O vírus da cinomose canina (CDV) e o vírus parainfluenza canino (CPIV) afetam uma ampla variedade de hospedeiros e encontram-se distribuídos mundialmente. O CDV é considerado um dos mais importantes agentes infecciosos dentro das populações caninas. Este vírus é o agente causal da cinomose, uma doença potencialmente letal em membros das famílias Canidae, Mustelidae e Procionidae, sendo recentemente detectado como causa de morbidade e mortalidade em carnívoros aquáticos e grandes felinos. O CPIV, por sua vez, é altamente contagioso entre cães, podendo infectar roedores e gatos em infecções experimentais. Geralmente, o CPIV produz uma traqueobronquite aguda auto-limitante, porém pode atuar sinergicamente com outros agentes infecciosos, como o CDV, causando sinais clínicos mais graves. Como em nosso meio são escassas as informações sobre estes vírus, o presente estudo visou aprofundar os conhecimentos sobre a prevalência de CDV e CPIV em cães e felinos silvestres mantidos em cativeiro. Para tanto, soros destes animais foram testados em busca de anticorpos neutralizantes contra amostras padrão do CDV (Rockborn e Snyder Hill) e do CPIV (V660). Inicialmente, foram testados soros de 173 cães de rua mantidos em canis municipais em Novo Hamburgo e Porto Alegre, RS. A prevalência de anticorpos neutralizantes anti-CDV frente às amostras de vírus da cinomose Rockborn e Snyder Hill, foi de 9,3 % e 4,1 %, respectivamente. Somente dois cães apresentaram títulos de anticorpos considerados protetores contra CDV Rockborn (igual ou maior que 100) e nenhum soro apresentou título de anticorpos neutralizantes considerado protetor para a amostra Snyder Hill (igual ou maior que 100). Contra a amostra de parainfluenza canino V660, a prevalência de anticorpos neutralizantes encontrada foi de 51,4 %. Conclui-se, portanto, que a população de cães de rua amostrada apresenta poucos indícios de contato prévio com CDV, sugerindo grande susceptibilidade à cinomose. Por outro lado, o CPIV parece circular amplamente nesta população. Na segunda parte do presente estudo, como no Brasil não existem relatos sobre CDV e CPIV em felinos silvestres, buscou-se verificar a possibilidade da ocorrência dessas infecções em felinos silvestres brasileiros. Para tanto, foram testados soros de 84 felinos silvestres de seis diferentes espécies nativas do Brasil (Leopardus tigrinus, Puma concolor, Leopardus wiedii, Herpailurus yaguarondi, Panthera onca), todos mantidos em cativeiro em criatórios de distintas regiões do País. Todos os felinos amostrados apresentaram-se soronegativos frente às amostras de CDV e CPIV utilizadas. Estes resultados indicam que CDV e CPIV parecem não circular nas populações de felinos silvestres amostradas. / Canine distemper virus (CDV) and canine parainfluenza virus (CPIV) infect a great variety of hosts ranges and are distributed worldwide. CDV is one of the most important infectious agents in dogs. This virus may cause potentially lethal disease among members of the Canidae, Mustelidae and Procionidae families. It has also caused diseases of significant morbidity and mortality in aquatic carnivores and large felids. CPIV, on its turn, is highly contagious among dogs, whilst rodents and cats are susceptible to experimental infections. CPIV is usually associated with an acute selflimiting tracheobronchitis. However, it can act sinergistically with other infectious agents, such as CDV, and cause clinical signs of variable severity. As information on CDV and CPIV infections in our millieu are scarce, this study was carried out aiming to increase knowledge on the prevalence of CDV and CPIV in stray dogs as well as in captive Brazilian wild felids. In order to have an estimate on such prevalences, sera from these animals were tested for neutralizing antibodies to CDV strains Rockborn and Snyder Hill, and to CPIV strain V660. Initially, 173 sera from stray dogs kept in kennels from the municipalities of Novo Hamburgo and Porto Alegre, RS, were examined. The prevalences of neutralizing antibodies to CDV strains Rockborn and Snyder Hill were 9.3 % and 4.1 %, respectively. Only two dogs had antibody levels which could be correlated to protection (that is, titre ≥ 100) to CDV Rockborn whereas no sera presented antibody titres high enough to be considered protective to CDV strain Snyder Hill (that is, titre ≥ 100). Regarding CPIV, the prevalence of anti-V660 neutralizing antibodies was 51.4 %. It can be concluded that the stray dog populations under study shows few serological evidence of previous contact with CDV and seem largely susceptible to CDV infections. On the other hand, CPIV seems to circulate widely in the examined population. In the second part of this study, as there are no reports on CDV and CPIV infections in wild felids in Brazil, it was aimed to determine whether there would be any evidence of such infections among some of such species. For that, 84 sera from wild felids of six different Brazilian native species (Leopardus tigrinus, Puma concolor, Leopardus wiedii, Herpailurus yaguarondi, Panthera onca), all kept in captivity in different regions of the country, were tested for neutralizing antibodies to both CDV and CPIV. All wild felid sera tested were negative for antibodies to the two strains of CDV as well as to CPIV. These results indicate that CDV and CPIV do not seem to circulate among the wild felid populations examined.

The hantaviruses are among the most important zoonotic pathogens of humans, especially due to high fatality, those associated with Hantavirus Pulmonary Syndrome (HPS). In Brazil, more than 1600 cases of HPS have been confirmed since 1993, with a fatality rate of 40%. The viral genotypes associated with HPS in humans, as well as those present in wild rodents were investigated in an endemic area of the state of Minas Gerais in this study. Furthermore, the seroprevalence for hantaviruses, the karyotyping of rodent species captured and the population dynamics of these animals on the Cerrado vegetation types were also evaluated in an ecoepidemiological approach. The ELISA and / or RT-PCR were used to test sera from human cases of SPH and wild rodents and rodent lung fragments. In our study, six patients were evaluated, of these six (100%) were seroreactive in ELISA in six (100%) was possible to amplify viral genetic material and in five (83.3%) was possible sequencing. Were observed in all the viral genotype Araraquara (ARAV), but with the formation of two well-defined clusters. The case fatality rate was 50%. Regarding rodents, 258 specimens were captured. Nine taxa were identified to species level and seven in genus level, all belonging to the subfamily Sigmodontinae. Necromys lasiurus was the most abundant (70.2). We observed a greater diversity of rodents in a fitofisionomy called semi-deciduous dry forest (07 taxa in species level and four in genus level). The winter dry season was associated with the highest capture success (p <0.0001). There was a higher prevalence of pregnancy during the rainy season (p <0.0001). There was a prevalence of IgG antibodies against hantavirus of 1.6%, all specimens of N. lasiurus. Among the four seroreactive rodents, three (75%) was possible to amplify viral genetic material and two (50%) was possible sequencing. Only ARAV viral genotype was observed. Samples of rodents had higher phylogenetic identity with the genotype sequenced of the human sample of Uberlândia, Minas Gerais, where the rodents were also captured. Samples identified with ARAV analyzed in this study were distributed at a distance of approximately 400 kilometers. Despite the geographical distance, we observed a high phylogenetic identity between two samples 384 km distant from each other. The environmental and demographic changes that have occurred in recent decades in the study area affected the ecology of wild rodents and facilitated the occurrence of hantavirus infections in humans and the emergence of HPS in this region, mainly ARAV transmitted by N. lasiurus. The observation in this study only the genotype ARAV in specimens of N. lasiurus and humans, does not exclude the possibility of co-circulation of other viral genotypes in this area, beyond the possibility of the existence of other reservoirs of hantaviruses, including non-rodents. / Os hantavírus estão entre os patógenos zoonóticos mais importantes para o homem, especialmente devido a alta letalidade, daqueles associados à Síndrome Pulmonar por hantavírus (SPH). No Brasil, mais de 1600 casos de SPH foram confirmados desde 1993, com uma taxa de letalidade de 40%. Os genótipos virais associados à SPH em humanos, bem como os presentes nos roedores silvestres foram investigados em uma área endêmica do estado de Minas Gerais neste estudo. Além disso, a soroprevalência para hantavírus, a cariotipagem das espécies de roedores capturadas e a dinâmica populacional destes animais nas fitofisionomias do Cerrado também foram avaliadas em uma abordagem ecoepidemiológica. O ELISA e/ou o RT-PCR foram utilizados para testar amostras de soro de casos humanos suspeitos de SPH e de roedores silvestres e fragmentos de pulmão de roedores. Em nossa casuística, seis pacientes foram avaliados, destes (100%) foram sororreativos no ELISA, e em seis (100%) foi possível amplificar material genético viral e em cinco (83,3%) foi possível o sequenciamento. Em todos foram observados o genótipo viral Araraquara (ARAV), porém com a formação de dois clusters bem definidos. A taxa de letalidade dos casos foi de 50%. Em relação aos roedores, 258 espécimes foram capturados. Nove táxons foram identificados a nível específico e sete a nível genérico, todos pertencentes à subfamília Sigmodontinae. Necromys lasiurus foi a espécie mais capturada (70,2). Foi observada maior diversidade de roedores na fitofisionomia Mata seca semidecídua (07 táxons a nível específico e quatro a nível genérico), A estação inverno seco esteve relacionada com o maior sucesso de captura (p < 0,0001). Houve maior prevalência de prenhez durante a estação chuvosa (p<0,0001). Observou-se uma prevalência de anticorpos IgG contra hantavírus de 1,6%, todos espécimes de N. lasiurus. Dentre os quatro roedores sororreativos, em três (75%) foi possível amplificar material genético viral e em dois (50%) foi possível o sequenciamento. Somente o genótipo viral ARAV foi observado. Estes tiveram maior identidade filogenética com o genótipo viral sequenciado de uma amostra humana do município de Uberlândia-MG, local onde também os roedores foram capturados. As amostras identificadas com ARAV analisados no presente estudo foram distribuídas a uma distância de aproximadamente 400 quilômetros. Apesar da distância geográfica, observamos uma alta identidade filogenética entre duas amostras distantes 384 km entre si. As alterações ambientais e demográficas ocorridas nas últimas décadas na área de estudo afetou a ecologia dos roedores silvestres e facilitou a ocorrência de infecções humanas por hantavírus e a emergência da SPH nesta região, principalmente por ARAV transmitido por N. lasiurus. A observação neste estudo apenas do genótipo ARAV em espécimes de N. lasiurus e humanos, não exclui a possibilidade de cocirculação de outros genótipos virais nesta área, além da possibilidade da existência de outros reservatórios de hantavírus, inclusive não roedores. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Visando contribuir com a descrição da diversidade e ecologia de carrapatos e riquétsias no Cerrado brasileiro, este estudo foi conduzido em uma fazenda particular e suas imediações em Araguapaz, Goiás. O trabalho foi realizado durante quatro anos em 11 coletas, sendo oito em estações consecutivas em três fitofisionomias distintas. Coletou-se carrapatos do ambiente, de animais domésticos, aves e pequenos mamíferos silvestres e, em uma amostra destes, procurou-se por DNA de riquétsias. No ambiente foram coletados Amblyomma sculptum, A. ovale, A. parvum, A. naponense, A. rotundatum e Ornithodoros sp. O ambiente com infestação mais intensa e diversa foi a Mata de Galeria e o carrapato A. sculptum exibiu uma distribuição sazonal bem definida com larvas e ninfas prevalecendo nas estações mais secas e adultos nas mais úmidas. Em cães foram encontrados A. sculptum, A. ovale, A. parvum e Rhipicephalus sanguineus; em equídeos A. sculptum, Dermacentor nitens e R.(Boophilus) microplus; em bovinos R. (Boophilus) microplus e A. sculptum. Nas aves silvestres foram coletadas ninfas de A. sculptum e A. nodosum. Nos pequenos roedores coletou ninfas de A. parvum, larvas de Amblyomma spp e larvas de Ornithodoros sp. Coletas fortuitas em répteis, resultaram em ninfas e adultos de A. rotundatum e larvas de Amblyomma sp. Duas espécies de riquetsias do grupo da febre maculosa foram identificadas R. amblyommii e candidatus R. andeanae ambas em A. parvum e R. bellii em A. rotundatum. O carrapato Ornithodoros sp encontrado diverge morfologicamente e geneticamente das espécies conhecidas constituindo-se em uma nova espécie. De forma global ficou evidente que os animais na área estudada são expostos a uma diversidade maior de macroparasitos (carrapatos) e microparasitos (bactérias) do que em áreas muito mais antropizadas. O papel desta diversidade maior no desenvolvimento de doenças, na prevenção destas, merece investigações adicionais. / Aiming contributing to the description of species and of the ecology of ticks and Rickettsia in the Cerrado (savannah) this research was conducted in private farm and surroundings in Araguapaz county, Goiás. Overall eleven samplings, eight in consecutive seasons in three phytofisiognomies, were done along four years. Ticks were collected from the environment, domestic animals, birds and small mammals and Rickettsia DNA was searched for in a sample of this ectoparasites. Amblyomma sculptum, A. ovale, A. parvum, A. naponense, A. rotundatum and Ornithodoros sp. were collected from the environment and gallery forests exhibited the overall highest infestation and tick species diversity. A. sculptum ticks exhibited a seasonal pattern with larvae and nymphs prevailing in the driest seasons and adults in most humid ones. Dogs were parasitized by A. sculptum, A. ovale, A. parvum and Rhipicephalus sanguineus; horses by A. sculptum, Dermacentor nitens and Rhipicephalus (Boophilus) microplus; cattle by Rhipicephalus (Boophilus) microplus, and A. sculptum. A. sculptum and A. nodosum nymphs were collected from birds and A. parvum nymphs, Amblyomma sp. and Ornithodoros sp. larvae from small mammals. Unplanned tick collections from reptiles yielded A. rotundatum nymphs and adults as well as Amblyomma sp. larvae. Two spotted fever Rickettsia species were identified; R. amblyommii and candidatus R. andeanae both in A. parvum as well as R. bellii in A. rotundatum. The Ornithodoros sp. tick found diverge both morphologically and genetically from known species and a new tick species may be supposed. Broadly it is evident that in the studied area animals are exposed to a higher macroparasite (ticks) and microparasites (bactéria) that those from more anthroposized areas. The role of such higher parasite diversity in the development or prevention of diseases should be further investigated. / Tese (Doutorado)

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A estrongiloidíase humana é uma parasitose intestinal negligenciada com ampla distribuição mundial, podendo acarretar cronificação e hiperinfecção caso não seja diagnosticada precocemente. Os casos que merecem mais atenção são aqueles relacionados, principalmente, à pacientes imunocomprometidos. O diagnóstico parasitológico desta helmintose é pouco sensível devido a eliminação pequena e irregular de larvas nas fezes. Os métodos imunológicos, principalmente enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), apresentam elevada sensibilidade e especificidade. No entanto há sempre a necessidade de aprimorar e elevar a eficiência diagnóstica para evitar reatividade-cruzada e casos de resultados falsos-negativos. O objetivo deste estudo foi de produzir e padronizar antígenos de excreção/secreção (E/S) de larvas filarioides (L3) de Strongyloides venezuelensis para uso no imunodiagnóstico. As larvas L3 de S. venezuelensis foram obtidas para a produção de extrato salino total (SE), E/S no meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) e E/S em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Todos os antígenos foram utilizados na detecção de IgG anti-S. stercoralis em doentes com e sem condições imunossupressoras. Utilizaram-se 150 amostras de soro humano, divididas em 5 grupos. Indivíduos imunocompetentes positivos para estrongiloidíase (n = 30) ou negativos para estrongiloidíase (n = 30); Pacientes com outros parasitas (n = 30), como ancilostomídeos, Ascaris lumbricoides, Hymenolepis nana, Giardia lamblia, Schistosoma mansoni, Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura e Taenia sp; pacientes imunossuprimidos positivos para estrongiloidíase (N = 30), incluindo HIV, diabetes, alcoólatras, tuberculose, câncer e alcoólatras com câncer e pacientes imunossuprimidos negativos para parasitas intestinais (n = 30), incluindo HIV, diabetes, alcoolistas, tuberculose e câncer. Observou-se que todos os antígenos apresentaram frações antigênicas semelhantes com peso molecular de 62, 44, 39, 33 e 18 kDa. No entanto, quando utilizados em teste ELISA os antígenos E/S tanto em meio RPMI quanto em PBS apresentaram-se mais específicos que o SE, 94,4%, 96,7% e 77,8% respectivamente, enquanto que o antígeno E/S em PBS foi mais sensível (95,0%) que os outros dois antígenos (SE 93,3% e RPMI 86,7%). Os antígenos E/S apresentaram-se de fácil execução e o produto E/S em PBS mostrou-se mais sensível e específico que os demais antígenos em estudo. Concluiu-se que, o antígeno E/S em PBS é uma boa alternativa para diagnóstico mais sensível e específico da estrongiloidíase humana. / Human strongyloidiasis is a neglected intestinal parasitosis, with a large worldwide distribution, affecting millions of people, and may lead to chronification and hyperinfection if not diagnosed early. The cases that deserve more attention are those related, mainly, to immunocompromised patients. The parasitological diagnosis of this helminth is not very sensitive due to the small and irregular larval output in the faeces. Immunological methods, especially enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), present high sensitivity and specificity, however, there is always a need to improve and increase diagnostic efficiency to avoid cross-reactivity and cases of false-negative results. The aim of this study was to produce and standardize excretion/secretion (E/S) antigens of filarial larvae (L3) of Strongyloides venezuelensis for immunodiagnostic use. The L3 larvae of S. venezuelensis were obtained for the production of total saline extract (SE), E/S in Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) and E/S in phosphate-buffered saline (PBS). All antigens were used in the detection of IgG anti- S. stercoralis in patients with and without immunosuppressive conditions. A total of 150 human serum samples were used, divided into 5 groups. Immunocompetent individuals positive for strongyloidiasis (n=30) or negatives for strongyloidiasis (n=30); patients with others parasites (n=30) such as hookworms, Ascaris lumbricoides, Hymenolepis nana, Giardia lamblia, Schistosoma mansoni, Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura and Taenia sp; immunosuppressed patients positive for strongyloidiasis (n=30), including HIV, diabetes, alcoholics, tuberculosis, cancer, and alcoholics with cancer and negative immunosuppressed patients for intestinal parasites (n=30) including HIV, diabetes, alcoholics, tuberculosis and cancer. All antigens were observed to have similar antigenic fractions having molecular weights of 62, 44, 39, 33 and 18 kDa. However, when used in the ELISA test the E/S antigens in both RPMI and PBS media were more specific than SE, 94.4%, 96.7% and 77.8%, respectively, whereas the antigen E/S in PBS was more sensitive (95.0%) than the other two antigens (SE 93.3% and RPMI 86.7%). The E/S antigens were easy to perform and the E/S product in PBS was more sensitive and specific than the other antigens in the study. It may conclude that the E/S in PBS antigen is a good alternative for a more sensitive and specific diagnosis of human strongyloidiasis. / Dissertação (Mestrado)

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Toxoplasmosis is an important zoonotic disease due to ability of its causal agent, Toxoplasma gondii, to infect large number of vertebrates and to be associated with congenital infection or opportunistic disease in immunosuppressed patients. As the traditional treatment has shown adverse effects, low-toxicity compounds including artemisinin and its derivatives have been researched, as well Artemisina annua tea infusion. The use of silicon in the soil of A. annua crops and its role on artemisinin content has not been studied yet. This study aimed to investigate the effects of silicon on A. annua plant physiology and the role of the tea infusion obtained from these plants in the control of T. gondii infection in cell culture. The experimental design was a completely randomized design (CRD), in which A. annua was planted in the soil with five different doses of calcium/magnesium silicate (0, 200, 400, 800 and 1600 kg ha-1) and five replications, and maintained in a greenhouse. Analysis of foliar macronutrients showed a significant increase only for nitrogen, in the presence of the highest dose of silicate in the soil. The foliar micronutrient and Si concentrations as well the plant height were not significantly changed with any silicate doses in the soil. The use of 400 kg ha-1 of silicate induced the highest total glandular trichome area that was also associated with the intact glandular trichomes, as observed by scanning electron microscopy, and with the highest artemisinin content in plant leaves and tea infusion, as determined by thin layer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography (HPLC), respectively. HeLa cell treatments along with or after T. gondii infection, with infusion of A. annua grown in the soil without or with silicate (400 kg ha-1), induced a decrease of parasite proliferation in a dose-dependent manner, as also seen for cell treatment with pure artemisinin. In conclusion, the use of silicon had positive effect on the glandular trichome areas and artemisinin contents, but this outcome was not associated with a better efficacy of A. annua tea infusion on T. gondii replication. These findings suggest that other components rather than artemisinin could be contributing to this effect, such as flavonoids present in its leaves, which may act in synergism with the artemisinin and improve its efficacy. / A toxoplasmose é uma zoonose importante devido à capacidade de seu agente causal, Toxoplasma gondii, de infectar um grande número de vertebrados e ser associada com infecção congênita ou doença oportunista em pacientes imunocomprometidos. O tratamento tradicional mostra efeitos adversos levando à pesquisa de compostos de baixa toxicidade como a artemisinina, seus derivados e a infusão da planta Artemisia annua. A utilização de silício no solo de culturas de A. annua e seu papel no conteúdo de artemisinina ainda não foram estudados. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do silício sobre a fisiologia da planta A. annua e o papel da infusão destas plantas sobre o controle da infecção de T. gondii em cultura celular. Foi utilizado o delineamento inteiramente ao acaso (DIC), no qual A. annua foi plantada em solo com aplicação de cinco diferentes dosagens de silicato de cálcio/magnésio (0, 200, 400, 800 e 1600 kg ha-1), em cinco repetições e mantida em casa de vegetação. A análise de macronutrientes foliares mostrou um aumento significativo apenas para o nitrogênio, na presença da maior dosagem de silicato no solo. As quantidades de micronutrientes e silício foliares bem como a altura da planta não foram significativamente alteradas em quaisquer dosagens de silicato no solo. A aplicação de 400 kg ha-1 de silicato induziu a maior área de tricomas glandulares totais que foi associada com os tricomas glandulares intactos, como observado por microscopia eletrônica de varredura, e com o mais alto conteúdo de artemisinina nas folhas e na infusão da planta, como determinado por cromatografia em camada fina (TLC) e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), respectivamente. Os tratamentos de células HeLa, simultaneamente ou após a infecção por T. gondii, com infusão de A. annua cultivada sem ou com silicato (400 kg ha-1) aplicado ao solo, induziram decréscimo dependente da dose na proliferação parasitária, como também verificado para o tratamento das células com artemisinina pura. Em conclusão, o uso de silício teve efeito positivo sobre as áreas de tricomas glandulares e seu conteúdo de artemisinina, mas este resultado não foi associado com melhor eficácia da infusão de A. annua sobre a replicação intracelular de T. gondii. Estes resultados sugerem que outros componentes além da artemisinina poderiam contribuir para este efeito, como os flavonóides presentes nas folhas de A. annua que podem atuar em sinergismo com a artemisinina e melhorar a sua eficácia. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Toxoplasma gondii infection in susceptible C57BL/6 mice induces a strong Th1 immune response causing intense inflammation and lesions in ileum in response to microbial antigens and if controlled causes death of animals. The Th1 immune response is similar to that in patients with inflammatory bowel disease (IBD) such as Crohn\'s disease (CD) and ulcerative colitis (UC). Therefore find alternative treatments that have adjuvant effect of conventional treatments are of great interest. The use of probiotics is increasing due to several benefits found in inflammatory diseases. To verify the effects of probiotics Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus acidophilus and Lactococcus lactis NCDO 2118 in C57BL/6 mice, we treat one day before and 7 days after oral infection with 30 cysts of the ME-49 strain. We found that L. casei- and L. acidophilus-treatment mice decreased intestinal parasitism reducing the pathology in small intestine of C57BL/6 mice and prevent death. In addition, the microbiological culture of organs shows L. casei- and L. acidophilus-treatment mice prevent bacterial translocation from the intestinal lumen to organs such as liver, spleen, lung and blood, moreover the microbiological analysis of feces showed that there were fewer gram negative bacteria species in feces of probiotic treated mice. The NAG, MPO and EPO assay that are characteristic of macrophages, and eosinophils neutrophils respectively showed that there was a decrease in the activity of enzymes MPO and NAG and a small increase in activity and EPO. Finally, the qPCR analysis revealed that treatment with L. acidophilus decreased IFN-&#947; and TNF-&#945; mRNA induced by infection with T. gondii and L.casei treatment increased the expression of Foxp3 and IL-10. Our results demonstrate the ability of probiotics to control the inflammation response and reduce mortality caused by ileitis. However, further studies are needed to find out what the precise mechanisms that probiotics L. casei and L. acidophilus modulate the host immune response. / A infecção por Toxoplasma gondii em camundongos susceptíveis C57BL/6 com 30 cistos da cepa ME-49 induz uma forte resposta do sistema imune do tipo Th1 causando uma intensa inflamação com lesão no íleo em resposta a antígenos da microbiota e se não for controlada causa a morte dos animais. Essa resposta é semelhante à encontrada em pacientes com doenças inflamatórias intestinais (IBD) como a doença de Crohn (CD) e colite ulcerativa (UC). Portanto encontrar tratamentos alternativos que tenham efeito adjuvante aos tratamentos convencionais é de grande interesse. O uso de probióticos em produtos fermentados vem aumentando devido aos vários benefícios encontrados em pacientes com doenças inflamatórias que utilizam esses produtos. Com o objetivo de investigar o efeito da administração dos probióticos Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus acidophilus e Lactococcus lactis NCDO 2118 no intestino delgado, tratamos camundongos C57BL/6 um dia antes e 7 dias depois da infecção oral com 30 cistos da cepa ME-49 de T. gondii. O tratamento com L. casei ou L. acidophilus diminuiu o parasitismo intestinal, reduziu a patologia associada ao intestino delgado e evitou a morte dos animais. Além disso, a cultura microbiológica dos órgãos revelou que L. casei e L. acidophilus foi capaz de impedir a translocação de bactérias do lúmen intestinal para órgãos como fígado, baço, pulmão e também para o sangue. O cultivo microbiológico das fezes mostrou que houve menos espécies de bactérias gram negativas encontradas nas fezes dos animais tratados com probióticos. A análise das enzimas NAG, MPO e EPO que são características de macrófagos, neutr´filos e eosinófilos, respectivamente mostrou que houve diminuição na atividade das enzimas MPO e NAG e um pequeno aumento na atividade e EPO. Por último, a análise em qPCR revelou que o tratamento com L. acidophilus diminuiu a expressão de IFN-&#947; e TNF-&#945; induzido pela infecção por T. gondii e o tratamento com L.casei aumentou a expressão de Foxp3 e IL-10. Esses resultados demonstram a capacidade dos probióticos em controlar a resposta inflamação e reduzir a mortalidade causada pela ileíte. Contudo, serão necessários mais estudos para descobrir quais os mecanismos precisos que os probióticos L. casei e L. acidophilus utilizam para modular a resposta imune em favor do hospedeiro. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Giardia duodenalis is one of the main causative agents of diarrhea worldwide, being transmitted by oral-fecal route. Giardiasis is usually self-limiting in immunocompetent individuals, indicating the presence of effective host defense mechanisms. The objective of that study was to determine the prepatent period and to evaluate the kinetics of elimination of cysts and the immune response humoral systemic (IgA, IgG1, IgG2a, IgM, IgE) and intestinal secretory (IgA) in gerbils (Meriones unguiculatus) inoculated, experimentally, with different doses of trophozoites of Giardia duodenalis, in the primary infection, reinfection, immunosuppression and reinfection/immunosuppression. We used 48 animals, 6-8 weeks old, distributed in 5 groups inoculated with different doses of trophozoites of G. duodenalis (101, 102, 103, 104 and 105) and a group control. Coproparasitology exams were carried out, daily, using the method of fluctuation in zinc sulfate 33%, to determine the prepatent period and the kinetics of elimination of cysts. Weekly, blood collections for retro-orbital puncture were performed and samples of feces were processed for obtaining of faecal extracts. In the 45th day after inoculation, the animals of each group were redistributed in 4 subgroups and submitted to the reinfection, immunosuppression or reinfection/immunosuppression. It was verified that all the gerbils inoculated with different trophozoites doses were susceptible to the primary infection, with prepatent period between 9 and 13 days. The reinfected animals didn't eliminate cysts and the immunosuppressed or reinfected/immunosuppressed again they presented recrudescence of the infection. The production of antibodies was induced by the parasite, although the systemics antibodies just reflect the stimulation of the immune response for G. duodenalis, since they don't act in the elimination of the parasite. In the reinfection it was observed fast production of both serum and secretory antibodies and the immunossuppressed animals they presented smaller levels of responsible antibodies for the control of the infection. Fecal IgA showed increase in the titles in the period in that absence of cysts was verified in the feces, could be correlated with the control of the giardiasis in this experimental model. / Giardia duodenalis é um dos principais agentes causadores de diarréia em todo o mundo, sendo transmitido por via oro-fecal. A giardíase é, usualmente, auto-limitante em indivíduos imunocompetentes, indicando a presença de mecanismos efetivos de defesa do hospedeiro. O objetivo desse estudo foi determinar o período pré-patente e avaliar a cinética de eliminação de cistos e a resposta imune humoral sistêmica (IgA, IgG1, IgG2a, IgM, IgE) e secretora intestinal (IgA) em gerbils (Meriones unguiculatus) inoculados, experimentalmente, com diferentes doses de trofozoítos de Giardia duodenalis, na infecção primária, reinfecção, imunossupressão e reinfecção/imunossupressão. Foram utilizados 48 animais, com idade entre 6 e 8 semanas, distribuídos em 5 grupos inoculados com diferentes doses de trofozoítos de G. duodenalis (101, 102, 103, 104 e 105) e um grupo controle. Exames coproparasitológicos foram realizados, diariamente, utilizando método de flutuação em sulfato de zinco a 33%, para determinar o período pré-patente e a cinética de eliminação de cistos. Semanalmente, coletas sanguíneas por punção retro-orbital foram realizadas e amostras de fezes foram processadas para obtenção de extratos fecais. No 45º dia após inoculação, os animais de cada grupo foram redistribuídos em 4 subgrupos e submetidos à reinfecção, imunossupressão ou reinfecção/imunossupressão. Verificou-se que todos os gerbils inoculados com diferentes doses de trofozoítos mostraram-se susceptíveis à infecção primária, com período pré-patente entre 9 e 13 dias. Os animais reinfectados não voltaram a eliminar cistos e os imunossuprimidos ou reinfectados/imunossuprimidos apresentaram recrudescência da infecção. A produção de anticorpos foi induzida pelo parasito, embora os sistêmicos apenas reflitam a estimulação da resposta imune por G. duodenalis, já que não atuam na eliminação do parasito. Na reinfecção foi observada rápida produção de anticorpos séricos e secretores e os animais imunossuprimidos apresentaram baixos níveis de anticorpos responsáveis pelo controle da infecção. A IgA fecal mostrou aumento nos títulos no período em que se verificou ausência de cistos nas fezes, podendo estar correlacionada com o controle da giardíase neste modelo experimental. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Neurocysticercosis (NC) is a polymorphic disease and the immune response in human carrier is heterogenic. In this study, 35 primers were used for amplifications by Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) of Taenia solium metacestodes, from five different geographic areas in Brazil: 1) Distrito Federal (DF), Center West; 2) Barreiras (BA), Northeast and Southeast; 3) Hydro Basin of the Mosquito River (North of Minas Gerais, RM-MG), 4) São Paulo (SP) and 5) Uberaba (Minas Gerais, UB-MG). Metacestodes saline crude extracts of four populations (DF, BA, RM-MG e SP) were used for the detection of specific IgG antibodies by ELISA and Western Blotting (WB). A total of 157 serum samples of three groups, (G1): 49 NC patients; (G2): 68 patients with other helminthiasis: hydatidosis (10), taeniasis (20), strongyloidiasis (20), schistosomiasis (10) and hymenolepiasis (8); and (G3): 40 healthy individuals; were analyzed by ELISA. From these, the 98 serum samples were assayed by WB; G1 (49), G2 (39) and G3 (10). The genetic distances, in disagreement percentage, between the metacestode populations were calculated from of 15 RAPD markers and showed 49.5% (DF), 48% (BA), 38.5% (UBMG) and 28% (RM-MG and SP) of genetic distances. Six primers identified polymorphic fragments and the primers 26 (GGGTTTGGCA) and 29 (TCGCCAGCCA) allowed a better differentiation of populations. The fragments of 1000, 500 and 326 pb (pairs of bases) in the UB-MG and of 600 and 244 pb in RM-MG were amplified by primer 26. The fragments generated by primer 29 were 500, 800 and 1191 pb, 300 and 1377 pb, 1000 pb and 244 and 434 pb in SP, UB-MG, DF and BA populations, respectively. In G1, the positivity by ELISA was: 90% (DF), 69% (BA), 71% (MG) and 67% (SP). The DF extract was more antigenic than others (p=0.02). In WB, the 64-68 kDa antigens were recognized in all extracts, exclusively, in serum samples from active NC patients (p=0.001). Variation in banding pattern was detected between the extracts (p<0.05). In G2, the serum samples of hydatidosis patients presented from 70 to 90% positivity by ELISA in antigenic extracts (p<0.05); however, the bands recognition pattern in WB was different from that presented in G1 samples. The 77 kDa band was significantly identified in hydatidosis samples (p=0.0001). In conclusion, the T. solium populations analyzed showed genetic variability and antigenic differences. / A neurocisticercose (NC) constitui doença polimórfica, apresentando heterogeneidade da resposta imune no hospedeiro humano. Nesse estudo, o teste Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) foi utilizado com 35 primers na detecção de polimorfismo em metacestódeos de Taenia solium provenientes de cinco áreas geográficas distintas do Brasil: 1) Distrito Federal (DF), região Centro-Oeste; 2) Barreiras (BA), região nordeste e da região sudeste: 3) Bacia Hidrográfica do Rio Mosquito (norte de Minas Gerais, RM-MG), 4) São Paulo (SP) e 5) Uberaba (Minas Gerais, UB-MG). Os extratos salinos totais de metacestódeos de quatro populações (DF, BA, RM-MG e SP) foram utilizados na detecção de anticorpos IgG específicos pelo ELISA e Western Blotting (WB). As 157 amostras de soro de três grupos (G) de indivíduos: G1: 49 pacientes com NC; G2: 68 pacientes com outras helmintíases, sendo hidatidose (10), teníase (20), estrongiloidíase (20), esquistossomose (10) e himenolepíase (8) e G3: 40 indivíduos saudáveis (controles); foram analisadas pelo ELISA. Foram ensaiadas 98 amostras de soro: G1 (49), G2 (39) e G3 (10) pelo WB. As distâncias genéticas, por porcentagem de desacordo, foram de 49,5% (DF), 48% (BA), 38,5% (UB-MG) e 28% (RM-MG e SP) nas populações de metacestódeos, calculadas a partir de 15 marcadores de RAPD. Seis primers geraram fragmentos polimórficos nos isolados analisados, sendo que os primers 26 (GGGTTTGGCA) e 29 (TCGCCAGCCA) permitiram melhor diferenciação entre as populações, o primer 26 gerou os fragmentos de 1000, 500 e 326 pb (pares de bases) na amostra de UB-MG, e de 600 e 244 pb em RM-MG. O 29 gerou fragmentos em quatro das populações analisadas, sendo 500, 800 e 1191 pb em SP, 300 e 1377 pb em UBMG, 1000 pb no DF e 244 e 434 pb na BA. No G1, as freqüências de positividade no ELISA, foram: 90% (DF), 69% (BA), 71% (MG) e 67% (SP), sendo o extrato do DF mais antigênico que os demais (p = 0,02). No WB, o peptídeo de 64-68 kDa foi reconhecido em todos os extratos, exclusivamente, em amostras de pacientes com NC ativa (p=0,001). Detectou-se variação no padrão de reconhecimento de bandas entre os extratos (p<0,05). No G2, as amostras de soro de pacientes com hidatidose apresentaram de 70 a 90% de positividade no ELISA frente aos extratos analisados (p<0,05); porém, o padrão de reconhecimento de bandas no WB diferiu do apresentado pelas amostras do G1, sendo que a banda de 77 kDa foi significativamente identificada pelas amostras de pacientes com hidatidose (p=0,0001). Concluiu-se que as populações de T. solium analisadas nesse estudo, apresentaram variabilidade genética e diferenças de antigenicidade. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The purpose of this study is to evaluate the amount of transcripts from the Major Histocompatibility Complex (MHC) class I classical (BoLA-N *) and non-classical (BoLA-NC*), as well as of TNF-&#945; (Tumor Necrosis Factor alpha) and TGF-&#946;1 (Transforming Growth Factor beta 1) cytokines in bovine non-pregnant uterus, caruncles, cotyledons and blastocysts throughout the pregnancy period, in order to understand the immune and physiological mechanisms that occur in pregnancy in cows. The samples were analyzed by qPCR, the qualification (presence or absence) by conventional RT-PCR and the immune fluorescence with sheep monoclonal antibody against MHC class I. As positive control we used a sample of tissue from the bovine lymph node and/or spleen in all experimental tests. The amount of transcript BoLA-N* and BoLA-NC* was small (fold change 0 to 3) in blastocysts and cotyledons. Cotyledons transcription BoLA-NC* is greater than the transcription of BoLA-N*. Blastocysts transcription of BoLA-N* was higher than BoLA-NC*. Blastocysts transcribed more BoLA-NC2 than in cotyledons. Blastocysts not transcribed BoLA-NC4. Cotyledons transcribed BoLA-NC4 more than BoLA-NC2. The caruncles showed large amounts of transcripts (fold change 5 to 400), which were higher for pregnancy period of \"8-9\" month to BoLA-N* and one month for BoLA-NC*. Caruncles BoLA-NC2 transcription was higher than the BoLA-NC4. The uterus non pregnant had fewer transcripts BoLA-N* and BoLA-NC* than in caruncles. The uterus non pregnant no have transcripts of BoLA-NC2, but they had a small amount of transcripts of BoLA-NC4. Caruncles had large amounts of transcripts (fold change 50 to 500) of BoLA-NC2 with pregnancy age greater than one month; those are seemed to protect the fetus from rejection. TNF-&#945; appears in greater amount in late gestation (8 and 9 months), showing the beginning of an inflammatory reaction, necessary to the adequate removal of the fetus and the placenta during delivery. Since TGF-&#946;1 has a peak of expression in the sixth and seventh months of gestation, just when the fetus has its greatest growth, demonstrating a probable involvement of this cytokine in this phenomenon. / Com o intuito de entender os mecanismos imunofisiológicos da gestação em vacas esta tese teve como objetivo avaliar a quantidade de transcritos do Complexo de Histocompatibilidade Principal (MHC) de classe I clássico (BoLA-N*) e não clássico (BoLA-NC*), bem como das citocinas TNF-&#945; (Fator de Necrose Tumoral alfa) e TGF-&#946;1 (Fator de Crescimento Transformador beta 1) em úteros não gestantes, carúnculas, blastocistos e cotilédones bovino durante todo o período gestacional. Utilizou-se a quantificação por qPCR, a qualificação (presença ou ausência) via RT-PCR convencional e a imunofluorescência com anticorpo primário monoclonal MHC de classe I ovino. Como controle positivo foi utilizado uma amostra de tecido de linfonodo e/ou baço bovino em todos os ensaios experimentais. A quantidade de transcrito de BoLA de classe I clássico e não clássico foi pequena (fold change variando de 0 a 3) nos blastocistos e cotilédones. Nos cotilédones a transcrição de BoLA-NC* foi maior do que a transcrição de BoLA-N*. Nos blastocistos houve maior transcrição de BoLA-N* do que de BoLA-NC*. BoLA-NC2 transcreveu mais nos blastocisto do que nos cotilédones. BoLA-NC4 não transcreveu nos blastocistos. Os cotilédones transcreveram mais BoLA-NC4 do que BoLA-NC2. As carúnculas apresentaram grandes quantidades de transcritos (fold change variando de 5 a 400), que foram maiores nos períodos gestacionais de 8 a 9 para BoLA_N* e até 1 mês para BoLA-NC*. A transcrição de BoLA-NC2 foi maior do que a de BoLA-NC4 nas carúncula. O útero não gestante teve menor quantidade de transcritos de BoLA-N* e BoLA-NC* do que nas carúnculas. Não há transcrição de BoLA-NC2 no útero não gestante, mas há uma pequena quantidade de transcritos de BoLA-NC4 neste tecido. A presença de grandes quantidades de transcritos (fold change variando de 50 a 500) de BoLA-NC2 nas carúnculas, com idade gestacional maior do que um mês, parece proteger o feto da rejeição. Nas carúnculas parece existir um pico de transcrição de TGF-&#946;1 no sexto e sétimo meses de gestação, justamente quando o feto tem seu maior crescimento, sinalizando um provável envolvimento desta citocina neste fenômeno. O TNF-&#945; surge em maior quantidade no final da gestação, tanto nas carúnculas quanto nos cotilédones, demonstrando o início de uma reação inflamatória, necessária para a adequada expulsão do concepto e da placenta durante o parto. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Expressão aumentada do receptor Fc de IgA (CD89) e da cadeia g associada, avaliadas respectivamente por citometria de fluxo e por “immunobloting”, foram encontradas em fagócitos do sangue de pacientes com bacteremia por germes gram-negativos, em comparação com controles e pacientes com bacteremia por gram-positivos. A Mr do CD89 avaliada por SDS-PAGE estava diminuída, com núcleo protéico de 32kDa, sugerindo alteração de glicosilação. O aumento da expressão do CD89 correlacionou-se com aumento dos níveis séricos de IL-6. A cadeia g estava fosforilada nos neutrófilos, sugerindo participação do CD89 na sepsis por gram-negativos. / The expression and function of FcaRI (CD89) were analyzed on blood monocytes and neutrophils of patients with gram-positive and gram-negative bacteremia. Eighteen patients with gram-positive bacteremia, sixteen patients with gram-negative bacteremia and twenty healthy individuals were studied. CD89 expression were analyzed by flow cytometry using specific stained antibodies. Analysis of the surface iodinated CD89 molecules by SDS-PAGE and of the CD89 g-associated chain by immunoblotting also were performed. A marked increase in expression of the a and g subunits of the FcaRI were found on both types of cells in patients with gram-negative bacteremia, but not in patients with gram-positive bacteremia. This increase was independent of serum IgA levels. FcaRI Mr was lower on cells from gram negative patients than on cells from controls (50-65 kDa vs 55-75 kDa) despite of similar 32 kDa backbone, indicating altered glycosylation. Increased levels of FcaRI on blood phagocytes correlated with enhanced serum IL-6 levels, but not with IFN-g or TNF-a levels. The CD89 g-associated chain was phosphorylated on neutrophils, suggesting an engagement of CD89 during gram negative sepsis.