Hiperprolinemias são erros inatos do metabolismo causados pela deficiência de enzimas envolvidas no catabolismo da prolina, o que resulta em acúmulo tecidual de desse aminoácido. Clinicamente, os pacientes podem apresentar manifestações neurológicas graves como retardo mental e convulsões, cuja fisiopatologia não está totalmente elucidada. O objetivo desse trabalho foi investigar o efeito da prolina sobre parâmetros bioquímicos (metabolismo energético, estresse oxidativo e sistema glutamatérgico) em cérebro e fígado, bem como sobre parâmetros comportamentais de ratos submetidos ao modelo experimental de hiperprolinemia e investigar possíveis efeitos neuroprotetores das vitaminas E e C, da guanosina e do exercício físico sobre as alterações causadas pela prolina. Os resultados mostraram que a administração aguda e crônica de prolina induz peroxidação lipídica, compromete o metabolismo energético cerebral, diminui os níveis de ATP intracelular, inibe a atividade da Na+,K+-ATPase sem alterar a expressão de suas subunidades catalíticas, e prejudica a captação de glutamato, embora não diminua o conteúdo de seus transportadores. Todas essas alterações podem estar intimamente relacionadas ao déficit cognitivo causado pela hiperprolinemia, o qual também está relacionado à diminuição dos níveis de BDNF e da atividade colinérgica. A hiperprolinemia também altera a homeostase hepática pela indução de um leve grau de estresse oxidativo e de alterações metabólicas, as quais provavelmente não implicam em dano significativo ao tecido hepático, mas sugerem uma adaptação tecidual ao estresse oxidativo. Além disso, demonstramos que a utilização das vitaminas antioxidantes, da guanosina e/ou do exercício físico pode contribuir para a contenção do estresse oxidativo, da toxicidade glutamatérgica e dos prejuízos na cognição induzidos pela hiperprolinemia. Acreditamos que esses achados possam ser relevantes para o entendimento das alterações neurológicas presentes na hiperprolinemia, além de sugerir possibilidades de neuroproteção, como por exemplo, o exercício físico que poderia ser usado como um adjuvante terapêutico no tratamento dos pacientes hiperprolinêmicos. A magnitude dos efeitos biológicos das vitaminas antioxidantes e especialmente da guanosina requerem estudos adicionais para uma melhor compreensão das suas ações neuroprotetoras na hiperprolinemia. / Hyperprolinemias are inborn errors of metabolism of proline caused by genetic defects in the L-proline catabolic pathway, resulting in tissue accumulation of this amino acid. Clinically, patients may present severe neurological manifestations, such as mental retardation and seizures. However, the mechanisms underlying these alterations are not fully understood. The aim of this study was to investigate the effect of proline on biochemical parameters (energy metabolism, oxidative stress and glutamatergic system) in brain and liver, as well as on behavior of rats submitted to experimental hiperprolinemia. In addition, we investigated some neuroprotective effects of vitamins E and C, guanosine and physical exercise on the harmful effects induced by proline. The results showed that acute and chronic proline administration induce lipid peroxidation, impair energy metabolism by inhibiting key enzymes in the brain, decrease of intracellular ATP levels and inhibit the Na+,K+-ATPase activity, but not the expression of their catalytic subunits. Moreover, this amino acid impairs glutamate uptake, but not decrease the content of their carriers. All these changes caused by proline may be closely related to cognitive impairment caused by hyperprolinemia, which also seem to involve a reduction in the BDNF levels and cholinergic activity. The hyperprolinemia also alters hepatic homeostasis by inducing a mild degree of oxidative stress and metabolic changes, which probably do not involve significant damage to liver tissue, but show a process of tissue adaptation to oxidative stress. Also, we showed that the antioxidant vitamins, the nucleoside guanosine and physical exercise may contribute to the counteracting of oxidative stress, excitotoxicity and cognitive deficit induced by hyperprolinemia. These findings may be relevant to the comprehension of neurological disorders in hyperprolinemia and suggest possibilities for neuroprotection to hyperprolinemic patients, such as physical exercise, which may be used as an adjuvant therapy for these patients. The magnitude of benefical effects of antioxidant vitamins and especially guanosine on hyperprolinemia requires additional studies to better understand its neuroprotective actions.

Objetivos: Desenvolver um modelo de isquemia e reperfusão (I-R) ocular baseado no aumento da pressão intraocular (PIO) em ratos Wistar, e utilizar este modelo para investigar o efeito da guanosina (GUA) na captação de glutamato (GLU) nas retinas destes ratos em condições de I-R. Métodos: Desenvolvemos um modelo de I-R ocular e utilizamos este modelo para investigar 30 ratos Wistar, divididos em 3 grupos de 10 animais. Em cada rato, o olho direito foi submetido à elevação da PIO, gerando isquemia retiniana por 45 minutos, sem nenhuma intervenção no olho esquerdo (controle). No grupo 1, os animais não receberam GUA. No grupo 2, os animais receberam injeção intraperitoneal de GUA 30 minutos antes da isquemia e, no grupo 3, os animais receberam GUA na água durante 1 semana antes e 1 semana após a isquemia. Todos os animais foram mortos 7 dias após a isquemia e suas retinas foram coletadas para quantificar a captação de GLU. Resultados: As captações de GLU nas retinas controle foram semelhantes em todos os grupos. No grupo 1, a captação de GLU foi reduzida pela I-R. Esta redução foi abolida pela GUA administrada na água (grupo 3) e, no grupo 2, a captação de GLU aumentou com a administração intraperitoneal de GUA (P<0.001; ANOVA). Conclusões: Estes resultados sugerem que a I-R ocular gerada em nosso modelo experimental diminuiu a captação de GLU nas retinas de ratos Wistar e que a GUA aboliu tal redução ou, até mesmo, aumentou a captação de GLU. Este efeito da GUA está de acordo com estudos prévios que revelaram comportamento neuroprotetor da GUA no sistema nervoso central, por estimular a captação de GLU por astrócitos. Na retina, este efeito pode ser devido à ação da GUA estimulando a captação de GLU pelas células de Müller. / Purpose: To devise an experimental model of ocular ischemia-reperfusion (I-R) based on intraocular pressure (IOP) elevation in Wistar rats, and use this model to investigate the effect of guanosine (GUA) on glutamate (GLU) uptake in retinas of Wistar rats submitted to such ocular I-R injuries. Methods: We devised an experimental model of ocular I-R and applied this model to investigate 30 Wistar rats, divided in 3 groups of 10 rats. Each rat was submitted to IOP elevation in the right eye generating retinal ischemia during 45 minutes with no intervention in the left eye (control retina). In group 1, animals did not receive any GUA. In group 2, animals received an intraperitoneal injection of GUA 30 minutes before ischemia and, in group 3, animals received GUA in water during 1 week before and 1 week after ischemia. All animals were killed 7 days after ischemia and retina samples were obtained. Glutamate uptakes were performed from these retina samples. Results: GLU uptake in control retina was similar in all groups. In group 1, GLU uptake was significantly reduced by I-R; this reduction was abolished by GUA administration in water (group 3) and GLU uptake increased with intraperitoneal GUA (group 2).(P<0.001; ANOVA) Conclusions: These results point that I-R generated by our experimental model decreased GLU uptake in retinas of Wistar rats and that GUA abolished or even overcomed this decrease. These GUA effects are in agreement to previous results, which show that GUA administration presents neuroprotection in central nervous system by stimulating GLU uptake, mainly by astrocytes. In retina, this effect may be due to GUA stimulation of GLU uptake exerted mainly by Müller cells.

Os objetivos da presente tese de doutorado foram os de investigar o papel dos derivados da guanina na nocicepção e compreender os mecanismos responsáveis pelos efeitos extracelulares desses compostos. Os resultados desta tese estão divididos em três partes, de acordo com sua natureza, em revisão da literatura (parte um), experimental (parte dois) e clínica (parte três). Para o desenvolvimento da primeira parte, uma extensa revisão da literatura em relação ao papel extracelular das purinas foi realizada e um novo sistema guanosinérgico foi proposto. Na segunda parte desta tese, procedimentos experimentais em animais demonstraram que a guanosina é antinociceptiva em diversos modelos de dor. A administração sistêmica de guanosina causou um aumento significativo nos níveis de guanosina no líquido cefalorraquiano (LCR), demonstrando que este composto penetra ativamente no sistema nervoso central. Diversos testes comportamentais e neuroquímicos demonstraram o baixo potencial de toxicidade apresentado pela guanosina. A seguir, os mecanismos de ação envolvidos nos efeitos antinociceptivos da guanosina foram investigados através de métodos neuroquímicos e farmacológicos. Guanosina foi escolhida porque tem demonstrado interagir com o sistema glutamatérgico - sabidamente envolvido na transmissão da dor - por estimular a recaptação de glutamato. Guanosina atenuou o comportamento doloroso induzido pela injeção intratecal de glutamato e seus agonistas (AMPA, cainato, trans-ACPD) e hiperalgesia induzida por altas doses de MK-801, um efeito provavelmente relacionado à diminuição das concentrações de glutamato e aspartato no LCR. Guanosina também foi testada em um método para avaliar a captação de glutamato em fatias de cérebro e medula. Nossos resultados demonstraram que a guanosina não alterou a captação basal de glutamato. Entretanto, a guanosina atenuou os efeitos da dor sobre a captação de glutamato. Baseado nestes dados, não é possível estabelecer uma relação causal entre os dados da captação e o comportamento doloroso. Entretanto, podemos argumentar que os efeitos da guanosina sobre a captação de glutamato foram provavelmente produzidos pela modulação do estímulo doloroso e não correspondem a um mecanismo de ação responsável por estas alterações. Também demonstramos que o alopurinol, um derivado das purinas e inibidor da xantina oxidase normalmente utilizado para o tratamento de hiperuricemia, também produziu efeitos antinociceptivos em camundongos. Este efeito está provavelmente relacionado ao acúmulo de adenosina e guanosina no meio extracelular. Apesar da utilização clínica das purinas ser demasiadamente precoce, podemos inferir que a utilização de alopurinol poderia ser uma excelente estratégia para testar nossas hipóteses, pois demonstra a vantagem de estar aprovado para uso comercial, apresentar boa tolerabilidade e baixo custo. A terceira parte desta tese demonstra trabalhos sobre o sistema purinérgico em humanos. Estes estudos investigaram a correlação entre a concentração de purinas no LCR e dor aguda ou crônica em humanos. Os resultados demonstram que adenosina, guanosina e inosina correlacionaram-se significativamente com a dor em humanos. Os resultados apresentados nesta tese ratificam o papel das purinas nos mecanismos de transmissão da dor e um novo papel para a guanosina é proposto: a modulação da dor. Guanosina e outras purinas são alvos para desenvolvimento de novos fármacos e podem ser úteis no tratamento de dor relacionada a hiperestimulação do sistema glutamatérgico. / The main aims of this work were the investigation of the role of guanine-based purines on nociception and the understanding of the mechanism of action leading to extracellular effects of these compounds. The results obtained are presented in three distinct parts based on their nature, namely, literature review (part one), experimental (part two) and clinical (part three). For the development of the first part, an extensive review of the literature regarding the extracellular roles for the purinergic system was performed and a guanine-based purinergic system was proposed. In the second part, experimental procedures in animals demonstrated that guanosine is antinociceptive in several acute or chronic pain models in rodents. Systemic administration of guanosine significantly increased cerebrospinal fluid (CSF) guanosine levels, showing that this compound actively penetrates in the central nervous system. Several behavioral tasks and neurochemical approaches demonstrated that guanosine presents minimal toxic effects. After that, the mechanisms of action underlying the antinociceptive effects of guanosine were investigated, by using pharmacological and neurochemical means. Guanosine was chosen because it has been shown to interact with the glutamatergic system - which is known to be involved in the mechanisms of pain transmission - by promoting astrocytic glutamate reuptake. Guanosine attenuated nociceptive behavior induced by intrathecal administration of glutamate and its receptor agonists (AMPA, kainate, trans-ACPD) and hyperalgesia induced by high-dose MK-801, an effect that seems to be related with the reduction of glutamate and aspartate accumulation in the CSF. Guanosine was tested in a model of glutamate uptake by brain and spinal cord slices from rats and mice. Our results demonstrated that guanosine did not alter basal glutamate uptake at both brain and spinal cord. However, guanosine attenuated effects on glutamate uptake induced by pain behavior in animals. It is not possible to establish whether the changes in the spinal cord glutamate uptake were responsible for nociceptive behavior or it caused the changes. However, we may argue that the changes in the glutamate uptake induced guanosine were probably produced by modulation of nociceptive stimuli rather than an underlying mechanism of action. In the second part of this work, we demonstrated that allopurinol, a purine derivative and xanthine oxidase inhibitor commonly used to treat hyperuricemia, also produced consistent antinociception in mice. This effect was probably related to the accumulation of extracellular adenosine and guanosine. It was therefore concluded that, although is early to propose the use of purines in a clinical setting, allopurinol could be an excellent alternative to test this hypothesis since shows the advantage of be already approved for commercial use, presenting well tolerability and very low cost. The third part of this work presents some results derived from the human models of pain. These studies investigated the correlation between the CSF concentration of purines and acute or chronic pain in humans. Our results show that adenosine, guanosine and inosine were significantly correlated with pain in humans. Altogether these results further demonstrate the role of purines in pain mechanisms and provide a new role for guanosine: pain modulation. Guanosine and other purines presents as a new target for future drug development and might be useful for treat pain related to overstimulation of the glutamatergic system.

Os Transtornos psiquiátricos acompanham a história da humanidade. Classificados em categorias distintas podemos observar que dentre todas as patologias que constituem os transtornos mentais e de comportamento, as doenças mais prevalentes são as doenças de Ansiedade e de Transtorno Depressivo Maior (TDM). Mesmo com muitos avanços nas neurociências, assim como na terapêutica (psicofarmacologia), ainda hoje a fisiopatologia e o desenvolvimento farmacológico são áreas que necessitam intenso estudo. Avanços recentes tem sugerido que drogas capazes de modular os sistemas glutamatérgico e purinérgico possuem potencial efeito neuromodulador, sendo promissores candidatos para o desenvolvimento de novas drogas com ação ansiolítica e/ou antidepressiva. Dessa maneira, o objetivo desta tese foi investigar o potencial efeito ansiolítico da guanosina (GUO) em modelos animais preditivos para o estudo da potencial atividade ansiolítica de novos compostos, assim como seu potencial efeito antidepressivo no modelo animal de depressão da Bulbectomia Olfatória Bilateral (OBX). Inicialmente, nossos resultados demonstram que a administração de GUO foi capaz de produzir um consistente efeito ansiolítico modulando os níveis de adenosina (ADO) e glutamato cerebral. Ainda, pela primeira vez, foi observado que a GUO per se promoveu uma diminuição da liberação de glutamato em preparações de sinaptosomas de hipocampo, um efeito dependente da ativação dos receptores A1 de ADO. Após a caracterização do potencial efeito ansiolítico da GUO, nosso objetivo foi avaliar o potencial efeito antidepressivo da GUO em um modelo animal com validade de face e de constructo, como o modelo da OBX. Contudo, após revisão da literatura em estudos que utilizaram o modelo da OBX, observou-se a necessidade de uma investigação a longo prazo, das principais alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pela OBX. Nossos resultados, mostram pela primeira vez, que camundongos submetidos a OBX apresentaram simultaneamente alterações comportamentais e neuroquímicas transitórias e de longa duração. Ademais, as evidências indicam que o hipocampo possui alta susceptibilidade aos danos induzidos pela OBX, visto que uma sinaptotoxicidade transitória, acompanhada de um duradouro desequilíbrio redox e aumento da resposta inflamatória foram observados. Por fim, o tratamento crônico com GUO foi capaz de reverter a maioria das alterações identificadas previamente como duradouras nos parâmetros comportamentais e neuroquímicos no modelo da OBX. Considerando os resultados neuroquímicos obtidos pelos diferentes protocolos de tratamento realizados neste estudo, novas hipóteses de mecanismos de ação exercidos pela GUO foram apresentadas, e mecanismos já estabelecidos foram reproduzidos. Por fim, de uma maneira geral os dados apresentados nesta tese reforçam a hipótese do envolvimento do sistema purinérgico nos transtornos psiquiátricos, e sugerem que a GUO apresenta uma potencial ação terapêutica para o tratamento destas doenças, abrindo assim novas perspectivas para elucidação dos mecanismos envolvidos na fisiopatologia da ansiedade e TDM. / Psychiatric disorder had accompanied the course of human history. Mental and behavioral disorders are classified in different categories and among all different psychiatric disorders; anxiety and major depressive disorder (MDD) are the most prevalents. Despite the substantial advances in our knowledge on the neurobiological bases of both anxiety and MDD, as well as in the therapeutic area (psychopharmacology), even today, the pathophysiology of these disorders as well as pharmacological development are still under investigation. Recent advances have suggested that drugs able to modulate glutamatergic and purinergic systems present a potential neuromodulatory effect, and are promising candidates for the development of new drugs with both anxiolytic and antidepressant effects. Thus, the aim of this work was to investigate the potential guanosine (GUO) anxiolytic-like effects in predictive animal models largely used to elucidate anxiolytic properties of new compounds, as well as investigate the potential GUO antidepressant effect in Olfactory Bulbectomy (OBX) model of depression. Initially, our results demonstrate that acute GUO administration was able to induce a consistent anxiolytic-like effect, by modulating the adenosine and glutamate cerebrospinal levels. Here, for the first time, it was observed that GUO per se was able to decrease the glutamate release in hippocampal synaptosome. After characterizing the potential anxiolytic-like effect promoted by GUO, our second goal was to evaluate the potential GUO antidepressant-like effect in an animal model with recognized face and construct validity as the OBX model of depression. However, given the lack of studies in the literature considering the time course of the behavioral and neurochemical changes after the depressive-like behavior onset induced by OBX we firstly characterize some important features regarding the OBX model. Collectively, mice submitted to the OBX model of depression and followed up to 8 weeks simultaneously presented transient and long-lasting deleterious effects in behavioral and neurochemical parameters. The evidences pointed that hippocampus was the most affected brain structure, since a transient hippocampal-related synaptotoxicity, accompanied by a long-lasting hippocampal imbalance in redox and inflammatory homeostasis were observed. Additionally, the neurochemical effects seem to strengthen our behavioral findings. Finally, chronic GUO treatment, similarly to the classical tricyclic antidepressant imipramine, was able to improve the long-term behavioral phenotype impairment induced by OBX, specifically improving behavioral performances that require cognitive functions, accompanied by reversion of hippocampal redox imbalance parameters, as well as in peripheral and central anti-inflammatory IL-10 release. Thus, in present study, the pre-clinical evaluation of GUO as a potential drug for treatment of the most prevalent psychiatric disorders (anxiety and MDD) presented promising results. Furthermore, additional GUO mechanisms of action were evidenced and new perspectives were established. Thus, the data presented in this thesis support the hypothesis of the involvement of the purinergic system in mood disorders, and suggest that GUO has a potential therapeutic activity for the treatment of psychiatric disorders.

Os Transtornos psiquiátricos acompanham a história da humanidade. Classificados em categorias distintas podemos observar que dentre todas as patologias que constituem os transtornos mentais e de comportamento, as doenças mais prevalentes são as doenças de Ansiedade e de Transtorno Depressivo Maior (TDM). Mesmo com muitos avanços nas neurociências, assim como na terapêutica (psicofarmacologia), ainda hoje a fisiopatologia e o desenvolvimento farmacológico são áreas que necessitam intenso estudo. Avanços recentes tem sugerido que drogas capazes de modular os sistemas glutamatérgico e purinérgico possuem potencial efeito neuromodulador, sendo promissores candidatos para o desenvolvimento de novas drogas com ação ansiolítica e/ou antidepressiva. Dessa maneira, o objetivo desta tese foi investigar o potencial efeito ansiolítico da guanosina (GUO) em modelos animais preditivos para o estudo da potencial atividade ansiolítica de novos compostos, assim como seu potencial efeito antidepressivo no modelo animal de depressão da Bulbectomia Olfatória Bilateral (OBX). Inicialmente, nossos resultados demonstram que a administração de GUO foi capaz de produzir um consistente efeito ansiolítico modulando os níveis de adenosina (ADO) e glutamato cerebral. Ainda, pela primeira vez, foi observado que a GUO per se promoveu uma diminuição da liberação de glutamato em preparações de sinaptosomas de hipocampo, um efeito dependente da ativação dos receptores A1 de ADO. Após a caracterização do potencial efeito ansiolítico da GUO, nosso objetivo foi avaliar o potencial efeito antidepressivo da GUO em um modelo animal com validade de face e de constructo, como o modelo da OBX. Contudo, após revisão da literatura em estudos que utilizaram o modelo da OBX, observou-se a necessidade de uma investigação a longo prazo, das principais alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pela OBX. Nossos resultados, mostram pela primeira vez, que camundongos submetidos a OBX apresentaram simultaneamente alterações comportamentais e neuroquímicas transitórias e de longa duração. Ademais, as evidências indicam que o hipocampo possui alta susceptibilidade aos danos induzidos pela OBX, visto que uma sinaptotoxicidade transitória, acompanhada de um duradouro desequilíbrio redox e aumento da resposta inflamatória foram observados. Por fim, o tratamento crônico com GUO foi capaz de reverter a maioria das alterações identificadas previamente como duradouras nos parâmetros comportamentais e neuroquímicos no modelo da OBX. Considerando os resultados neuroquímicos obtidos pelos diferentes protocolos de tratamento realizados neste estudo, novas hipóteses de mecanismos de ação exercidos pela GUO foram apresentadas, e mecanismos já estabelecidos foram reproduzidos. Por fim, de uma maneira geral os dados apresentados nesta tese reforçam a hipótese do envolvimento do sistema purinérgico nos transtornos psiquiátricos, e sugerem que a GUO apresenta uma potencial ação terapêutica para o tratamento destas doenças, abrindo assim novas perspectivas para elucidação dos mecanismos envolvidos na fisiopatologia da ansiedade e TDM. / Psychiatric disorder had accompanied the course of human history. Mental and behavioral disorders are classified in different categories and among all different psychiatric disorders; anxiety and major depressive disorder (MDD) are the most prevalents. Despite the substantial advances in our knowledge on the neurobiological bases of both anxiety and MDD, as well as in the therapeutic area (psychopharmacology), even today, the pathophysiology of these disorders as well as pharmacological development are still under investigation. Recent advances have suggested that drugs able to modulate glutamatergic and purinergic systems present a potential neuromodulatory effect, and are promising candidates for the development of new drugs with both anxiolytic and antidepressant effects. Thus, the aim of this work was to investigate the potential guanosine (GUO) anxiolytic-like effects in predictive animal models largely used to elucidate anxiolytic properties of new compounds, as well as investigate the potential GUO antidepressant effect in Olfactory Bulbectomy (OBX) model of depression. Initially, our results demonstrate that acute GUO administration was able to induce a consistent anxiolytic-like effect, by modulating the adenosine and glutamate cerebrospinal levels. Here, for the first time, it was observed that GUO per se was able to decrease the glutamate release in hippocampal synaptosome. After characterizing the potential anxiolytic-like effect promoted by GUO, our second goal was to evaluate the potential GUO antidepressant-like effect in an animal model with recognized face and construct validity as the OBX model of depression. However, given the lack of studies in the literature considering the time course of the behavioral and neurochemical changes after the depressive-like behavior onset induced by OBX we firstly characterize some important features regarding the OBX model. Collectively, mice submitted to the OBX model of depression and followed up to 8 weeks simultaneously presented transient and long-lasting deleterious effects in behavioral and neurochemical parameters. The evidences pointed that hippocampus was the most affected brain structure, since a transient hippocampal-related synaptotoxicity, accompanied by a long-lasting hippocampal imbalance in redox and inflammatory homeostasis were observed. Additionally, the neurochemical effects seem to strengthen our behavioral findings. Finally, chronic GUO treatment, similarly to the classical tricyclic antidepressant imipramine, was able to improve the long-term behavioral phenotype impairment induced by OBX, specifically improving behavioral performances that require cognitive functions, accompanied by reversion of hippocampal redox imbalance parameters, as well as in peripheral and central anti-inflammatory IL-10 release. Thus, in present study, the pre-clinical evaluation of GUO as a potential drug for treatment of the most prevalent psychiatric disorders (anxiety and MDD) presented promising results. Furthermore, additional GUO mechanisms of action were evidenced and new perspectives were established. Thus, the data presented in this thesis support the hypothesis of the involvement of the purinergic system in mood disorders, and suggest that GUO has a potential therapeutic activity for the treatment of psychiatric disorders.

Os Transtornos psiquiátricos acompanham a história da humanidade. Classificados em categorias distintas podemos observar que dentre todas as patologias que constituem os transtornos mentais e de comportamento, as doenças mais prevalentes são as doenças de Ansiedade e de Transtorno Depressivo Maior (TDM). Mesmo com muitos avanços nas neurociências, assim como na terapêutica (psicofarmacologia), ainda hoje a fisiopatologia e o desenvolvimento farmacológico são áreas que necessitam intenso estudo. Avanços recentes tem sugerido que drogas capazes de modular os sistemas glutamatérgico e purinérgico possuem potencial efeito neuromodulador, sendo promissores candidatos para o desenvolvimento de novas drogas com ação ansiolítica e/ou antidepressiva. Dessa maneira, o objetivo desta tese foi investigar o potencial efeito ansiolítico da guanosina (GUO) em modelos animais preditivos para o estudo da potencial atividade ansiolítica de novos compostos, assim como seu potencial efeito antidepressivo no modelo animal de depressão da Bulbectomia Olfatória Bilateral (OBX). Inicialmente, nossos resultados demonstram que a administração de GUO foi capaz de produzir um consistente efeito ansiolítico modulando os níveis de adenosina (ADO) e glutamato cerebral. Ainda, pela primeira vez, foi observado que a GUO per se promoveu uma diminuição da liberação de glutamato em preparações de sinaptosomas de hipocampo, um efeito dependente da ativação dos receptores A1 de ADO. Após a caracterização do potencial efeito ansiolítico da GUO, nosso objetivo foi avaliar o potencial efeito antidepressivo da GUO em um modelo animal com validade de face e de constructo, como o modelo da OBX. Contudo, após revisão da literatura em estudos que utilizaram o modelo da OBX, observou-se a necessidade de uma investigação a longo prazo, das principais alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pela OBX. Nossos resultados, mostram pela primeira vez, que camundongos submetidos a OBX apresentaram simultaneamente alterações comportamentais e neuroquímicas transitórias e de longa duração. Ademais, as evidências indicam que o hipocampo possui alta susceptibilidade aos danos induzidos pela OBX, visto que uma sinaptotoxicidade transitória, acompanhada de um duradouro desequilíbrio redox e aumento da resposta inflamatória foram observados. Por fim, o tratamento crônico com GUO foi capaz de reverter a maioria das alterações identificadas previamente como duradouras nos parâmetros comportamentais e neuroquímicos no modelo da OBX. Considerando os resultados neuroquímicos obtidos pelos diferentes protocolos de tratamento realizados neste estudo, novas hipóteses de mecanismos de ação exercidos pela GUO foram apresentadas, e mecanismos já estabelecidos foram reproduzidos. Por fim, de uma maneira geral os dados apresentados nesta tese reforçam a hipótese do envolvimento do sistema purinérgico nos transtornos psiquiátricos, e sugerem que a GUO apresenta uma potencial ação terapêutica para o tratamento destas doenças, abrindo assim novas perspectivas para elucidação dos mecanismos envolvidos na fisiopatologia da ansiedade e TDM. / Psychiatric disorder had accompanied the course of human history. Mental and behavioral disorders are classified in different categories and among all different psychiatric disorders; anxiety and major depressive disorder (MDD) are the most prevalents. Despite the substantial advances in our knowledge on the neurobiological bases of both anxiety and MDD, as well as in the therapeutic area (psychopharmacology), even today, the pathophysiology of these disorders as well as pharmacological development are still under investigation. Recent advances have suggested that drugs able to modulate glutamatergic and purinergic systems present a potential neuromodulatory effect, and are promising candidates for the development of new drugs with both anxiolytic and antidepressant effects. Thus, the aim of this work was to investigate the potential guanosine (GUO) anxiolytic-like effects in predictive animal models largely used to elucidate anxiolytic properties of new compounds, as well as investigate the potential GUO antidepressant effect in Olfactory Bulbectomy (OBX) model of depression. Initially, our results demonstrate that acute GUO administration was able to induce a consistent anxiolytic-like effect, by modulating the adenosine and glutamate cerebrospinal levels. Here, for the first time, it was observed that GUO per se was able to decrease the glutamate release in hippocampal synaptosome. After characterizing the potential anxiolytic-like effect promoted by GUO, our second goal was to evaluate the potential GUO antidepressant-like effect in an animal model with recognized face and construct validity as the OBX model of depression. However, given the lack of studies in the literature considering the time course of the behavioral and neurochemical changes after the depressive-like behavior onset induced by OBX we firstly characterize some important features regarding the OBX model. Collectively, mice submitted to the OBX model of depression and followed up to 8 weeks simultaneously presented transient and long-lasting deleterious effects in behavioral and neurochemical parameters. The evidences pointed that hippocampus was the most affected brain structure, since a transient hippocampal-related synaptotoxicity, accompanied by a long-lasting hippocampal imbalance in redox and inflammatory homeostasis were observed. Additionally, the neurochemical effects seem to strengthen our behavioral findings. Finally, chronic GUO treatment, similarly to the classical tricyclic antidepressant imipramine, was able to improve the long-term behavioral phenotype impairment induced by OBX, specifically improving behavioral performances that require cognitive functions, accompanied by reversion of hippocampal redox imbalance parameters, as well as in peripheral and central anti-inflammatory IL-10 release. Thus, in present study, the pre-clinical evaluation of GUO as a potential drug for treatment of the most prevalent psychiatric disorders (anxiety and MDD) presented promising results. Furthermore, additional GUO mechanisms of action were evidenced and new perspectives were established. Thus, the data presented in this thesis support the hypothesis of the involvement of the purinergic system in mood disorders, and suggest that GUO has a potential therapeutic activity for the treatment of psychiatric disorders.

A persistência bacteriana correlacionada à formação de biofilmes bacterianos é, há algum tempo, fonte de grande preocupação médica em virtude de sua ampla associação com a dificuldade de tratamento de infecções crônicas. Por outro lado, as perspectivas de utilização de biofilmes bacterianos em novas aplicações biotecnológicas e até mesmo para fins terapêuticos são promissoras. Há, portanto, grande interesse em compreender os mecanismos que levam as células bacterianas a deixar o estado planctônico, de vida livre, e associarem-se nesses conglomerados celulares altamente complexos. Ao longo das últimas décadas, o segundo mensageiro c-di-GMP &ndash; em conjunto com as moléculas que catalisam sua síntese (diguanilato ciclases) e sua degradação (fosfodiesterases) e seus receptores &ndash; estabeleceu-se como um elemento central de regulação de uma série de respostas celulares que determinam a formação ou a dispersão de biofilmes. Curiosamente, as proteínas que participam do metabolismo deste segundo mensageiro estão, frequentemente, codificadas múltiplas vezes em um mesmo genoma bacteriano. Em vista dessa observação, estudos mais recentes apontam que, para reger paralelamente uma variedade tão ampla de fenótipos, este sistema opera em modo de alta especificidade de sinalização e que, portanto, o sinal metabolizado por determinados conjuntos de diguanilato ciclases e fosfodiesterases tem alvos celulares específicos. Evidências robustas, porém isoladas até o momento, apontaram que um dos meios pelo qual ocorre a segregação entre sinal produzido e alvo específico é a interação direta entre as proteínas componentes das vias de sinalização. Mais, demonstrou-se que, em algumas vias, a transmissão de sinal ocorre exclusivamente via interação proteica, dispensando a intermediação do sinalizador em si. Para avaliar a validade e relevância global deste mecanismo, propôs-se, neste estudo, a investigação da rede total de interações entre as proteínas tipicamente associadas às vias de sinalização por c-di-GMP em Pseudomonas aeruginosa, utilizando ensaios de duplo-hibrido bacteriano. Para tanto, foram construídas duas bibliotecas de DNA direcionadas e foram feitos testes de interação de forma estratégica para possibilitar o esgotamento e averiguação de todas as possíveis interações entre as proteínas alvo identificadas. O resultado obtido, um mapa inicial, porém abrangente, da rede de interações proteicas em P. aeruginosa, indica uma grande probabilidade de que os mecanismos previamente descritos sejam realmente recorrentes e relevantes para o intermédio da sinalização nesse organismo. Algumas das interações mais robustas encontradas são bastante interessantes e serão, em estudos futuros, mais extensivamente estudadas. / Persister bacteria are correlated to biofilm formation and have been a source of great medical concern due to its close association with the impairment of traditional treatment in combating chronic infections. On the other hand, using bacterial biofilms to create original biotechnological applications or even as a means of therapeutic treatment in medical settings constitutes a promising prospect. There is, therefore, a great interest in understanding the mechanisms that allow bacteria to leave the free-living planktonic lifestyle and associate in these highly complex cellular aggregates. Over the last decades, the second messenger c-di-GMP &ndash; and also the molecules involved in its synthesis (diguanylate ciclases) and degradation (phosphodiesterases) along with its receptors &ndash; has been established as a key element implicated in regulation of a series of cellular responses that determine biofilm formation or dispersion. Curiously, the proteins that play a part in the metabolism of this second messenger are frequently coded multiple times in single bacterial genomes. Taking this into account, recent studies indicate that, in order to control such a wide range of phenotypes, this system operates via high specificity of signaling &ndash; which means that the signal metabolized by a certain set of diguanylate ciclases and phosphodiesterases has specific cellular targets. Robust but yet isolated evidence indicate that a means by which a signal is segregated with its correlated phenotypic response is through direct protein-protein interaction involving the components of these signaling pathways. Even more, there has been strikingly evidence that, in some of these pathways, signal transduction occurs exclusively through protein-protein interaction, entirely dismissing any mediation by the signal molecule. In order to validate and evaluate the global relevance of this type of mechanism, this study proposed the investigation of the entire network of interactions between proteins typically associated with c-di-GMP signaling pathways of Pseudomonas aeruginosa by employing bacterial two-hybrid system assays. To make that possible, two DNA libraries were constructed and interaction essays were performed in a strategic way so that all possibilities of interaction between target proteins were explored. The results obtained from these experiments allowed the construction of a broad map of interactions that, although still primitive, indicates that, chances are, the mechanisms previously described are both recurrent and relevant to signaling regulation in this organism. Some of the interaction partners found are particularly interesting and will be further investigated in future studies.

A isquemia cerebral é uma enfermidade grave, de incidência e prevalência global, considerada uma das principais causas de morte e incapacidade no mundo. Ela é decorrente da hipoperfusão ou interrupção sanguínea em uma determinada região encefálica e a falta de oxigênio e glicose leva a falha no metabolismo energético de neurônios e células gliais. A morte destas células libera grande quantidade de glutamato, o principal neurotransmissor excitatório, o que desencadeia a cascata isquêmica, formada por estresse oxidativo, excitotoxicidade e processo inflamatório. Estes insultos causam danos teciduais graves que comprometem, principalmente, o sistema sensorimotor, memória, cognição e as emoções. A guanosina, um derivado da guanina, tem mostrado papel neuroprotetor ao sistema nervoso central, agindo no sistema glutamatérgico. Esses efeitos têm sido demonstrados em ratos machos, mas não em fêmeas, por isso, o objetivo desta tese foi investigar através de testes comportamentais, imunoistoquímico e histológico, a ação da guanosina em ratos Wistar machos e fêmeas induzidos cirurgicamente a um modelo de isquemia focal permanente do córtex cerebral parietal, levando em consideração o ciclo estral das fêmeas imediatamente antes da indução isquêmica. Este trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UFRGS (Nº 29396). Após a verificação do ciclo estral, fêmeas e machos foram anestesiados, posicionados em aparelho estereotáxico e a isquemia focal cortical foi induzida por termocoagulação dos vasos piais. Ao término da cirurgia, os animais foram tratados com solução salina 0,9% ou guanosina 60 mg/kg, ambos por via intraperitoneal, em 4 doses (0, 1, 3 e 6 horas após a indução isquêmica). No teste do cilindro, as fêmeas apresentaram significativamente melhor recuperação sensorimotora a longo prazo comparadas aos machos. No teste do campo aberto, memória de habituação a longo prazo e locomoção em fêmeas foram prejudicadas pela isquemia e os machos não apresentaram prejuízo. No teste do labirinto em cruz elevado não houve diferença significativa entre os grupos. No teste claro/escuro, as fêmeas isquêmicas demonstraram comportamento ansiolítico comparadas aos machos e às fêmeas naïves. A imunoistoquímica de astrócitos e a mensuração do volume de lesão não apresentaram diferença estatística entre os grupos. Com este trabalho demonstrou-se a importância da realização de pesquisas em ambos os gêneros, considerando o ciclo estral, principalmente para enfermidades complexas como a isquemia cerebral. O tratamento com a guanosina é promissor, principalmente na recuperação motora em fêmeas, entretanto, estudos futuros são necessários para melhor compreendimento dos mecanismos envolvidos. / Ischemic stroke is a serious disease of global incidence and prevalence, considered a leading cause of death and disability worldwide. It is due to hypoperfusion or blood disruption in a brain region and the lack of oxygen and glucose leads to failure in energetic metabolism of neurons and glial cells. The death of these cells releases large amount of glutamate, the main excitatory neurotransmitter, which triggers the ischemic cascade, formed by oxidative stress, excitotoxicity and inflammatory processes. These insults cause severe tissue damage that mainly compromise the sensorimotor system, memory, cognition and emotions. Guanosine, a guanine derivative, has shown a neuroprotective role in the central nervous system, acting on the glutamatergic system. These effects have been demonstrated in male rats, but not in females, so the aim of this thesis was to investigate through behavioral, immunohistochemical and histological tests, the action of guanosine in male and female Wistar rats surgically induced to a model of focal permanent cerebral ischemia in the motor cortex, considering the female estrous cycle immediately before the ischemic induction. This work was approved by the UFRGS Ethical Committee on the Use of Animals (No. 29396). After estrous cycle verification, females and males were anesthetized, positioned in a stereotaxic apparatus, and cortical focal ischemia was induced by thermocoagulation of the pial vessels. At the end of the surgery, the animals were treated with 0.9% saline or guanosine 60 mg/kg, both intraperitoneally, in 4 doses (0, 1, 3 and 6 hours after ischemic induction). In the cylinder test, females presented significant long-term sensorimotor recovery compared to males. In the open field test, long-term memory habituation and locomotion/exploratory activity in females were impaired by ischemia and males showed no impairment. In the elevated plus maze test, there was no significant difference between groups. In the light/dark test, the ischemic females showed anxiolytic-like behavior compared to naïve males and females. The immunohistochemistry of astrocytes and the measurement of lesion volume did not show any statistical difference between groups. With this work it was demonstrated the importance of conducting researches in both genders, considering the estrous cycle, mainly for complex diseases such as cerebral ischemia. The treatment with guanosine is promising, especially in motor recovery in females; however, future studies are necessary to better understand the mechanisms involved.

Astrócitos são células gliais com fundamental importância no sistema nervoso central (SNC), tanto em condições fisiológicas quanto patológicas. Estas células são essenciais na plasticidade neural, no metabolismo de neurotransmissores, na defesa antioxidante, na regulação do metabolismo energético, na homeostase iônica, na resposta inflamatória, na manutenção da barreira sangue-cérebro, na migração neuronal e na estabilização da comunicação entre as células. Assim, alterações em funções astrocitárias (como as que ocorrem no envelhecimento) estão relacionadas a importantes alterações na funcionalidade cerebral. Desta forma, esta tese teve por objetivo demonstrar que a cultura de astrócitos derivada de ratos Wistar adultos, desenvolvida e caracterizada pelo nosso grupo de pesquisa, pode ser um modelo de estudo fidedigno e versátil das propriedades celulares astrocitárias. Nossos resultados apontam que esta metodologia pode ser utilizada para elucidar o perfil de aminoácidos e gliotransmissores assim como da atividade enzimática glial e gerenciamento de neurotransmissores. Também demonstramos que a cultura adulta não é derivada de progenitores neurais e que parâmetros mitocondriais observados no cérebro adulto foram reproduzidos in vitro. A análise de respostas a estímulos demonstrou ser variável, dependendo da idade dos animais. Da mesma forma, o uso de culturas de diferentes idades revelou o efeito antienvelhecimento da guanosina, sugerindo sua atividade glioprotetora. Finalmente, demonstramos que culturas preparadas a partir de animais neonatos submetidas a um modelo de senescência in vitro apresentam respostas diferentes das apresentadas por culturas preparadas a partir de animais adultos e/ou envelhecidos, demonstrando que o modelo mais adequado para elucidar propriedades astrocitárias do cérebro maduro é o derivado de animais adultos. Portanto, demonstramos com este estudo a importância da disponibilidade de uma ferramenta como a cultura de astrócitos adultos e elucidamos características bioquímicas, celulares e moleculares desta ferramenta, evidenciando algumas de suas diferenças em comparação à cultura preparada a partir de ratos neonatos. Assim, ampliamos a compreensão das propriedades e funções celulares desta ferramenta, fornecendo respostas mais aproximadas às respostas fornecidas por astrócitos do cérebro maduro in vivo, especialmente no estudo do envelhecimento e das doenças neurodegenerativas. / Astrocytes are glial cells of pivotal importance in the central nervous system (CNS), both in physiological and pathological conditions. Some of their roles include neural plasticity, neurotransmitter metabolism, antioxidant defenses, control of energy metabolism, ionic homeostasis, inflammatory response, formation and maintenance of blood-brain barrier, neuronal migration and cellular communication. Thus, changes in astrocytic function (such as occurs in aging) are related to changes in brain function. The aim of this thesis was to demonstrate that astrocyte cultures from adult Wistar rats (developed and characterized by our research group) might be a reliable and versatile tool for studying astrocytic cellular properties. Our results suggest that this culture model is suitable to study the amino acids content and gliotransmitters, as well as glial enzymatic activity and neurotransmitter management. Next, we showed that the astrocyte cultures are not derived from neural progenitors and tissue mitochondrial parameters were reproduced in in vitro cultures. Responses to stimulus were variable, depending on the animals’ age. Accordingly, guanosine presented an anti-aging effect, indicating its glioprotective activity. Finally, we showed that cultures prepared from newborn rats submitted to an in vitro senescence model presented different responses when compared with mature animals, indicating that our culture model is the most suitable model to represent astrocytic properties in the mature brain. Therefore, this study demonstrates the relevance of this tool to understanding the biochemical, cellular and molecular properties of adult astrocytes, showing some differences related to the culture prepared from newborn animals. Thus, we amplify the comprehension about cellular functions of this tool, providing closer responses related to mature brain in vivo, especially regarding studies about aging and neurodegenerative diseases.

Astrócitos são células gliais com fundamental importância no sistema nervoso central (SNC), tanto em condições fisiológicas quanto patológicas. Estas células são essenciais na plasticidade neural, no metabolismo de neurotransmissores, na defesa antioxidante, na regulação do metabolismo energético, na homeostase iônica, na resposta inflamatória, na manutenção da barreira sangue-cérebro, na migração neuronal e na estabilização da comunicação entre as células. Assim, alterações em funções astrocitárias (como as que ocorrem no envelhecimento) estão relacionadas a importantes alterações na funcionalidade cerebral. Desta forma, esta tese teve por objetivo demonstrar que a cultura de astrócitos derivada de ratos Wistar adultos, desenvolvida e caracterizada pelo nosso grupo de pesquisa, pode ser um modelo de estudo fidedigno e versátil das propriedades celulares astrocitárias. Nossos resultados apontam que esta metodologia pode ser utilizada para elucidar o perfil de aminoácidos e gliotransmissores assim como da atividade enzimática glial e gerenciamento de neurotransmissores. Também demonstramos que a cultura adulta não é derivada de progenitores neurais e que parâmetros mitocondriais observados no cérebro adulto foram reproduzidos in vitro. A análise de respostas a estímulos demonstrou ser variável, dependendo da idade dos animais. Da mesma forma, o uso de culturas de diferentes idades revelou o efeito antienvelhecimento da guanosina, sugerindo sua atividade glioprotetora. Finalmente, demonstramos que culturas preparadas a partir de animais neonatos submetidas a um modelo de senescência in vitro apresentam respostas diferentes das apresentadas por culturas preparadas a partir de animais adultos e/ou envelhecidos, demonstrando que o modelo mais adequado para elucidar propriedades astrocitárias do cérebro maduro é o derivado de animais adultos. Portanto, demonstramos com este estudo a importância da disponibilidade de uma ferramenta como a cultura de astrócitos adultos e elucidamos características bioquímicas, celulares e moleculares desta ferramenta, evidenciando algumas de suas diferenças em comparação à cultura preparada a partir de ratos neonatos. Assim, ampliamos a compreensão das propriedades e funções celulares desta ferramenta, fornecendo respostas mais aproximadas às respostas fornecidas por astrócitos do cérebro maduro in vivo, especialmente no estudo do envelhecimento e das doenças neurodegenerativas. / Astrocytes are glial cells of pivotal importance in the central nervous system (CNS), both in physiological and pathological conditions. Some of their roles include neural plasticity, neurotransmitter metabolism, antioxidant defenses, control of energy metabolism, ionic homeostasis, inflammatory response, formation and maintenance of blood-brain barrier, neuronal migration and cellular communication. Thus, changes in astrocytic function (such as occurs in aging) are related to changes in brain function. The aim of this thesis was to demonstrate that astrocyte cultures from adult Wistar rats (developed and characterized by our research group) might be a reliable and versatile tool for studying astrocytic cellular properties. Our results suggest that this culture model is suitable to study the amino acids content and gliotransmitters, as well as glial enzymatic activity and neurotransmitter management. Next, we showed that the astrocyte cultures are not derived from neural progenitors and tissue mitochondrial parameters were reproduced in in vitro cultures. Responses to stimulus were variable, depending on the animals’ age. Accordingly, guanosine presented an anti-aging effect, indicating its glioprotective activity. Finally, we showed that cultures prepared from newborn rats submitted to an in vitro senescence model presented different responses when compared with mature animals, indicating that our culture model is the most suitable model to represent astrocytic properties in the mature brain. Therefore, this study demonstrates the relevance of this tool to understanding the biochemical, cellular and molecular properties of adult astrocytes, showing some differences related to the culture prepared from newborn animals. Thus, we amplify the comprehension about cellular functions of this tool, providing closer responses related to mature brain in vivo, especially regarding studies about aging and neurodegenerative diseases.