos das décadas de 70 e 80 sugeriram que a inibição do hormônio do crescimento (GH) poderia retardar a evolução do processo distrófico de pacientes com DMD. Entretanto, como essas observações não foram comprovadas cientificamente até a presente data, neste trabalho estudamos os efeitos do excesso e da inibição do GH na evolução do quadro distrófico em modelo murino de distrofia muscular: i) administrou-se GH (10μg/ camundongo/dia, i.p., por 10 dias) em camundongos: a) distróficos dy/dy (B6.Wk-Lama2dy-2J/J) com fenótipo, resultando na aceleração dos sintomas da doença, traduzida pela piora das performances de 17% no teste de deambulação (TD), 64% no teste de sustentação (TS), 28% no teste da esteira (TE) e 55% no teste de força máxima (TFM), em relação aos distróficos que não tomaram GH; apenas no teste de resistência à inclinação (TRI) não houve diferença significativa; entretanto, cortes histológicos do músculo gastrocnêmico desses camundongos, não mostraram alterações significativas em relação aos distróficos que não tomaram a droga; quanto aos marcadores de degeneração e regeneração (MDR) na musculatura desses animais, o GH não alterou os níveis de Pax7, MyoD, Laminina e Desmina, mas aumentou de 90% os níveis de TGFβ-1, uma citocina inflamatória que induz fibrose; b) já nos camundongos normais, o GH, ao contrário dos resultados acima, aumentou as performances de 13% no TD e de 28% TS, e ligeiramente, de forma não significativa, em outros dois testes; cortes histológicos revelaram que o GH aumentou de 16,5% a área de secção transversal dos músculos desses animais, o que poderia explicar os resultados descritos acima; já os níveis dos MDR, incluindo o de TGFβ-1, estavam semelhantes aos dos animais controles; ii) desenvolveu-se um novo modelo experimental resultante de cruzamentos de camundongos geneticamente deficientes em GH (Ghrhrlit) com os distróficos dy/dy (B6.Wk-Lama2dy-2J/J), mostrando um retardo na evolução da doença: as performances dos anões distróficos em relação aos anões normais foram melhores que aquelas dos distróficos em relação aos animais normais, ou sejam, 14% maior TD, 71% maior no TS, 18% maior no TE, 5,5% maior no TRI e 102% maior no TFM; cortes histológicos mostraram que a área do interstício nos músculos dos anões distróficos foi 29% menor que a dos distróficos não anões; os níveis de TGFβ-1 nestes animais, foram os únicos entre aqueles dos MDR estudados, que encontravam-se diminuidos de 36% em relação àqueles dos distróficos não anões; iii) a inibição da liberação do GH pela octreatida, análogo da somatostatina, mostrou também uma relativa melhora ou uma estabilização na evolução do quadro distrófico, traduzido pelo aumento, após 60 dias de tratamento, das performances nos testes funcionais da musculatura em relação àquelas dos animais distróficos sem tratamento: foi 12% maior no TD enquanto os distróficos controles diminuíram em 14%; foi 27% maior no teste de Rota Rod, enquanto os distróficos controles diminuíram em 32%; mantiveram a mesma performance no TE, enquanto os distróficos controles pioraram em 23%, e foram 29% maiores no TS, e 43% no teste de força de preensão, enquanto os distróficos controles não melhoram as suas performances nestes testes. Esses resultados sugerem um efeito patológico do GH na musculatura distrófica, com seu excesso levando a uma piora da doença, possivelmente através do aumento dos níveis de TGFβ-1. A diminuição do GH, consequentemente, poderia levar a um retardo da evolução da doença. Estes estudos experimentais abrem perspectivas bastante promissoras para se testar inibição dos efeitos do GH na evolução das doenças distróficas humanas. / Muscular dystrophies (DM) are characterized by progressive and irrevertible degeneration of the skeleton muscles. Among them, Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) consitutes lethal disease linked to chromossome X, distinguished by the absence of dystrophyn in the muscular fibers membrane, affecting one in each 3,000 boys born alive, who, most of them, will be confined to wheel chairs since the age of 6 and with life expectance, without special care, of 25 years. Despite modern diagnosis techniques, there is not an efficient treatment for these diseases. Some works from the 1970´s and 1980´s suggested that the inhibition of the growth hormone (GH) could retard the dystrophy process evolution in DMD patients. Nevertheless since this observation has not been proven scientifically, in the present work, the GH excess and inhibition effects on a murino model of muscular dystrophy, were studied: i) GH (10μg/mouse/day, i.p., for 10 days) was given to mice: a) dystrophic dy/dy (B6.Wk-Lama2dy-2J/J), with phenotype , resulting in the acceleration of the disease symptoms, confirmed by the performance worsening by 17% in the deambulation test (DT), 64% in the sustaining test (S), 28% in the mat test and 55% in the maximum strength test (MST), in relation to dystrophic mice which had not taken GH; only in the inclination resistance test (IRT) there was no significant difference; however, histological cuts of the gastrocnemius muscle of these mice did not show significant alterations, comparing to dystrophic mice which had not taken the drug: as to degeneration and regeneration markers (DRM) in these animals muscles, the GH did not alter Pax7, MyoD. Laminin and Desmin levels, although it increased by 90% the TGFβ-1 levels, an inflammatory cytokine, that induces fibrosis b) in normal mice, the GH, opposite to the results above, increased the performances by 13% in the DT and by 28% in the ST, and slightly, not significantly, in other two tests; histological cuts revealed that the GH increased by 16.5% the transversal section area of these animals muscles, what could explain the results described above; as to the MDR levels, including those of the TGFβ-1, they were similar to the control animals; ii) a new experimental model, resulting from the crossing of GH genetically deficient mice (Ghrthlit) with dystrophic dy/dy (B6.Wk-Lama2dy-2J/J), showing retardation in the disease evolution; the performances of the dystrophic dwarfs, compared to the normal dwarfs, were better than those of the dystrophic compared to normal animals, namely, 14% larger DT, 71% superior in the ST, 18% larger in the MT, 5.5% larger in the IRT and 102% superior in the MST; histological cuts showed that the interstice area in the dystrophic dwarfs muscles was 29% smaller than that of non-dwarfs dystrophic; the TGFβ-1 levels in these animals were the only MDR studied, which were found to be diminished by 36%, compared to those of the non-dwarfs dystrophic; the GH release inhibition by octreotide, somatostatin analogous, also showed a relative improvement or stabilization in the dystrophy evolution, demonstrated by the increase, ater 60 days treatment, of the performances in the muscle functional tests, compared to those of the dystrophic animals, without treatment: it was 12% larger in the DT, while the control dystrophic animals worsened by 32%; they maintained the same performance in the ST, and 43% in the seizing strength test, while the control dystrophic did not improve their performances in these tests. These results suggest a GH pathologic effect, possibly through the TGFβ-1 levels increase. The GH diminishing, consequently, could lead to the retardation in the disease evolution. These experimental studies open promissing perspectives to test the GH effects inhibition in human dystrophic diseases evolution.

Queratinócitos são células bastante atrativas para a transferência gênica ex vivo e liberação sistêmica, uma vez que as proteínas secretadas por estas células podem atingir a circulação via um mecanismo similar ao processo natural. No presente trabalho, queratinócitos transduzidos mediante um vetor retroviral com o gene do hormônio de crescimento de camundongo (mGH) foram submetidos a um tratamento de aderência ao colágeno e à análise clonal, com o intuito de enriquecer esta população de queratinócitos em células-tronco. O principal resultado foi um aumento da viabilidade celular in vitro dos queratinócitos tratados, que poderá se refletir num aumento da durabilidade da secreção do hormônio in vivo, quando realizado o implante de culturas organotípicas em camundongos anões imunodeficientes (lit/scid). Foi também utilizado um modelo de terapia gênica in vivo, baseado na eletrotransferência de DNA plasmidial (naked DNA), contendo o gene do hormônio de crescimento humano (hGH), no músculo quadríceps de camundongos anões (lit/lit) e anões imunodeficientes (lit/scid). Foram padronizadas as condições de eletroporação em 8 pulsos de 50 V e 20 ms com 0,5 s de intervalo, utilizando um plasmídeo com o promotor da ubiquitina C e a sequência genômica do hGH. A administração de uma dose única de 50 g do plasmídeo pUC-UBI-hGH em camundongos lit/scid, seguida de eletroporação, propiciou pela primeira vez na literatura obtenção de níveis sustentáveis na circulação de 1,5-3,0 ng hGH/ml, durante 60 dias. Esses animais tratados com DNA apresentaram um aumento de peso altamente significativo (P<0,001) de 33,1%, comparado a uma perda de peso, não significativa, no grupo controle (camundongos injetados com salina + eletroporação). Os músculos quadríceps dos animais tratados apresentaram um aumento de 48%, quando comparados aos dos animais do grupo controle (P<0,001). Outro estudo de eletrotransferência foi realizado comparando a utilização da sequência genômica do hGH (gDNA) com a complementar (cDNA), em plasmídeos sob o controle do promotor de citomegalovírus (CMV). Foi observado que o cDNA do hGH foi expresso de maneira mais eficiente na circulação de camundongos lit/scid, por um período de 21 dias. Foram também construídos vetores lentivirais com os genes do hGH (cDNA e gDNA) e do mGH (cDNA), que serão utilizados num próximo estudo, tanto para a transdução de queratinócitos, como para a eletrotransferência in vivo. Vetores lentivirais serão de fato necessários para futuros estudos devido a sua reduzida toxicidade em comparação com os retrovirais. Os resultados deste trabalho, assim como as perspectivas de estudo abertas, têm como meta estabelecer condições para que a terapia gênica seja num futuro próximo uma alternativa viável e segura para o tratamento da deficiência de GH e de outras doenças sistêmicas. / Keratinocytes are very attractive cells for ex vivo gene transfer and systemic delivery, since proteins secreted by these cells may reach the circulation via a mechanism which mimics the natural process. In this study, retrovirally transduced keratinocytes with the mouse growth hormone (mGH) gene underwent a treatment for adhesion to collagen and clonal analysis, in order to enrich in stem cells the keratinocyte population. The main result was an in vitro increase of cell viability for treated keratinocytes, which should result in an increase of the in vivo sustainability of hormone secretion, when implanting organotypic cultures onto immunodeficient dwarf (lit/scid) mice. A model for in vivo gene therapy based on the electrotransfer of human growth hormone (hGH)-coding naked DNA in the exposed quadriceps muscle of dwarf (lit/lit) and immunodeficient dwarf (lit/scid) mice was also utilized. Electroporation conditions were optimized, setting up eight 50-V pulses of 20 ms at a 0.5 s interval, using a plasmid containing the ubiquitin C promoter and the genomic hGH sequence. Administration of a single dose of 50 g of this plasmid led, for the first time in the literature, to sustained levels of circulating hGH of the order of 1.5-3 ng/ml, up to 60 days. The DNA-treated animals presented a highly significant weight gain (P<0.001) of 33.1%, compared to a non-significant weight loss of 4.2% for the control group (saline injected mice + electroporation). The injected quadriceps muscles of the DNA-treated mice showed a 48% weight increase, when compared to the control group (P<0.001). Another electrotransfer study was carried out comparing the use of the genomic hGH sequence (gDNA) with the complementary sequence (cDNA), cloned under the control of the cytomegalovirus (CMV) promoter. It was observed that hGH was more efficiently expressed in the circulation of lit/scid mice, for 21 days, when injecting cDNA. Lentiviral vectors containing the hGH (cDNA and gDNA) and the mGH (cDNA) genes were also constructed and will be used in a next study, both for the transduction of keratinocytes or for in vivo electrotransfer. Lentiviral vectors will in fact be necessary for future studies, considering their reduced toxicity when compared to retroviral vectors. The results of this work, as well as opening perspectives of new studies, will establish in the near future conditions for gene therapy as a feasible and safe option for the treatment of GH deficiency and other systemic diseases.

O craniofaringioma (CF) é o tumor das regiões selar e supra-selar mais comum na infância, que cursa com deficiências hipofisárias, principalmente do hormônio de crescimento (GH). As crianças afetadas apresentam redução da velocidade de crescimento (VC) e baixa estatura, mas após a ressecção do tumor, há relatos de pacientes com crescimento normal ou até aumentado mesmo deficientes em GH (DGH). Os mecanismos deste evento não são claros, mas há associações com o ganho de peso. Recentemente foram descritas relações diretas entre a leptina, o GH e o índice de massa corpórea (IMC). Com os objetivos de estabelecer correlações entre a leptina e a velocidade de crescimento (VC) e com o IMC, de correlacionar a leptina e o IGF-I com GH, e de verificar se o GH exógeno modifica o perfil de leptina nos portadores de CF e DGH, foram estudados 15 pacientes portadores de CF, sendo sete meninos e oito meninas, menores de 18 anos, deficientes em GH e impúberes. Os pacientes foram divididos em dois grupos (1 e 2) quanto à reposição com GH em tratados e não-tratados, respectivamente, e foram avaliados quanto a VC, IMC, leptinemia, insulinemia, lipidograma e IGF-I nos dois primeiros anos após a primeira cirurgia. Foi estabelecida correlação entre o IMC e a leptinemia e, para os pacientes do grupo 2, foram estabelecidas correlações entre a VC e o IGF-I, a insulinemia, o índice HOMA e a leptinemia. Após a primeira neurocirurgia, 13 pacientes cursaram com hipocortisolismo, 11 com diabetes insipidus definitivo, 12 com hipotiroidismo e todos com deficiência de GH. As medianas dos valores de Z-escore das velocidades de crescimento (Z-VC) no primeiro e segundo anos, respectivamente ,foram: no grupo 1, 0,61 e -1,86; e no grupo 2, 0,85 e 0,94. Os valores do Z-IMC final do grupo 1 variaram de -0,24 a 2,74, e no grupo 2, de -0,12 a 2,88. Não houve correlação entre o Z-IMC e o Z-VC. Os pacientes apresentaram hiperleptinemia (MZ-leptina = 10,58 e DP = 14,08), com correlação positiva entre os valores de leptina e o Z-IMC final (P = 0,0095). Não houve correlação entre os valores da leptina e o Z-VC. A correlação entre a insulina e o Z-IMC foi significante apenas no grupo 1 (P = 0,001). A insulina não se correlacionou com a VC no grupo 2. A correlação entre o IGF-I e a VC foi positiva apenas no primeiro ano (P = 0,007). Não houve diferença estatisticamente significante entre a leptina e o IGF-I, nos pacientes do grupo 2. Concluímos que houve correlação positiva entre os valores de leptina e o IMC nos pacientes portadores de CF e DGH; não houve correlação entre a leptina e a VC; não houve correlação positiva entre o IGF I e a leptina dos pacientes com CF e DGH não-tratados com hGH e não houve diferença estatística dos valores de leptina entre os grupos tratados e não-tratados. / Craniopharyngioma (CF) is a tumor of the sellar and suprasellar regions, more commonly found in children, its course being associated with hypophyseal hormones deficiency, especially growth hormone (GHD). Affected children have reduced growth rates (GR) and short stature. However, after tumor resection, patients have been reported to exhibit normal or increased growth rates, even in the presence of GH deficiency. The underlying mechanisms to this phenomenon are not clear, yet they are known to be associated with weight gain. Recently, a direct relation between leptin, GH and the body mass index (BMI) has been reported. With the objective of establishing correlations between leptin, growth rate (GR) and BMI; correlate leptin and IGF-I with GH, and verify if exogenous GH modifies the leptin profile in patients with CF and GHD, 15 GH-deficient and impuberal patients with CF, 7 boys and 8 girls, under the age of 18, were studied. According to the use of GH replacement therapy, patients were divided into 2 groups (1 and 2), respectively treated and non treated, and were evaluated for GR and BMI, leptinemia, insulinemia, lipidogram and IGF-I during the first 2 years after the first surgery. Correlation was established between BMI and leptinemia and, for the patients in group 2, correlations were established between GR and IGF-I, insulinemia, the HOMA index and leptinemia. After the first neurosurgery, 13 patients evolved with hypocortisolism, 11 with established diabetes insipidus, 12 with hypothyroidism and all patients were GH-deficient. Mean growth rate Z-score values (Z-GR) in the 1st and 2nd year, respectively, were: group 1: 0.61 and 1.86 and group 2: 0.85 and 0.94. Final Z-BMI values ranged from -0.24 to 2.74 for group 1 and from -0.12 to 2.88 for group 2. There was no correlation between Z-BMI and Z-GR. The patients showed hyperleptinemia (MZ-leptin = 10.58; SD = 14.08), with positive correlation between leptin values and the final Z-BMI (P=0.0095). There was no correlation between leptin values and Z-GR. The correlation between insulin and Z-BMI was only significant in group 1 (P = 0.001). Insulin did not correlate with GR in group 2. The correlation between IGF-I and GR was only positive in the 1st year (P = 0.007). There was t correlation between leptin and the IGF I in group 2. We conclude that there was a positive correlation between leptin values and the IMC in patients with CF and DGH; there was no correlation between leptin and GR; there was no positive correlation between IGF I and leptin in patients with CF and GHD not treated with hGH, and there was no statistical difference in leptin values between treated and non-treated groups.

Bioinformatic searching on the zebrafish genome indicates that there are five members of this hormone family (namely GH, SLalpha, SLbeta, PRL1 and PRL2) and four receptors (namely GHR1, GHR2, PRLR1 and PRLR2). However, it should be noted that these ligands and receptors are only named according to their sequence homology with those in other species. There is so far no systematic study to unravel the relationship among the ligands and receptors. The last point is particularly relevant as some of the ligands and receptors are duplicated in the fish genome. In addition, there is much controversy regarding whether one of the two GHRs is in fact the receptor for SL. A systematic study on the interaction among the ligands and receptors in zebrafish would help to resolve these issues. / In fish, growth hormone (GH), prolactin (PRL) and somatolactin (SL) are members of a gene family of polypeptide hormones which share homology in protein sequence and structure. To date, numerous functions have been attributed to this family of hormones such as growth, immune response, protein metabolism and ion regulation. The biological functions of GHlPRL are mediated through binding of the ligands on their respective receptors. It is believed that this gene family arose as the result of multiple gene duplications and subsequent divergent evolution, co-evolving with their corresponding receptors. Despite the above mentioned similarities in their structures, their cognate receptors and their signaling mechanisms, important differences among this gene family of polypeptide hormones can be recognized in their biological functions. / In the present study, the luciferase reporter assay, His-tag pulldown assay and signaling pathway activation were employed to investigate the interaction among the ligands and their receptors. It was shown that recombinant zebrafish GH, PRLI and PRL2 could only interact with their cognate receptors, i.e. GHRl, GHR2, PRLRI and PRLR2 respectively. In comparison, zebrafish SLalpha and SLbeta could neither interact with GHR1, GHR2, PRLR1 and PRLR2 in the binding study, nor could these two SLs activate the receptor-mediated downstream signaling and transcriptional activities of the four receptors in zebrafish. These data argue against the hypothesis that GHRI is the SL receptor. / The role of PRLR in early development of zebrafish was also explored. Whole mount in situ hybridization (WISH) study showed that PRLR1 was mainly expressed in the pancreas and pronephric duct, while PRLR2 was expressed in the pronephric duct only. In the PRLR1 morpholino (MO) knockdown embryos, the yolk extension (YE), the formation of which was reported to be associated with pronephric duct development, disappeared at 24 hours post fertilization. This phenotype could not be observed in the PRLR2 MO knockdown or control embryos. Real time quantitative RT-PCR and WISH data revealed that several genes expressed in the pronephric duct were up or down-regulated. The protein expression pattern of pronephric duct marker atplal was also affected in the embryos injected with PRLRI MO. In addition, histological studies showed that structure of the pronephric duct was destroyed in the PRLRI MO embryos. These results suggest that PRLRI plays an important role in the development of the pronephric duct in zebrafish embryos. / Chen, Mingliang. / "October 2010." / Adviser: Cheung Wing-Tai. / Source: Dissertation Abstracts International, Volume: 73-04, Section: B, page: . / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2011. / Includes bibliographical references (leaves 140-179). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Electronic reproduction. [Ann Arbor, MI] : ProQuest Information and Learning, [201-] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstract also in Chinese.

O craniofaringioma (CF) é o tumor das regiões selar e supra-selar mais comum na infância, que cursa com deficiências hipofisárias, principalmente do hormônio de crescimento (GH). As crianças afetadas apresentam redução da velocidade de crescimento (VC) e baixa estatura, mas após a ressecção do tumor, há relatos de pacientes com crescimento normal ou até aumentado mesmo deficientes em GH (DGH). Os mecanismos deste evento não são claros, mas há associações com o ganho de peso. Recentemente foram descritas relações diretas entre a leptina, o GH e o índice de massa corpórea (IMC). Com os objetivos de estabelecer correlações entre a leptina e a velocidade de crescimento (VC) e com o IMC, de correlacionar a leptina e o IGF-I com GH, e de verificar se o GH exógeno modifica o perfil de leptina nos portadores de CF e DGH, foram estudados 15 pacientes portadores de CF, sendo sete meninos e oito meninas, menores de 18 anos, deficientes em GH e impúberes. Os pacientes foram divididos em dois grupos (1 e 2) quanto à reposição com GH em tratados e não-tratados, respectivamente, e foram avaliados quanto a VC, IMC, leptinemia, insulinemia, lipidograma e IGF-I nos dois primeiros anos após a primeira cirurgia. Foi estabelecida correlação entre o IMC e a leptinemia e, para os pacientes do grupo 2, foram estabelecidas correlações entre a VC e o IGF-I, a insulinemia, o índice HOMA e a leptinemia. Após a primeira neurocirurgia, 13 pacientes cursaram com hipocortisolismo, 11 com diabetes insipidus definitivo, 12 com hipotiroidismo e todos com deficiência de GH. As medianas dos valores de Z-escore das velocidades de crescimento (Z-VC) no primeiro e segundo anos, respectivamente ,foram: no grupo 1, 0,61 e -1,86; e no grupo 2, 0,85 e 0,94. Os valores do Z-IMC final do grupo 1 variaram de -0,24 a 2,74, e no grupo 2, de -0,12 a 2,88. Não houve correlação entre o Z-IMC e o Z-VC. Os pacientes apresentaram hiperleptinemia (MZ-leptina = 10,58 e DP = 14,08), com correlação positiva entre os valores de leptina e o Z-IMC final (P = 0,0095). Não houve correlação entre os valores da leptina e o Z-VC. A correlação entre a insulina e o Z-IMC foi significante apenas no grupo 1 (P = 0,001). A insulina não se correlacionou com a VC no grupo 2. A correlação entre o IGF-I e a VC foi positiva apenas no primeiro ano (P = 0,007). Não houve diferença estatisticamente significante entre a leptina e o IGF-I, nos pacientes do grupo 2. Concluímos que houve correlação positiva entre os valores de leptina e o IMC nos pacientes portadores de CF e DGH; não houve correlação entre a leptina e a VC; não houve correlação positiva entre o IGF I e a leptina dos pacientes com CF e DGH não-tratados com hGH e não houve diferença estatística dos valores de leptina entre os grupos tratados e não-tratados. / Craniopharyngioma (CF) is a tumor of the sellar and suprasellar regions, more commonly found in children, its course being associated with hypophyseal hormones deficiency, especially growth hormone (GHD). Affected children have reduced growth rates (GR) and short stature. However, after tumor resection, patients have been reported to exhibit normal or increased growth rates, even in the presence of GH deficiency. The underlying mechanisms to this phenomenon are not clear, yet they are known to be associated with weight gain. Recently, a direct relation between leptin, GH and the body mass index (BMI) has been reported. With the objective of establishing correlations between leptin, growth rate (GR) and BMI; correlate leptin and IGF-I with GH, and verify if exogenous GH modifies the leptin profile in patients with CF and GHD, 15 GH-deficient and impuberal patients with CF, 7 boys and 8 girls, under the age of 18, were studied. According to the use of GH replacement therapy, patients were divided into 2 groups (1 and 2), respectively treated and non treated, and were evaluated for GR and BMI, leptinemia, insulinemia, lipidogram and IGF-I during the first 2 years after the first surgery. Correlation was established between BMI and leptinemia and, for the patients in group 2, correlations were established between GR and IGF-I, insulinemia, the HOMA index and leptinemia. After the first neurosurgery, 13 patients evolved with hypocortisolism, 11 with established diabetes insipidus, 12 with hypothyroidism and all patients were GH-deficient. Mean growth rate Z-score values (Z-GR) in the 1st and 2nd year, respectively, were: group 1: 0.61 and 1.86 and group 2: 0.85 and 0.94. Final Z-BMI values ranged from -0.24 to 2.74 for group 1 and from -0.12 to 2.88 for group 2. There was no correlation between Z-BMI and Z-GR. The patients showed hyperleptinemia (MZ-leptin = 10.58; SD = 14.08), with positive correlation between leptin values and the final Z-BMI (P=0.0095). There was no correlation between leptin values and Z-GR. The correlation between insulin and Z-BMI was only significant in group 1 (P = 0.001). Insulin did not correlate with GR in group 2. The correlation between IGF-I and GR was only positive in the 1st year (P = 0.007). There was t correlation between leptin and the IGF I in group 2. We conclude that there was a positive correlation between leptin values and the IMC in patients with CF and DGH; there was no correlation between leptin and GR; there was no positive correlation between IGF I and leptin in patients with CF and GHD not treated with hGH, and there was no statistical difference in leptin values between treated and non-treated groups.

Queratinócitos são células bastante atrativas para a transferência gênica ex vivo e liberação sistêmica, uma vez que as proteínas secretadas por estas células podem atingir a circulação via um mecanismo similar ao processo natural. No presente trabalho, queratinócitos transduzidos mediante um vetor retroviral com o gene do hormônio de crescimento de camundongo (mGH) foram submetidos a um tratamento de aderência ao colágeno e à análise clonal, com o intuito de enriquecer esta população de queratinócitos em células-tronco. O principal resultado foi um aumento da viabilidade celular in vitro dos queratinócitos tratados, que poderá se refletir num aumento da durabilidade da secreção do hormônio in vivo, quando realizado o implante de culturas organotípicas em camundongos anões imunodeficientes (lit/scid). Foi também utilizado um modelo de terapia gênica in vivo, baseado na eletrotransferência de DNA plasmidial (naked DNA), contendo o gene do hormônio de crescimento humano (hGH), no músculo quadríceps de camundongos anões (lit/lit) e anões imunodeficientes (lit/scid). Foram padronizadas as condições de eletroporação em 8 pulsos de 50 V e 20 ms com 0,5 s de intervalo, utilizando um plasmídeo com o promotor da ubiquitina C e a sequência genômica do hGH. A administração de uma dose única de 50 g do plasmídeo pUC-UBI-hGH em camundongos lit/scid, seguida de eletroporação, propiciou pela primeira vez na literatura obtenção de níveis sustentáveis na circulação de 1,5-3,0 ng hGH/ml, durante 60 dias. Esses animais tratados com DNA apresentaram um aumento de peso altamente significativo (P<0,001) de 33,1%, comparado a uma perda de peso, não significativa, no grupo controle (camundongos injetados com salina + eletroporação). Os músculos quadríceps dos animais tratados apresentaram um aumento de 48%, quando comparados aos dos animais do grupo controle (P<0,001). Outro estudo de eletrotransferência foi realizado comparando a utilização da sequência genômica do hGH (gDNA) com a complementar (cDNA), em plasmídeos sob o controle do promotor de citomegalovírus (CMV). Foi observado que o cDNA do hGH foi expresso de maneira mais eficiente na circulação de camundongos lit/scid, por um período de 21 dias. Foram também construídos vetores lentivirais com os genes do hGH (cDNA e gDNA) e do mGH (cDNA), que serão utilizados num próximo estudo, tanto para a transdução de queratinócitos, como para a eletrotransferência in vivo. Vetores lentivirais serão de fato necessários para futuros estudos devido a sua reduzida toxicidade em comparação com os retrovirais. Os resultados deste trabalho, assim como as perspectivas de estudo abertas, têm como meta estabelecer condições para que a terapia gênica seja num futuro próximo uma alternativa viável e segura para o tratamento da deficiência de GH e de outras doenças sistêmicas. / Keratinocytes are very attractive cells for ex vivo gene transfer and systemic delivery, since proteins secreted by these cells may reach the circulation via a mechanism which mimics the natural process. In this study, retrovirally transduced keratinocytes with the mouse growth hormone (mGH) gene underwent a treatment for adhesion to collagen and clonal analysis, in order to enrich in stem cells the keratinocyte population. The main result was an in vitro increase of cell viability for treated keratinocytes, which should result in an increase of the in vivo sustainability of hormone secretion, when implanting organotypic cultures onto immunodeficient dwarf (lit/scid) mice. A model for in vivo gene therapy based on the electrotransfer of human growth hormone (hGH)-coding naked DNA in the exposed quadriceps muscle of dwarf (lit/lit) and immunodeficient dwarf (lit/scid) mice was also utilized. Electroporation conditions were optimized, setting up eight 50-V pulses of 20 ms at a 0.5 s interval, using a plasmid containing the ubiquitin C promoter and the genomic hGH sequence. Administration of a single dose of 50 g of this plasmid led, for the first time in the literature, to sustained levels of circulating hGH of the order of 1.5-3 ng/ml, up to 60 days. The DNA-treated animals presented a highly significant weight gain (P<0.001) of 33.1%, compared to a non-significant weight loss of 4.2% for the control group (saline injected mice + electroporation). The injected quadriceps muscles of the DNA-treated mice showed a 48% weight increase, when compared to the control group (P<0.001). Another electrotransfer study was carried out comparing the use of the genomic hGH sequence (gDNA) with the complementary sequence (cDNA), cloned under the control of the cytomegalovirus (CMV) promoter. It was observed that hGH was more efficiently expressed in the circulation of lit/scid mice, for 21 days, when injecting cDNA. Lentiviral vectors containing the hGH (cDNA and gDNA) and the mGH (cDNA) genes were also constructed and will be used in a next study, both for the transduction of keratinocytes or for in vivo electrotransfer. Lentiviral vectors will in fact be necessary for future studies, considering their reduced toxicity when compared to retroviral vectors. The results of this work, as well as opening perspectives of new studies, will establish in the near future conditions for gene therapy as a feasible and safe option for the treatment of GH deficiency and other systemic diseases.

In this study, effects of different carbon sources and their feeding strategies on recombinant human growth hormone (rhGH) production by Pichia pastoris were investigated by means of cell growth, recombinant protein production and expression levels of hGH and alcohol oxidase (AOX) genes. In this content, firstly, the strain to be used for high level rhGH production was selected between the two phenotypes, i.e., P. pastoris hGH-Mut+ and P. pastoris hGH-MutS. In this selection both phenotypes were compared in two different media containing glycerol/methanol or sorbitol/methanol and P. pastoris-hGH-Mut+ strain grown on medium containing 30 g/L sorbitol with 1% (v/v) methanol was found to have the highest hGH expression level and rhGH production level, 9.84x109 copies/mg CDW and 120 mg/L, respectively. Thereafter, effects of sorbitol, mannitol, fructose, lactose, sucrose, citric acid, lactic acid and acetic acid were investigated by using P. pastoris hGH-Mut+ strain in laboratory scale bioreactors. Among them sorbitol and sucrose were selected to be compared for production in pilot scale bioreactors by adding them batch-wise at the beginning of induction phase with fed batch methanol feeding scheme at &amp / #956 / =0.03h-1. It was shown that sucrose does not support cell growth as sorbitol although it does not repress recombinant protein production. Then three different feeding strategies were applied to develop sorbitol/methanol mixed feeding i) single sorbitol addition at t=0, ii) besides at t=0, adding second batch-wise sorbitol at t=9 h, iii) giving pulse methanol at t=24 h to trigger AOX promoter. These three strategies were compared with a production without addition of co-substrate sorbitol. Substrate consumption, cell growth, recombinant protein production and expression levels of hGH and AOX were investigated for these different feeding strategies. The highest cell concentration was achieved in third strategy as 55 g/L where the highest extracellular rhGH production (301 mg/L) was achieved in the second strategy, with addition of two times of sorbitol. For this highest recombinant protein production case, overall cell and product yield on total substrate were found as 0.17 g/g and 1.71 mg/g, respectively. Moreover, the highest hGH and AOX expression levels were obtained in this strategy.