Um dos principais fatores de risco de doenças cardiovasculares, a hipercolesterolemia afeta um quinto da população brasileira, e é atualmente a principal causa de morte no Brasil e segunda maior de internações hospitalares, segundo a Sociedade Brasileira de Cardiologia. São utilizados agentes hipolipemiantes nos pacientes com propensão a doenças cardiovasculares associadas. A sinvastatina pertencente a classe dos inibidores da HMG-CoA redutase (3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A) e o ezetimiba pertencente a classe dos inibidores da absorção do colesterol são fármacos hipolipemiantes. Este trabalho possui como objetivo o desenvolvimento e a validação de métodos bioanalíticos através da cromatografia liquida de alta eficiência acoplada ao detector de espectrometria de massas para a determinação simultânea quantitativa de ezetimiba e sinvastatina e seus metabólitos em plasma humano. O presente trabalho foi dividido nas seguintes etapas: (i) obtenção das amostras de pacientes provenientes do HU onde foi administrado a associação ezetimiba+sinvastatina, (ii) obtenção dos padrões de ezetimiba, sinvastatina e padrão interno, (iii) caracterização dos fármacos utilizando técnicas de análises térmicas, ressonância magnética nuclear e espectrometria de infra-vermelho, (iv) obtenção dos padrões dos metabólitos de ezetimiba (ezetimiba glucoronideo) e sinvastatina (sinvastatina hydroxy acid ammonium salt), (v) seleção do método analítico, fase móvel e tipo de extração nas amostras de plasma compatível com o detector de espectrometria de massas e (vi) teste no cromatógrafo líquido de alta eficiência acoplado ao detector de espectrômetro de massas. A separação cromatográfica foi realizada utilizando coluna Poroshell 50mm x 2,1mm, com partícula de 1,8 µm, eluição isocrática usando ácido fórmico 0,1%: acetonitrila (50:50, v/v), vazão 0,7 mL/min e volume de injeção de 10 µL. A temperatura da coluna foi de 30ºC e a detecção foi realizada em equipamento do tipo QTOF, usando fonte ESI no modo positivo para o ezetimiba e sinvastatina e modo negativo para o ezetimiba glucoronideo e sinvastatttina hidroxi-ácida. A monitoração dos íons produto foram: ezetimiba (m/z 409,1489>392,3123), sinvastatina (m/z 418,2719>419,2892), ezetimiba glucoronídeo (m/z 585,1810>521,0673) e sinvastatina hidroxi-ácida (m/z 453,3090>239,0501). Os métodos analíticos foram validados de acordo com os requerimentos vigentes da ANVISA e Farmacopéia Americana. Portanto, os métodos propostos demonstraram ser lineares, precisos, exatos e adequados para a quantificação simultânea de ezetimbe e sinvastatina e seus metabólitos (ezetimiba glucoronídeo e sinvastatina hidroxi-ácida) em plasma humano / One of the main risk factor, hypercholesterolemia which affects a fifth of the Brazilian people, particularly in people with more than 45 years old and currently is the main cause of death in Brazil and the second one of hospital admissions, according to the Brazilian Cardiology Society. It must be used lipid-lowering agents in patients with trend to cardiovascular disease associated. Simvastatin belongs to the HMG-CoA Reductase Inhibitors class ((3-hydroxy-3-metilglutaril-coenzyme A) and ezetimiba belongs to cholesterol absorption inhibitors and they are hypolipidemic. The aim of this work is to develop and validate Bioanalytical methodology using high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (QTOF) to determinate simultaneously quantity of ezetimiba and simvastatin and their metabolites in human plasma. This study was divided into the following steps: (i) obtaining samples of patients from HU where ezetimibe+sinvastatina were administered, (ii) obtaining of ezetimibe, simvastatin and 4-methoxycoumarin (used as internal standard) standards, (iii) charactherization of drugs using techniques of termal analysis, nuclear magnetic ressonance and infra-red spectroscopy, (iv) obtaining of ezetimibe metabolite standard (glucuronide ezetimibe) and simvastatin metabolite standard (simvastatin hydroxy acid ammonium salt), (v) selection of analytical method, mobile phase and type of drugs extraction in human plasma samples to be used mass spectrometry, (vi) tests in the high efficiency liquid chromatography coupled to charged aerosol detector and mass spectrometry detector. Chromatographic separation was carried out using a Poroshell C18 column 50 mm x 2,1 mm with particle size of 1,8 µm, isocratic elution using 0,1% formic acid: acetonitrile (50:50, v/v), flow rate 0,7 mL/ min and injection volume of 10 µL. The column temperature was set at 30ºC and detection was performed in one equipament like QTOF, using ESI source, positive mode. Monitoring of the product ions were: ezetimibe (m/z 410,1557), simvastatina (m/z 419,2784), ezetimibe glucoronídeo (m/z 611,5756) and simvastatina hidroxi-ácida (m/z 552,2250). Analytical methods were validated according to the current ANVISA and United States Pharmacopoeia guidelines. Therefore, the proposed methods showed evidence to be linear, accurate and precision, suitable to the simultaneous quantitation of ezetimibe and simvastatin and their metabolites (ezetimibe glucoronídeo e sinvastatina hidroxi-ácida) in human plasma

INTRODUÇÃO: A hipercolesterolemia provoca alterações inflamatórias no sistema cardiovascular, induzindo disfunção endotelial e mudanças estruturais na microcirculação, com alterações significativas da homeostase vascular, processo este reversível com o tratamento hipolipemiante. Clinicamente, tais fenômenos podem ser demonstrados pela avaliação da reserva de fluxo coronário e da reatividade vascular periférica. A ecocardiografia de perfusão miocárdica em tempo real (EPMTR) possui características que a tornam ideal para a avaliação da microcirculação coronária, como a utilização de contrastes intravasculares, além de ótimas resoluções temporal e espacial. MÉTODOS: 16 pacientes com hipercolesterolemia e sem lesões coronárias obstrutivas (grupo HF) e 10 indivíduos saudáveis, sem doença arterial coronária obstrutiva estabelecida (grupo controle) foram avaliados por EPMTR e por ultrassonografia da artéria braquial em dois momentos: pré-tratamento com atorvastatina no grupo HF (período livre de medicação >6 semanas) e 12 semanas após o primeiro exame. A análise do fluxo miocárdico foi realizada nos 17 segmentos do ventrículo esquerdo obtendo-se índices de volume de sangue relativo no miocárdio (AN), da velocidade do fluxo () e do fluxo miocárdico absoluto (ANx) na condição de repouso e durante a vasodilatação com adenosina. A reserva de fluxo foi definida como a razão entre o fluxo durante vasodilatação e o fluxo do repouso. Para estudo da reatividade vascular periférica, todos os indivíduos foram submetidos à ultrassonografia da artéria braquial, com avaliação dos diâmetros da artéria braquial antes e depois de um período de isquemia de 5 minutos. RESULTADOS: Os dois grupos foram comparáveis quanto à idade, sexo, peso, superfície corpórea, índice de massa corpórea, índice de massa do VE, frequência cardíaca e pressões arteriais sistólica e diastólica, tanto no repouso quanto durante a infusão de adenosina. Os valores evolutivos de LDL-C (mg.dL-1) nos dois momentos foram 106±36 e 107±35; p=NS para o grupo controle vs 278±48 e 172±71; p<0,001 para o grupo HF. Na avaliação inicial, a dilatação braquial estava reduzida nos pacientes do grupo HF 0,08±0,04 vs 0,15±0,02; p<0,001 relativamente ao grupo controle, com aumento do diâmetro arterial basal (mm): 3,42±0,63 vs 3,07±0,53; p<0,001. O grupo HF, quando comparado ao grupo controle na avaliação inicial, apresentava valores mais altos de AN: (dB) 0,56±0,08 vs 0,49±0,05; p=0,02, de (s-1) 0,56±0,14 vs 0,45±0,04; p=0,02 e ANx: (dB.dB-1 s-1) 0,28±0,06 vs 0,20±0,02; p<0,001, maiores valores de AN: durante infusão de adenosina 0,64±0,08 vs 0,57±0,06; p=0,001 e menores reservas de : 2,59±0,61 vs 3,25±0,45; p=0,001 e de ANx: 2,78±0,71 vs 3,43±0,66; p=0,03. Após o uso de atorvastatina, as alterações foram revertidas, tanto na circulação periférica quanto na coronária. CONCLUSÕES: A EPMTR monstrou que em indivíduos com hipercolesterolemia e sem doença coronária obstrutiva existe aumento do fluxo microvascular em repouso e redução da reserva de fluxo miocárdico. Após o tratamento com atorvastatina houve normalização do fluxo em repouso. Adicionalmente, alterações similares ocorreram na circulação periférica dos indivíduos hipercolesterolêmicos, revertidas por utilização da atorvastatina. / BACKGROUND: Hypercholesterolemia induces inflammatory changes on the cardiovascular system, causing endothelial dysfunction and structural alterations of microcirculation, with substantial imbalance of vascular homeostasis. Reduction of blood cholesterol levels can stop these processes. These circulation alterations can be demonstrated by coronary flow reserve and peripheral vascular reactivity evaluation. Real time myocardial perfusion echocardiography (EPMTR) is an excellent method to demonstrate coronary microcirculation alterations, as ultrasound contrast agent has rheological properties close to red cells. Additionally, EPMTR has optimal spatial and temporal resolutions. METHODS: 16 patients with hypercholesterolemia (group-HF) without overt obstructive coronary disease and 10 healthy volunteers (group-C) were evaluated by EPMTR and vascular ultrasound in 2 moments: before atorvastatin treatment (group-HF, >6 weeks free of statin) and 12 weeks after beginning medication (group-HF), or 12 weeks after the first evaluation (group-C). For myocardial blood flow evaluation, the left ventricle was divided into 17 segments, and indexes of myocardial blood volume (AN), blood flow velocity (), and myocardial blood flow (ANx) were obtained for each myocardial segment at rest condition and after adenosine infusion. Myocardial flow reserve was calculated as the hyperemic to rest values of AN, e ANx. Peripheral vascular reactivity was evaluated by vascular ultrasound. Measures of braquial artery diameter were obtained before and after 5 minutes of arterial flow occlusion. RESULTS: Both groups were comparable for age, sex, body weight, body surface area, body mass index, left ventricular mass index, heart rate, and systolic and diastolic arterial blood pressure. These variables were also comparable, under basal or adenosine stress conditions. LDL-C values (mg.dL-1) in different moments (intra-group) were 106±36 and 107±35; p=NS for group-C vs 278±48 and 172±71; p<0,001 for group-HF. Group-HF as compared to group-C had higher initial resting values of AN (dB): 0,56±0,08 vs 0,49±0,05; p=0,02, (s-1): 0,56±0,14 vs 0,45±0,04; p=0,02, and ANx (dBdB-1s-1): 0,28±0,06 vs 0,20±0,02; p<0,001, and higher hyperemic value of AN 0,64±0,08 vs 0,57±0,06; p=0,04, and lesser reserves of 2,59±0,61 vs 3,25±0,45; p=0,01 and of ANx: 2,78±0,71 vs 3,43±0,66; p=0,03. After atorvastatin treatment no difference was observed at rest, hyperemic and reserve values of AN, and ANx between the groups. CONCLUSION: In patients with hypercholesterolemia and without coronary obstruction, there was augmented myocardial blood flow and reduced coronary flow reserve at rest, compared to healthy volunteers. After atorvastatin treatment at rest myocardial blood flow was normalized in those patients. Additionally, similar alterations in peripheral circulation could be demonstrated in hypercholesterolemia, and were reverted with atorvastatin.

Made available in DSpace on 2016-07-01T11:59:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 2.pdf: 2625869 bytes, checksum: 8cb28dd9acaae218862e11d5bbeec859 (MD5) Previous issue date: 2012 / Made available in DSpace on 2016-07-21T14:39:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 2.pdf: 2625869 bytes, checksum: 8cb28dd9acaae218862e11d5bbeec859 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Fármacos/Farmanguinhos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / As estatinas são substâncias que reduzem os níveis lipídicos no sangue, sendo a hipercolesterolemia o fator causal da aterosclerose, doenças coronarianas dentre outras. Devido ao alto índice do distúrbio na população brasileira, as estatinas são usadas como tratamento de primeira escolha, por serem mais seguras e eficazes. Sendo que duas estatinas (a atorvastatina e a sinvastatina) fazem parte da RENAME e sinvastatina incluída no programa Aqui tem farmácia popular . Devido à ampla utilização da sinvastatina, faz-se necessária a avaliação da qualidade dos medicamentos, sendo relevante o conhecimento de sua estabilidade química e física até o fim de seu prazo de validade. O monitoramento de produtos de degradação faz parte desta avaliação e é necessária a implementação de metodologias analíticas validadas de pesquisa destas impurezas na rotina dos estudos de estabilidade. Além disso, é essencial o desenvolvimento contínuo de formulações melhoradas para garantir a disponibilidade, eficácia e segurança do fármaco. A maioria das técnicas descritas na literatura são usadas para quantificar o teor de sinvastatina e seus metabólitos no sangue. Os compêndios oficiais disponibilizam apenas metodologia para a quantificação de produtos de degradação na matéria-prima. O objetivo deste trabalho foi avaliar a formação de produtos de degradação na formulação de comprimidos durante o prazo de validade. Para isto, foram propostas a adaptação e a validação da metodologia da Farmacopéia Americana da matéria-prima. O método proposto empregou coluna cromatográfica C18 e fase móvel constituída de de solução de ácido fosfórico e acetonitrila misturados por gradiente de eluição com tempo total de corrida de 13 minutos. O fluxo empregado foi de 3 mL/min. e detecção UV/VIS a 238 nm. A metodologia apresentou resultados satisfatórios de especificidade, linearidade, precisão, exatidão e robustez. O estudo de estabilidade foi conduzido numa condição controlada de temperatura e umidade (30ºC, 75% U.R.) ao longo do prazo de validade e demonstrou que não há formação ou aumento dos níveis dos produtos de degradação na formulação de comprimidos. / Statins are substances that reduce blood lipid levels, being hypercholesterolemia the causative factor of atherosclerosis, coronary heart disease among others. Due to the high rate of the disorder in the population, statins are used as first-line treatment because of are their safety and effectiveness. Two statins (atorvastatin and simvastatin) are part of RENAME and simvastatin is included in the program "Here's pharmacy popular".Due to the wide use of simvastatin, it is necessary to evaluate the quality of drugs being relevant knowledge of their chemical and physical stability until the end of its shelf life. The monitoring of degradation products and is part of this assessment an it is necessary to implement validated analytical methodologies in the routine of stability studies. Furthermore, it is essential to continuing development of improved formulations for the availability, effectiveness and safety of the drug.Most techniques described in literature are used to quantify the amount of simvastatin and its metabolites in blood. The official compendia only provide methodology for quantification of degradation products in raw material.The aim of this study was to evaluate the formation of degradation products in tablet formulation during the shelf life. For this, was proposed adaptation and validation of the methodology of the American Pharmacopoeia of the raw material. The proposed method employed C18 chromatographic column and a mobile phase consisting of a phosphoric acid solution and acetonitrile mixed by gradient elution with a total run time of 13 minutes. The flow was 3 ml / min. and detection UV / VIS at 238 nm. The methodology presented satisfactory specificity, linearity, precision, accuracy and robustness. The stability study was conducted in a controlled condition of temperature and humidity (30 ° C, 75% RH) during the shelf life and showed no training or increased levels of degradation products in tablet formulation.

A influencia dos polimorfismos genéticos de HMGCoA redutase (HMGCR) e LDL receptor (LDLR) na resposta a atorvastatina (10 mg/dia/4semanas) foi avaliada em individuos hipercolesterolemicos (HC). Amostras de sangue foram coletadas de 153 HC e 182 normolipidemicos (NL) para determinações de lipideos séricos e extração de DNA. Polimorfismos de troca única (SNP) HMGCR (A11898T e T24558G) e LDLR (C16730T, C20001T, G26857A) foram detectados. por PCR-RFLP. Os alelos HMGCR 11898T e 24558G foram associados com menores triglicérides e VLDL-C séricos nos grupos NL e HC (p<0,05). Além disso, o SNP HM0CR T24558G foi relacionado com HDL-C e apoAI séricos aumentados em resposta a atorvastatina no grupo HC. O alelo LDLR 20001 C foi associado com maior apoAI sérica basal no grupo NL (p=O,034) e com melhor resposta de apoAI a atorvastatina no grupo HC (p=O,045). Foi observada relação entre o haplótipo heterozigoto LDLR 20001 C/16730T e redução significativa de apoB e aumento de apoAI no soro após o tratamento com atorvastatina (p<O,05). Em conclusão, os SNPs HMGCR A 11898T e T24558G influenciam os triglicérides e VLDL-C séricos independentemente do estado lipêmico e o haplótipo LDLR 20001 C/16730T está associado com melhor resposta de apoB e ApoAI séricos em resposta a atorvastatina. / Influence of the HMGCoA reductase (HMGCR) and LDL receptor (LDLR) gene polymorphisms on response to atorvastatin (10 mg/day/4weeks) was evaluated in hypercholesterolemic (HC) individuais. Blood samples were collected from 153 HC and 182 normolipidemic (NL) individuais for serum lipids determinations and DNA extratcion. Single nucleotide polymorphisms (SNP) HMGCR (A11898T e T24558G) and LDLR (C16730T, C20001T, G26857A) were detected by PCR-RFLP. HMGCR 11898T and 24558G alleles were associated with lower serum triglycerides and VLDL-C in NL and HC groups (p<0.05). Moreover, the SNP HMGCR T24558G was related to increased serum HDL-C and apoAI in response to atorvastatin in the HC group. The LDLR 20001 C allele was associated with higher basal serum apoAI in the NL group (p=0.034) and with better response of apoAI to atorvastatin in HC group (p=0.045). There was a relationship between heterozygote LDLR 20001 C/16730T haplotype and a significant reduction of apoB and increase in apoAI serum leveis after atorvastatin treatment (p<0.05). In conclusion, the HMGCR A11898T e T24558G SNPs influence serum triglycerides and VLDL-C independently of the lipemic status and LDLR 20001 C/16730T haplotype is associated with better serum apoB and Apol response to atorvastatin treatment.

Introdução: Rosiglitazone (RGL) é um ligante dos receptores PPAR e vem sendo usada no tratamento do Diabetes Mellitus tipo 2 e nas doenças inflamatórias. Mas, RGL pode reduzir a filtração glomerular (FG), a carga excretada de sódio na urina (UVNa) e aumentar a expressão da Na+,K+- ATPase na medula renal. Então, RGL pode causar edema e insuficiência cardíaca congestiva. Entretanto, não tem sido reportado se RGL pode induzir insuficiência renal aguda (IRA). Objetivo: Verificar se a redução da FG causada pelo tratamento com RGL predispõe à IRA em ratos. Avaliar em condições basais e de vasoconstrição renal e se há diferenças entre ratos normocolesterolêmicos (NC) e hipercolesterolêmicos (HC). Métodos: A FG foi medida pelo clearance de inulina no 8º dia em ratos (~200g) NC e HC tratados ou não com RGL (48 mg/kg/dieta) na situação basal e durante a infusão endovenosa de Ang II (40 ng/kg/min). Além disso, a atividade da Na+,K+-ATPase foi avaliada em homogenato renal em outra série de animais. Resultados: Na situação basal, NC e HC apresentaram FG semelhante e o tratamento com RGL reduziu a FG apenas em NC de 0,78±0,03 para 0,50±0,05* ml/min/100g, *p<0,001. Apesar da redução da FG, a UVNa em NC+RGL não se modificou. Durante a infusão de Ang II, a FG de NC, HC e HC+RGL reduziu-se para o mesmo patamar de NC+RGL e um significante aumento da UVNa foi observada apenas em NC+RGL (NC= 3,32±0,88; NC+RGL=5,86±1,04*; HC= 2,63±0,43 e HC+RGL= 2,23±0,39 uEq/min, *p<0,01). Além disso, RGL induziu aumento na atividade da Na+,K+-ATPase em HC+RGL e não modificou em NC+RGL. Os valores expressos em M Pi/mg proteína.h-1 foram de 45±7 em NC, 43±5 em NC+RGL, 48±7 em HC e 64±4* em HC+RGL, *p<0,05. Analisando todos os resultados em conjunto, a redução da FG associada com a alta natriurese e ausência da modulação da atividade da Na+,K+-ATPase em NC+RGL sugerem lesão renal neste grupo. Conclusão: Os mecanismos de ação da RGL diferem de acordo com a condição metabólica. Então, RGL deve ser prescrita com cautela na ausência de hipercolesterolemia e requer a monitoração da função renal principalmente nas situações de vasoconstrição / Introduction: Rosiglitazone (RGL) is a ligand for PPAR used to treat type 2 Diabetes Mellitus and inflammatory diseases. However, RGL can reduce the glomerular filtration rate (GFR), urinary sodium excretion (UVNa) and increase the expression of Na+, K+-ATPase in renal medulla. Thus, RGL may induce edema and congestive heart failure. However, acute renal failure (ARF) provoked by RGL treatment has not been reported. Aim: To test whether reduced GFR by RGL may predispose to ARF at baseline and during a renal vasoconstriction state, and if the findings differ between normocholesterolemic (NC) and hypercholesterolemic (HC) rats. Methods: GFR was measured by inulin clearance on the 8th day in NC and HC rats (~200g) treated or not with RGL (48 mg/kg diet) at baseline and during intravenous infusion of Ang II (40 ng/kg/min). Furthermore, the Na+,K+- ATPase activity was determined in renal homogenates in other series of animals. Results: At baseline, NC and HC had similar GFR and the treatment with RGL reduced GFR only in NC from 0.78±0.03 to 0.50±0.05* ml/min/100g, *p<0.001. Although GFR was reduced, UVNa was unchanged in NC+RGL. During Ang II infusion, GFR was significantly reduced in NC, HC and HC+RGL and it remained at the same reduced level in NC+RGL. At this time, when GFR was reduced the same range in all groups, a significant increment in UVNa was only observed in NC+RGL (NC = 3.32±0.88; NC+RGL = 5.86±1.04*; HC = 2.63±0.43 and HC+RGL = 2.23±0.39 Eq/min, *p<0.01). Moreover, RGL induced an increase in the activity of Na+, K+-ATPase in HC+RGL, but it did not modify the activity of this enzyme in NC+RGL. The values expressed in M Pi/mg.protein.h-1 were 45±7 in NC, 43±5 in NC+RGL, 48±7 in HC and 64±4* in HC+RGL, *p<0.05. Taken together, reduction in GFR associated with high natriuresis and without changes in the Na+, K+-ATPase activity in renal medulla of NC+RGL may suggest renal injury in this group. Conclusion: RGL may act distinctly in normocholesterolemia and in hypercholesterolemia. Thus, RGL may be prescribed with caution in absence of hypercholesterolemia and requires monitoring of renal function specially if a renal vasoconstriction state is associated.

Nesta dissertação, estudamos o efeito da Rosuvastatina (Ros) sob pacientes hipercolesterolêmicos. Dentro de 180 dias de estudo prospectivo, avaliamos a eficácia da utilização de anticorpos contra a LDL oxidada ou contra sequência peptídica da apolipoproteína B (apoBD) como marcadores no acompanhamento de resposta à droga. Acompanhamos 76 pacientes (Ros.,n=40/cont.,n=36) através das seguintes variáveis: perfil lipídico, TBARS, anticorpos IgG e IgM anti-oxLDL e IgG anti-apoBD. A partir dos resultados obtidos, concluímos que: não houve alterações consideradas significativas dentro do perfil lipídico; o tratamento controle reduziu significativamente TBARS; os anticorpos IgM anti-oxLDL e IgG anti-apoBD foram sensíveis como marcadores e houve redução significativa destes apenas no tratamento com Rosuvastatina; os níveis de anticorpos IgM e IgG anti-oxLDL não são correlacionados; existe correlação direta entre anticorpos IgG anti-oxLDL e anti-apoBD; os níveis de LDL se correlacionam inversamente aos níveis de IgG anti-oxLDL e IgG anti-apoBD. / In this dissertation, we studied the effect of rosuvastatin (Ros) in hypercholesterolemic patients. During 180 days, we evaluated t if antibodies against oxidized LDL or against a peptide from apolipoprotein B (apoBD) would work as markers to monitor a response to the drug. We enrolled 76 patients (Ros.,n = 40/cont.,n = 36 and used the following variables: lipid profile, TBARS, IgG and IgM anti-oxLDL and IgG anti-apoBD., We conclude that there were no significant changes seen in the lipid profile, the control treatment significantly reduced TBARS ,IgM anti-oxLDL and IgG anti-apoBD were sensitive markers and decreased significantly only in the treatment in Ros group; levels of IgM and IgG anti-oxLDL are not correlated; there is a direct correlation between IgG anti-oxLDL and anti-apoBD; LDL levels correlate inversely with levels of IgG anti-oxLDL and IgG anti-apoBD.

Orientadores: Anibal Eugênio Vercesi, Helena Coutinho Franco de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Aplicadas / Made available in DSpace on 2018-08-24T17:38:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_Audreyde_M.pdf: 2287376 bytes, checksum: 667ac52246453deec2cd72f05541e70c (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital quando liberada / Abstract: Note: The complete abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Fisiopatologia Médica / Mestra em Ciências

A homeostase do colesterol é mediada por proteínas envolvidas na absorção (NPC1L1), regulação (SREBP1, SREBP2, SCAP), síntese (HMGCR) e remoção plasmática (LDLR). Os fármacos inibidores da síntese (vastatinas) e absorção (ezetimiba) do colesterol são potentes agentes hipocolesterolemiantes. Alterações em vários genes têm sido associadas a diferenças na resposta a diversos agentes terapêuticos. Com a finalidade de estudar os efeitos de hipolipemiantes e polimorfismos sobre a expressão dos genes HMGCR, LDLR, SREBF1a, SREBF2, SCAP e NPC1L1, foram selecionados 25 indivíduos com hipercolesterolemia familial (HF), 72 com hipercolesterolemia não familial (HNF) e 125 indivíduos normolipidêmicos e sem doença cardiovascular (NL). Os indivíduos HF foram tratados com sinvastatina (40 mg/dia/4 sem) combinada ou não com ezetimiba (10 mg/dia/4sem) e os HNF foram tratados com atorvastatina (10 mg/dia/4sem). Amostras de sangue foram obtidas antes e após o tratamento para a extração de DNA e RNA e analise do perfil lipídico sérico. A expressão de mRNA dos genes SREBF1a, SREBF2, SCAP, HMGCR, LDLR e NPC1L1 em células mononucleares do sangue periférico (CMSP) foi determinada por RT-PCR em tempo real empregando-se o gene da GAPD como controle endógeno. Os polimorfismos SREBF1a 36delG, SREBF2 G1784C e SCAP A2386G foram determinados por PCR-RFLP. Os indivíduos HF apresentaram maior expressão de mRNA dos genes NPC1L1, HMGCR e LDLR que os grupos HNF e NL (p<0,05). O efeito da atorvastatina sobre a expressão dos genes estudados parece depender da expressão basal nos indivíduos HNF. A variação da expressão após o tratamento com atorvastatina nos pacientes do grupo HNF esteve correlacionada nos genes: SREBF1a e SREBF2; SREBF1a e SCAP; SREBF1a e LDLR; SREBF2 e SCAP; SREBF2 e LDLR; HMGCR e LDLR. O tratamento com sinvastatina e ezetimiba não modificou o padrão de expressão dos genes estudados no grupo HF. Os polimorfismos SREBF2 G1784C e SCAP A2386G parecem estar relacionados com diminuição da expressão de mRNA após o tratamento com atorvastatina. Foi observado que os portadores do genótipo GG do polimorfismo SREBF2 G1784C apresentaram maiores concentrações séricas de colesterol total e LDL-C após o tratamento com atorvastatina. O polimorfismo SCAP A2386G parece estar associado com maiores concentrações de apoB em pacientes do grupo HNF antes do tratamento com atorvastatina. Os resultados são sugestivos que os genes HMGCR, LDLR e NPC1L1 são regulados diferentemente de acordo com o estado metabólico do indivíduo e a taxa de expressão de mRNA é influenciada pelos polimorfismos SREBF2 G1784C e SCAP A2386G após o tratamento com atorvastatina / The regulation of cholesterol is mediated by proteins involved in the absorption (NPC1L1), regulation (SREBP1, SREBP2, SCAP), synthesis (HMGCR) and removal of plasma cholesterol (LDLR). Potent hypocholesterolemic agents inhibit cholesterol synthesis (statins) and its absortion (ezetimibe). Changes in several genes have been associated to different responses to various therapeutic agents. In order to evaluate the association between genes involved in the metabolism of cholesterol and their response to lipid lowering drugs, patients with familial (FH, n = 25) and non familial hypercholesterolemia (NHF, n = 72) were selected. Additionally, 125 normolipidemic individuals and without cardiovascular disease were selected (NL). The HF group were treated with simvastatin (40 mg/day/4 weeks) combined or not with ezetimibe (10 mg/day/4weeks). The NHF group were treated with atorvastatin (10 mg/day/4weeks). Blood samples were obtained prior to and following treatment for extraction of DNA and RNA, and serum lipid profile analysis. The mRNA expression of SREBF1a, SREBF2, SCAP, HMGCR, LDLR, and NPC1L1 genes was determined by real time RT-PCR using the GAPD gene as endogenous control. The polymorphisms SREBF1a-36delG, SREBF2 G1784C, and SCAP A2386G were determined by PCR-RFLP. Individuals with HF showed higher expression of mRNA of genes NPC1L1, HMGCR and LDLR when compared with HNF and NL groups (p <0.05). The effect of atorvastatin on the gene expression seems to depend on the baseline expression in HNF subjects. The change of expression after treatment with atorvastatin in group HNF was correlated as followed: SREBF1a and SREBF2; SREBF1a and SCAP; SREBF1a and LDLR; SREBF2 and SCAP; SREBF2 and LDLR; HMGCR and LDLR. Treatment with simvastatin and ezetimibe did not change the gene-expression profile in HF group. The polymorphisms SREBF2 G1784C, and SCAP A2386G appear to be related to a decreased expression of mRNA after treatment with atorvastatin. HNF group Carriers of GG genotype of SREBF2 G1784C polymorphism had higher serum concentrations of total cholesterol and LDL-C after therapy. The SCAP A2386G polymorphism seems to be associated with higher concentrations of apoB in patients from HNF group prior to treatment with atorvastatin. The results suggest that the HMGCR, LDLR and NPC1L1 genes are regulated according to the metabolic status of the individual, and the expression rate of mRNA is influenced by SREBF2 G1784C and SCAP A2386G polymorphisms after atorvastatin therapy.

A idade avançada e a dislipidemia são dois dos fatores de risco clássicos para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares e se associam à fisiopatologia da aterosclerose. A oxidação da LDL, in vivo, é parte do mecanismo de iniciação e progressão das placas ateromatosas. A LDL oxidada, encontrada no espaço sub-endotelial, interfere com a função de células endoteliais e macrófagos. Formas minimamente oxidadas da LDL, ou LDLminus, são circulantes. Discute-se a importância das vitaminas como substâncias protetoras in vivo, embora a susceptibilidade da partícula à oxidação in vitro dependa de seu conteúdo em antioxidantes lipossolúveis. A apolipoproteína H ou H-&#946;2glicoproteína I (&#946;2GPI) é uma apolipoproteína capaz de ligar-se a lipoproteínas oxidadas in vitro, especialmente a LDL e pode desempenhar um papel protetor, in vivo. A oxidação da LDL avaliada pela sua susceptibilidade à oxidação in vitro e pela concentração plasmática de LDLminus in vivo, a concentração plasmática de vitaminas antioxidantes e de &#946;2GPI foram avaliadas em cem indivíduos idosos hipercolesterolêmicos (concentrações LDL > 130mg/dL) clinicamente normais. Estes indivíduos foram orientados a manter a dieta preconizada pela American Heart Association e atividade física regular. Mediram-se as concentrações de colesterol total e frações e separou-se a fração de LDL por ultracentrifugação, para determinação da sua susceptibilidade à oxidação e da concentração plasmática de LDLminus. A duração da fase lag em ensaios de oxidabilidade foi de (68 ± 23) min e a velocidade de oxidação, (0,03 ± 0,01) Abs/min. A concentração plasmática de LDLminus foi de (8 ± 6) mg/dL, correspondente (5 ± 3)% da LDL nativa. Após separação por HPLC, foram obtidas as concentrações plasmáticas de ácido ascórbico (57 ± 23) &#181;M, &#946;-caroteno (0,4 ± 0,3)nmol/mg colesterol na LDL, licopeno (0,4 ± 0,2) nmol/mg colesterol na LDL, &#945;-tocoferol (11 ± 4) nmol/mg colesterol na LDL, &#947;-tocoferol (1,8 ± 0,9)nmol/mg colesterol na LDL, ubiquinol-10 (0,09 ± 0,07)nmol/mg colesterol na LDL. Foi padronizado um ensaio imunoenzimático de competição para a &#946;2GPI plasmática, obtendo-se (397 ± 168) &#181;g/mL. As concentrações de LDLminus correlacionaram-se inversamente com as de 945;-tocoferol (p=0,003) e ubiquinol-10 (p=0,046) plasmáticos e as de ubiquinol-10 correlacionaram-se diretamente com a fase lag da oxidabilidade (p=0,037). Os resultados sustentam a hipótese de que &#945;-tocoferol e ubiquinol-10 protegem a LDL da oxidação. Concentrações plasmáticas elevadas &#946;2GPI em idosos hipercolesterolêmicos sugerem o envolvimento dessa glicoproteína no metabolismo de lipoproteínas. / Advanced age and dislipidemic disorders are two of the main risk factors in the development of cardiovascular disease, as they are associated to the physiopathology of atherosclerosis. In vivo LDL oxidation is involved both in the initiation mechanism and the progression of atheroma plaques. Oxidized LDL, found in the subendothelial space, interferes in endothelial cell and macrophage function . A minimally oxidized form of LDL, called LDLminus, is also found in the blood stream. The importance of antioxidant vitamins in the in vivo protection of the particle is currently a matter of discussion; indeed, its susceptibility to in vitro oxidation depends on its lipossoluble antioxidant content. Apolipoprotein H, also known as &#946;2-glycoprotein I (&#946;2- GPI), is a molecule capable of binding to in vitro oxidized lipoproteins, particularly to oxidized LDL, and may play a protective role in vivo. LDL oxidation evaluated by its susceptibility to in vitro oxidation and the in vivo plasmatic concentration of LDLminus -, as well as plasmatic concentration of antioxidant vitamins and of &#946;2GPI , were assessed in one hundred elderly hypercholesterolemic (LDL concentration > 130mg/dL) subjects, otherwise clinically normal. These subjects received nutritional orientation to follow the diet recommended by the American Heart Association, as well as to perform regular physical activities. Total cholesterol and its fractions were measured and the LDL fraction was subsequently separated by ultracentrifugation in order to determine its susceptibility to oxidation and the concentration of LDLminus in the fraction. The extension of the lag phase during oxidability assays was found to be of 68 ± 23 min, with an oxidation rate of 0,03 ± 0,01 Abs/min. Plasmatic concentration of LDLminus was 8 ± 6 mg/dL, corresponding to 5 ± 3% of the native LDL. Following HPLC separation, plasmatic concentration of ascorbic acid (57 ± 23 &#181;M), &#946;-carotene (0,4 ± 0,3 nmol/mg LoL cholesterol), Iycopene (0,4 ± 0,2 nmol/mg LDL cholesterol), &#945;-tocopherol (11 ± 4 nmollmg LDL cholesterol), &#947;-tocopherol (1,8 ± 0,9 nmollmg LDL cholesterol), and ubiquinol-10 (0,09 ± 0,07 nmol/mg LDL cholesterol) were determined. A competition immune enzymatic assay was standardized to measure &#946;2GPI plasmatic concentration, which was found to be 397 ± 168 &#181;g/mL. LDLminus concentration inversely correlates to both &#945;-tocopherol (p=0,003) and ubiquinol-10 (p=0,046) plasmatic contents. Also, ubiquinol-10 directly correlates to the lag phase of the oxidability assay (p=0,037). These results support the contention that &#945;-tocopherol and ubiquinol-10 protect LDL from oxidation. Moreover, the increased plasmatic concentrations of &#946;2GPI found in the hypercholesterolemic elderly subjects suggest the involvement of this glycoprotein in the metabolism of lipoproteins.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Hypercholesterolemia is a risk factor for the development of atherosclerosis, which is a chronic inflammatory disease characterized by accumulation of platelets on the walls of arteries and also by an inflammatory process. Platelets accumulated within atherosclerotic lesions, may recruit additional platelets to form a thrombus. Extracellular nucleotides and nucleosides such as ATP, ADP, AMP and adenosine have important functions, including the regulation of the thrombus, causing a variety of effects on platelets. The family of ecto-enzymes (E-NTPDase, E-5'-nucleotidase, E-NPP, E-ADA) that regulates the concentration of these nucleotides and nucleosides. Studies show that physical exercise may cause changes in lipid profile. Among the exercises, swimming in rats has been used to evaluate cardiovascular adaptations to exercise, may be an adjunct therapy to prevent progression of atherosclerosis. In the exercise, natural products have been used for the control of cardiovascular diseases, such as curcumin, a natural phenolic compound, which has antioxidant and hypocholesterolemic. Therefore, the objective of this study was to evaluate the activity of ecto-enzymes E-NTPDase, E-5'-nucleotidase, E-NPP and E- ADA in platelets of rats with induced hypercholesterolemia treated with curcumin and submitted to physical exercise. The rats used in the study were divided into eight groups: standard diet (C), standard diet along with curcumin (CC), standard diet along with physical exercise (PE), standard diet along with curcumin and physical exercise (CCPE), hypercholesterolemic diet (H), hypercholesterolemic diet along with curcumin (HCC), hypercholesterolemic diet along with physical exercise (HPE), and hypercholesterolemic diet along with curcumin and physical exercise (HCCPE). The activity of E-NTPDase, E-NPP, E-5'-NT and E-ADA were measured in isolated platelets. Curcumin was administered by gavage at a dose of 25 mg / kg / day, the rats were submitted to forced swimming. There was an increase in the hydrolysis of ATP and ADP in rats with hypercholesterolaemia induced. When these mice were treated with curcumin and physical exercise, physical exercise per se was able to further enhance the hydrolysis of ATP. In the hydrolysis of ADP, it was observed a decrease in activity of the E- NTPDase when hypercholesterolemic rats were treated with curcumin and physical exercise per se, well as when it was associated with curcumin and physical exercise. The activities of E-5'nucleotidase, E-NPP and E-ADA and platelet aggregation, did not show any significant. These results suggest that the hypercholesterolemic diet alters the activity of ecto-enzyme in platelets, and that treatment with curcumin and physical exercise may be able to modulate hydrolysis of nucleotides and nucleosides of adenine this experimental condition. / A hipercolesterolemia é um fator de risco para o surgimento da aterosclerose, sendo esta uma doença inflamatória crônica caracterizada por acúmulo de plaquetas nas paredes das artérias e também por um processo inflamatório. As plaquetas acumuladas dentro das lesões ateroscleróticas, podem recrutar plaquetas adicionais para formar um trombo. Os nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares como ATP, ADP, AMP e adenosina têm funções importantes, incluindo a regulação do trombo, exercendo uma variedade de efeitos sobre as plaquetas. A família de ectoenzimas (E-NTPDase, E-5'-nucleotidase, E-NPP, E-ADA) é que regula a concentração destes nucleotídeos e nucleosídeos. Estudos demonstram que o exercício físico, pode provocar alterações no perfil lipídico. Dentre os exercícios físicos, o nado tem sido utilizado em ratos para avaliação de adaptações cardiovasculares ao exercício, podendo ser uma terapia adjuvante para a prevenção da progressão da aterosclerose. Além do exercício físico, produtos naturais tem sido utilizado para o controle de doenças cardiovasculares, como é o caso da curcumina, um composto fenólico natural, que tem propriedades antioxidantes e hipocolesterolêmicas. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade das ectoenzimas E-NTPDase, E-5 -nucleotidase, E-NPP e E-ADA em plaquetas de ratos com hipercolesterolemia induzida tratados com curcumina e submetidos ao exercício físico. Os ratos utilizados no estudo foram divididos em 8 grupos: dieta padrão (C), dieta padrão mais curcumina (CC), dieta padrão mais exercício físico (PE), dieta padrão mais exercício físico e curcumina (CCPE), dieta hipercolesterolêmica (H), dieta hipercolesterolêmica mais curcumina (HCC), dieta hipercolesterolêmica mais exercício físico (HPE), e dieta hipercolesterolêmica mais exercício físico e curcumina (HCCPE). A atividade da E-NTPDase, E-NPP, E-5'-NT e E-ADA foram medidos em plaquetas isoladas. A curcumina foi administrada por gavagem na dose de 25 mg/kg/dia e os ratos foram submetidos ao nado forçado. Foi observado um aumento na hidrólise do ATP e ADP nos ratos com hipercolesterolemia induzida. Quando esses ratos receberam tratamento com curcumina e exercício físico, o exercício físico por si só foi capaz de aumentar a hidrólise de ATP. Na hidrólise de ADP, observou-se uma diminuição na atividade da E-NTPDase quando os ratos hipercolesterolêmicos foram tratados com curcumina e exercício físico por si só, bem como quando foram tratados com curcumina e exercício físico concomitante. A atividade da E-5'nucleotidase, E-NPP, E-ADA e agregação plaquetária não mostraram diferenças significativas. Estes resultados sugerem que a dieta hipercolesterolêmica altera a atividade das ecto-enzimas em plaquetas, e que o tratamento com a curcumina e exercício físico pode ser capaz de modular a hidrólise de nucleotídeos e nucleosídeos de adenina nesta condição experimental.