Para conseguirem se alimentar com sucesso, os mosquitos hematófagos possuem componentes em sua saliva capazes de regular a hemostasia e modular a imunidade dos hospedeiros. Entretanto, a avaliação das atividades biológicas dessas moléculas no hospedeiro ainda carece de estudos mais aprofundados. No presente projeto, propomos caracterizar as atividades biológicas do produto do transcrito AET-7393, uma serpina presente nas glândulas salivares de fêmeas do mosquito Aedes aegypti. Nossos dados mostram que a serpina AET-7393 recombinante provoca um aumento no sangramento quando inoculada em camundongos, mas aparentemente esse efeito não está ligado à interferência com a cascata de coagulação. Mostramos ainda que a AET-7393 é capaz de inibir a proteinase 3 e aumentar a produção de IL-1b. Por fim, observamos a ausência de capacidade moduladora sobre a ativação de macrófagos ou sobre a inflamação, e que presença de anticorpos específicos contra a serpina no hospedeiro não interfere no ciclo de vida do mosquito. / In order to successfully feed, hematophagous mosquitoes possess salivary components capable of regulating hemostasis and modulate the host immunity. However, the evaluation of the biological activities of the salivary molecules in the host still needs further investigation. In this study, we intend to characterize the biological activities of the AET-7393, a serpin that is present in the saliva of the females Aedes aegypti mosquitoes. Our data show that the recombinant AET-7393 serpin increases bleeding when inoculated in mice, but apparently this effect is not due to its interference on the coagulation cascade. In addition, AET-7393 is able to inhibit proteinase 3 and enhance the production of IL-1b. Finally, we observed the absence of modulatory effect on macrophage activation or inflammation, and that the presence of host anti-AET-7393 antibodies does not interfere in the life cycle of the mosquitoes.

Investigamos o agonista de Guanilato Ciclase solúvel, BAY 41-2272, como alternativa para compensar falhas nas funções de monócitos. Avaliamos in vitro o efeito do fármaco em células humanas de linhagem e de sangue periférico. O BAY, em células THP-1 e monócitos, aumentou a expressão de CD11b, CD18, CD14, TLR4, TLR2 e CD163 e induziu a produção de TNF-<font face=\"Symbol\">a, IL-1<font face=\"Symbol\">b, IL-6 e IL-12p70. Além disso, o fármaco aumentou a expressão gênica (CYBB, CYBA e NCF2) e protéica (p67PHOX e gp91PHOX) da NADPH oxidase. Ainda, o BAY ativa a via do NF-kB (p65) (dependente de PKG). Mais importante, o fármaco aumentou a atividade microbicida de monócitos de pacientes com DGC e deficiência de MPO a S. aureus e C. albicans. Em animais, o BAY 41-2272 induziu intenso influxo de macrófagos para o peritônio e inflamação. Ainda, potencializou o espraiamento, atividade fagocítica, atividade microbicida, produção espontânea de óxido nítrico e de peróxido de hidrogênio induzida por PMA, em macrófagos peritoneais, aumentando a proteção dos animais desafiados com C. albicans. Em conjunto, nossos resultados confirmam o potencial do BAY 41-2272, ou sua via (GCs/PKG), como alternativa para o desenvolvimento de terapias contra infecções. / We investigated the soluble guanylate cyclase agonist, BAY 41-2272, as an alternative to compensate for failures in of monocytes function. We evaluated the in vitro effect of the drug on human cells lines and peripheral blood cells. The BAY increased expression of CD11b, CD18, CD14, TLR4, TLR2 and CD163 and induce the production of TNF-<font face=\"Symbol\">a, IL-1<font face=\"Symbol\">b, IL-6 and IL-12p70 in THP-1 cells and monocytes. Furthermore, the drug increased NADPH oxidase gene (CYBB, CYBA and NCF2) and protein (gp91phox and p67phox) expression. Also, BAY activates the PKG-dependent NF-kB pathway (p65). More importantly, the drug increased microbicidal activity against S. aureus and C. albicans of monocytes from patients with CGD and MPO deficiency. In animals, BAY 41-2272 induced intense influx of macrophages to the peritoneum and inflammation. BAY potentiated the spreading, phagocytic activity, microbicidal activity, spontaneous production of nitric oxide and PMA-induced hydrogen peroxide release by peritoneal macrophages, increasing host protection against C. albicans. Taken together, our results confirm the potential of BAY 41-2272, or its pathway (sGC / PKG), as an alternative for the development of therapies against infections.

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença granulomatosa sistêmica causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. Aproximadamente 10 milhões de pessoas que vivem em áreas endêmicas estão infectadas com P. brasiliensis e até 2% destas podem desenvolver a PCM. Períodos extensos de quimioterapia são necessários e problemas de recidiva da doença são frequentes. Vacinas anti-PCM ainda não estão disponíveis para uso em humanos, porém, nos últimos anos, testes em modelo animal mostram que estratégias vacinais são viáveis. Formulações vacinais baseadas na proteína gp43 e no peptídeo P10 específico para células T CD4+ mostram-se promissores como antígenos vacinais. No presente trabalho, testamos as propriedades de uma formulação vacinal terapêutica baseada no peptídeo P10 combinado com flagelina de S. enterica, associada ou não a quimioterapia, como tratamento da PCM experimental. Os resultados indicaram que animais tratados apenas com a vacina, combinada ou não com os quimioterápicos, não demonstraram uma redução significativa da carga fúngica no pulmão. No entanto granulomas mais organizados foram observados no pulmão dos animais que receberam a formulação vacinal. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis. Approximately 10 million people living in endemic areas may be infected with this fungus and up to 2% of them may develop the disease. Extended periods of chemotherapy are often necessary to treat PCM and relapses occur frequently. PCM vaccines are not yet available for use in humans, but in recent years tests in animal models showed that vaccine strategies are viable. Vaccine formulations based in protein gp43 and a derived peptide P10, representing a CD4+ T cell-specific epitope, have showed promising results as vaccine antigens. In the present work, we tested the properties of a vaccine formulation based on the P10 peptide admixed with the S. enterica flagellin, in combination or not with chemotherapy, as a PCM therapeutic treatment. Treated mice, combined or not with chemotherapy, showed no significant reduction in lung fungal burden. Nonetheless, more organized lung granulomas were observed in animals that received the vaccine formulation.

As vacinas pertussis celulares apresentam certa reatogenicidade e as acelulares, menos reatogênicas, têm seu uso restrito, devido a seu alto custo. O Instituto Butantan desenvolveu uma vacina pertussis celular (Plow), com baixo teor de lipopolissacarídeo e outra acelular (Pa), por metodologia simples e econômica. Essas preparações, combinadas aos toxóides diftérico e tetânico (DTPlow e DTPa, respectivamente), foram comparadas à DTP tradicional, com diferentes adjuvantes: vitamina A, surfactante pulmonar, BCG, monofosforil lipídeo A (MPL) e Al(OH)3. A resposta humoral em camundongos foi semelhante para as diferentes formulações e independente do adjuvante utilizado. As vacinas induziram níveis equilibrados de IgG1/IgG2a anti-pertussis e a DTPlow mostrou-se menos reatogênica, induzindo níveis significativamente menores de IL-6 sérica. A adição de MPL sugeriu tendência de proteção contra a colonização nasotraqueal no grupo imunizado com DTPa e levou à indução de IFN-g nos grupos imunizados com DTP e DTPa, sugerindo possível atividade imunomodulatória para Th1. / The whole cell pertussis vaccines present some reactogenicity and the acellular, less reactogenic, have prohibitive use due to its high cost. Instituto Butantan developed a less reactogenic whole cell pertussis vaccine (Plow), with low lipopolysaccharide content and an acellular vaccine (Pa), by simple and economic methodology. These preparations, combined to diphtheria and tetanus toxoids (DTPlow and DTPa, respectively), were compared with the traditional DTP, with different adjuvants: vitamin A, pulmonary surfactant, BCG, monophosphoryl lipid A (MPL) and Al(OH)3. The humoral immune response induced in mice by the different vaccine formulations, was similar and independent of the adjuvant used. The vaccines induced balanced levels of IgG1/IgG2a anti-pertussis and DTPlow showed to be less rectogenic, inducing lower levels of serum IL-6. The use of MPL suggested to induce higher protection against nasotracheal colonization in DTPa group and induced IFN-g in the DTP and DTPa groups, suggesting a possible immunemodulatory activity for Th1.

New Zealand Black/White F₁ hybrid (NZB/W) and MRL/Mp-lpr/lpr (MRL/lpr) mice spontaneously develop a Systemic Lupus Erythematosus-like autoimmune disease. While the primary immunologic defect in the NZB/W is due to B cells, in the MRL/lpr it is a result of T cell abnormalities. Diethyldithiocarbamate (DTC), an agent suggested to enhance T cell function, was used to treat both strains. Weekly treatment of NZB/W mice with 25 mg/kg DTC had no significant effect upon survival or autoantibody levels but did induce changes in cell surface antigen expression. MRL/lpr mice treated with DTC displayed normalization of cell surface antigen expression (particularly increased expression of Lyt-2, macrophage markers and Lyt-2⁺/L3T4⁺ thymocytes), decreased lymphoproliferation and thymic atrophy, decreased serum autoantibody levels and kidney deposition of C3 and IgM, restored responses to mitogens and significantly prolonged survival. To determine both the influence of MRL background and lpr genes and to better understand on what cell populations DTC effects, changes in cell surface antigen expression were examined in DTC treated MRL-+/+, Balb/c, and Balb/lpr strains. The only consistent similarities observed between all strains tested were DTC induced changes in Mac-1 splenocyte surface antigen expression. In vitro studies showed DTC to have variable effects upon the mitogenic responses of lymphoid cells to phytohemagluttinin, but DTC alone stimulated both MRL/lpr and Balb/lpr lymphocytes. DTC stimulated the null cell population that predominates in lpr gene-bearing mice, but all observed in vitro effects of DTC were dependent upon the adherent cell population included in culture. DTC had no apparent direct effects upon adherent cells alone however. These studies have shown that DTC is capable of positive effects upon one autoimmune murine strain, the MRL/lpr, but not the NZB/W. DTC appears to affect macrophages, but other cell populations are required to obtain full activity of this compound. The variable effects of DTC emphasize the need to define the immunopathology of individual patients with autoimmune disease before initiating treatment with immunomodulative therapy.

A leptospirose é uma zoonose de importância global causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira. Foi avaliado o potencial adjuvante da flagelina FliCi de Salmonella enterica sorovar Thyphimurium na indução de resposta imunoprotetora em uma formulação vacinal acelular composta pela proteína LigAc e por seis prováveis lipoproteínas de membrana externa recombinantes de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni como alternativa profilática. Grupos de hamsters imunizados com LigAc co-administrada com o pool das proteínas acrescidas de FliCi ou Al(OH)3 apresentaram altos títulos de anticorpos contra as proteínas recombinantes e foram protegidos do desafio letal (86-100%). Grupos imunizados com vacina comercial, bacterina ou pool+LigAc+FliCi apresentaram redução na colonização renal (0-28%). Dados sugerem aumento da expressão dos genes das citocinas de resposta Th1/Th2. Os resultados demonstram que novas formulações vacinais, compostas por proteínas recombinantes e flagelina FliCi como adjuvante, é um caminho promissor. / Leptospirosis is a global zoonotic disease caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira. In the present study, we evaluated the adjuvant activity of Salmonella enterica FliCi flagellin in the protective immunity induced by the LigAc and also by six other novel recombinant leptospiral outer membrane lipoproteins (OMP) of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Immunization of hamsters with LigAc or LigAc coadministered with OMPs cocktail, both with FliCi or Al(OH)3, induced robust antibody responses against recombinant proteins, and conferred protection after challenge (86-100%). Moreover, only groups inoculated with the commercial vaccine, bacterin or LigAc coadministered with OMPs cocktail and FliCi as adjuvant showed reduced bacterial load in kidneys (0-28%) with significant enhancement of gene expression of both Th1 and Th2 cytokines. Taken together, our data pave the way for the development of novel vaccine formulations against leptospirosis, using recombinant proteins and FliCi as adjuvant.

Atualmente várias substâncias estão sendo avaliadas quanto à sua possível atividade adjuvante, apresentando alta potência, mas também alta toxicidade, que os impede de serem introduzidos numa rotina clínica, como o lipopolissacarídio (LPS), componente da parede celular das bactérias Gram negativas. Estudos têm estimulado o desenvolvimento de derivados de LPS com propriedades potencialmente úteis, um dos exemplos mais conhecidos é o monofosforil lipídio A (MPL), desenvolvido como adjuvante para a aplicação em vacinas de uso humano. O objetivo deste estudo foi caracterizar um sub-produto do LPS de Bordetella pertussis (BpLipídioA), através do desenvolvimento e padronização de testes de controle de qualidade, visando a posterior utilização deste sub-produto como adjuvante vacinal. O conhecimento adquirido sobre o produto durante as fases de pesquisa e desenvolvimento conduziu à seleção de testes físico-químicos, biológicos e microbiológicos, bem como sua faixa de aceitação e limites de detecção. A atividade adjuvante deste produto foi realizada com a Vacina de Hepatite B Recombinante e apresentou resultados promissores. O BpLipídioA foi formulado em emulsão óleo em água, onde foi verificada a estabilidade deste composto. A utilização deste produto em emulsão ou suspensão apresentou-se possível e permite a redução da quantidade de antígeno na dose vacinal, o que aumenta a capacidade de produção das vacinas. / Currently a number of substances are being evaluated for possible adjuvant activity, with high power but also high toxicity, which prevents them from being introduced into clinical routine, such as lipopolysaccharide (LPS), cell wall component of Gram negative bacteria. The aim of this study was to characterize a byproduct of Bordetella pertussis LPS (BpLipídioA), through the development and standardization of quality control tests in order to later use this sub-product as an adjuvant vaccine. The knowledge about the product during all phases of research and development led to the selection of optimal physico-chemical, biological and microbiological tests as well as its acceptable range and detection limits. The adjuvant activity of this product was performed with the recombinant hepatitis B vaccine, which showed promissory results. Using this product in emulsion or suspension forms had to be possible to reduce the amount of antigen in the vaccine dose, which increases the installed production capacity of vaccines.

Peptídeos de defesa do hospedeiro antimicrobiano (PDHA) são componentes do sistema imune inato podem ser expressos constitutivamente ou induzidos por componentes bacterianos, citocinas, ou a combinação de ambos. Estes peptídeos possuem ação direta sobre microrganismo e são potentes imunomoduladores de células de mamíferos. A microplusina é um peptídeo antimicrobiano quelante de cobre, originário do aracnídeo Tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus, com massa molecular de 10 204 Da. Este peptídeo possue atividade bacteriostática sobre Micrococcus luteus, mas sem atividade microbicida sobre E. coli e Candida albicans. Neste trabalho foi analisado o efeito direto da microplusina em cultura de macrófagos derivados de medula óssea (MDM) tratados ou não com LPS ou IFN-&#947. Foi demonstrado que este peptídeo não teve efeito citotóxico para macrófagos, não estimulou a síntese de NO e IL-1&#946, mas aumentou a produção de TNF-&#945 e IL-6 após estímulo. O pré-tratamento dos macrófagos com microplusina, antes da adição do LPS, não modificou o nível de nitrito, TNF-&#945 ou IL-6 em resposta ao LPS. Quando os macrófagos foram pré-tratados com microplusina e posteriormente incubados com IFN-&#947 houve aumento significativo da produção de NO e TNF-&#945, confirmando a natureza pró-inflamatória deste peptídeo. Isto indica que a microplusina é um agente imunomodulador da resposta imune inata e pode auxiliar no controle de infecções por microrganismos patogênicos. / Antimicrobial host defense peptides are components of the innate immune system. They are expressed constitutively or induced by bacterial components, cytokines or the combination of both are expressed constitutively or induced by bacterial components, cytokines, or a combination of both. These peptides have direct action on microorganisms and are potent immunomodulators in mammalian cells. Microplusin is a copper II-chelating antimicrobial peptide from the Tick Rhipicephalus ( Boophilus) microplus, with a molecular mass of 10 204 Da. This peptide has a bacteriostatic activity against Micrococcus luteus, but no activity against E. coli and Candida albicans. The aim of the present work was to analyze the direct effect of microplusin in the culture of murine bone marrow derivated macrophages (BDM) treated or not with LPS or IFN-&#947. Our data showed that microplusin had no cytotoxic effect on macrophages, did not stimulate the synthesis of NO and IL-1&#946, but increased the production of TNF-&#945 and IL-6 after stimulation. The pre-treatment of macrophages with microplusin before LPS addition did not change the level of nitrite, TNF-&#945 or IL-6 in response to LPS. If the microplusin pre-treated macrophages were incubated with IFN-&#947 there was evidence that microplusin led to significant increase of NO and TNF-&#945 production confirming the pro-inflammatory characteristic of microplusin and its potential against pathogenic microorganisms. This indicates microplusin to be a potential immunomodulating agent of innate immunity and may help to control infections by pathogenic microorganisms.

Peptídeos de defesa do hospedeiro antimicrobiano (PDHA) são componentes do sistema imune inato podem ser expressos constitutivamente ou induzidos por componentes bacterianos, citocinas, ou a combinação de ambos. Estes peptídeos possuem ação direta sobre microrganismo e são potentes imunomoduladores de células de mamíferos. A microplusina é um peptídeo antimicrobiano quelante de cobre, originário do aracnídeo Tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus, com massa molecular de 10 204 Da. Este peptídeo possue atividade bacteriostática sobre Micrococcus luteus, mas sem atividade microbicida sobre E. coli e Candida albicans. Neste trabalho foi analisado o efeito direto da microplusina em cultura de macrófagos derivados de medula óssea (MDM) tratados ou não com LPS ou IFN-&#947. Foi demonstrado que este peptídeo não teve efeito citotóxico para macrófagos, não estimulou a síntese de NO e IL-1&#946, mas aumentou a produção de TNF-&#945 e IL-6 após estímulo. O pré-tratamento dos macrófagos com microplusina, antes da adição do LPS, não modificou o nível de nitrito, TNF-&#945 ou IL-6 em resposta ao LPS. Quando os macrófagos foram pré-tratados com microplusina e posteriormente incubados com IFN-&#947 houve aumento significativo da produção de NO e TNF-&#945, confirmando a natureza pró-inflamatória deste peptídeo. Isto indica que a microplusina é um agente imunomodulador da resposta imune inata e pode auxiliar no controle de infecções por microrganismos patogênicos. / Antimicrobial host defense peptides are components of the innate immune system. They are expressed constitutively or induced by bacterial components, cytokines or the combination of both are expressed constitutively or induced by bacterial components, cytokines, or a combination of both. These peptides have direct action on microorganisms and are potent immunomodulators in mammalian cells. Microplusin is a copper II-chelating antimicrobial peptide from the Tick Rhipicephalus ( Boophilus) microplus, with a molecular mass of 10 204 Da. This peptide has a bacteriostatic activity against Micrococcus luteus, but no activity against E. coli and Candida albicans. The aim of the present work was to analyze the direct effect of microplusin in the culture of murine bone marrow derivated macrophages (BDM) treated or not with LPS or IFN-&#947. Our data showed that microplusin had no cytotoxic effect on macrophages, did not stimulate the synthesis of NO and IL-1&#946, but increased the production of TNF-&#945 and IL-6 after stimulation. The pre-treatment of macrophages with microplusin before LPS addition did not change the level of nitrite, TNF-&#945 or IL-6 in response to LPS. If the microplusin pre-treated macrophages were incubated with IFN-&#947 there was evidence that microplusin led to significant increase of NO and TNF-&#945 production confirming the pro-inflammatory characteristic of microplusin and its potential against pathogenic microorganisms. This indicates microplusin to be a potential immunomodulating agent of innate immunity and may help to control infections by pathogenic microorganisms.

Atualmente várias substâncias estão sendo avaliadas quanto à sua possível atividade adjuvante, apresentando alta potência, mas também alta toxicidade, que os impede de serem introduzidos numa rotina clínica, como o lipopolissacarídio (LPS), componente da parede celular das bactérias Gram negativas. Estudos têm estimulado o desenvolvimento de derivados de LPS com propriedades potencialmente úteis, um dos exemplos mais conhecidos é o monofosforil lipídio A (MPL), desenvolvido como adjuvante para a aplicação em vacinas de uso humano. O objetivo deste estudo foi caracterizar um sub-produto do LPS de Bordetella pertussis (BpLipídioA), através do desenvolvimento e padronização de testes de controle de qualidade, visando a posterior utilização deste sub-produto como adjuvante vacinal. O conhecimento adquirido sobre o produto durante as fases de pesquisa e desenvolvimento conduziu à seleção de testes físico-químicos, biológicos e microbiológicos, bem como sua faixa de aceitação e limites de detecção. A atividade adjuvante deste produto foi realizada com a Vacina de Hepatite B Recombinante e apresentou resultados promissores. O BpLipídioA foi formulado em emulsão óleo em água, onde foi verificada a estabilidade deste composto. A utilização deste produto em emulsão ou suspensão apresentou-se possível e permite a redução da quantidade de antígeno na dose vacinal, o que aumenta a capacidade de produção das vacinas. / Currently a number of substances are being evaluated for possible adjuvant activity, with high power but also high toxicity, which prevents them from being introduced into clinical routine, such as lipopolysaccharide (LPS), cell wall component of Gram negative bacteria. The aim of this study was to characterize a byproduct of Bordetella pertussis LPS (BpLipídioA), through the development and standardization of quality control tests in order to later use this sub-product as an adjuvant vaccine. The knowledge about the product during all phases of research and development led to the selection of optimal physico-chemical, biological and microbiological tests as well as its acceptable range and detection limits. The adjuvant activity of this product was performed with the recombinant hepatitis B vaccine, which showed promissory results. Using this product in emulsion or suspension forms had to be possible to reduce the amount of antigen in the vaccine dose, which increases the installed production capacity of vaccines.