INTRODUÇÃO: Embora todos os indivíduos com anemia falciforme (AF) apresentem o mesmo defeito molecular nos genes da beta-globina, existe uma considerável variabilidade fenotípica entre eles. A síntese continuada da hemoglobina fetal (HbF) é o mais potente modificador da morbimortalidade da AF. A HbF diminui a polimerização da desoxi-HbS, reduzindo a intensidade da anemia hemolítica crônica e dos fenômenos vaso-oclusivos, consequentemente, as complicações sistêmicas da AF. Há uma grande variação na taxa de síntese de HbF (1% a 30%) em indivíduos com AF. Vários estudos demonstraram que o tratamento com hidroxiureia (HU) diminui a morbimortalidade desta hemoglobinopatia, principalmente, por estimular a síntese de HbF. Na dose máxima tolerada (DMT), a HU geralmente aumenta os níveis de HbF entre 10% e 40%. Contudo, há uma grande variabilidade de resposta, a DMT é muito variável, cerca de 25% dos portadores de AF não respondem e não há preditores de resposta definidos à HU. Estudos polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) demonstraram a influência de modificadores epigenéticos na regulação da expressão da HbF. Estes elementos são, principalmente, o oncogene BCL11A, a região intergênica HMIP e o polimorfismo Xmn1-HBG2. Estes 3 quantitative trait loci (QTLs) detêm 20% a 50% do controle da expressão dos genes HBG (genes envolvidos na síntese da HbF). OBJETIVOS: Avaliar o comportamento epidemiológico e a associação dos SNPs Xmn1- HBG2; BCL11A rs7482144, rs4671393 e rs11886868; HMIP-2 rs9399137 e rs9402686 com a expressão da HbF e com o comportamento dos parâmetros hematimétricos em portadores de AF tratados com HU. PACIENTES E MÉTODOS: Neste estudo pioneiro de coorte prospectivo foram incluídos sequencialmente indivíduos com AF, em uso regular de HU por pelo menos 6 meses, que não receberam transfusão sanguínea 3 meses antes de ingressar no estudo e que não faziam uso de drogas que estimulassem a síntese de HbF. Foram coletados 4 ml de sangue venoso periférico para extração do DNA genômico. A genotipagem dos polimorfismos foi realizada por meio da reação da cadeia de polimerase em tempo real. RESULTADOS: Foram avaliados 121 pacientes, entre 1 ano e 9 meses-54 anos (19 ± 14) anos idade, que estavam recebendo doses regulares de HU entre 8,6-42,8 (23 ± 7,6) mg/kg/dia, durante 6- 254 (102± 67) meses. Não encontramos correlação entre a contagem de leucócitos, de neutrófilos e de reticulócitos; hemoglobina total; volume corpuscular médio e a concentração de hemoglobina corpuscular média, com os valores basais da HbF. A HbF basal (r=0,40; P < 0,001), a hemoglobina total basal (r=0,26; P = 0,005) e o tempo de exposição (r = -0,30; P = 0,001) foram associadas significativamente com maiores taxas de HbF ao final do estudo. Não houve correlação dos polimorfismos com os parâmetros hematimétricos, com o tempo de exposição e com a DMT de HU. Os SNPs HMIP-2 rs9399137 e rs9402686 foram responsáveis por 5,7% e 8,4% do total de variação da HbF basal (P= 0,01 e P=0,002). Não houve correlação, porém, entre os demais polimorfismos com a variação dos níveis basais de HbF. Os SNPs BCL11A rs1427407, rs4671393 e rs11886868 foram responsáveis, respectivamente, por uma variação de 7,6%, 4,5% e 4,3% nos níveis de HbF final (P=0,017; P=0,025 e P=0,029). Ainda, houve uma associação do rs1427407 (B = 0,29; P = 0,035) e do rs4671393 (B = 0,28; P = 0,036) em relação aos valores do delta HbF (variação da HbF final menos a HbF inicial). CONCLUSÃO: Estes dados sugerem que os indivíduos com AF com SNP BCL11A rs1427407 respondem mais favoravelmente ao tratamento com HU, no incremento dos níveis de HbF. São necessários estudos com populações maiores para validarmos estes achados. / INTRODUCTION: Although all individuals with sickle cell anemia (SCA) have the same molecular defect in the beta-globin genes, considerable phenotypic variability exists between them. Continued synthesis of fetal hemoglobin (HbF) is the most powerful SCA morbimortality modifier. HbF decreases the polymerization of deoxy-Hb, reducing the intensity of chronic hemolytic anemia and vaso-occlusive phenomena, and consequently systemic complications of SCA. There is a large variation in the HbF synthesis rate (1 to 30%) in patients with SCA. Several studies show that treatment with hydroxyurea (HU) decreases the morbimortality of this hemoglobinopathy, mainly by stimulating HbF synthesis. At the maximum tolerated dose (MTD), HU generally increases HbF levels from 10 to 40%. However, there is great variability in response as the MTD is highly variable, about 25% of SCA patients do not respond and there are no response predictors set for HU. Single nucleotide polymorphism studies (SNPs) demonstrate the influence of epigenetic modifiers in the regulation of HbF expression. These elements are, mainly, the BCL11A oncogene, the HMIP intergenic region and the Xmn1-HBG2 polymorphism. These 3 quantitative trait loci (QTLs) hold 20 to 50% of HBG gene expression control (genes involved in HbF synthesis). OBJECTIVE: To study the epidemiological behaviors and the association of SNPs Xmn1- HBG2; BCL11A rs7482144, rs4671393 and rs11886868; HMIP-2 rs9399137 and rs9402686 with HbF expression and with the behavior of hematimetric parameters in SCA patients treated with HU. PATIENTS AND METHODS: In this pioneering prospective cohort study, we included SCA patients, in regular treatment with HU at least for 6 months, who had not received blood transfusions in the 3 months prior to entering in the study and who didn‘t use drugs that stimulate HbF synthesis. We collected 4 ml of venous blood to proceed with the genomic DNA extraction. The polymorphism genotyping was done by real-time polymerase chain reaction. RESULTS: We evaluated 121 individuals with SCA aged between 1 year 9 months and 54 years (19 ± 14) who were receiving HU doses between 8.6 and 42.8 (23 ± 7.6) mg/kg/day for 6 to 254 (102 ± 67) months. No correlation was found between total leukocyte, neutrophils and reticulocytes counts; total hemoglobin; mean corpuscular volume and the concentration of mean corpuscular hemoglobin with baseline values of HbF. Basal HbF (r = 0.40; P <0.001), total baseline hemoglobin (r = 0.26; P = 0.005) and exposure time to HU (r = -0.30; P = 0.001) were significantly associated with higher HbF rates at the end of the study. There was no correlation of polymorphisms with the hematological parameters, exposure time and the MTD of HU. The SNPs HMIP-2, rs9399137 and rs9402686 accounted for 5.7% and 8.4% of the total variation of baseline HbF (P = 0.01 and P = 0.002). There was no correlation, however, between the other polymorphisms and variation in baseline HbF levels. The SNPs BCL11, rs1427407, rs4671393 and rs11886868 were responsible, respectively, for a variation of 7.6%, 4.5% and 4.3% in the final HbF levels (P = 0.017, P = 0.025 and P = 0.029). Still, there was an association of rs1427407 (B = 0.29; P = 0.035) and rs4671393 (B = 0.28; P = 0.036) in relation to delta HbF values (final minus initial HbF variation). CONCLUSIONS: These data suggest that individuals with SCA who have SNP rs1427407 BCL11A respond more favorably to HU treatment, with increased HbF levels. Studies with larger populations are necessary to validate these findings.

A presente pesquisa teve a finalidade de estudar a hematologia de bezerros clonados da raça Nelore, originados por meio da técnica de transferência nuclear de células somáticas (TNCS) por meio da avaliação do quadro eritrocitário, da dinâmica dos tipos de hemoglobina e do metabolismo do ferro destes animais durante o primeiro mês de vida. O delineamento experimental envolveu a colheita de 260 amostras de sangue e soro sanguíneo de 20 bezerros distribuídas nos seguintes momentos: imediatamente após o nascimento, 12 horas após o nascimento, 1 dia de vida, 2 , 3 , 4, 5, 7, 10, 15, 20 e 30 dias de vida. Os animais foram divididos em quatro grupos experimentais: 12 bezerros obtidos por meio da técnica de TNCS pelos laboratórios A e 8, 4 por meio de fertilização in vitro (FIV) e 4 por monta natural (MN). A ocorrência de anemia de grau moderado a grave, do tipo normocítico e normocrômico, foi observada em 100 % (5/5) dos 5 bezerros clonados pelo Laboratório A, enquanto a incidência nos bezerros clonados pelo Laboratório B foi igual a 14,2 % (1/7), nos bezerros obtidos por fertilização in vitro foi igual 50,0 % (2/4) e em bezerros obtidos por monta natural foi igual a 50,0 % (2/4). A avaliação do eritrograma dos bezerros cio nados pelo Laboratório A evidenciou que a anemia instalou-se gradualmente a partir das 12 horas de vida atingindo ao final da primeira semana, a, sua intensidade máxima, sendo observada a recuperação gradativa dos valores eritrograma a partir do 15°dia de vida. Os valores médios obtidos para o eritrograma dos bezerros clonados do Laboratório A no 7º dia de vida foram os seguintes: Hemácias - 4,33X106/mm3-; Volume Globular - 23 %, Taxa de Hemoglobina - 7,25 g/dL; VCM - 52,89 µ3-; HCM - 16,65 pg; CHCM - 31,47%. A anemia observada nos bezerros clonados pelo Laboratório A era de origem ferropriva, pois se evidenciou nesses animais uma significativa diminuição dos teores séricos de ferro associada à diminuição do índice de saturação da transferrina (1ST), enquanto os valores da capacidade total de ligação do ferro (CTLF) não sofreram influência durante o período. Os valores médios obtidos para o metabolismo de ferro dos bezerros clonados pelo Laboratório A no 7º dia de vida foram os seguintes: teores séricos de ferro - 47,35 mg/dL; capacidade total de ligação de ferro - 455,90 mg/dL, índice de saturação da transferrina - 9,64%. Durante o estudo dos tipos de hemoglobinas, utilizando-se técnica de eletroforese foram identificados três fenótipos de hemoblogina adulta (Hb-A; Hb-B e Hb-AB) e a presença de hemoglobina fetal (Hb-F), não sendo observadas anomalias que pudessem sugerir a ocorrência de hemoglobinopatias hereditárias e/ ou congênitas. Verificou-se que as taxas de Hb-A, nos clones com fenótipo Hb-AB e Hb-A, permaneceram estáveis durante todo o período experimental, enquanto nos bezerros obtidos por fertilização in vitro ou monta natural com os mesmos fenótipos (Hb-A e Hb-AB) observou-se a partir de 120 horas de vida um gradativo aumento das taxas de Hb-A. Durante a avaliação da dinâmica da hemoglobina do tipo fetal (Hb-F) no primeiro mês de vida observou-se, que todos os grupos animais apresentaram comportamento similar, caracterizado por sua diminuição com o desenvolvimento etário. / The present work aimed to study the hematology of cloned Nelore calves produced using the technique of somatic cell nuclear transfer (SCNT), by evaluating erythrocyte parameters, hemoglobin dynamics, and iron metabolism in the animals during the first month after birth. The experimental design included the collection of 260 blood and blood serum samples from 20 calves in the following times: immediately after birth, 12 hours after birth, 1st of life, 2nd, 3rd, 4th, 5th, 7th, 20th and 30th day of life. The animals were classified in four experimental groups: 12 calves produced, using SCNT for two commercial laboratories (laboratory A=5 calves and laboratory B= 7 calves), four calves produced by in vitro fertilization (IVF) and four calves produced by natural mating (NM). Mild to severe normocytic and normochromic anemia was observed in 100% (5/5) cloned calves from laboratory A, and 14.2% (117) cloned calves from laboratory B. In both IVF and NM calves, anemia was observed in 50% (214) of the calves. Erytrogram evaluation of cloned calves from laboratory A showed that anemia developed gradually from 12 hours after birth, was most intense at the end of the first week, and then erytrogram normal values were recovered after the 15th day of life. Mean values for the laboratory A cloned calves erytrogram in the 7th day of life were the following: Red cells 4033X106/mm3, hematocrit 23%, hemoglobin 7.25g/dL, MCV 52.89µ3-; MCH 16.65, MCHC 31.47%. Anemia observed in cloned calves from laboratory A was caused by iron deficiency, since a significant decrease in iron se rum levels together with a decrease in transferrin saturation index (TSI) was confirmed. At the same time, Total iron-binding capacity (TIBC) was not changed in this period of time. Mean iron metabolism values for cloned calves from laboratory A were the following: serum iron amount: 47,35mg/dL, TIBC 455,90 mg/dL and TSI 9,64%. Hemoglobin identification by eletrophoresis identified three adult hemolglobin phenotypes (A-Hb; B-Hb e AB-Hb) and the fetal hemoglobin (F-HB), and there was no sign of hereditary hemoglobin disorders were observed. The rate of A-Hb in cloned calves with A-Hb and AB-Hb phenotypes was maintained during the experimental period. Nonetheless, for the IVF calves with the same phenotypes (A-Hb and AB-Hb) a constant increase in the A-Hb was noticed. For the evaluation of F-Hb dynamics in the first month of life, results showed similar pattern, characterized by its decrease with age.

A estabilidade térmica em função do pH para três formas da hemoglobina extracelular gigante do anelídeo Glossoscolex paulistus (HbGp), monitorada atraves de DSC, CD e absorção óptica, e estudada no presente trabalho. Estes estudos possibilitaram a determinação de parâmetros importantes do processo de desnaturação e dissociação da proteína oligomerica em pH ácido, neutro e alcalino. A HbGp se mostrou mais estável no pH ácido do que em pH neutro e alcalino. No meio alcalino a HbGp sofre dissociação oligomérica gerando subunidades tais como o dodecâmero, o trímero e o monômero. Além disso, as técnicas de DSC, dicroísmo circular (CD) e absorção óptica permitiram o monitoramento da desnaturação da estrutura protéica global, da estrutura secundária e do centro ativo da HbGp, em função da temperatura. Por DSC foi determinado que o mecanismo do processo de desnaturação térmica da HbGp é irreversível. As variações de entalpia calorimétrica, &Delta;Hcal, e de van Hoff, &Delta;HvH, nas formas oxi-, meta- e cianometa-HbGp são bem distintas, em todos os pHs estudados, indicando que o processo de desnaturação é bastante complexo, sugerindo que o pico de transição deve ser composto por varias transições. A ordem de estabilidade apresentada pela HbGp em termos dos valores de temperatura de transição (Tm) foi a seguinte: cianometa- > oxi- > meta- no intervalo de pH 5,0 a 8,0. Os valores de &Delta;Hcal no pH 7,0 para a oxi-HbGp, meta-HbGp e cianometa-HbGp foram de 25 &plusmn; 4, 20 &plusmn; 2 e 56 &plusmn; 4 MJ/mol, respectivamente. Os valores de energia de ativação (Ea) obtidos no pH 7,0 para a oxi- e cianometa-HbGp foram de 673 &plusmn; 99 e 780 &plusmn; 105 KJ/mol, e no pH 8,0 de 897 &plusmn; 106 e 850 &plusmn; 201 KJ/mol, respectivamente. Esses valores de energia de ativação são condizentes com os reportados na literatura para outras hemoglobinas. Nos estudos realizados por CD a oxi-HbGp forma hemicromo no pH 6,0 e 7,0, em temperaturas superiores a 40 &deg;C, e se dissocia em meio alcalino. A oxi-HbGp apresenta temperatura crítica (Tc) nas regiões das hélices-&alpha; e do grupo heme praticamente idêntica nos vários pHs estudados. A cianometa-HbGp possui maior quantidade de estrutura secundária do que a oxi-HbGp, e maiores valores de temperatura crítica (Tc), sendo bem mais estável que a oxi-HbGp, assim como o observado por DSC. Por absorção óptica o comportamento térmico da HbGp é similar ao do CD, sendo observado ainda, além da formação de hemicromo, a presença de espécies pentacoordenadas no pH neutro e alcalino. / The thermal stability as a function of the pH, for three forms of the extracellular giant hemoglobin of the annelid Glossoscolex paulistus (HbGp) was monitored by DSC, CD and optical absorption in the present work. These studies allowed the determination of important parameters characterizing the denaturation and dissociation at acid, neutral and alkaline pH values. HbGp was shown to be more stable in acid pH as compared to neutral and alkaline pH values. In alkaline medium, HbGp presents oligomeric dissociation generating smaller subunits such as the dodecamer, the trimer and the monomer. Besides that, the techniques of the DSC, circular dichroism (CD) and optical absorption spectroscopy allowed to monitor, respectively, the denaturation of the global protein structure, of the secondary structure and of the active center of the hemoglobin, as a function of the temperature. By DSC it was determined that the mechanism of the thermal denaturation of the HbGp is irreversible. The variations of calorimetric and van Hoff enthalpies, in the oxy- and cyanomet-HbGp forms, are quite different, for all studied pH values, indicating that the process of denaturation is complex, characterized by a transition peak composed by several contributions. The order of stability presented by the HbGp in terms of the transition temperature values (Tm) was the following: cyanomet-> oxy- for pH from 5.0 to 8.0. The values of &Delta;Hcal at pH 7.0 for the oxy-HbGp, met-HbGp and cianomet-HbGp were 25 &plusmn; 4, 20 &plusmn; 2 and 56 &plusmn; 4 MJ/mol, respectively. The activation energy values (Ea) obtained at pH 7.0 for the oxy- and cyanomet-HbGp were 673 &plusmn; 99 and 780 &plusmn; 105 KJ/mol, and at pH 8.0 they were 897 &plusmn; 106 and 850 &plusmn; 201 KJ/mol, respectively. Those energy values are consistent with data reported in the literature for other hemoglobins. In the studies carried out by CD for oxy-HbGp formation of hemichrome was observed at pH 6.0 and 7.0, at temperatures above 40 &deg;C. In alkaline medium the oligomeric dissociation is observed. Oxy-HbGp presents critical temperatures (Tc), which are practically identical in the spectral regions of the polypeptide and of the heme groups for all studied pH values. The cyanomet-HbGp own larger quantity of secondary structure than oxy-HbGp, and higher values of critical temperatures (Tc), being more stable than oxy-HbGp, in agreemente with DSC data. Optical absorption spectroscopy shows thermal behavior of HbGp similar to that observed by CD. Besides the formation of the hemichrome species upon heating, the presence of penta-coordinate species at neutral and alkaline pH values was observed.

A hemoglobina extracelular de Glossoscolex paulistus (HbGp) possui estrutura oligomérica composta por 144 cadeias globínicas e 36 cadeias linkers, que não possuem heme, formando uma bicamada hexagonal. Estudos mostraram que a HbGp possui uma alta estabilidade á variação de pH e presença de agentes desnaturantes, tais como, surfactantes e ureia, a 25&deg;C. Com esses conhecimentos prévios, o presente estudo tem por objetivo avaliar a estabilidade térmica da HbGp 0,5-3,0 mg/mL, nas formas oxi-, meta- e cianometa-, em diferentes valores de pH. O efeito do SDS na estabilidade térmica da oxi-HbGp 0,5 e 3,0 mg/mL, em função do pH, será investigado também. Esses estudos foram realizados usando as técnicas de absorção óptica, dicroísmo circular (CD), espalhamento de luz dinâmico (DLS) e espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS). Os resultados de absorção óptica e CD revelam que o processo de desnaturação da oxi- e cianometa-HbGp, no pH 7,0, envolve a formação das espécies oxidadas aquo-meta-HbGp e hemicromo. O processo de desnaturação é próximo ao modelo de dois estados, com uma temperatura crítica (Tc) de 58-59 &deg;C. No pH ácido, a proteína agrega a partir de 58 &deg;C. A cinética de agregação da oxi-HbGp, no pH 7,0, é dependente da concentração de proteína e da temperatura. Os dados de DLS mostram que a meta- e cianometa-HbGp 0,5 mg/mL, pH 7,0, desnaturam a 48 &plusmn; 1 e 56 &plusmn; 1 &deg;C, respectivamente. Em pH alcalino, a proteína dissocia parcialmente antes de desnaturar, e o aumento da concentração de proteína faz aumentar o valor de Tc para a cianometa-HbGp. Dados de SAXS mostram que a oxi- e meta-HbGp, pH 7,0, desnaturam a 60 &deg;C, apresentando valores de Rg=143&plusmn;1 &Aring; e Dmax=450&plusmn;1 &Aring;, enquanto que a cianometa-HbGp se mantém estável, com valores de Rg=107&plusmn;1 &Aring; e Dmax=300&plusmn;1 &Aring;. As análises das curvas p(r) mostram uma porcentagem crescente de dodecâmero e tetrâmero em solução, em relação à fração de protreína íntegra e de subunidades maiores, com o aumento do pH e da temperatura. As análises baseadas no programa OLIGOMER são similares às baseadas na função p(r). A presença do SDS induz a dissociação da oxi-HbGp 0,5 mg/mL pH 7,0. Entretanto, com 3,0 mg/mL de proteína a dissociação é parcial, com a sobreposição dos processos de dissociação, desnaturação e agregação, com o aumento da temperatura. No pH 5,0, o SDS promove a agregação da oxi-HbGp em temperaturas menores. As constantes cinéticas de dissociação da oxi-HbGp 0,5 mg/mL, pH 7,0 aumentam de (0,53&plusmn;0,07)x10-4 s-1 para (2,1&plusmn;0,2)x10-4 s-1 na presença de 0,4 e 0,6 mmol/L de SDS a 40 &deg;C, respectivamente. Na temperatura de 42 &deg;C a constante aumenta 2,6 vezes, com 0,6 mmol/L de SDS, comparada a 40 &deg;C. A oxi-HbGp 3,0 mg/ml na presença de 0,6 mmol/L de SDS, dissocia parcialmente em tempos menores com o aumento da temperatura antes de agregar. Portanto, esses estudos mostram que a estabilidade térmica da HbGp é sensível ao aumento de pH e presença de SDS. A ordem de estabilidade térmica em pH alcalino é dado por: cianometa->oxi->meta-HbGp. Alem disso, o processo de desnaturação é governado pelo valor do pH e dependente da concentração de proteína em solução. / The extracellular hemoglobin Glossoscolex paulistus of (HbGp) has an oligomeric structure composed by 144 globin chains and 36 non globin chains (named linkers), forming a hexagonal bilayer. HbGp presents a high stability reagarding pH variation and the presence of denaturing agents, such as, for example, urea and surfactant, at 25&deg;C. In this way, the present studies aim to evaluate the thermal stability for oxy-, meta- and cyanomet-HbGp 0.5-3.0 mg/ml, at different pH values. The SDS effect on the thermal stability of oxy-HbGp 0.5 and 3.0 mg / mL is also investigated. Optical absorption, circular dichroism (CD), dynamic light scattering (DLS) and small angle X-ray scattering (SAXS) techniques were emplayed for these studies. The results based on the optical absorption and CD spectroscopies show that the denaturation process for oxy- and cyanomet-HbGp, at pH 7.0, involves the formation of oxidized species, such as aquo-met-HbGp and hemichrome. This denaturation process is very close to a two-state model, with a critical temperature (Tc) of 58-59 &deg;C. However, in the acidic pH, the aggregation of protein occurs at 58 &deg;C. The aggregation process kinetics for oxy-HbGp, pH 7.0, is dependent on the protein concentration and temperature. DLS data show that meta- and cyanomet-HbGp, 0.5 mg/mL, pH 7.0, undergo denaturation at 48 &plusmn; 1 and 56 &plusmn; 1 &deg; C, respectively. At alkaline pH, two HbGp forms undergo partial dissociation before denaturation, and at higher protein concentration, an increase of Tc values for cyanomet-HbGp is observed. SAXS results show that the denaturation of oxy-and met-HbGp occur at 60 &deg;C, presenting Rg=143&plusmn;1 &Aring; and Dmax=450&plusmn;15 &Aring;, while cyanomet-HbGp remains stable with Rg =107&plusmn;1 &Aring; and Dmax= 300&plusmn;10&Aring;, at this temperature. The p(r) curves analysis show the increase of dodecamer and tetramer percentages in solution, with increase of pH and temperature. The results using the OLIGOMER program are similar to the p(r) data analysis. For oxy-HbGp 0.5 mg/mL pH 7.0, in the presence of SDS, oligomeric dissociation before denaturation is observed. However, with 3.0 mg/ml of protein the dissociation process is slower, showing an overlap of the dissociation, denaturation and aggregation processes in the system, with increase of temperature. At pH 5.0, SDS promotes the aggregation of oxy-HbGp at lower temperatures, as compared to the absence of surfactant. The kinetic dissociation constant values for oxy-HbGp 0.5 mg/mL increase from (0.53 &plusmn; 0.07) x10-4 s-1 to (2.1 &plusmn; 0.2) x10-4 s-1, in the presence of 0.4 and 0.6 mmol/L SDS at 40 &deg; C, respectively. At 42 &deg;C the dissociation constant value increases 2.6-fold, with 0.6 mmol/L SDS, as compared to 40 &deg;C. For oxy-HbGp 3.0 mg/ml, in the presence of 0.6 mmol/L SDS, the oligomeric dissociation is smallest occurring in shorter times with increasing temperature before aggregation. Therefore, these studies show that the thermal stability of HbGp is sensitive to the pH variation and the presence of SDS. At alkaline pH, the order of thermal stability is the following: cyanomet->oxy->met-HbGp. Furthermore, the denaturation process is governed by the pH value, being dependent on the protein concentration in solution.

Estudos com eletrodos modificados foram conduzidos utilizando dois sistemas porfirínicos supramoleculares diferentes. O primeiro foi baseado na modificação de eletrodo de carbono vítreo com uma porfirina de níquel tetrarrutenada, [NiIITPyP{RuII(bipy)2Cl}4]4+. A modificação do eletrodo foi realizada por meio de sucessivos ciclos voltamétricos em meio alcalino (pH 13), gerando um eletrodo com característica similar a eletrodos modificados com &#945;-Ni(OH)2. A caracterização química do filme formado foi realizada através das técnicas de voltametria cíclica, ressonância paramagnética eletrônica, espectroscopia eletrônica por reflectância e espectroscopia Raman com ensaio espectro-eletroquímico. Os resultados sugerem a formação de um polímero de coordenação, [&#181;-O2-NiIITPyP{RuII(bipy)2Cl}4]n, composto por subunidades porfirínicas ligadas entre si por pontes &#181;-peroxo axialmente coordenadas aos átomos de níquel (Ni-O-O-Ni). O crescimento do filme apresentou dependência da alcalinidade do meio pela formação do precursor octaédrico [Ni(OH)2TRPyP]2+ em solução, pela coordenação de OH- nas posições axiais do átomo de níquel. O processo de eletropolimerização indicou a participação de radical hidroxil, gerado por oxidação eletrocatalítica da água nos sítios periféricos da porfirina contendo o complexo de rutênio. O mesmo eletrodo foi aplicado como sensor eletroquímico para análise amperométrica de ácido fólico em comprimidos farmacêuticos. O sensor foi associado a um sistema de Batch Injection Analysis (BIA) alcançando considerável rapidez e baixo limite de detecção. Para as análises das amostras também foi proposto um método para a remoção da lactose, que agia como interferente. O segundo estudo envolveu a modificação de eletrodos de carbono vítreo com diferentes hemoglobinas, naturais (HbA0, HbA2 e HbS) e sintéticas (Hb-PEG5K2, &#945;&#945;-Hb-PEG5K2 e BT-PEG5K4), para a avaliação da eficiência na redução eletrocatalítica de nitrito mediada por FeI-heme. Os filmes foram produzidos pela mistura de soluções das hemoglobinas com brometo de didodecildimetiltrimetilamônio (DDAB), aplicados nas superfícies com consecutiva evaporação, formando filmes estáveis. Os valores de potencial redox para os processos do grupo heme e a sua associação com a disponibilidade do grupo na proteína foram avaliados por voltametria cíclica. Os valores das constantes de velocidade, k, para redução de nitrito foram obtidos por cronoamperometria em -1,1 V (vs Ag/AgCl(KCl 3M)) que foram utilizados para estudo comparativo entre as espécies sintéticas para eventual aplicação clínica. / Studies with modified electrodos were conducted using two different supramolecular porphyrin systems. The first one was based on the modification of glassy carbon electrode with a tetraruthenated nickel porphyrin, [NiIITPyP{RuII(bipy)2Cl}4]4+. The electrode modification was carried out through successive voltemmetric cycles in alkaline media (pH 13), generating an electrode with feature similar to &#945;-Ni(OH)2 modified electrodes. The chemical characterization of this film was performed by cyclic voltammetry, electronic paramagnetic resonance, reflectance electronic spectroscopy and Raman spectroscopy with spectroelectrochemistry assay. The results suggested the formation of a coordination polymer, [&#181;-O2-NiIITPyP{RuII(bipy)2Cl}4]n, composed by porphyrin subunits linked by &#181;-peroxo bridges axially coordinated to nickel atoms (Ni-O-O-Ni). The film growth showed dependence of the alkaline media by the formation of octahedral precursor [Ni(OH)2TRPyP]2+ in solution by way of axial coordination of OH- to the nickel atoms. The electropolymerization process showed to have a contribution from hydroxyl radicals, generated by electrocatalytic oxidation of water on the peripheral sites containing the ruthenium complexes. The same electrode was applied as an electrochemical sensor for amperometric analysis of folic acid in pharmaceutical tablets. The sensor was associated to a Bath Injection Analysis (BIA) system, achieving good sampling frequency and low detection limit. For the samples analysis, it was also proposed a method for lactose removal. The second study comprises the modification of glassy carbon electrodes with different hemoglobin species, of natural occurrence (HbA0, HbA2 e HbS) and synthetics (Hb-PEG5K2, &#945;&#945;-Hb-PEG5K2 e BT-PEG5K4) for evaluation of efficiency on electrocatalytic reduction of nitrite mediated by FeI-heme. The films were produced by mixing solutions of the hemoglobins with didecyldimethylammonium bromide (DDAB), applied on the surfaces with following solvent evaporation, forming stable films. The redox potential values for the heme group processes and the heme availability in the protein were evaluated by cyclic voltammetry. The reaction rate constants, k, for nitrite reduction were obtained by chronoamperometry at -1,1 V, which were used for comparative study between the synthetic species for further clinical applications.

Orientadores: Fabíola Traina, Erich Vinícius de Paula / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T00:53:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Colella_MarinaPereira_D.pdf: 9236093 bytes, checksum: efa509cf78d63c66379b975a9b095ac8 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A anemia falciforme (AF) é caracterizada pela presença de crises vaso-oclusivas e hemólise intravascular com consequente depleção de óxido nítrico, ativação endotelial e inflamação crônica. Praticamente todos os elementos da coagulação estão alterados na direção pró-coagulante na AF, de forma que uma incidência aumentada de eventos tromboembólicos tem sido descrita nesta doença. A hidroxiuréia é atualmente um dos pilares do tratamento destes pacientes, tendo como principal ação induzir um aumento da hemoglobina fetal. A hemoglobinopatia SC (HbSC) é a segunda hemoglobinopatia mais prevalente após a AF. Sabe-se que há uma incidência elevada de eventos tromboembólicos na HbSC, porém conhece-se muito pouco sobre a ativação da coagulação nesta doença. O presente estudo foi dividido em duas partes, tendo dois objetivos principais: (1) testar a hipótese de que a hidroxiuréia teria um efeito benéfico no estado de hipercoagulabilidade visto na AF; (2) avaliar o estado de hipercoagulabilildade presente na HbSC. Na primeira parte do estudo avaliamos a ação da hidroxiuréia nos principais componentes do balanço hemostático em pacientes com AF tratados (SS-HU) ou não (SS) com hidroxiureia; e estudamos o efeito da hidroxiureia na ativação final da coagulação em um modelo murino de AF incapaz de expressar a hemoglobina fetal. Nossos resultados mostraram que o tratamento com hidroxiuréia esteve associado com melhora dos marcadores de ativação da coagulação, incluindo redução na expressão gênica de fator tecidual (FT) (5.0[SS] vs. 2.6[SS-HU], p=0.02) e diminuição nos níveis plasmáticos de FT (p=0.01), complexo trombina-antitrombina III (TAT) (11.5[SS] vs. 7.5[SS-HU], p=0.03) e fragmento 1+2 da protrombina (301.5[SS] vs. 245[SS-HU], p=0.09). Os pacientes tratados com hidroxiuréia também apresentaram reduções significativas dos níveis de trombomodulina solúvel (3.6[SS] vs. 2.5[SS-HU], p=0.0007) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-_) (2.7[SS] vs. 0.3[SS-HU], p<0.0001). A redução dos marcadores de hipercoagulabilidade apresentou correlações significativas com o aumento da HbF e reduções dos marcadores de hemólise, ativação endotelial e inflamação. Em modelo murino de AF, a hidroxiuréia resultou em diminuição dos níveis plasmáticos de TAT (138.5[salina] vs. 106.7[HU], p=0.05). Esses resultados fornecem evidências de um efeito benéfico da hidroxiuréia em reduzir o estado de hipercoagulabilidade na AF. Na segunda parte do presente estudo, nós avaliamos os diversos componentes do balanço hemostático nos pacientes com HbSC e comparamos com os pacientes AF (SS e SS-HU). A comparação dos marcadores de hipercoagulabilidade entre pacientes HbSC e AF revelou que a expressão gênica do FT foi semelhante ao encontrado na AF (2.6[SC] vs. 3.1[SS+SS-HU], p=0.2), enquanto os níveis de TAT e D-dímero foram inferiores (TAT: 4.2[SC] vs. 7.4[SS+SS-HU], p<0.0001; D-dímero: 710.4[SC] vs. 1495[SS+SS-HU], p=0.0003). Em comparação com pacientes com AF, os pacientes com HbSC apresentaram níveis semelhantes de trombomodulina solúvel (3.2[SC] vs. 3.0[SS+SS-HU], p=0.6), TNF-_ (2.7[SC] vs. 2.2[SS+SSHU], p=0.5), e níveis inferiores de interleucina 8 (2.5[SC] vs. 3.2[SS+SS-HU], p=0.05). Dentre os pacientes com HbSC os marcadores de hipercoagulabilidade também apresentaram correlações significativas com marcadores de hemólise e inflamação. Em conclusão, nossos resultados fornecem evidências de um efeito benéfico da hidroxiuréia em reduzir o estado de hipercoagulabilidade na AF e demostram que existe uma ativação da coagulação na HbSC quando comparados a indivíduos normais, porém não tão intensa quanto a vista na AF / Abstract: Sickle cell anemia is characterized by the presence of vaso-occlusive crises and intravascular hemolysis with consequent depletion of nitric oxide, endothelial activation and chronic inflammation. Virtually all of the components of coagulation are altered in the procoagulant direction in sickle cell anemia, and thus an increased incidence of thromboembolic events has been described in this disease. Hydroxyurea is currently one of the mainstays of treatment of these patients, with the primary action of inducing an increase in fetal hemoglobin. Hemoglobin SC disease is the second most prevalent hemoglobinopathy after sickle cell anemia. There is a high incidence of thromboembolic events in hemoglobin SC disease, but very little is known about the activation of coagulation in this disease. This study was divided into two parts, with two main objectives: (1) test our hypothesis that hydroxyurea would have a beneficial effect on the hypercogulable state seen in sickle cell anemia; (2) evaluate the hypercoagulable state present in hemoglobin SC disease. In the first part of this study we evaluated the effect of hydroxyurea in the main components of the hemostatic balance of sickle cell anemia patients treated (SS-HU) or not (SS) with the drug; and we also evaluated the effect of hydroxyurea on thrombin generation in a sickle cell murine model, uncapable of expressing fetal hemoglobin. Our results showed that treatment with hydroxyurea was associated with reduced markers of coagulation activation, including a reduction in the expression of the tissue factor gene (5.0[SS] vs. 2.6[SS-HU], p=0.02) and in plasma levels of tissue factor (p=0.01), thrombin-antithrombin complex III (TAT) (11.5[SS] vs. 7.5[SS-HU], p=0.03), and prothrombin fragment 1+2 (301.5[SS] vs. 245[SS-HU], p=0.09). Patients treated with hydroxyurea also presented reductions in the levels of soluble thrombomodulin (3.6[SS] vs. 2.5[SS-HU], p=0.0007) and tumor necrosis fatoralpha (TNF-_) (2.7[SS] vs. 0.3[SS-HU], p<0.0001). Hypercoagulability markers presented significant correlations with the increase in fetal hemoglobin levels and reductions in hemolysis, endothelial activation and inflammation markers. In the murine model of sickle cell anemia hydroxyurea resulted in reduction of plasma levels of TAT (138.5[saline] vs. 106.7[HU], p=0.05). These results provide evidence that treatment with hydroxyurea has a beneficial effect of reducing the hypercoagulability state seen in sickle cell anemia. In the second part of this study, we studied the various components of the hemostatic balance in hemoglobin SC disease patients and compared them with sickle cell anemia patients (SS and SS-HU). The gene expression of tissue fator was similar to the expression seen in sickle cell anemia (2.6[SC] vs. 3.1[SS+SS-HU], p=0.2), while the levels of TAT and D-dimer were lower (TAT: 4.2[SC] vs. 7.4[SS+SS-HU], p<0.0001; D-dimer: 710.4[SC] vs. 1495[SS+SS-HU], p=0.0003). In comparison to patients with sickle cell anemia, patients with hemoglobin SC disease presented similar levels of soluble thrombomodulin (3.2[SC] vs. 3.0[SS+SS-HU], p=0.6), TNF-_ (2.7[SC] vs. 2.2[SS+SS-HU], p=0.5), and lower levels of interleukin 8 (2.5[SC] vs. 3.2[SS+SS-HU], p=0.05). In hemoglobin SC patients, the hypercoagulability markers presented significant correlations with hemolysis and inflammation markers. In conclusion, our results provide evidence that treatment with hydroxyurea has a beneficial effect of reducing the hypercoagulability state seen in sickle cell anemia, and that there is an activation of coagulation in hemoglobin SC disease when compared to normal individuals, but not as intense as seen in sickle cell anemia / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Clínica Médica

Background: The One Drop vertical bar Mobile app supports manual and passive (via HealthKit and One Drop's glucose meter) tracking of self-care and glycated hemoglobin A(1c) (HbA(1c)). Objective: We assessed the HbA(1c) change of a sample of people with type 1 diabetes (T1D) or type 2 diabetes (T2D) using the One Drop vertical bar Mobile app on iPhone and Apple Watch, and tested relationships between self-care tracking with the app and HbA(1c) change. Methods: In June 2017, we identified people with diabetes using the One Drop vertical bar Mobile app on iPhone and Apple Watch who entered two HbA(1c) measurements in the app 60 to 365 days apart. We assessed the relationship between using the app and HbA(1c) change. Results: Users had T1D (n=65) or T2D (n=191), were 22.7% (58/219) female, with diabetes for a mean 8.34 (SD 8.79) years, and tracked a mean 2176.35 (SD 3430.23) self-care activities between HbA(1c) entries. There was a significant 1.36% or 14.9 mmol/mol HbA(1c) reduction (F=62.60, P<.001) from the first (8.72%, 71.8 mmol/mol) to second HbA(1c) (7.36%, 56.9 mmol/mol) measurement. Tracking carbohydrates was independently associated with greater HbA(1c) improvement (all P<.01). Conclusions: Using One Drop vertical bar Mobile on iPhone and Apple Watch may favorably impact glycemic control.

Introduktion Diabetes Mellitus typ 1 är en autoimmun sjukdom som så småningom leder till total insulinbrist vilket är livshotande. Insulinbristsjukdomen är kronisk och är i Sverige en av de vanligaste folksjukdomarna. I världen insjuknar i dagsläget flest antal i Sverige och Finland. Vad gäller behandling vid Diabetes Mellitus typ 1 får alla patienter i dagsläget insulininjektioner antingen via insulinpenna eller via insulinpump. Glukosnivån i blodet bör mätas kontinuerligt för att kunna optimera behandlingsterapin. En annan typ av behandlingsterapi vid Diabetes Mellitus typ 1 är SAP (Sensor- augmented pump). Denna metod innebär att insulinpumpsbehandling kombineras med kontinuerlig glukosmätning (continuous glucose monitoring, CGM).Att mäta glykerat hemoglobin (HbA1c) har blivit en viktig del för att följa samt utvärdera hur behandlingen av Diabetes Mellitus fungerar. Ett lågt HbA1c ger en minskad risk för komplikationer och är ett tydligt mål i behandlingen samtidigt som risken för hypoglykemi måste tas i anspråk. Syfte Syftet med denna litteraturstudie är att undersöka om HbA1c-värden kan förbättras hos patienter med Diabetes Mellitus typ 1 vid användning av SAP-behandlingsterapi jämfört med CSII-behandlingsterapi (continuous subcutaneous insulin infusion) kombinerat med SMBG (self monitoring of blood glucose) och MDI-behandlingsterapi (multiple daily injections) kombinerat med SMBG. Syftet är även att undersöka om det finns något samband mellan användningsfrekvens av CGM-sensorer och förbättrat HbA1c-värde. Metod Denna litteraturstudie baseras på åtta stycken artiklar som hittades via databasen PubMed. Resultat och diskussion Resultatet, av de utvalda originalstudierna, visar att SAP-behandlingsterapi har en bättre effekt på optimering av HbA1c-värden, hos patienter med Diabetes Mellitus typ 1, om det jämförs med MDI-behandlingsterapi kombinerat med SMBG. Om förbättringen beror på SAP-terapibehandlingen eller om CSII och CGM separat hade gett effekten är svårt att avgöra. Däremot ses ingen signifikant skillnad, i resultatet i de originalstudier som valts ut, av denna effekt vid jämförelse av SAP-behandlingsterapi mot CSII kombinerat med SMBG. Ytterligare studier med ett större antal deltagare behövs som underlag för att kunna avläsa detta. Vad gäller relationen mellan frekvens av CGM-sensoranvändning och förändring i HbA1c-värden finns både studier som stödjer och studier som förkastar. Vid ett eventuellt byte av behandlingsterapi bör hänsyn tas till andra aspekter än surrogatmåttet HbA1c. Slutsats Resultatet av denna litteraturstudie visar att SAP-behandlingsterapi i vissa fall kan reducera HbA1c-värden i jämförelse med andra metoder. En del resultat stödjer även sambandet mellan ökad användningsfrekvens av CGM-sensorer och reducering av HbA1c-värden. Det måste tas hänsyn till andra parametrar vid eventuellt byte av behandlingsterapi. Det är av stor vikt att patienterna känner sig tillfreds med sin behandlingsterapi då det kan bibehålla motivationen till att optimera sina HbA1c-värden.

Les hémorphines représentent une classe de peptides cryptiques bioactifs issus de la protéolyse de la chaîne ß de l’hémoglobine dont la présence in vivo a souvent été associée à des conditions physiologiques ou pathologiques particulières, comme les cancers. De ce fait, l’hypothèse d’utiliser ces peptides comme marqueur de pathologies avaient déjà été posé. Des études récentes au laboratoire ont montré que leur concentration sérique des hémorphines était diminuée chez les patients diabétiques. Nous avons travaillé sur une cohorte de 120 patients atteints de diabète de type 1 et 2 et nous avons étudié les différentes hypothèses permettant d’expliquer cette diminution : métabolisme des hémorphines, impact de la glycation de l’hémoglobine sur la libération des peptides. De plus, nous avons cherché à connaître le rôle de LVVH7 dans la signalisation insulinique. Les résultats obtenus suggèrent que la diminution de la concentration sérique des hémorphines de type 7 est spécifique du diabète mais que la glycation de l’hémoglobine n’a pas d’impact sur la libération des hémorphines. Parallèlement à cette étude, nous avons caractérisé les hémorphines de type 7 dans le microenvironnement du cancer broncho-pulmonaire. La cathepsine D, enzyme impliquée dans la libération de LVVH7 et VVH7 ainsi que dans le microenvironnement tumoral, a été étudié dans des cultures de lignées de cancers broncho-pulmonaires acidifiée et donc propice à la progression tumorale. Les résultats ont permis de confirmer la présence de la cathepsine D dans le surnageant de cultures des cellules cancéreuses. De plus, nous avons montré la libération d’hémorphines de type 7 dans des milieux de culture acidifiés. / Hemorphins are cryptic bioactive peptides derived from ß chain of haemoglobin proteolysis. Their biological presence has often been associated with physiological or pathological conditions, like cancers. Thus, it was already suggested that hemorphins could be used as marker of pathology. Previous studies achieved in our laboratory demonstrated that hemorphin-7 was decreased in serum of diabetic patients. We worked on a population of 120 patients with type 1 and type 2 diabetes and we studied different hypothesis: hemorphins metabolism, impact of glycated haemoglobin. Moreover, we researched the role of LVVH7 in insulin signalisation. The results suggested that hemorphin-7 concentrations in serum of diabetic patients are specific of this pathology but glycation of haemoglobin have no impact on liberation of hemorphins. In parallel, we characterized hemorphin-7 in tumor progression of lung cancers. Cathepsin D, previously demonstrated as a key enzyme in hemorphins generation and also in tumor progression, has been studied in vitro in lung cancers, cultured in acidified conditions, favourable to metastasis. In addition, we also identified hemorphin-7 liberation in acidified media culture.

Background: Iron deficiency, anemia, and iron excess have been associated with altered hearing functions in children and adults. Animal studies suggest that iron deficiency during pregnancy negatively affect fetal auditory development. The relationship between maternal iron status and auditory functions in healthy term newborns has not been clearly elucidated among humans. The goal of this pilot study was to determine the relationship between markers of iron status during pregnancy and brainstem auditory function in healthy neonates. Methods: Pregnant women who gave birth at the Montfort Hospital were recruited to take part in this study (n=6). Within two weeks after birth, their newborn’s hearing function was assessed by wave amplitude, latency and inter-latency from the Auditory Brainstem Response (ABR) test. Markers of iron status, namely hemoglobin (Hb) and mean corpuscular volume (MCV), were collected retrospectively for the first and second trimester from the women’s medical chart. Results: Overall, no significant relationship was observed between maternal Hb and MCV concentrations and newborns auditory function. Although two significant Spearman correlations were observed (MCV and inter-latency I-V; r=0.87; p=0.005 and Hb and amplitude V; r=0.89; p=0.04), these findings may be due to chance because of multiple testing and the small sample size. Conclusion: Although iron is a key nutrient involved in the brain and auditory system development, we were not able to demonstrate a relationship between iron status during pregnancy and newborn hearing function. Prospective or intervention studies with a larger sample size and with more specific iron markers (ex. ferritin) are required to confirm these findings.