<p>Gilbert’s syndrome (GS) occurs in approximately 10% of the European population. The most common cause is homozygosity for UGT1A1*28, which is a TA repeat expansion in the promoter of UGT1A1. It is characterised by intermittent hyperbilirubinemia due to reduced hepatic activity of the  enzyme UDP-glucuronosyl-transferase 1A1(UGT1A1). GS also  alteres the pharmacokinetics of some drugs and increases the risk of drug toxicity. Irinotecan (Camptosar®, Campto®) is used in metastatic colorectal cancer and the active metabolite is inactivated by UGT1A1. Studies have shown that GS can be a risk factor for toxicity during irinotecan therapy.</p><p>Three different methods for genotyping of UGT1A1*28 have been tested.</p><p>PCR with electrophoresis used for size separation, melting temperature analysis and fluorescent PCR followed by fragment analysis on a capillary sequencer.</p><p>The last method was found to be superior. This method was used for genotyping of patients with colorectal cancer treated with irinotecan and 5-fluorouracil in the Nordic VI study. A significant association between UGT1A1 genotype and plasma bilirubin level before the start of irinotecan treatment was seen (ANOVA p<0.0001). Patients with GS had an overall increased risk of adverse drug reactions (Fishers Exact test p=0.02).</p><p>Gilbert’s syndrome can be diagnosed by genotyping UGT1A1*28 with a fragment analysis method. Genotyping of UGT1A1*28 can be used to identify patients with an increased risk of adverse reactions to irinotecan.<strong> </strong></p><p><strong> </strong></p> / <p>Gilberts syndrom (GS) drabbar upp till 10% av befolkningen i Västeuropa. GS beror på nedsatt aktivitet av enzymet UDP-glukuronosyltransferas 1A1 (UGT1A1) i levern. Den vanligaste orsaken är att individen är homozygot för en insertion av två baser i promotorn för genen UGT1A1. Denna genvariant kallas (TA)7TAA  eller UGT1A1*28. GS leder till intermittent stegring av bilirubin vid infektioner, men bilirubinstegring kan förekomma även utan utlösande agens. GS kan också leda till bilirubinstegring vid viss läkemedelsbehandling. Irinotekan (Campto®) används vid metastaserande colorektal cancer och dess aktiva metabolit inaktiveras av UGT1A1. Det finns rapporter om att GS ger ökad risk för toxiska biverkningar av irinotekan.</p><p>Tre metoder för att bestämma UGT1A1 har jämförts: PCR med elfores, PCR med smältpunktsanalys och PCR med fragmentanalys på sekvensator. Den sista metoden var bäst och användes för att genotypa UGT1A1 hos patienter med colorektal cancer från Nordic VI-studien. De behandlades med irinotekan i kombination med bolusinjektion eller infusion av 5-fluorouracil. Vi fann att  patienter med GS hade signifikant högre S-bilirubin före behandling jämfört med övriga patienter. De hade även ökad frekvens biverkningar av irinotekan (Fishers exakta test p=0,02).</p><p>Genotypning av UGT1A1 kan således användas för att diagnostisera Gilberts syndrom hos patienter med oförklarad bilirubinstegring. Det kan även användas för att identifiera patienter med ökad risk för biverkningar av irinotekan.</p>

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Personnaliser les traitements anticancéreux sur base moléculaire consiste à optimiser la thérapie en fonction des profils d'expression de gènes des cellules saines et tumorales du patient. Les différences au niveau moléculaire entre tissus normaux et cancéreux sont exploitées afin de maximiser l'efficacité du traitement et minimiser sa toxicité. Cette thèse propose une approche pluridisciplinaire expérimentale et mathématique ayant pur but la détermination de stratégies anticancéreuses optimales sur base moléculaire. Cette approche est, tout d'abord, mise en œuvre pour la personnalisation de la chronothérapeutique des cancers, puis pour l'optimisation de la thérapie anticancéreuse dans le cas d'une mutation de l'oncogène SRC. La plupart des fonctions physiologiques chez les mammifères présentent une rythmicité circadienne, c'est-à-dire de période environ égale à 24 h. C'est par exemple le cas de l'alternance activité-repos, de la température corporelle, et de la concentration intracellulaire d'enzymes du métabolisme. Ces rythmes ont pour conséquence une variation de la toxicité et de l'efficacité d'un grand nombre de médicaments anticancéreux selon leur heure circadienne d'administration. De récentes études soulignent la nécessité d'adapter les schémas d'injection chronomodulés au profil moléculaire du patient. La première partie de cette thèse propose une approche combinée expérimentale et modélisatrice pour personnaliser sur base moléculaire la chronothérapie. La première étape a consisté en une preuve de concept impliquant des expérimentations in vitro sur cultures de cellules humaines et des travaux de modélisation in silico. Nous nous sommes focalisés sur l'étude de l'irinotecan (CPT11), un médicament anticancéreux actuellement utilisé en clinique dans le traitement des cancers colorectaux, et présentant des rythmes de chronotoxicité et de chronoefficacité chez la souris et chez l'homme. Sa pharmacocinétique (PK) et pharmacodynamie (PD) moléculaires ont été étudiées dans la lignée de cellules d'adénocarcinome colorectal humain Caco-2. Un modèle mathématique de la PK-PD moléculaire du CPT11, à base d'équations différentielles ordinaires, a été conçu. Il a guidé l'expérimentation qui a été réalisée dans le but de d'évaluer les paramètres du modèle. L'utilisation de procédures d'optimisation, appliquées au modèle calibré aux données biologiques, a permis la conception de schéma d'exposition au CPT11 théoriquement optimaux dans le cas particulier des cellules Caco-2. Le CPT11 s'est accumulé dans les cellules Caco-2 où il a été biotransformé en son métabolite actif le SN38, sous l'action des carboxylestérases (CES). La pré-incubation des cellules avec du verapamil, un inhibiteur non spécifique des transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette) a permis la mise en évidence du rôle de ces pompes d'efflux ABC dans le transport du CPT11. Après synchronisation des cellules par choc sérique, qui définit le temps circadien (CT) 0, des rythmes circadiens d'une période de 26 h 50 (SD 63 min) ont été mis en évidence pour l'expression de trois gènes de l'horloge circadienne: REV-ERBα, PER2, et BMAL1; et six gènes de la pharmacologie du CPT11: la cible du médicament la topoisomerase 1 (TOP1), l'enzyme d'activation CES2, l'enzyme de désactivation UGT1A1, et les quatre transporteurs ABCB1, ABCC1, ABCC2, ABCG2. Au contraire, l'expression protéique et l'activité de la TOP1 sont restées constantes. Enfin, la quantité de TOP1 liée à l'ADN en présence de CPT11, un marqueur de la PD du médicament, a été plus importante pour une exposition à CT14 (47±5.2% de la quantité totale de TOP1), que pour une exposition à CT28 (35.5±1.8%). Les paramètres du modèle mathématique de la PK-PD du CPT11 ont ensuite été estimés par une approche de bootstrap, en utilisant des résultats expérimentaux obtenus sur les cellules Caco-2, combinés aux données de la littérature. Ensuite, des algorithmes d'optimisation ont été utilisés pour concevoir les schémas d'exposition théoriquement optimaux des cellules Caco-2 à l'irinotecan. Les cellules synchronisées par un choc sérique ont été considérées comme les cellules saines et les cellules non-synchronisées ont joué le rôle de cellules cancéreuses puisque l'organisation circadienne est souvent perturbée dans les tissus tumoraux. La stratégie thérapeutique optimale a été définie comme celle qui maximise l'efficacité sur les cellules cancéreuses, sous une contrainte de toxicité maximale sur les cellules saines. Les schémas d'administration considérés ont pris la forme d'une exposition à une concentration donnée de CPT11, débutant à un CT particulier, sur une durée comprise entre 0 et 27 h. Les simulations numériques prédisent que toute dose de CPT11 devrait être optimalement administrée sur une durée de 3h40 à 7h10, débutant entre CT2h10 et CT2h30, un intervalle de temps correspondant à 1h30 à 1h50 avant le minimum des rythmes de bioactivation du CPT11 par les CES. Une interprétation clinique peut être établie en ramenant à 24 h ces résultats pour les cellules Caco-2 qui présentent une période de 27 h. Ainsi, une administration optimale du CPT11 chez le patient cancéreux résulterait en une présence du médicament dans le sang pendant 3h30 à 6h30, débutant de 1h30 à 1h40 avant le minimum des rythmes d'activité des CES chez le patient. La deuxième étape de nos travaux a consisté à adapter l'approche mise en œuvre pour optimiser l'exposition des cellules Caco-2 au CPT11, pour l'optimisation de l'administration du médicament chez la souris. Des études récentes mettent en évidence trois classes de chronotoxicité à l'irinotecan chez la souris. La classe 1, les souris de la lignée B6D2F1 femelles, présentent la pire tolérabilité au CPT11 après une administration à ZT3, et la meilleure pour une administration à ZT15, où ZT est le temps de Zeitgeber, ZT0 définissant le début de la phase de lumière. La classe 2, les souris B6D2F1 mâles, montrent une pire heure d'administration à ZT23 et une meilleure à ZT11. Enfin, la classe 3, les B6CBAF1 femelles présentent la pire tolérabilité pour une injection à ZT7, et la meilleure pour ZT15. Nous avons entrepris une approche pluridisciplinaire in vivo et in silico dont le but est la caractérisation moléculaire des trois classes de chronotoxicité, ainsi que la conception de schémas optimaux d'administration pour chacune d'elles. Le modèle mathématique mis au point pour une population de cellules en culture a été adapté pour la construction d'un modèle "corps entier" à base physiologique de la PK-PD de l'irinotecan. Un ensemble de paramètres a été estimé pour la classe 2, en utilisant deux sortes de résultats expérimentaux: d'une part, les concentrations sanguines et tissulaires (foie, colon, moelle osseuse, tumeur) du CPT11 administré aux pire et meilleure heures circadiennes de tolérabilité, et d'autre part, les variations circadiennes des protéines de la pharmacologie du médicament dans le foie et l'intestin. Le modèle ainsi calibré reproduit de façon satisfaisante les données biologiques. Cette étude est en cours pour les classes 1 et 3. Une fois les ensembles de paramètres validés pour chacune des trois classes, ils seront comparés entre eux pour mettre en évidence de possibles différences moléculaires. L'étape suivante consiste en l'application d'algorithmes d'optimisation sur le modèle corps entier pour définir des schémas d'administration chronomodulés optimaux pour chaque classe. La deuxième partie de cette thèse s'intéresse à l'étude de la tyrosine kinase SRC, dont l'expression est dérégulée dans de nombreux cancers. Des études récentes montrent un contrôle de SRC sur la voie mitochondriale de l'apoptose dans des fibroblastes de souris NIH-3T3 transfectés avec l'oncogène v-src, cette régulation étant inexistante dans les cellules parentales. L'oncogène SRC active la voie RAS / RAK / MEK1/2 / ERK1/2 qui augmente la vitesse de phosphorylation de la protéine pro-apoptotique BIK, menant ainsi à sa dégradation par le protéasome. La faible expression de BIK résultant de ce mécanisme rendrait ainsi les cellules v-src résistantes à la plupart des stress apoptotiques. Notre étude a consisté à déterminer, par une approche combinée mathématique et expérimentale, les stratégies thérapeutiques optimales lorsque les cellules NIH-3T3 parentales jouent le rôle de cellules saines, et les fibroblastes transformés celui de cellules cancéreuses. Pour cela, nous avons, tout d'abord, construit un modèle mathématique de la cinétique de BIK en conditions non-apoptotiques. L'estimation des paramètres de ce modèle, en utilisant des données expérimentales existantes, confirme que la phosphorylation de BIK sous le contrôle de SRC est inactive dans les cellules normales. L'étude exprimentale de l'évolution de BIK après le signal apoptotique que constitue une exposition à la staurosporine, démontre une relocalisation de BIK aux mitochondries, la concentration totale de la protéine restant constante durant le stress. Nous avons ensuite conçu un modèle mathématique de la voie mitochondriale de l'apoptose mettant en jeu les protéines anti-apoptotiques de type Bcl2, les protéines effectrices de type BAX, les protéines BH3-only activatrices et les BH3-only sensibilisatrices. Un ensemble de paramètres a été déterminé pour les cellules NIH-3T3 parentales, et celles transformées v-src, en comparant le modèle aux données expérimentales. Le modèle reproduit le fait expérimentalement démontré que la préincubation des cellules v-src avec un inhibiteur de la tyrosine kinase SRC, avant l'exposition à la staurosporine, annihile la résistance des fibroblastes transformés au stress apoptotique. Le modèle prédit que l'administration de l'ABT-737, un inhibiteur de protéines anti-apoptotiques, avant l'exposition à la staurosporine, ne devrait pas être entreprise dans notre systéme biologique, ce qui a été expérimentalement validé. Enfin, le modèle a été utilisé dans des procédures d'optimisation pour déterminer la stratégie thérapeutique théoriquement optimale, lorsque les cellules normales et transformées sont exposées aux mêmes médicaments. Les combinaisons médicamenteuses considérées consiste en une exposition à la staurosporine, précédée d'une exposition à des répresseurs ou activateurs d'expression des protéines de la famille Bcl2. La stratégie optimale est définie comme celle qui maximise le pourcentage de cellules apoptotiques dans les fibroblastes v-src, sous la contrainte que celui dans les cellules normales reste au-dessous d'un seuil de tolérabilité. Les simulations numériques nous permettent de conclure à une combinaison médicamenteuse optimale constituée d'une exposition à la staurosporine, précédée d'une exposition à un répresseur de l'expression de BAX (de manière à diminuer sa concentration en-dessous du seuil apoptotique dans les cellules normales, mais pas dans les cellules cancéreuses), combinée à un répresseur de BCL2 ou un inhibiteur de tyrosines kinases SRC. Cette stratégie optimale aboutit à moins d'1% de cellules apoptotiques dans les cellules saines et plus de 98% dans les cellules cancéreuses.

Gilbert’s syndrome (GS) occurs in approximately 10% of the European population. The most common cause is homozygosity for UGT1A1*28, which is a TA repeat expansion in the promoter of UGT1A1. It is characterised by intermittent hyperbilirubinemia due to reduced hepatic activity of the  enzyme UDP-glucuronosyl-transferase 1A1(UGT1A1). GS also  alteres the pharmacokinetics of some drugs and increases the risk of drug toxicity. Irinotecan (Camptosar®, Campto®) is used in metastatic colorectal cancer and the active metabolite is inactivated by UGT1A1. Studies have shown that GS can be a risk factor for toxicity during irinotecan therapy. Three different methods for genotyping of UGT1A1*28 have been tested. PCR with electrophoresis used for size separation, melting temperature analysis and fluorescent PCR followed by fragment analysis on a capillary sequencer. The last method was found to be superior. This method was used for genotyping of patients with colorectal cancer treated with irinotecan and 5-fluorouracil in the Nordic VI study. A significant association between UGT1A1 genotype and plasma bilirubin level before the start of irinotecan treatment was seen (ANOVA p&lt;0.0001). Patients with GS had an overall increased risk of adverse drug reactions (Fishers Exact test p=0.02). Gilbert’s syndrome can be diagnosed by genotyping UGT1A1*28 with a fragment analysis method. Genotyping of UGT1A1*28 can be used to identify patients with an increased risk of adverse reactions to irinotecan. / Gilberts syndrom (GS) drabbar upp till 10% av befolkningen i Västeuropa. GS beror på nedsatt aktivitet av enzymet UDP-glukuronosyltransferas 1A1 (UGT1A1) i levern. Den vanligaste orsaken är att individen är homozygot för en insertion av två baser i promotorn för genen UGT1A1. Denna genvariant kallas (TA)7TAA  eller UGT1A1*28. GS leder till intermittent stegring av bilirubin vid infektioner, men bilirubinstegring kan förekomma även utan utlösande agens. GS kan också leda till bilirubinstegring vid viss läkemedelsbehandling. Irinotekan (Campto®) används vid metastaserande colorektal cancer och dess aktiva metabolit inaktiveras av UGT1A1. Det finns rapporter om att GS ger ökad risk för toxiska biverkningar av irinotekan. Tre metoder för att bestämma UGT1A1 har jämförts: PCR med elfores, PCR med smältpunktsanalys och PCR med fragmentanalys på sekvensator. Den sista metoden var bäst och användes för att genotypa UGT1A1 hos patienter med colorektal cancer från Nordic VI-studien. De behandlades med irinotekan i kombination med bolusinjektion eller infusion av 5-fluorouracil. Vi fann att  patienter med GS hade signifikant högre S-bilirubin före behandling jämfört med övriga patienter. De hade även ökad frekvens biverkningar av irinotekan (Fishers exakta test p=0,02). Genotypning av UGT1A1 kan således användas för att diagnostisera Gilberts syndrom hos patienter med oförklarad bilirubinstegring. Det kan även användas för att identifiera patienter med ökad risk för biverkningar av irinotekan.

Activée par la chimiothérapie, la sénescence est un mécanisme suppresseur de tumeur qui empêche la progression tumorale. Cependant, certaines cellules cancéreuses sont capables d’émerger et de provoquer une rechute clinique. Les mécanismes mis en place par les cellules pour échapper à la sénescence ne sont pas encore clairement connus. Nous avons récemment décrit que les cellules qui échappent à la sénescence résistent à l’anoïkis et sont dépendantes de Mcl-1. Dans cette étude, nous caractérisons plus en détail cette émergence en réponse à l'irinotécan, un traitement de première ligne utilisé dans le cancer colorectal. Nos résultats indiquent que la kinase Aktest activée comme une voie de survie lors de l'étape précoce de la sénescence et qu’elle est également réactivée lors de l’émergence. L'inhibition de la kinase avec le GSK690693 empêche l’émergence et améliore l’efficacité du traitement, à la fois in vitro et in vivo. Cette amélioration a été corrélée à l'inhibition de la sénescence et l’activation concomitante de l'apoptose via l’inactivation de Mcl-1 par Noxa. De plus, en utilisant des cellules p21Waf1 déficientes, nous avons confirmé que la voie p53-p21, principal régulateur de la sénescence, favorise l’émergence. A l’inverse, son inhibition améliore l'efficacité du traitement par induction de l'apoptose. Ces résultats mettent en évidence que l'inhibition d’Akt améliore l’efficacité de l’irinotécan et empêche l'émergence de cellules persistantes en diminuant la sénescence au profit de la réponse apoptotique. Par conséquent, nous proposons que l’utilisation d’inhibiteurs d’Akt en thérapies séquentielles devrait être considérée dans le futur pour améliorer le traitement des cancers colorectaux réfractaires à l’irinotécan. / Activated by chemotherapy, senescence is a tumor suppressive mechanism that prevents tumor progression. However, some cancer cells can emerge to induce clinical relapse. The mechanisms set up by cells to escape senescence are not yet clearly known. We have recently described that cells that escape senescence are more transformed than non treated parental cells ; they resist anoikis and depend on Mcl-1. In this study, we further characterize this emergence in response to irinotecan, a first line treatment used in colorectal cancer. Our results indicate that the Akt kinase was activated as a feedback pathway during the early step of senescence and also during emergence. Inhibition of the kinase with GSK690693 prevented cell emergence and improved treatment efficacy, both in vitro and in vivo. This improvement was correlated with senescence inhibition, p21waf1 down regulation and a concomitant activation of apoptosis due to Noxa upregulation and Mcl-1 inactivation. Indeed, Noxa inactivation prevented apoptosis and increased the number of emergent cells. Moreover, using p21waf1-deficient cells, we further confirmed that an intact p53-p21-senescence pathway favored cell emergence and that its down regulation improved treatment efficacy through apoptosis induction. These results highlight that Akt inhibition improves irinotecan treatment and prevent cell emergence by switching the senescence response to apoptosis. Therefore, we propose that use of Akt inhibitors in sequential therapies should be considered in future to improve the treatment of irinotecan-refractory colorectal cancers.

[pt] Os derivados da camptotecina (CPT), irinotecana (CPT-11) e topotecana (TPT) são usados para o tratamento do câncer, sendo a CPT um potencial contaminante em medicamentos anticâncer a base de CPT-11 ou TPT. Neste trabalho, a fosforimetria na temperatura ambiente em substrato sólido (SSRTP) foi proposta como técnica analítica para a determinação do princípio ativo do anticâncer injetável a base de CPT-11 e de traços do contaminante CPT em formulações farmacêuticas anticâncer. As características fosforescentes dos dois analitos foram estudadas de modo univariado em função de diversos parâmetros experimentais, como o tipo e a quantidade de sal de átomo pesado indutor de fosforescência, influência do valor do pH do tampão usado na solução do analito e quantidade de surfactante modificador de superfície da celulose. Uma vez definidos os fatores relevantes, o planejamento fatorial do tipo composto central foi realizado para a determinação de traços do contaminante (CPT) com o intuito de estudar os efeitos principais e as possíveis interações entre os fatores de resposta visando à escolha da melhor condição experimental. As melhores condições foram obtidas usando substratos de celulose contendo 332 microgramas de TlNO3 (indutor da fosforescência) em solução carreadora contendo tampão Britton-Robinson (pH 10,5). Para a CPT-11 a otimização foi realizada apenas pela abordagem univariada, com as seguintes condições escolhidas: 662 microgramas de Pb(NO3)2 em substratos de celulose contendo 577 microgramas de SDS. A CPT pôde ser determinada seletivamente em matrizes contendo 40 vezes mais TPT, em concentração, usando a determinação no ponto isodiferencial (367 nm) da derivada de segunda ordem do espectro de excitação. Para matrizes contendo CPT-11, esse desempenho foi mais limitado, pois a CPT só foi determinada seletivamente em misturas contendo até 5 vezes mais CPT-11. Para cada uma das condições selecionadas foram realizados estudos para obtenção dos parâmetros de desempenho. Em ambos os casos, a resposta analítica teve comportamento linear (homocedático) em função da massa de CPT ou de CPT-11 presentes no substrato de celulose. Os limites de detecção e de quantificação absolutos ficaram na ordem do ng. Um estudo detalhado da estimativa da incerteza de medição também foi realizado e a incerteza combinada associada à medição de fosforescência da CPT foi de até 16 por cento. O método foi aplicado na quantificação de CPT-11 em soluções injetáveis com 97,5 mais ou menos 5,5 por cento de recuperação e na determinação de CPT em medicamentos a base de TPT (101,5 mais ou menos 3,5 por cento de recuperação medindo em 367 nm do espectro de excitação após derivação de segunda ordem) e nas matrizes urina (102,5 mais ou menos 3,5 por cento de recuperação) e saliva (102,5 mais ou menos 4,5 por cento de recuperação), ambas fortificadas com CPT e usando-se detecção em 570 nm do espectro de emissão de varredura normal. Testes comparativos entre a SSRTP e a HPLC-DF foram realizados e os resultados foram satisfatórios para um nível de 95 por cento de confiança. Uma comparação entre diferentes substratos foi também realizada para avaliar requisitos práticos, variabilidade de sinal do analito e do branco, o que indicou vantagens do substrato de nylon sobre o de celulose. / [en] Irinotecan (CPT-11) and topotecan (TPT) are employed for cancer treatment and camptothecin (CPT) is a potential contaminant in anti-cancer drugs based on CPT-11 or TPT. In this work, solid substrate room-temperature phosphorimetry (SSRTP) was proposed as analytical technique for the quantification of CPT-11 in anti-cancer drugs and for the determination of traces of CPT in CPT-11 and TPT based anti-cancer pharmaceutical formulations. The phosphorescence characteristics of the analytes have been studied and experimental conditions (type and amount of the heavy atom salts used to induce phosphorescence, influence of the pH of the analyte carrier solution and the amount of surface modifier) were optimized in an univariate way. For the method aiming the determination of CPT, a further optimization using a central composite design was made in order to identify the main effects and possible interactions among factors. The best conditions had been achieved using cellulose substrate containing 332 micrograms of TlNO3 (phosphorescence inducer) and analyte carrier solution containing Britton-Robinson buffer (pH 10.5). For the CPT-11, best conditions were achieved in cellulose substrates containing 577 micrograms of SDS and 662 micrograms of Pb(NO3)2 The selective determination of CPT could be performed in samples containing a higher amount of TPT (40 times) if the signal measurement is made at the isodifferential wavelength (367 nm) of the second derivative excitation spectra. For samples containing CPT-11, selective determination of CPT could be made in samples containing CPT-11/CPT molar proportion no higher than 5. Parameters of merit have been obtained for both methods. Analytical responses presented linear behavior in the in working range from the limit of quantification up to at least 348.0 ng of CPT or 440.2 ng of CPT-11 (deposited in the center of the substrate). Absolute limits of detection and quantification were 26.8 and 42.3 ng for CPT and 79.6 and 99.9 ng for CPT-11. A detailed metrological study was performed for the measurement of CPT and the combined uncertainty associated to the phosphorescence measurement was 16 percent. The method was applied for the quantification of CPT-11 in injectable solutions with recovery of 97.5 more or less 5.5 percent. For CPT, recovery in TPT based pharmaceutical formulation, previously fortified with the analyte, was 101.5 more or less 3.5 percent (measurement made at 367 nm of the second derivative excitation spectra). In analyte fortified urine and saliva, recoveries were respectively 102.5 more or less 3.5 percent and 102.5 more or less 4.5 percent (using non-derived spectra and detention at 570 nm of the emission band). Comparative tests between the SSRTP and HPLC-DF have been made and the results agreed (at a 95 percent confidence level). A comparison using different substrates (nylon and cellulose) was also performed in order to evaluate practical aspects, analyte signal intensity and the variability of the analyte and blank signals. The result indicated advantages in using nylon substrates for the phosphorimetric determination of CPT.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / IntroduÃÃo: O cloridrato de irinotecano (CPT-11) à um inibidor da topoisomerase I, clinicamente efetivo no tratamento de vÃrios tipos de cÃncer. Apesar da mucosite intestinal (MI) acompanhada de severa diarrÃia ser o efeito colateral mais limitante do uso terapÃutico do CPT-11, os exatos mecanismos que levam a estes efeitos nÃo sÃo estabelecidos. Objetivo: avaliar o envolvimento de mediadores inflamatÃrios (citocinas, Ãxido nÃtrico â NO e prostaglandinas â PGs) na patogÃnese dos eventos que acompanham a MI induzida pelo CPT-11; e estudar o efeito de inibidores da sÃntese e liberaÃÃo de citocinas, como pentoxifilina (PTX) e talidomida (TLD), e de um inibidor seletivo da ciclooxigenase-2 (COX-2), o celecoxibe (CLX), na lesÃo intestinal induzida pelo CPT-11. Material e MÃtodos: camundongos Swiss, machos, foram tratados durante quatro dias consecutivos com CPT-11 (50, 75 e 100 mg/kg, i.p.) ou veÃculo (0,5 mL, i.p.), a fim de se obter a melhor dose capaz de induzir injÃrias consistentes com o mÃnimo de letalidade. Os animais foram tratados com PTX (1,7, 5 e 15 mg/kg, s.c.), TLD (15, 30, 60 mg/kg, s.c), CLX (3, 10, 30 mg/kg, gavagem) ou veÃculo (0,5 mL, s.c. ou gavagem), um dia antes da primeira administraÃÃo do CPT-11 (75 mg/kg), e diariamente, atà o sacrifÃcio, no quinto ou sÃtimo dia. Os seguintes parÃmetros foram avaliados: diarrÃia, variaÃÃo de massa corpÃrea, leucograma, sobrevida, anÃlise histopatolÃgica, atividade de mieloperoxidase (MPO), dosagem de citocinas (TNF-&#945;, IL-1&#946; e KC) por ELISA e imunohistoquÃmica para TNF-&#945;, IL-1&#946;, iNOS e COX-2 nas mucosas duodenais. Resultados: CPT-11 induziu diarrÃia significante, acompanhada de perda acentuada de massa corpÃrea, leucopenia e reduÃÃo da sobrevida. As alteraÃÃes histopatolÃgicas intestinais induzidas pelo CPT-11 caracterizaram-se pela presenÃa de infiltrado inflamatÃrio nas cÃlulas da lÃmina prÃpria, perda da arquitetura das criptas e achatamento dos vilos. Observou-se ainda, aumento intestinal na atividade de MPO e dos nÃveis de TNF-&#945;, IL-1&#946; e KC, alÃm do aumento significativo na marcaÃÃo imunohistoquÃmica para TNF-&#945;, IL-1&#946;, iNOS e COX-2. O tratamento com PTX inibiu a diarrÃia tardia, reduziu as alteraÃÃes histopatolÃgicas, a atividade de MPO, e os nÃveis de TNF-&#945;, IL-1&#946; e KC, assim como a marcaÃÃo imunohistoquÃmica para TNF-&#945;, IL-1&#946; e iNOS na mucosa duodenal, entretanto, nÃo preveniu significativamente a perda de massa corpÃrea, a leucopenia e tampouco a mortalidade dos animais. O tratamento com TLD reduziu as lesÃes histopatolÃgicas induzidas pelo CPT-11 na mucosa intestinal, os nÃveis intestinais de MPO e TNF-&#945;, bem como a marcaÃÃo imunohistoquÃmica de TNF-&#945;, mas nÃo foi capaz de prevenir a diarrÃia, a perda de massa corpÃrea, a leucopenia e a sobrevida. O tratamento com CLX nÃo foi capaz de reduzir os parÃmetros inflamatÃrios e sistÃmicos observados nos animais tratados com CPT-11. ConclusÃo: Estes resultados sugerem o envolvimento de TNF-&#945;, IL-1&#946;, KC, NO e PGs na patogÃnese da MI induzida pelo CPT-11. PTX e TLD preveniram significativamente as alteraÃÃes histolÃgicas e inflamatÃrias induzidas pelo CPT-11, entretanto, somente PTX foi capaz de inibir o curso da diarrÃia / Introduction: Irinotecan (CPT-11) is an inhibitor of DNA topoisomerase I and clinically effective against several cancers. A major toxic effect of CPT-11 is delayed diarrhea; however, the exact mechanism by which the drug induces diarrhea has not been established. Purpose: The aim of the present study was to elucidate the involvement of cytokines (TNF-&#945;, IL-1&#946; and KC), nitric oxide (NO) and prostaglandins (PGs) in the pathogenesis of CPT-11-induced mucositis and the effects of the cytokine production inhibitors, pentoxifylline (PTX) and thalidomide (TLD), as well as the effects of the selective cyclooxygenase (COX-2) inhibitor, celecoxib (CLX), in the CPT-11 induced intestinal mucositis, in mice. Materials and methods: the animals were treated with CPT-11 (50, 75 or 100 mg/kg, i.p.) or vehicle (0,5 ml, i.p.) daily for four days, in order to investigate the best dose able to induce intestinal mucositis without important mortality. In another set of experiments, the animals received PTX (1.7, 5, 15 mg/kg, s.c.), TLD (15, 30, 60 mg/kg, s.c.), CLX (3, 10, 30 mg/kg, oral gavage) or vehicle (0,5 ml, s.c. or oral gavage) one day before the 1st administration of CPT-11 (75 mg/kg; i.p.) and daily until the sacrifice, on the 5th or 7th day. The systemic parameters evaluated were: diarrhea, body mass variation, survival curve and leucogram. In addition, it was also performed histological analysis, myeloperoxidase (MPO) activity assay, duodenum levels of TNF-&#945;, IL-1&#946; and KC by ELISA and immunohistochemistry for TNF-&#945;, IL-1&#946;, iNOS and COX-2 in the duodenal segments. Results: CPT-11 induced an important diarrhea, weight loss, leucopenia and mortality increase. It was also observed histopathological changes, such as shortened villi, loss of the crypt architecture and inflammatory cells infiltration, observed in the lamina propria, as well as, an increase in MPO activity, TNF-&#945;, IL-1&#946; and KC tissue levels and a marked immuno-staining for TNF-&#945;, IL-1&#946;, iNOS and COX-2. The treatment with PTX inhibited the delayed diarrhea and reduced the following parameters: histopathological alterations, MPO activity, tissue levels of TNF-&#945;, IL-1&#946; and KC, and the immuno-staining for TNF-&#945;, IL-1&#946; and iNOS, however, did not prevent leucopenia, weight loss and mortality. TLD significantly reduced all the inflammatory parameters evaluated, but was not able to prevent diarrhea, leucopenia, weight loss and mortality. On the other hand, CLX did not inhibit the inflammatory nor the systemic alterations induced by CPT-11. Conclusion: These results suggest an important role of TNF-&#945;, IL-1&#946;, KC, NO and PGs in the pathogenesis of intestinal mucositis induced by CPT-11. PTX and TLD showed a protector effect in intestinal structures, however, only PTX reduced the severity of CPT-11-induced diarrhea

Positionnée en aval des voies PI3K/AKT et RAS/MAPK, la protéine kinase mTOR joue un rôle déterminant dans le développement et la progression tumorale des cancers colorectaux où elle est fortement surexprimée. Par ailleurs, les cancers colorectaux comme toutes les tumeurs solides, ont un microenvironnement hypoxique. L’adaptation des cellules tumorales à l’hypoxie est notamment régulée par la voie PI3K/AKT/mTOR ainsi que par les facteurs de transcription HIFs dont l’expression protéique et l’activité transcriptionnelle est en partie régulée par mTOR. Dans cette étude, nous avons montré que l’inhibition verticale et complète de l’axe PI3K/AKT/mTOR/HIF-1α par l’utilisation combinée d’irinotecan à faible dose et d’inhibiteurs catalytiques de mTOR inhibe significativement la prolifération cellulaire de lignées coliques humaines, la croissance tumorale et le développement de métastases de xénogreffes de tumeurs coliques dérivées de patients.En parallèle, une étude de cohorte de tumeurs coliques humaines de stade III par Tissue Micro Array montre que les facteurs HIFs sont fortement exprimés dans l’épithélium et le stroma de cancers du côlon de stade III, qu’une faible expression nucléaire de HIF-1α dans les cellules épithéliales confère une mauvaise survie aux patients et qu’elle a une valeur prédictive de moins bonne réponse au traitement 5-FU. / Downstream of the PI3K/AKT and RAS/MAPK pathways, mTOR protein kinase plays a decisive role in the development and tumor progression of colorectal cancers. Furthermore, the microenvironment of colorectal cancers is hypoxic. The adaptation of the tumor cells to hypoxia is regulated by the PI3K/AKT /mTOR pathway as well as by the HIFs transcription factors whose protein expression and transcriptional activity is partially regulated by mTOR. In this study, we showed that the vertical and complete inhibition of the PI3K / AKT / mTOR /HIF-1α axis by the combined use of low-dose irinotecan and mTOR catalytic inhibitors significantly inhibits human colon cancer cell proliferation, as well as the growth and metastatic development of xenografted human colon tumors. In parallel, a Tissue Micro Array study on a cohort of stage III human colic tumors shows that the HIFs are strongly expressed in the epithelium and stroma of the tumors and a low nuclear expression of HIF-1α in epithelial cells provides with poor survival to patients and has a predictive value of worse response to 5-FU treatment.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Carboxylesterases (CES) are enzymes that metabolize a wide variety of compounds including esters, thioesters, carbamates, and amides. In humans there are three known carboxylesterase genes CES1, CES2, and CES3. Irinotecan (CPT-11) and capecitabine are important chemotherapeutic prodrugs that are used for the treatment of colorectal cancer. Of the three CES isoenzymes, CES2 has the highest catalytic efficiency for irinotecan activation. There is large inter-individual variation in response to treatment with irinotecan. Life-threatening late-onset diarrhea has been reported in approximately 13% of patients receiving irinotecan. Several studies have reported single nucleotide polymorphisms (SNPs) for the CES2 gene. However, there has been no consensus on the effect of different CES2 SNPs and their relationship to CES2 RNA expression or irinotecan hydrolase activity. Three CES2 mRNA transcripts of approximately 2kb,3kb, and 4kb have been identified by multi-tissue northern analysis. The expressed sequence tag (EST) database indicates that CES2 undergoes several splicing events that could generate up to six potential proteins. Four of the proteins CES2, CES2458-473, CES2+64, CES21-93 were studied to characterize their expression and activity. Multi-tissue northern analysis revealed that CES2+64 corresponds to the 4kb and 3kb transcripts while CES21-93 is located only in the 4 kb transcript. CES2458-473 is an inactive splice variant that accounts for approximately 6% of the CES2 transcripts in normal and tumor colon tissue. There is large inter-individual variation in CES2 expression in both tumor and normal colon samples. Characterization of CES2+64 identified the protein as normal CES2 indicating that the signal peptide is recognized in spite of the additional 64 amino acids at the N-terminus. Sub-cellular localization studies revealed that CES2 and CES2+64 localize to the ER, and CES21-93 localizes to the cytoplasm. To date CES2 SNP data has not provided any explanation for the high inter-individual variability in response to irinotecan treatment. Multi-tissue northern blots indicate that CES2 is expressed in a tissue specific manner. We have identified the CES2 variants which correspond to each mRNA transcript. This information will be critical to defining the role of CES2 variants in the different tissues.

This project combines oncolytic Vaccinia virus (VV) with irinotecan (CPT-11) for the treatment of cancer. VV can infect, replicate in and destroy cancer cells, yet leave healthy cells relatively unaffected. CPT-11 is a chemotherapeutic of which ~5% is converted to the more active chemotherapeutic SN-38 by endogenous carboxylesterase (CE) enzymes. SN-38 is a topoisomerase I inhibitor that induces DNA double strand breaks, leading to growth arrest and apoptosis. Consequently, VV has been engineered to express a more effective isoform of the CE enzyme. The virus’ tumour tropism should restrict enhanced conversion of CPT-11 to the tumour. Neither CPT-11 nor SN-38 interfered with VV replication or spread. Engineered recombinants expressed CE enzyme which, when combined with CPT-11, produced DNA double strand breaks and cancer cell death. In vitro, the combination of CE-virus and CPT-11 killed more K-562 cancer cells than its non-CE counterpart and CPT-11.