Orientadores: Maria Helena Andrade Santana / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-17T17:36:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Macedo_AndreCasimirode_D.pdf: 2580147 bytes, checksum: a40d4a6b3da0d03730c34fddf3f06101 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Neste trabalho, estudou-se a produção de ácido hialurônico (AH) por cultivo de Streptococcus zooepidemicus em estado sólido com enfoque básico nas alterações inerentes à estímulos na concentração inicial de açúcares (CIA), concentração inicial de ascorbato (CIAsc), vazão de ar e disponibilidade de oxigênio e tamanho de partícula. O primeiro enfoque mostra a comparação entre cultivos em meio líquido (FS) e em estado sólido (FES) e a produção de AH integrada em substrato caju. Cada kg de caju pode gerar 761 mg (FES) e 1790 mg (FS) de AH, o que permite além da possibilidade de utilização integral deste resíduo, a produção consorciada para a obtenção de moléculas de AH que podem ser usadas em aplicações biomédicas. A segunda abordagem trata da adição de ascorbato ao meio, que favoreceu os efeitos de despolimerização por oxi-redução causados por radicais hidroxila, alterando a massa molar final do produto obtido, o que explica as menores massas molares obtidas em cultivos em meio de caju quando comparados a meios sintéticos. Na terceira abordagem deste trabalho observou-se os efeitos da CIA, mostrando a influência direta desta variável sobre o metabolismo microbiano e em especial sobre o comportamento da competição entre a formação de AH e a biossíntese celular (Y AH/x). O desvio metabólico para a produção de AH em relação à síntese de células é superior para a faixa entre 30-90 gr-1 em fase líquida (0,61 g.g.1 ). A quarta e última abordagem traz a importância do oxigênio no cultivo em estado sólido. Como principal resultado, observou-se a grande importância da razão entre vazão de ar/massa de açúcares. A faixa ideal observada foi de 1,27-2,8 L de ar I (g sugars. min), o rendimento Y AH/X foi máximo. Este conjunto de resultados contribui pioneiramente ao processo de produção de AH em FES e para a otimização da sua produção, assim como para um melhor entendimento do mecanismo metabólico do Streptococcus zooepidemicus. / Abstract: In this work, hyaluronic acid (HA) production was studied the in solid state cultivation (SSF) of Streptococcus zooepidemicus, focusing on metabolic changes induced by varying the initial sugar concentration (ICS), initial concentration of ascorbate (I CAse), volumetric air flow rate, oxygen availability and particle size. The first approach shows the comparison between liquid (SF) and solid state (SSF) culture medium, exploring the HA production by the cashew substrate-integrated. Each lkg of Cashew can generate 761 mg (SSF) and 1790 mg (SF) of HA, which allows, for the possibility of full utilization of this waste, with production focused on HA molecules that can be used in biomedical applications. The second approach shows that the addition of ascorbate in culture medium favored HA redox depolymerization effects by hydroxyl radicais, altering the molecular weight of the final product. This explains the lower molecular weight obtained from cashew culture medium when compared to synthetic medium. In the third part of this work, we observed the effects of the ISC, showing the direct influence of this variable on the microbial metabolism and, in particular, on the behavior of HA/Biomass Yield (Y AHfX). The metabolic deviation for the HA production related to cell synthesis is superior, in the range of 30-90 gL-1 in liquid phase (0.61 g.g-1). The fourth and last approach presents the role of oxygen in solid state cultivation. As the main result, it was we observed the importance of the ratio of air flow rate I mass of sugars. The ideal range was between 1.27-2.8 L I air (g sugars. min), for which case Y AII/X was maximum. These pioneering results contribute to the HA production in SSF, as well as to understanding the metabolic mechanism of Streptococcus zooepidemicus. / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

Orientador: Maria Helena Andrade Santana / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-17T16:54:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Shimojo_AndreaArrudaMartins_M.pdf: 3448066 bytes, checksum: 3fb61b807d37d04fb162230b89e8166b (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Neste trabalho foram estudadas as reações de modificação química do ácido hialurônico (AH) com divinilsulfona (DVS) para preparação de géis reticulados e com carbodiimidas para preparação de fosfolipídios derivatizados. A modificação com DVS envolve os grupos hidroxílicos do AH, enquanto a modificação mediada por carbodiimida envolve os grupos carboxílicos do AH e o grupo amina do fosfolipídio. A extensão da reação de reticulação do AH com divinilsulfona (DVS) foi estudada em relação à razão mássica AH/DVS e concentração de NaOH na mistura reacional. O grau de modificação dos géis foi correlacionado com a reologia e a razão de intumescimento (RI). As reações de reticulação foram realizadas com AH de origem bacteriana de massa molar média da ordem de 105 Da. O gel plano preparado com concentrações de AH e NaCl de 3g/100g e em pH alcalino foi submetido a alto cisalhamento para produção de partículas. A reologia desses géis foi estudada em relação ao diâmetro médio das partículas e razão mássica gel/fluido. Um gel com propriedades reológicas semelhantes ao fluido sinovial foi preparado com partículas entre 75 e 100 µm e razão mássica gel/fluido (AH 1g/100g) de 75:25, o qual foi avaliado quanto à sua citotoxicidade em ensaios in vitro. Os resultados mostraram que a concentração de DVS é diretamente proporcional à dureza e à viscoelasticidade do gel, mas inversamente proporcional a RI. Os géis mostraram comportamento não Newtoniano pseudoplástico em toda a faixa de taxa de cisalhamento estudada. Nas medidas oscilatórias, foi observado comportamento característico de géis, com o módulo elástico maior que o viscoso (G'>G"), ambos independentes da frequência. Baseado nos parâmetros reológicos, os géis foram classificados em covalentes e fracos. A alcalinidade da mistura reacional foi inversamente proporcional à viscosidade do meio e à dureza do gel. O tamanho de partícula foi diretamente proporcional à dureza do gel e à viscosidade. O aumento da porcentagem da fase fluida (solução de AH 1% não reticulado) causou redução em G' e G" e nas forças de extrusão. O gel analisado in vitro não apresentou efeitos citotóxicos. O conjugado AH-fosfolipídio foi preparado através da ativação do AH com 1-ethyl-3-[3-dimethyl)aminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDCA) em pH 4,0 e adição do fosfolipídio 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) em pH 8,6. Os conjugados obtidos foram separados por ultrafiltração e caracterizados por cromatografia em camada delgada, ressonância magnética nuclear de próton, teor de fosfato e AH. A capacidade de incorporação do conjugado em bicamada lipídica foi avaliada através da preparação de lipossomas compostos de lecitina de ovo e DPPE, contendo 5, 10 e 15% do conjugado. Os resultados obtidos indicaram modificação do tamanho, polidispersidade e das propriedades de superfície dos lipossomas preparados com incorporação do conjugado AH DPPE. Esses resultados contribuem para o desenvolvimento de produtos à base de AH, para aplicações nas áreas médica, farmacêutica e de cosméticos / Abstract: In this work, it was studied the chemical modification of hyaluronic acid (HA) with divinyl sulfone (DVS) for the preparation of cross-linked hydrogels and with carbodiimides for the preparation of derivatized phospholipids. The modification with DVS involves the hydroxyl groups of HA, while the carbodiimidemediated modification involves the carboxylic groups of HA and the amino group of the phospholipid. The cross-linking reaction of HA with DVS has been studied regarding the HA/DVS mass ratio and NaOH concentration in the reaction mixture. The modification degree of the gels was correlated with their rheological properties and swelling ratios (SR). The crosslinking reactions were performed with bacterial hyaluronic acid of molecular weight around 105 Da. The hydrogels plans prepared with concentrations of HA and NaCl of 3g/100g and at alkaline pH were subjected to high shear to produce particles. The rheology of these hydrogels was studied in relation to the average particle size and gel/fluid mass ratio. A gel with rheological properties similar to synovial fluid was prepared with particles between 75 and 100 micrometres and gel/fluid mass ratio (HA 1g/100g) of 75:25. The cytotoxicity of this gel was evaluated through tests in vitro. The results showed that the DVS concentration was directly proportional to the hardness and viscoelasticity of the hydrogel, but it was inversely proportional to the SR. The hydrogels showed non-Newtonian pseudoplastic behavior in the range of shear rate studied. In the oscillatory measurements, the cross-linked HA hydrogels exhibited characteristic behavior of gels, with the elastic modulus higher than the viscous modulus (G' > G"), both frequency independent. Furthermore, based on the rheological parameters, the gels were classified as covalent and weak. The alkalinity of the reaction mixture was inversely proportional to the viscosity of the medium and to the hardness of the hydrogel. The particle size was directly proportional to the hardness and viscosity of the hydrogel. The increase in the percentage of fluid phase caused a reduction in G' and G" and the extrusion forces. The hydrogel analised in vitro showed no cytotoxic effects. The HA-phospholipid conjugate was prepared through the activation of HA with 1-ethyl-3-[3-dimethyl aminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDCA) at pH 4.0 and addition of the phospholipid 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) at pH 8.6. The conjugates were separated by ultrafiltration and characterized by thin layer chromatography, proton nuclear magnetic resonance, phosphate and HA content. The incorporation ability of the conjugate into the lipid bilayer was evaluated through the preparation of liposomes composed of egg lecithin and DPPE containing 5, 10 and 15% of the conjugate. The liposomes were characterized by size, polydispersity and zeta potential, and compared with the control (no conjugate). The results indicated modification of the size, polydispersity and surface properties of liposome-conjugates HA-DPPE. These results contribute to the development of HA-based products for applications in medical, pharmaceutical and cosmetic industries / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Maria Helena Andrade Santana / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-06T05:31:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ogrodowski_ChristianeSaraiva_D.pdf: 2070554 bytes, checksum: 434797b23387d845e6ccd6232e5a2e99 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Neste trabalho estudou-se a produção de ácido hialurônico (AH) por via microbiana, correlacionando-se as variáveis do processo com a produtividade e propriedades do produto. Foram utilizas cepas de Streptococcus em fermentações descontínuas, e buscou-se obter o AH de massa molar elevada, da ordem de milhões de Da, com alta viscosidade e viscoelasticidade. Essas propriedades são requeridas para as aplicações médicas do AH no tratamento de doenças degenerativas e inflamatórias das articulações dos ossos, na reposição do fluido sinovial e como veículo de liberação de fármacos em implantes cirúrgicos. Foram avaliadas três cepas de mutantes de Streptococcus (S. equi, ATCC 39506 e 6580, e S. zooepidemicus ATCC 39920), crescidas em meio de cultura composto de glicose, extrato de leveduras e sais. A maior produção do AH com alta viscosidade e viscoelasticidade foi obtida com a cepa ATCC 39920. O planejamento fatorial completo de experimentos 22, foi utilizado para otimização do meio de cultura e indicou a maior produtividade para a razão mássica 1:1 entre as fontes de carbono (glicose) e nitrogênio (extrato de leveduras). O suprimento de oxigênio ao meio de cultura foi o principal fator para a produção do AH com as propriedades desejadas. A melhor produção foi 3,75 g/L, obtida a 2,0 vvm e agitação 150 rpm em 2,5 L de meio. O AH produzido apresentou viscosidade 913 cP, módulo elástico 73,1 Pa e massa molar 3,2 x 106 Da. O corte na alimentação de oxigênio causou despolimerização reduzindo a viscosidade e viscoelasticidade do AH. A determinação do coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio permitiu caracterizar o suprimento adequado de oxigênio ao longo da fermentação. Os resultados obtidos demonstram a potencialidade da produção do AH por fermentação submersa e contribuem para o entendimento dos mecanismos envolvidos na sua formação e polimerização / Abstract: This work studied the production of hyaluronic acid (HA) by microbial route correlating variables of the process with productivity and physico-chemical properties of the product. Strains of Streptococcus were used in batch fermentations, aiming to obtain HA with high molecular weight, in the range o millions, high viscosity and viscoelasticity. Those properties are requested for medical applications of HA in the treatment of degenerative and inflammatory diseases of joints, as well as in the replacement of the sinovial fluid and as vehicle for drug delivery in surgical implants. Initially, the performance of three strains of mutants of Streptococcus (S. equi, ATCC 39506 and 6580, and S. zooepidemicus ATCC 39920), grown in medium of culture composed of glucose, yeast extract and salts were evaluated. The largest production of HA with viscous properties and viscoelasticity was obtained with the strain ATCC 39920. Secondly, a complete factorial planning of experiments 22 using the selected strain was performed aiming optimization the culture medium. The largest productivity was obtained for 1:1 (w/w) ratio between the sources of carbon (glucose) and nitrogen (yeast extract). The supplying of oxygen to the culture medium was the limiting factor to the production of AH with the required properties. The best production obtained was 3.75 g/L, using 2.0 vvm and 150 rpm agitation in 2.5 L medium. The AH produced had viscosity 913 cP, elastic module 73.1 Pa and molecular weight 3.2 x 106 Da. The interruption in the feeding of oxygen reduced the viscosity and viscoelasticity of HA, due to depolymerization. The determination of the volumetric coefficient for oxygen transfer allowed to detect changes in medium along fermentation. The obtained results demonstrate the potentiality of the production of HA by submerged fermentation and also contribute to the understanding of the mechanisms involved in HA formation and polymerization / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

Orientador: Cesar Costapinto Santana / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-19T00:34:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sousa_AnayladosSantos_D.pdf: 1255579 bytes, checksum: 2c0a223e27891ba584d4f621ffa8e2bd (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O Ácido hialurônico (AH) é um polissacarídeo linear com importantes aplicações na indústria farmacêutica, médica e cosmética, fazendo-se necessária sua purificação por ser oriundo de uma variedade de fontes, animal e não animal. Assim sendo, o presente trabalho discorre sobre a separação do AH produzido por fermentação em meio de cultura sintético, utilizando a técnica cromatográfica de exclusão por tamanho. Determinaram-se as melhores condições de separação utilizando, inicialmente, uma coluna de exclusão por tamanho operando em batelada. Estas condições foram mantidas em todos os ensaios e serviram de modelo para a obtenção dos parâmetros para o escalonamento do processo. Ainda em batelada, avaliou-se a inserção da técnica cromatográfica de troca iônica acoplada à exclusão por tamanho, com o intuito de aprimorar a separação do AH, averiguando resinas de caráter catiônico e aniônico. Realizou-se um estudo comparativo entre o processo em batelada, com e sem a inserção da troca iônica, e o semicontínuo operado com reciclo externo estacionário (REE), visando a obtenção de frações de AH e proteínas com elevado grau de pureza. Considerando-se o processo semicontínuo operado em REE foram avaliados diferentes volumes de reciclo, sendo eles 1,0; 1,5; 2,25 e 3,0 mL. Os resultados obtidos com o processo semicontínuo em REE alcançaram um percentual de purificação entre 92% e 97% para o AH, trabalhando-se com volumes de reciclo de 1,0 a 3,0 mL, enquanto que para as proteínas mostrou-se inviável. A inserção da cromatografia de troca iônica mostrou-se promissora com o uso da resina catiônica, apresentando 98% de pureza com um rendimento de 99% para o AH; ao contrário da resina aniônica que exibiu uma perda mássica de AH em torno de 50%. O escalonamento do processo cromatográfico de exclusão por tamanho mostrou-se possível, apresentando resultados semelhantes à operação em batelada / Abstract: The hyaluronic acid (HA) is a linear polysaccharide with important applications in the pharmaceutical, medical and cosmetics industry. Its purification is necessary because it is in a mixture coming from a variety of sources, animal and non-animal. The aim of this work is the separation of HA obtained by fermentation in synthetic medium, using the technique of size exclusion chromatography. The best conditions for HA separation were determined using, initially, a batch operation size exclusion column. These conditions were maintained in all trials and served to obtain the parameters for the large scale process. The batch operation also evaluated the ion exchange chromatography technique coupled to size exclusion, in order to enhance the separation of HA by examining cationic and anionic resins. A comparative study was carried out between the batch process, with and without the inclusion of ion exchange, and the semi-batch process with steady state recycling (SSR), in order to obtain fractions of HA and proteins with high purity. The semi-batch process operated with SSR assessed in differents volumes of recycle (1.0, 1.5, 2.25 and 3.0 mL). The results obtained with the semi-batch process with SSR achieved a purification percentage between 92 % and 97% for HA, working with recycle volumes from 1.0 to 3.0 mL, showing to be feasible for HA, while for the proteins proved to be unfeasible, with a maximum of 60 % purity. The ion-exchange chromatography obtained good results with the use of cationic resin, with 98% of purity and a yield of 99 % for HA, unlike the anionic resin which exhibited a mass loss of HA around 50 %. The scale-up process for size exclusion chromatography proved to be possible, with similar results to batch operation / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

Orientador: Lucimara Gaziola de La Torre / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-21T16:14:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Correa_GabrieladeSaCavalcanti_M.pdf: 2289921 bytes, checksum: fab97f76a524bba1b46aeeb55756ed3f (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Esta pesquisa visou o desenvolvimento de lipossomas catiônicos contendo o DNA plasmideal e recobertos com o ácido hialurônico, para o desenvolvimento de novas estratégias de vacinas gênicas. Os lipossomas foram compostos dos lipídios: fosfatidilcolina natural de ovo (EPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) e 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOTAP). A primeira etapa, avaliou-se a influência do tipo de lipossoma (extrudado ou DRV - "Dehydrated-rehydrated") e de duas massas molares de ácido hialurônico (HA 6 e 16 kDa) nas propriedades dos complexos finais. Lipossomas extrudados apresentaram diâmetro médio reprodutível, quando comparado com lipossomas do tipo DRV. Surpreendentemente, complexos formados por lipossomas extrudados e HA 16 kDa apresentaram diâmetro na faixa nanométrica (200-400nm). Na segunda etapa, estudou-se o efeito da incorporação de um DNA modelo nas estruturas contendo HA e lipossomas catiônicos através da construção do perfil de diâmetro médio e potencial zeta em função da razão molar entre as cargas positivas (dos lipídeos catiônicos) e das cargas negativas proveniente do DNA (R+/-). A proporção escolhida foi R+/- = 3, pois permite toda a incorporação do DNA na estrutura lipossomal. Estudos de transfecção mostraram que a presença do HA nas estruturas eleva a eficiência de transfecção em células HeLa, porém de forma independente da quantidade de HA. A partir destes estudos, amostras contendo LACKDNA/Lipossomas catiônicos/HA foram preparadas e enviadas para estudos in vivo no Laboratório de Imunofarmacologia - Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho - UFRJ para avaliação da capacidade destas nanoestruturas na vacinação contra a Leishmaniose / Abstract: This research has the goal of develop a vaccine composed of liposome containing DNA and covered by hyaluronic acid as a new strategy for gene delivery. The hyaluronic acid is a natural polysacaride with mucoadhesive properties and has been used in vaccines using nasal route. This biopolymer allows the increase in the gene delivery in liposome systems because it has specific sinals for the cells, CD44 and RHAMM. The liposomes use in this research are composed of egg phosphatidylcholine(EPC), 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane(DOTAP), l-alpha-dioleoyl phosphatidylethanolamine(DOPE), and hyaluronic acid used was of low molecular weight (6 and 16 kDa). The first step study the influence of the kind of liposome (extruded liposome or DRV - "Dehydrated-rehydrated") and polymer mplecular weight. The final properties of the systems were checked. Extruded liposomes show diameter results more reproductive compared to DRV. The complexe of HA 16 kDa and extruded liposomes has the diameter in the nano scale (200-400 nm). The morphology of these complexes indicat the HA is covering the liposome. In a second step study the DNA incorporation in liposome using the construction of diameter and zeta potential profile in function of molar charge ratio ( positive molar charge from cationic lipid/ molar negative charge ratio from DNA).The best molar charge ratio considered was 3 for futher studies with liposome , DNA and HA. Transfection studies demonstrated that the HA presence increase the eficience of gene delivery in HeLa cells, no matter the amount of HA. Using this study, the structures composed of liposome/LACKDNA/HA, are prepared to be used in in vivo and in vitro studies of Leishmanioses in the Carlos Chagas Institute/UFRJ / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestra em Engenharia Química

Orientadores: Olga Maria de Toledo Correa, Paulo Pinto Joazeiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T13:23:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Garcia_EduardoAnselmo_M.pdf: 5637432 bytes, checksum: 7856ba76c45912e029c4e039ce280e21 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: O tecido interpúbico no camundongo é conhecido pelas rápidas adaptações sofridas devido as novas demandas impostas durante a prenhez, parto e pós-parto. O desenvolvimento de um ligamento interpúbico é explicado em parte pelas modificações observadas na hidratação deste tecido, assim como, pela presença de Ácido Hialurônico (AH). O presente estudo focou-se na presença do AH na sínfise púbica, uma vez que pouco se sabe a respeito do seu papel durante as modificações sofridas neste período. A localização e quantificação do AH, por meio de uma sonda específica para AH, foi feita em amostras de sínfises púbicas de camundongos virgens, com 12 a 18 dias de prenhez, no dia do parto (D19) e durante o 3° e 5° dia pós-parto. A análise quantitativa fluorométrica indicou um aumento gradual no AH do tecido interpúbico durante a prenhez, seguido de uma diminuição já presente no dia do parto. A análise histoquímica demonstrou a presença de AH na matriz extracelular deste tecido assim como dentro das células. Baseado nestes resultados, pudemos demonstrar a provável participação do AH em três processos. Quando encontrado na matriz extracelular, o AH contribui para a formação de uma estrutura flexível, de consistência rígida, que vai permitir a passagem do feto pelo canal de parto. Ao passo que, quando encontrado intracelularmente, o AH contribui em dois processos distintos: até o 18° dia de prenhez, o AH participa nos processos de proliferação celular, através de possíveis interações com moléculas e estruturas importantes neste processo. O AH talvez também contribua para a proliferação através da formação de uma zona hidratada ao redor das células facilitando o destacamento das mesmas de seu substrato. Finalmente, após o parto e até o 5° dia pós-parto o AH contribui para a manutenção do fenótipo miofibroblástico destas células ajudando no processo de involução sofrido pelo tecido interpúbico no pós-parto / Abstract: The interpubic tissue in mice is known to rapidly adapt itself to the ali new demands imposed during pregnancy, partum and post-partum. The development of an interpubic ligament may be explained, in part, due to the modifications observed in the hydration of this tissue, as well as, the presence of hyaluronan (HA). The present study focuses on the presence of HA in the pubic symphysis, since still very little is known of its role during the modifications suffered through this period. The localization and quantification of HA using a HA-probe were studied in samples of mice pubic symphyses from virgin, 12th to 18th days of pregnancy, the day of delivery (D19) and during 3 and 5 days post-partum. The quantitative fluorimetric analysis indicated a gradual increase of HA in the interpubic tissue throughout pregnancy, being followed by a decrease already present on the day of the delivery. In addition, the histochemical analysis demonstrated the presence of HA in the extracellular matrix of the tissue as well as within its cells. Based on these results, it can be shown that HA may participate in three processes during pregnancy, partum and post-partum. While found in the extracellular matrix, HA contributes in the formation of a flexible structure, yet of rigid consistency, that allows the passage of the embryo for the birth canal. Whereas, while found intracellular, HA contributes in two distinct processes: until the 18th day of pregnancy, HA participates in the process of cellular proliferation through its possible interaction with mitotic cells. HA may also contribute to cellular proliferation through the formation of a hydrated zone from parturition as well as the 5th day post-partum HA contributes to the maintenance of the myofibroblastic phenotype of these cells, aiding in the process of involution suffered by the interpubic tissue following parturition / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

This project focused on the design of a cellular scaffold applicable for the promotion of peripheral nerve regeneration. Firstly, we established a correlation between the organization of HA/PEG co-polymeric networks to their mechanical and degradability properties; cell adhesion was conferred to all gels by the incorporation of RGD peptides. Three families of hydrogels were produced using different procedures to permit an increasing physical incorporation of HA into a PEGDA-based network. From a comparative study of rheological properties and enzymatic degradability, co-networks obtained using thiolated HA as chain transfer agent during PEGDA photo-polymerization were selected for further biological investigations, aiming to link the cellular response of L929 murine fibroblasts (phenotype, proliferation rate, metabolic activity) to the composition and the consistency of selected hydrogels. Our findings showed that there is a clear relation between increasing hardness and increasing cell spreading/proliferation rate. This study illustrated the possibility to fine tune cell/material interactions with appropriate reactive processing techniques. As a spin-off of this study, we become interested in the interplay of cellular interactions in the use of materials that contain both HA and RGD peptides, which can bind at the same time to HA receptors such as CD44 and av integrins. We focused on soluble HA derivatives, with or without dandling RGD peptides. The kinetics and the mechanistic details of both HA and HA-RGD internalization were studied in a phagocytic model (J774.2 murine macrophages). HA-RGD showed a form of synergic binding to integrins and CD44 (HA receptor), whereas its uptake remained solely regulated by CD44 dwell-time on the cell membrane. This study demonstrated that the knowledge of the rate-determining steps of the uptake of a carrier is necessary for assessing its efficiency. In this case, the presence of multiple ligands on a carrier was beneficial in some respect, but may not be optimal to overcome internalization limitations that arise from the slow turnover of the determining receptor. Finally, we studied the relation between the regulation of the expression of CD44 / RHAMM (HA receptor mediated motility) and the motility of Schwann cells (peripheral glial cells) and stem cells differentiated into a glial phenotype. Rt-PCR and immuno-assay experiments suggested that RHAMM up-regulation is associated with glial differentiation and we speculate that in the future this HA receptor could be considered as a differentiation marker. We also illustrated the importance of HA / RHAMM interaction for the motility of glial cells. These results indicate the importance of HA in mediating glial cell function during peripheral nerve regeneration and have implications for therapeutic repair strategies.

A pele tem como principal função manter o isolamento do meio interior com o exterior. Quando esse órgão sofre uma lesão o organismo tenta reparar essa agressão ao promover a substituição do tecido por meio de um processo complexo dividido em fases. O ácido hialurônico está presente em todas as fases dessa reparação tecidual. Contudo a sua presença em adultos reduz cerca de 50% comparado ao recém-nascido, o que reduz a regeneração tecidual drasticamente. Este trabalho teve como objetivo analisar o efeito de uma pomada utilizando veículo comercial composto de lanolina e vaselina manipulada com ácido hialurônico, extraído da crista do frango, no processo cicatricial de feridas cutâneas em dorso de ratos. Para atingir o objetivo desse trabalho o ácido hialurônico foi extraído e purificado da crista do frango e foi acrescido ao veículo comercial composto de 10% lanolina e 90% vaselina. A pomada obtida foi analisada por meio de um reômetro de tensão controlada. Para os estudos in vivo, foram separados aleatoriamente 28 animais em 4 grupos. Em cada animal do grupo efetuou-se duas lesões em seu dorso, uma para a aplicação da pomada, com ou sem ácido, e a outra lesão para controle. A pomada foi aplicada diariamente durante 7 e 14 dias conforme protocolo estabelecido. Os resultados mostraram que as propriedades viscoelásticas da pomada, quando acrescentou o ácido hialurônico, tiveram pequenas alterações, porém não de forma significativa, o que possibilitou sua utilização. Como resultados dos testes in vivo, o grupo tratado com a pomada com ácido hialurônico durante 7 dias, obteve menor média da área da lesão com 0,07 cm² contra 0,11 cm² do seu controle, 0,09 cm² do grupo tratado com a pomada placebo e 0,10 cm² do controle do placebo. Ainda, os grupos tratados com a pomada com AH durante 7 e 14 dias obtiveram uma maior média na porcentagem de colágeno, e o grupo tratado com a pomada com AH por 14 dias, resultou em uma melhor cicatrização da lesão. / The skin has as main function to maintain the insulation of the inner tissues of the body from the external environment. When this organ is injured, the organism attempts to repair the damage with a tissue replacement, in a complex process divided into several stages. Hyaluronic acid is present in all phases of this process, although its expression in adults is reduced to approximately 50% compared to newborn individuals, leading to drastically reduced tissue regeneration. This study aimed to analyze the effect of an ointment composed of a commercial vehicle of lanolin and vaseline, manipulated with chicken crest-extracted hyaluronic acid, in skin wounds healing in rats. Hyaluronic acid was extracted and purified from chicken crests, and the extract was added to the commercial vehicle composed of 10% lanolin and 90% vaseline. The obtained ointment was analyzed using a controlled stress rheometer. For in vivo studies, 28 rats were randomly separated into four groups. Each animal was injured twice in the back, one lesion destined to the ointment application, and the other lesion as a control injury. The ointment was applied for 7 to 14 days according to the protocol established. Results showed that the viscoelastic properties of the ointment mixed with hyaluronic acid changed slightly, but not significantly, allowing its use in vivo. The group of animals treated with the ointment for seven days showed lower average lesion area, with 0.07 cm² against the control area of 0.11 cm². The animals treated with a placebo ointment showed an average lesion area of 0.09 cm² against a 0.10 cm² area of controls. The animals treated with the ointment with hyaluronic acid for 7 and 14 days had a higher average percentage of collagen, and the group treated for 14 days exhibited an improved wound healing.

Made available in DSpace on 2016-07-18T17:53:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gabriel Oliveira Lima Carapeba.pdf: 455083 bytes, checksum: 0a87ff40da4a5762f86ff7020cb058f9 (MD5) Previous issue date: 2015-11-26 / Viscosupplementation is one of the treatment modalities for osteoarthritis which consist in an intraarticular (IA) injection of hyaluronic composts. The aim of this randomized, double-blind study was to compare the clinical efficacy of viscosupplemantion with conventional conservative treatment (CCT) in dogs with hip dysplasia (HD). Fifteen dogs were distributed into two groups: HA (n=8): IA injection of hyaluronic acid (5-10 mg); Control (n=7): IA injection with saline solution (0.5-1.0 mL) in combination with a CCT using an oral nutraceutical (750-1000 mg, every 12 h, 90 days) and carprofen (2.2 mg/kg, every 12 h, 15 days). The clinical signs of HD were evaluated prior to treatment (baseline), 15, 30, 60, and 90 days after the IA injection by the veterinary using a score system and by the owners with a questionnaire about their dog s condition using the Canine Brief Pain Inventory (CBPI) and Helsinki Chronic Pain Index (HCPI). The data were analyzed using test unpaired-t, Mann-Whitney-U test and Friedman test, followed by post-hoc Dunn s test (P < 0.05). The scores measured by the veterinary decreased from 30 to 90 days in relation to the baseline in the HA group (P = 0.0005), and at 15 days in the Control group (P = 0.0003). The scores evaluated by veterinary and by CBPI were significantly lower in the HA than in the Control from 30 to 90 days. Compared with baseline, both groups had lower total CBPI scores from 60 to 90 days after IA injection respectively (P= 0.0145, HA and P = 0.0291, Control). The HCPI scores were significantly lower in the Control and HA groups at 15 and 90 days after treatment, respectively (P= 0.0054, HA and P = 0.041, Control). Both treatments reduced the clinical signs of HD, however better results were reached with viscosupplementation. / A viscossuplementação é um tratamento que consiste na administração intra-articular (IA) de derivados do ácido hialurônico, cuja eficácia clínica tem sido confirmada em seres humanos. Objetivou-se comparar a eficácia clínica da viscossuplementação em relação ao tratamento conservativo convencional (TCC) em cães com displasia coxofemoral (DCF). Quinze cães foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos: AH (n=8) tratamento IA com ácido hialurônico (5 mg a 10 mg); Controle (n=7): tratamento IA com solução salina (0,5 mL a 1,0 mL), além do TCC por via oral com condroprotetor (750-1000 mg, BID, 90 dias) e carprofeno (2,2 mg/kg BID, 15 dias). Os sinais clínicos da DCF foram avaliados de forma encoberta, antes do tratamento (basal), 15, 30, 60 e 90 dias após a injeção IA, por sistema de escore pelo pesquisador e mediante questionários respondidos pelos proprietários dos cães, empregando-se o Breve Inventário de Dor Canina (BIDC) e o Indicador de Dor Crônica de Helsinque (IDCH). Intervenção analgésica foi permitida se o somatório dos escores do BIDC e/ou IDCH excedesse 50%. Os resultados foram analisados pelo teste t não-pareado, teste de Mann-Whitney e teste de Friedman (P < 0,05). Os escores avaliados pelo médico veterinário foram inferiores (P = 0,0005) aos 30, 60 e 90 dias em relação ao basal no grupo AH, e aos 15 dias no grupo Controle (P = 0,0003). Na comparação entre grupos, escores inferiores foram observados aos 30, 60 e 90 dias no grupo AH em relação ao grupo controle, pela avaliação do pesquisador e pelo BIDC. Na comparação ao longo tempo, os escores totais do BIDC foram inferiores aos 60 e 90 dias em relação ao basal nos grupos Controle e AH, respectivamente (P= 0,0145, AH e P = 0,0291, Controle). Na avaliação pelo IDCH escores inferiores foram observados aos 15 e 90 dias em relação ao basal nos grupos Controle e AH, respectivamente (P= 0,0054, AH e P = 0,041, Controle). Intervenção analgésica não foi necessária durante o período de avaliação. Ambos os tratamentos reduziram os sinais clínicos associados à DCF, porém resultados mais expressivos foram alcançados com a viscossuplementação.

Cell-derived (CDM) matrix scaffolds provide a 3-dimensional (3D) matrix material that recapitulates a native, human extracellular matrix (ECM) microenvironment. CDMs are a heterogeneous source of ECM proteins with a composition dependent on the cell source and its phenotype. CDMs have several applications, such as for development of cell culture substrates to study stromal cell propagation and differentiation, as well as cell or drug delivery vehicles, or for regenerative biomaterial applications. Although CDMs are versatile and exhibit advantageous structure and activity, their use has been hindered due to the prolonged culture time required for ECM deposition and maturation in vitro. Macromolecular crowding (MMC) has been shown to increase ECM deposition and organization by limiting the diffusion of ECM precursor proteins and allowing the accumulation of matrix at the cell layer. A commonly used crowder that has been shown to increase ECM deposition in vitro is Ficoll, and was used in this study as a positive control to assess matrix deposition. Hyaluronic acid (HA), a natural crowding macromolecule expressed at high levels during fetal development, has been shown to play a role in ECM production, organization, and assembly in vivo. HA has not been investigated as a crowding molecule for matrix deposition or development of CDMs in vitro. This dissertation focused on 2 aims supporting the development of a functional, human dermal fibroblast-derived ECM material for the delivery deliver an antimicrobial peptide, cCBD-LL37, and for potentially promoting a pro-angiogenic environment. The goal of this thesis was to evaluate the effects of high molecular weight (HMW) HA as a macromolecular crowding agent on in vitro deposition of ECM proteins important for tissue regeneration and angiogenesis. A pilot proteomics study supported the use of HA as a crowder, as it preliminarily showed increases in ECM proteins and increased retention of ECM precursor proteins at the cell layer; thus supporting the use of HA as a crowder molecule. In the presence of HA, human dermal fibroblasts demonstrated an increase in ECM deposition comparable to the effects of Ficoll 70/400 at day 3 using Raman microspectroscopy. It was hypothesized that HA promotes matrix deposition through changes on ECM gene expression. However, qRT-PCR results indicate that HA and Ficoll 70/400 did not have a direct effect on collagen gene expression, but differences in matrix crosslinking and proteinase genes were observed. Decellularized CDMs were then used to assess CDM stiffness and endothelial sprouting, which indicated differences in structural organization of collagen, and preliminarily suggests that there are differences in endothelial cell migration depending on the crowder agent used in culture. Finally, the collagen retained in the decellularized CDM matrix prepared under MMC supported the binding of cCBD-LL37 with retention of antimicrobial activity when tested against E.coli. Overall, the differences in matrix deposition profiles in HA versus Ficoll crowded cultures may be attributed to crowder molecule-mediated differences in matrix crosslinking, turnover, and organization as indicated by differences in collagen deposition, matrix metalloproteinase expression, and matrix stiffness. MMC is a valuable tool for increasing matrix deposition, and can be combined with other techniques, such as low oxygen and bioreactor cultures, to promote development of a biomanufactured CDM-ECM biomaterial. Successful development of scalable CDM materials that stimulate angiogenesis and support antimicrobial peptide delivery would fill an important unmet need in the treatment of non-healing, chronic, infected wounds.