Eukaryotic cells depend on cargo uptake into the endocytic membrane system, which comprises a functionally interconnected network of endosomal compartments. The establishment and maintenance of such diverse compartments in face of the high rates of exchange between them, poses a major challenge for obtaining a molecular understanding of the endocytic system. Rab-GTPases have emerged as architectural key element thereof: Individual family members localize selectively to endosomal compartments, where they recruit a multitude of cytoplasmic effector proteins and coordinate them into membrane sub-domains. Such "Rab-domains" constitute modules of molecular membrane identity, which pattern the endocytic membrane system into a mosaic of Rab-domains. The main objective of this thesis research was to link such "static" mosaic-view with the highly dynamic nature of the endosomal system. The following questions were addressed: How are neighbouring Rab-domains coordinated? Are Rab-domains stable or can they undergo assembly and disassembly? Are the dynamics of Rab-domains utilized in cargo transport? The first part of this thesis research focused on the organization of Rab-domains in the recycling pathway. Utilizing Total Internal Reflection (TIRF) microscopy, Rab11-, but neither Rab4- nor Rab5-positive vesicles were observed to fuse with the plasma membrane. Rab4-positive membranes, however, could be induced to fuse in presence of Brefeldin A. Thus, these experiments complete the view of the recycling pathway by the following steps: a) Rab11-carriers likely mediate the return of recycling cargo to the surface; b) such carriers are presumably generated in an Arf-dependent fission reaction from Rab4-positive compartments. Rab11-chromatography was subsequently carried out in the hope of identifying Rab11-effectors functioning at the Rab4-Rab11 domain interface. An as yet uncharacterized ubiquitin ligase was identified, which selectively interacts with both Rab4 and Rab11. Contrary to expectations, however, the protein (termed RUL for *R*ab interacting *U*biquitin *L*igase) does not function in recycling,but appears to mediate trafficking between Golgi/TGN and endosomes instead.In order to address the dynamics of Rab-domains, fluorescently tagged Rab-GTPases were imaged during cargo transport reactions in living cells. Herefore high-speed/long-term imaging procedures and novel computational image analysis tools were developed. The application of such methodology to the analysis of Rab5-positive early endosomes showed that a) The amount of Rab5 associated with individual endosomes fluctuates strongly over time; b) such fluctuations can lead to the "catastrophic" loss of the Rab5-machinery from membranes; c) Rab5 catastrophe is part of a functional cycle of early endosomes, involving net centripetal motility, continuous growth and increase in Rab5 density. Next, the relevance of Rab5 catastrophe with respect to cargo transfer into either the recycling- or degradative pathway was examined. Recycling cargo (transferrin) could be observed to exit Rab5-positive early endosomes via the frequent budding of tubular exit carriers. Exit of degradative cargo (LDL) from Rab5-positive endosomes did not involve budding, but the rapid loss of Rab5 from the limiting membrane.Rab5-loss was further coordinated with the concomitant acquisition of Rab7, suggesting "Rab conversion" as mechanism of transport between early- and late endosomes.Altogether, this thesis research has shown that first, Rab-machineries can be acquired and lost from membranes. Second, such dynamics provide a molecular mechanism for cargo exchange between endosomal compartments. Jointly, these findings lead to the concept of Rab-domain dynamics modulation in /trans/ between neighbouring domains as mechanistic principle behind the dynamic organization of membrane trafficking pathways.

The deleterious effects of MPO make it a new target for medicinal research. The aim of our study is to find promising inhibitors of MPO for using them as starting point of new anti-inflammatory drugs. Depending on previous researches on MPO inhibitors, we selected 5-fluorotryptamine as starting compounds. Using docking experiments, we designed a series of compounds derived from 5-fluorotryptamine. Two modifications were proposed: <p>& / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Golgi apparatus protein 1 (GLG1) est une protéine transmembranaire de 160 kDa qui interagit avec l’apolipoprotéine B100 (apoB100), le récepteur des lipoprotéines de basse densité (LDLR) et la proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9). Cependant, son mécanisme d’action et sa régulation post-traductionnelle sont inconnus. Des études ont montré que GLG1 subit deux clivages résultant en fragments solubles secrétés de 150 kDa et 55 kDa. Dans cette étude, notre premier objectif est d’identifier les enzymes responsables de la protéolyse de GLG1 ainsi que l’effet du clivage sur sa fonction dans le métabolisme des lipides. De plus, les résultats de nos collaborateurs montrent que les souris adultes déficientes en GLG1 ont un plus grand nombre d’adipocytes mais de taille plus petite que les souris de type sauvage. Notre deuxième objectif est de mesurer la variation de l’expression ainsi qu’identifier l’effet de GLG1 lors de la différentiation des fibroblastes en adipocytes. Pour le premier objectif, les cellules HEK293T surexprimant GLG1 ont été soit transfectées avec des convertases de proprotéines (PCSK) soit incubées avec différents inhibiteurs d’enzymes. Les milieux et les lysats cellulaires ont été analysés par immunobuvardage à la Western. Il n’y a pas eu de nouveaux fragments générés en présence des PCSK. Cependant, en présence d’inhibiteurs des sérines protéases apparentées à la trypsine soit AEBSF et Gabexate mesylate, il y a eu une réduction de la formation du fragment de 55 kDa. Pour identifier la métalloprotéase responsable du clivage de l’ectodomaine générant le fragment de 150 kDa, GLG1 a été transfectée avec les Tissue Inhibitor of Metalloproteinase (TIMP 1-4). Nos résultats ont montré que TIMP3 empêche la relâche de l’ectodomaine de GLG1 dans le milieu de culture. Finalement, nos analyses de plasma de souris par immunobuvardage à la Western ont montré la présence des fragments de 150 kDa et 55 kDa de GLG1 in vivo. Pour le deuxième objectif de l’étude, les fibroblastes préadipocytaires de souris 3T3-L1 ont été différenciés en adipocytes. Des lysats cellulaires et l’isolation d’ARN ont été effectués aux jours 0, 2, 4, 6, 8 et 10 de la différenciation. Des immunobuvardages à la Western ainsi que des RT-qPCR ont été réalisés pour analyser l’expression de GLG1 au cours de la différenciation. Nos résultats ont montré que l’expression de GLG1 augmente durant la différenciation. Bref, nos résultats démontrent que des enzymes trypsin-like clivent GLG1 et génèrent le fragment de 55 kDa. L’inhibition du clivage de l’ectodomaine de GLG1 par TIMP3 suggère que les ADAMs sont impliquées dans la relâche du fragment de 150 kDa. De plus, nous avons montré que l’expression de GLG1 augmente au cours de la différenciation adipocytaire. / Golgi apparatus protein 1 (GLG1) is a 160 kDa transmembrane protein interacting with apolipoprotein B100 (apoB100), low-density lipoprotein receptor (LDLR) and proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9). However, the protein’s posttranslational regulation and mechanism of action are poorly understood. Previous studies showed that GLG1 is cleaved resulting in two fragments of 150 kDa and 55 kDa secreted at the cell surface and in the extracellular matrix. The first objective of this study is to identify enzymes responsible for GLG1 proteolysis and the effect of cleavage on its function in lipid metabolism. Furthermore, our collaborators showed that mice with GLG1 knockout have a higher number of adipocytes, but those cells are smaller in size compared to those in wild type mice. Therefore, the second objective of the study is to measure the variation of GLG1 expression during adipocytes differentiation and to identify the effects of GLG1 knockout on adipocytes differentiation. For the first objective, HEK293T cells overexpressing GLG1 were either transfected with basic amino acid-specific proprotein convertases (PCSK) or treated with enzyme inhibitors. Media and cell lysates were analyzed by Western blot. No new fragments were detected in media of PCSK-transfected cells. Cell treatment with trypsin-like serine proteases inhibitors, AEBSF and Gabexate mesylate, reduced the secretion of the 55 kDa fragment. To identify the metalloproteinase responsible for GLG1 shedding, GLG1 was co-transfected with Tissue Inhibitors of Metalloproteinase (TIMP1-4). Our results showed that TIMP3 inhibits shedding of the 150 kDa fragment. Finally, wild-type mouse plasma was analyzed by Western blot and showed the presence of both fragments in vivo. For the second objective of the study, fibroblasts 3T3-L1 cells were differentiated into adipocytes and GLG1 mRNA and protein expression were measured at day 0, 2, 4, 6, 8 and 10 by qPCR and Western Blot. Our results showed that GLG1 expression increased during differentiation and a peak was observed at day 4. To conclude, in the first objective of our study, our results showed that trypsin-like enzymes cleave GLG1 and produce a 55 kDa fragment. Shedding of GLG1 is inhibited by TIMP3, which suggests that ADAM10 or ADAM17 are involved in the release of the 150 kDa fragment. In addition, both 55 kDa and 150 kDa fragments were found in normal mouse plasma supporting the relevance of our findings in vivo. In the second objective of our study, GLG1 expression increased during adipocyte differentiation suggesting a role in adipose tissue development and/or morphology. In conclusion, our study will help elucidate how proteolysis of GLG1 impacts its role in the regulation of apoB and PCSK9 secretion and lipid metabolism and how can GLG1 expression affect adipocytes differentiation.

No description available.

Die autosomal-dominant vererbte Familiäre Hypercholesterinämie ist durch eine exzessive Erhöhung der LDL-Serumcholesterinspiegel gekennzeichnet und bedingt aufgrund einer prämaturen Atherosklerose den frühzeitigen Tod der Patienten. Da ursächlich ein defekter LDL-Rezeptor (LDL-R) zugrundeliegt, der durch Mutationen im Bereich des LDL-R-Gens hervorgerufen wird, kommt der Gentherapie als potentieller Behandlungsmöglichkeit ein besonderer Stellenwert zu. Diese Arbeit untersuchte den Einfluß einer Virusdosiseskalation auf Cholesterinsenkung und Langzeitexpression im adenoviral vermittelten LDL-R-Gentransferversuch im Kaninchenmodell. Hierfür wurden 7 Watanabe Heritable Hyperlipidemic Kaninchen, welche an einer vergleichbaren kongenitalen Hypercholesterinämie durch einen LDL-R-Defekt leiden, mit unterschiedlichen Dosierungen eines Adenovirus des Serotyps 5 therapiert, der die Gensequenz für den humanen LDL-R enthielt. Vor und nach Therapie wurden Bestimmungen der Serumcholesterinkonzentrationen und LDL-Stoffwechselkinetiken mit 125I-LDL sowie semiquantitative szintigraphische Auswertungen durch 111In-LDL-Scans durchgeführt. Hierbei mußte festgestellt werden, dass die adenoviral vermittelte transgene Expression des LDL-R durch die Bestimmung des Serumcholesterins nicht korrekt wiedergegeben wird. Denn zum einen konnte bei der Bestimmung des Serumcholesterins ein dosisabhängiger Effekt beobachtet werden, dieser zeigte sich bei den Stoffwechselkinetiken mit 125I-LDL und bei den Scanuntersuchungen mit 111-In-LDL jedoch nicht. Zum anderen kam es innerhalb von 12-18 Tagen nach Gentransfer zu einem Wiedererreichen der Serumcholesterinausgangswerte, wohingegen die in vivo-Stoffwechselkinetiken eine erhöhte Abbaurate radiomarkierter LDL und die Szintigraphie eine LDL-R-Expression über die gesamte Dauer des Experimentes von 120 Tagen belegten. / Familial hypercholesterolemia is an autosomal dominantly inherited disease characterized by an exzessive elevation of serum LDL cholesterol which leads to premature atherosclerosis and an early death of the patients. As the reason is a defective LDL receptor (LDLR) caused by mutations in the gene encoding LDLR, gene therapy plays an increasingly important role as a treatment possibility. This paper examined the influence of an escalation of the virus dose on the cholestorol reduction and long-term expression in the adenovirally mediated LDLR gene therapy experiment using a rabbit animal model. To facilitate this 7 Watanabe Heritable Hyperlipidemic rabbits, suffering from an equivalent congenital hypercholesterolemia due to a LDLR defect, were treated with different doses of a serotype 5 adenovirus which contained the gene sequence of the human LDLR. Pre and post gene therapy measurements of the serum cholesterol levels and kinetics of LDL metabolism with 125I-LDL were performed, as well as semiquantitative scintigraphic analysis of 111In-LDL scans. The finding was that the adenovirally mediated transgene expression of the LDLR was not correctly reflected by the measurement of the serum cholesterol levels. This was because of a dose dependant effect concerning the measurements of the serum LDL cholesterol levels, which did not appear regarding the kinetics of LDL metabolism with 125I-LDL and the scans with 111In-LDL. Moreover, the serum cholesterol levels reached their initial value within 12-18 days post gene transfer whilst the in vivo-kinetics of LDL metabolism showed an increased catabolic rate of radiolabeled LDL and the scintigraphy indicated a LDLR expression for the whole period of the experiment lasting 120 days.

No description available.

Contexte : La dysfonction du tissu adipeux blanc (TAB) favorise les facteurs de risque de diabète de type 2 (DbT2), c’est-à-dire la résistance à l’insuline (RI), l’hyper sécrétion d’insuline glucostimulée (SIGS), le délai de clairance des gras et les concentrations élevées d’apoBlipoprotéines (apoB plasmatique) incluant les lipoprotéines de faible densité (LDL). De récentes études de notre laboratoire et d’autres suggèrent que le niveau élevé d’apoB plasmatique (hyperapoB) est une cause et non seulement une conséquence de la dysfonction du TAB. De plus, une internalisation augmentée d’apoB-lipoprotéines via les récepteurs tels que le récepteur aux LDLs (LDLR) et le cluster de différenciation 36 (CD36), favorise le risque de DbT2. Cependant, les mécanismes sous-jacents de même que les interventions nutritionnelles pour les cibler demeurent incertains. L'activation de la voie de l’inflammasome NLRP3/ interleukine (IL) -1β favorise la dysfonction du TAB et les facteurs de risque de DbT2 et est activée par les LDLs oxydées dans les cellules immunitaires. L'acide eicosapentaénoïque (AEP) et l'acide docosahexaénoïque (ADH) réduisent l'hyperapoB, l'activité de l’inflammasome NLRP3 dans les cellules immunitaires et les facteurs de risque de DbT2 chez l’humain. Ils sont synthétisés de façon endogène par l’entremise des désaturases d’acides gras δ-5 (D5D) et δ-6 (D6D). Chez l’humain, de faibles niveaux d’AEP et d’ADH circulants et d’activité de la D5D et une activité élevée de la D6D prédisent l'incidence de DbT2 et la RI par des mécanismes inconnus. Objectifs : L'hypothèse de ma thèse est que l'AEP et l’ADH améliorent les facteurs de risque de DbT2, soit la dysfonction du TAB, le délai de clairance des gras, la RI et l’hyper SIGS, ceci via une baisse de l'apoB plasmatique et de l’activité de l’inflammasome NLRP3 dans le TAB. Les objectifs sont d'examiner si: 1) les associations entre les activités de la D5D et de la D6D et les facteurs de risque de DbT2 dépendent de l'apoB plasmatique; 2) la supplémentation en AEP+ADH réduit l'apoB plasmatique, l'expression du LDLR et du CD36 dans le TAB, l'activité de l’inflammasome NLRP3 dans le TAB et les facteurs de risque de DbT2; 3) l’AEP+ADH inhibe la sécrétion d'IL-1β par le TAB humain stimulée par des signaux canoniques ou les LDLs natives. Méthodes: Des hommes et des femmes postménopausées normoglycémiques ont été testés à l’état basal et après une supplémentation en AEP (1,8 g/jour) et ADH (0,9 g/jour) de 12 semaines. Les activités de la D5D et de la D6D ont été estimées à partir des acides gras produits/précurseurs dans les phospholipides plasmatiques. Nous avons mesuré la SIGS, la RI et le disposition index lors d’un clamp Botnia. Après un repas à 66% de gras, le délai de clairance des gras a été mesuré par l’aire sous la courbe (sur 6 h) des triglycérides (TG) ou de l’apoB48 (chylomicrons) plasmatiques. Ex vivo dans une biopsie de TAB, nous avons mesuré l'expression de surface du LDLR et du CD36 par immunohistochimie, l'ARNm de NLRP3 et IL1B par RT-qPCR et la sécrétion d'IL-1β par alpha-LISA en l’absence ou en présence d’une stimulation par le lipopolysaccharide (LPS), l'adénosine triphosphate (ATP) et/ou les LDLs humaines natives et lors d’une co-incubation avec l’AEP+ADH. Résultats: À l’état basal (N=98), l'activité de la D5D corrélait négativement avec l'apoB plasmatique, la 2e phase de SIGS, la RI et le délai de clairance des chylomicrons et ces associations étaient dépendantes de l'apoB plasmatique. Inversement, l'activité de la D6D corrélait positivement avec la SIGS, la RI et le délai de clairance des chylomicrons indépendamment de l'apoB plasmatique. Chez les sujets ayant complété la supplémentation en AEP+ADH (N=30), on notait une amélioration de la 1e phase de SIGS, du disposition index et de la clairance des TGs. Des niveaux initiaux plus élevés d'apoB plasmatique, de TGs postprandiaux plasmatiques et de RI, et dans le TAB d'expression du LDLR et du CD36, de sécrétion d’IL-1β et d'ARNm de NLRP3 prédisaient une plus grande réduction de ces paramètres. En comparaison à l'acide palmitique, l’AEP+ADH inhibait la sécrétion d'IL-1β par le TAB, en l’abscence ou en présence d’une stimulation par le LPS, l'ATP et/ou les LDLs natives de ces sujets. Conclusion: Les associations inverses entre l'activité de la D5D avec les facteurs de risque de DbT2 sont dépendantes de l'apoB plasmatique. Les meilleurs répondants à la supplémentation en AEP et ADH, en termes de réduction d'apoB plasmatique, d’expression du LDLR et du CD36 dans le TAB, d'activité de l’inflammasome NLRP3 dans le TAB, de TGs postprandiaux et de RI, sont les sujets avec des niveaux initiaux élevés de ces paramètres. L’AEP et l’ADH inhibent directement la sécrétion d'IL-1β par le TAB humain induite par les LDLs natives ou d'autres signaux. Nous proposons que la supplémentation en AEP et ADH puisse cibler l'activité de l’inflammasome NLRP3 dans le TAB, induite par un niveau élevé d’apoB-lipoprotéines plasmatiques ou internalisées par les récepteurs, et ainsi aider à prévenir le DbT2. / Background: White adipose tissue (WAT) dysfunction promotes risk factors for type 2 diabetes (T2D), namely insulin resistance (IR), high glucose-stimulated insulin secretion (GIIS), delayed fat clearance and high concentrations of apoB-lipoproteins (measured as plasma apoB) including low density lipoproteins (LDL). Recent studies from our lab and others suggest that high plasma apoB (hyperapoB) is a cause and not only a consequence of WAT dysfunction. Moreover, upregulated receptor-mediated uptake of apoB-lipoproteins via LDL receptor (LDLR) and cluster of differentiation 36 (CD36), promotes the risk for T2D. However, underlying mechanisms as well as nutritional interventions to target them remain unclear. Activation of the NLRP3 inflammasome/interleukin (IL)-1β pathway promotes WAT dysfunction and risk factors for T2D and is activated by oxidized LDLs in immune cells. Eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA) reduce hyperapoB, NLRP3 inflammasome activity in immune cells and risk factors for T2D in humans. They are synthesized endogenously through δ-5 (D5D) and δ-6 (D6D) fatty desaturases. In humans, low levels of circulating EPA and DHA and D5D activity and high D6D activity predict the incidence of T2D and IR by unknown mechanisms. Objectives: The hypothesis of my thesis is that EPA and DHA improve T2D risk factors, namely WAT dysfunction, delayed fat clearance, IR and high GIIS, this via a reduction of plasma apoB and WAT NLRP3 inflammasome activity. The objectives are to examine whether: 1) the associations between the levels of D5D and D6D activities and the risk factors for T2D are dependent on plasma apoB; 2) supplementation with EPA+DHA reduces plasma apoB, WAT LDLR and CD36 expression, WAT NLRP3 inflammasome activity and T2D risk factors; 3) EPA+DHA directly inhibits IL-1β secretion from human WAT stimulated by canonical signals or native LDLs. Methods: Normoglycemic men and postmenopausal women were tested at baseline and after supplementation with EPA (1.8 g/day) and DHA (0.9 g/day) for 12 weeks. The activities of D5D and D6D were estimated from the product/precursor fatty acids in plasma phospholipids. We measured GIIS, IR and disposition index by a Botnia clamp. Following a 66% fat meal, delayed fat clearance was measured as the area under the curve (over 6 h) of plasma triglycerides (TG) or apoB48 (chylomicrons). Ex vivo in a WAT biopsy, we measured LDLR and CD36 surface expression by immunohistochemistry, NLRP3 and IL1B mRNA by RT-qPCR, and IL-1β secretion by alpha-LISA either unstimulated or stimulated by lipopolysaccharide (LPS), adenosine triphosphate (ATP), and/or native human LDLs, and during co-incubation with EPA+DHA. Results: At baseline (N=98), D5D activity correlated negatively with plasma apoB, 2nd phase GIIS, IR and delayed chylomicron clearance and these associations were dependent on plasma apoB. Conversely, D6D activity correlated positively with GIIS, IR, and delayed chylomicron clearance independently of plasma apoB. In subjects who completed the EPA+DHA supplementation (N=30), there was an amelioration in 1st phase GIIS, disposition index and TG clearance. Higher baseline levels of plasma apoB, plasma postprandial TGs, IR, WAT LDLR and CD36 surface expression, WAT IL-1β secretion and WAT NLRP3 mRNA predicted a greater reduction of these parameters. In comparison with palmitic acid, EPA+DHA inhibited IL-1β secretion from WAT, either unstimulated or stimulated by LPS, ATP and/or subjects’ native LDLs. Conclusion: The negative associations of D5D activity with risk factors for T2D are dependent on plasma apoB. Best responders to EPA and DHA supplementation to reduce plasma apoB, WAT LDLR and CD36 expression, WAT NLRP3 inflammasome activity, delayed TG clearance, and IR are subjects with elevated baseline levels of these parameters. EPA and DHA directly inhibit IL-1β secretion from human WAT induced by native LDLs or other signals. We propose that EPA and DHA supplementation may target upregulated WAT NLRP3 inflammasome activity induced by high plasma concentrations, or receptor-mediated uptake, of apoB-lipoproteins, and thus help prevent T2D.

La phospholipase A2 liée aux lipoprotéines (Lp-PLA2) est une biomarqueur de plusieurs maladies inflammatoires et une niveau sérique élevé est associé à l’instabilité de la plaque artérioscléreuse. Comme son nom l’indique, la Lp-PLA2 est liée aux lipoprotéines plasmatiques (LDL et HDL) et son rôle est de prévenir l’accumulation de phospholipides oxidés a la surface des lipoprotéines. Toutefois, les produits de dégradation des phospholipides oxidés par la Lp-PLA2 - le lysophosphatidyl choline par les acides gras oxidés peuvent aussi promouvoir l’inflammation. Mieux comprendre le métabolisme de la Lp-PLA2 pourrait nous permettre de mieux apprécier son rôle dans la formation d’une plaque artérioscléreuse instable, car des études antérieures ont démontré une forte expression de la Lp-PLA2 dans la plaque. De plus, il existe une forte corrélation entre les niveaux et l’activité plasmatiques de la Lp-PLA2 et la maladie coronarienne, les accidents cérébraux-vasculaires et la mortalité cardiaque. L’inhibition de la Lp-PLA2 avec une petite molécule, le darapladib, n’a pas démontré de bénéfice sur les évènements cardiovasculaires dans deux études cliniques. Cette thèse présentera d’abord une revue de la littérature sur la Lp-PLA2 et les maladies cardiovasculaires et les deuxième et troisième chapitres, une étude clinique réalisée sur des patients avec un syndrome coronarien aigu. / Lipoprotein associated phospholipase A2 (Lp-PLA2) is a biomarker of several inflammatory diseases and syndromes. An elevated Lp-PLA2 level is associated with unstable atherosclerotic plaques. Bound to plasma lipoproteins (LDL and HDL), Lp-PLA2 prevents the formation of biologically active oxidized phospholipids on their surface such as oxidized phosphatidylcholine (oxPC). Nevertheless, the products of Lp-PLA2 action, lysophosphatidylcholine (LPC) and non-esterified fatty acids (NEFA) are both known to aggravate inflammation. Thus, understanding the metabolism of Lp-PLA2 could help us better understand its role in plaque formation, as studies have shown high expression of Lp-PLA2 and LPCs in unstable plaques. Moreover, studies showed correlation between increased Lp-PLA2 mass and activity and increased risk of coronary artery disease, stroke, and death. The inhibition of Lp-PLA2 with a small molecule, Darapladib, has not demonstrated benefit in reduction of cardiovascular events in two clinical studies. Here, the first chapter will focus on Lp-PLA2 and cardiovascular disease in man, highlighting the latest updates in the literature. The second and third chapters will introduce experimental work on Lp-PLA2 in the setting of acute coronary syndrome.

Sample preparation as an essential step in mass spectrometry-based analysis, plays a critical role in proteomics studies. Magnetic nanoparticles (MNPs) have been widely used in protein and peptide sample preparation due to their magnetic properties, biocompatibility, easy synthesis and surface functionalization. MNPs loaded with analyte or analyte modification reagent can be easily separated from the reaction medium by an externally applied magnetic field. The small size of MNPs provides high analyte loading and extraction capacity. Additionally, MNP can be decorated with different functional groups to achieve selective modification or extraction of analyte. In this study we have utilized silica coated iron oxide magnetic nanoparticles (Fe3O4@SiO2 MNPs) for protein and peptide sample preparation. Fluorescence-based methods were utilized for quantitative and qualitative characterization of N-hydrosucccinimidyl (NHS) ester groups on the surface of Fe3O4@SiO2 MNPs. Fluorophore Dansylcadaverine was conjugated to NHS ester functional groups. Fluorometric measurement of cleaved dansylcadaveine was employed to determine the number of NHS ester groups per MNPs that was found to be 2.6 × 102 and 3.4 × 103for 20 nm and 100 nm Fe3O4@SiO2 MNPrespectively. The efficiency of labeling native bovine serum albumin (BSA) by NHS ester coated Fe3O4@SiO2 MNPs was also explored in terms of maximizing the number of MNPs conjugated per BSA molecule or maximizing the number of BSA molecules conjugated per each MNP. Lysine residues of apolipoprotein B-100 (apoB-100) on the surface of intact human low density lipoprotein (LDL) were labeled by NHS ester modified Fe3O4@SiO2 MNPs in aqueous solvents at room temperature. The MNP labeledapoB-100 was treated by SDS to remove lipids and then digested using trypsin. Tryptic peptides were eluted from MNPs by cleaving disulfide linkage between labeled peptides and MNPs. LC-MS/MS analysis found 28 peptides containing labeled lysine residues. These lysine residues should be on the solvent exposed surface of LDL since the large size of MNPs prevents contact of the labeling reagent to those lysines embedded inside the structure of LDL. TCEP- immobilized Fe3O4@SiO2MNPs were fabricated and utilized for reduction of disulfide bonds in bovine pancreas insulin and two different cyclic peptides. Disulfide bonds were efficiently cleaved at room temperature in both organic and aqueous solvents confirmed by LC-MS/MS analysis of reduced/alkylated protein and peptides. Disulfide reduction and alkylation reactions was performed in one step and the reducing agent was simply separated from peptide and protein solution by magnetic separation.

科学研究費補助金 研究種目:一般研究(B) 課題番号:06453174 研究代表者:川岸 舜朗 研究期間:1994-1995年度