Orientadora: Mary Marcondes / Banca: Raimundo Souza Lopes / Banca: Áureo Evangelista Santana / Banca: Vera Lúcia Fonseca de Camargo-Neves / Banca: Carlos Eduardo Larsson / Resumo: O presente estudo teve como objetivos comparar a resposta da imunoglobulina G e de suas subclasses nos seguintes grupos de animais; cães hígidos (n=45), animais sintomáticos naturalmente infectados por Leishmania sp. (n=45), animais assintomáticos naturalmente infectados por Leishmania sp. (n=45), cães portadores de leishmaniose visceral submetidos à tratamento (n=27) e animais hígidos submetidos à vacinação contra a doença (n=37). Inicialmente foram avaliadas IgG1 e IgG2 utilizando anticorpos policlonais e posteriormente as quatro subclasses de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) com anticorpos monoclonais na tentativa de identificar um perfil de resposta para cada grupo de cães. As determinações sorológicas foram realizadas por meio da técnica de ELISA. A avaliação das subclasses de IgG com anticorpos policlonais não permitiu diferenciar os grupos de cães estudados. Por outro lado, com os anticorpos monoclonais observou-se que o grupo sintomático apresentou estimulação de todas as subclasses de IgG enquanto nos animais assintomáticos apenas a fração IgG1 foi estimulada. Nos cães submetidos a tratamento todas as frações encontravam-se elevadas e nos vacinados ocorreu estimulação de IgG1, IgG3 e IgG4. Desta forma, a avaliação das quatro subclasses permitiu a diferenciação entre animais portadores de leishmaniose visceral com e sem quadro clínico; entre cães vacinados e cães assintomáticos acometidos pela doença; e entre cães com leishmaniose visceral submetidos a tratamento e cães infectados assintomáticos. / Abstract: The present study aimed to compare immunoglobulin G subclasses in the following groups of animals: healthy dogs (n=45); symptomatic Leishmania sp. naturally infected dogs (n=45); asymptomatic Leishmania sp. naturally infected dogs (n=45); dogs with visceral leishmaniasis submitted to treatment (n=27) and healthy dogs vaccinated for visceral leishmaniasis (n=37). First of all IgG1 and IgG2 were evaluated using polyclonals antibodies, and later the four subclasses of IgG (IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4) were evaluated with monoclonals antibodies, in order to identify a profile of reply for each group of dogs. Serological tests were carried out using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The evaluation of the subclasses with polyclonals antibodies did not allow to differentiate the groups of studied dogs. On the other hand, with monoclonals antibodies it was possible to verify that symptomatic dogs presented stimulation of all subclasses of IgG, while in asymptomatic animals only IgG1 was stimulated. In dogs submitted to treatment all fractions increased, and in vaccinated ones occurred stimulation of IgG1, IgG3 and IgG4. In such a way, the evaluation of the four subclasses allowed the differentiation between symptomatic and asymptomatic infected dogs; between vaccinated dogs and asymptomatic infected dogs; and between infected dogs submitted to treatment and asymptomatic infected dogs. / Doutor

Leishmania amazonensis é um parasito endêmico no Brasil, que ao infectar humanos, pode causar a leishmaniose cutânea. Cerca de 12 milhões de pessoas estão infectadas com parasitos do gênero Leishmania em 98 países, e anualmente, 350 milhões de indivíduos estão em risco de contrair esta doença. Enquanto o papel da imunidade adaptativa já foi extensivamente investigado, em modelos de infecção com Leishmania spp., os mecanismos de alguns receptores da imunidade inata, e principalmente dos citosólicos, como é o caso do AIM2, permanecem obscuros. Recentemente, o nosso grupo descreveu a importância do inflamassoma de NLRP3 no controle da infecção por L. amazonensis, o qual é mediado pela produção de óxido nítrico dependente da sinalização de IL-1R. Neste trabalho, foi demonstrado que a deficiência para IL-1R confere uma maior susceptibilidade a este parasito do que a deficiência para NLRP3. Sugerindo que outros inflamassomas, que operam via IL- 1R, possam estar envolvidos na resposta contra este patógeno. Dentre estes, o AIM2 destacase como sendo um receptor de DNA citosólico que mediante a sua ativação promove a secreção de citocinas pro-inflamatórias e piroptose. Neste contexto, nós demonstramos que o AIM2 promove o controle da infecção in vitro por L. amazonensis em macrófagos, e que estas células requerem este sensor de DNA para a secreção de IL-1?, expressão da enzima NOS2 e produção de óxido nítrico. Adicionalmente, também observamos que AIM2 promove resistência à infecção por L. amazonensis in vivo, contribuindo para o desenvolvimento de uma resposta Th1. Por fim, também demonstramos que o inflamassoma de AIM2 atua na produção de IL-1? e IL-1?, por células dendríticas, assim como na expressão de CD86 e CD40 e na secreção de IL-12 por estas células. Desta forma, foi demonstrado neste trabalho que o AIM2, ao ativar células da imunidade inata e adaptativa, promove o controle direto ou indireto da infecção por L. amazonensis. / Leishmania amazonensis is an endemic parasite in Brazil that can cause the cutaneous leishmaniasis in humans. Annually, around 12 million people are infected with Leishmania spp. parasites, in 98 countries. In addition, 350 million of individuals are on risk to develop this disease. While the role of the adaptive immune response was already extensively evaluated, on models of infection with Leishmania spp., the mechanisms of some innate immune receptors, and mainly the cytosolic ones, such as AIM2, remain unclear. Recently, our group described the importance of the NLRP3 inflammasome to the control of L. amazonensis mediated by NO, which is dependent of the IL-1R signaling. In this work, it was also reported that the Il-1r deficiency displayed a higher susceptibility to L. amazonensis infection in comparison to Nlrp3-deficient mice. Suggesting that other inflammasomes, which may operate through IL-1R, might be involved in the response to this pathogen. Among these, the AIM2 highlights as a cytosolic DNA sensor, which, after its activation, promotes the secretion of proinflammatory cytokines and pyroptosis. On this context, we demonstrated that AIM2 promotes the in vitro control of L. amazonensis in macrophages, and that these cells require this DNA sensor for the IL-1? secretion, NOS2 expression and NO production. In addition, we also observed that AIM2 promotes the in vivo resistance to L. amazonensis infection, contributing for the development of a Th1 response. Finally, we also demonstrated that AIM2 acts on the production of IL-1? and IL-1?, by dendritic cells, as well as on the CD86 and CD40 expression and IL-12 secretion by these cells. Therefore, in this work, we showed that the AIM2, leading to the activation of innate and adaptive immune cells, promotes the direct or indirect control of L. amazonensis infection.

Antimonpräparate sind seit über 60 Jahren der Standard zur Behandlung der Leishmaniose. Immer häufiger kommt es jedoch zum Therapieversagen durch resistente Erreger. In Indien sprechen über 60 % der erstmalig mit Antimonpräparaten behandelten Patienten nicht mehr auf die Therapie an (Sundar et al., 2000). Obwohl dies ein großes Problem darstellt, ist bisher wenig über die Resistenzmechanismen der Parasiten bekannt. Durch die Aufklärung dieser Mechanismen könnten zwei Hauptziele erreicht werden: i) Es könnten optimierte Medikamente entwickelt werden, die die Resistenzmechanismen der Parasiten umgehen. ii) Es könnten diagnostische Maßnahmen ergriffen werden, um vor Beginn einer Therapie deren Erfolgschancen zu kalkulieren. So würde man dem Patienten die starken Nebenwirkungen sowie die Kosten der Antimontherapie ersparen. Desweiteren könnte sofort mit einer wirkungsvollen Therapie begonnen und somit die Zeitspanne verkürzt werden, in der der infizierte Patient ein Reservoir für die weitere Transmission der Parasiten darstellt. In Vorarbeiten wurde durch genetische Komplementation das Gen LbrM20_V2.0210 (Lbr_0210) vorläufig identifiziert, das bei Überexpression Antimonresistenz vermittelt (Dissertation A. Nuehs, 2010). Diese Arbeiten wurden mit Leishmania braziliensis durchgeführt. Direkt benachbart befindet sich ein strukturell sehr ähnliches Gen, LbrM20_V2.0200 (Lbr_0200). Beide Gene wurden bei den vorangegangenen Sb(III)-Selektionen untersucht. Hierbei konnte ausschließlich Lbr_0210 als resistenzvermittelnd identifiziert werden. Datenbankrecherchen ergaben, dass es zu Lbr_0210 je ein direktes orthologes Gen in Leishmania infantum und Leishmania major gibt. Das Ziel des ersten Teils dieser Doktorarbeit war es, die resistenzvermittelnde Funktion des zu Lbr_0210 orthologen Gens aus L. infantum, LinJ34.0220, in unterschiedlichen Leishmania-Spezies zu verifizieren. Es war vor allem wichtig die Frage zu beantworten, ob das Gen auch im pathogenen Stadium des Parasiten, also in intrazellulären Amastigoten, Resistenz gegenüber Pentostam®, einem Standardmedikament, vermittelt. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte das Protein strukturell und zellbiologisch charakterisiert werden, um Hinweise auf den Resistenzmechanismus zu erhalten. Durch den Vergleich mit dem zu Lb_0200 orthologen Gen aus L. infantum, LinJ34.0210, sollten Hinweise auf die unterschiedlichen Aufgaben der Proteine gesammelt werden.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-14T18:17:57Z No. of bitstreams: 1 Lais da Silva Pereira. Avaliação das histonas...2013.pdf: 2452594 bytes, checksum: 808d7633f6d2684df54ea8b640e282c0 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-14T18:17:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lais da Silva Pereira. Avaliação das histonas...2013.pdf: 2452594 bytes, checksum: 808d7633f6d2684df54ea8b640e282c0 (MD5) Previous issue date: 2013 / Universidade Federal da Bahia. Salvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A leishmaniose visceral é uma doença infecciosa grave, causada por protozoários intracelulares obrigatórios do gênero Leishmania. Vários antígenos de Leishmania têm sido avaliados como candidatos vacinais, destacando-se as proteínas de histonas (HIS), antígenos altamente conservados. A exposição de HIS pela Leishmania induz uma resposta imune potente no hospedeiro vertebrado. Desse modo, neste estudo, avaliamos, em hamsters, a capacidade imunoprotetora dos antígenos de histonas contra a infecção por Leishmania infantum. Os animais foram vacinados com estratégia homóloga, utilizando-se plasmídeos de DNA que codificam para HIS (pcDNA3LiH2A-H3, pcDNA3LiH2B-H4) ou heteróloga (DNA/proteínas HIS) mais 1nM de CpG. Quinze dias após a última imunização, os animais foram desafiados pela via intradérmica com 105 Leishmania infantum metacíclicas mais 0,5 par de glândula salivar de Lutzomya longipalpis. Após a última imunização e durante a infecção, realizaram-se dosagens de citocinas por PCR em tempo real (linfonodo e baço), sorologia por ELISA (soro), carga parasitária por diluição limitante e análise histopatológica de tecidos (linfonodo, baço e fígado). Detectou-se produção de anticorpos IgG anti HIS nos grupos imunizados com a estratégia homóloga e heteróloga, quando comparados aos hamsters não imunizados. As imunizações homóloga e heteróloga diferiram na razão IFN-γ/IL-10 no linfonodo em relação ao grupo controle. Não houve diferença significativa na expressão dessas citocinas no baço após a imunização, entretanto, cinco meses após o desafio o grupo homólogo apresentou um aumento na produção de IL-10 nesse órgão. Na análise histopatológica do baço, verificou-se formação de mais folículos com centro germinativo, evidentes nos animais imunizados independentemente do grupo analisado. Observou-se, também, leucocitose intrasinusoidal e periportal no fígado, e folículos reativos no linfonodo. Nenhuma das estratégias de imunizações com antígenos de histonas acarretou em diminuição da carga parasitária no linfonodo, baço e fígado. As estratégias de imunização homóloga e heteróloga, com antígenos de histonas nucleossomais, não foram capazes de proteger contra infecção por L. infantum no modelo do hamster. / Visceral leishmaniasis is a serious infectious disease caused by obligatory intracellular protozoan of the Leishmania genus. Many antigens from Leishmania have been evaluated as vaccine candidates mainly the histones (HIS) that are highly conserved. Exposure to HIS from Leishmania elicits a strong host immune response in the vertebrate host. Threfore, in this study, we evaluated the immunoprotective ability of HIS antigens against infection by Leishmania infantum in hamsters. The animals were immunized with homologous strategy using plasmid of the DNA coding for HIS (pcDNA3LiH2A-H3, pcDNA3LiH2B-H4) or heterologous strategy using DNA and recombinant protein plus CpG. Fifteen days after last immunization, the animals were challenged by the intradermal route with 105Leishmania infantum metacyclics plus 0,5 pair of Lutzomya longipalpis salivary gland. After the last immunization and in the course of the infection, we determined cytokine production by Real time PCR (lymph node and spleen), serology by ELISA (sera), parasite burden was estimated by limiting dilution assay and histopathological analysis (lymph node, spleen and liver). Production of antibody anti HIS IgG was detected in the immunized groups treated with the homologous and heterologous strategies when compared to non-immunized hamsters. Homologous and heterologous immunizations altered the ratio of IFN-γ/IL-10 in the lymph node compared to the control group. There is not a significant difference in the expression of this cytokine in the spleen after the immunization, however, five months after the challenge the homologous group presented a higher expression of IL-10 in this organ. The histopathological analysis of the spleen showed the formation of high number of follicles with a germinative center in the immunized animals independently of the immunization employed. Intrasinusoidal and periportal leukocytosis were observed in the liver and reactive follicles in the lymph node. Both immunization strategies with histone antigen did not result in reduction of parasite burden in the lymph node, spleen and liver. Immunization with homologous and heterologous strategies using histone antigen were not able to confer protection in the hamster model against L. infantum infection.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-25T18:00:25Z No. of bitstreams: 1 Manuela da Silva Solcà. Uso do PCR...pdf: 11332317 bytes, checksum: 657938584a2c80bcdcc02a52c2d8fa4d (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-25T18:00:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Manuela da Silva Solcà. Uso do PCR...pdf: 11332317 bytes, checksum: 657938584a2c80bcdcc02a52c2d8fa4d (MD5) Previous issue date: 2012 / Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina da Bahia. Salvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / No Brasil, os cães são considerados como o principal reservatório doméstico para Leishmania infantum (sin. L. chagasi). Desta forma, o diagnóstico da leishmaniose visceral canina (LVC) deve ser rápido e preciso. Este trabalho visa comparar a performance da reação em cadeia da polimerase (PCR) em detectar o DNA do parasito em diferentes tecidos para diagnóstico da LVC. Com este intuito, na primeira parte do estudo, foi padronizado um protocolo de PCR convencional (cPCR), para detecção do DNA do minicírculo do cinetoplasto (kDNA) de Leishmania sp., em 45 fragmentos esplênicos caninos. As mesmas amostras foram avaliadas utilizando-se um protocolo de PCR quantitativa (qPCR) tendo como alvo o gene da subunidade do RNA ribossomal (SSU rRNA) de Leishmania sp. Também foi comparada a eficácia do diagnóstico para LVC pelas técnicas moleculares e convencionais como a cultura e o ELISA. A cPCR apresentou sensibilidade mais elevada para detecção de DNA de Leishmania sp. (88,9%), comparada à qPCR (83,3%). Possivelmente o melhor desempenho da cPCR foi devido ao maior números de cópias do kDNA no genoma da Leishmania sp. Diante dos promissores resultados apresentados pela cPCR tendo o kDNA como alvo, na segunda parte do estudo foi padronizado um novo protocolo de qPCR com este mesmo alvo, objetivando-se aumentar a sensibilidade da técnica. Foram selecionados aleatoriamente 61 cães errantes e classificados de acordo com o número de sinais clínicos associados à LVC apresentados. Todos os cães foram eutanasiados, e durante a necropsia, foram coletados fragmentos de linfonodo, aspirado esplênico, medula óssea e sangue. Também foram realizadas culturas esplênicas e ELISA. A qPCR foi empregada para a avalição da taxa de detecção do DNA do parasito e carga parasitária nos diferentes tecidos. As diferenças entre a carga parasitária de cada tecido foram avaliadas pelo teste de Friedman (p ≤ 0,05). Para inclusão dos tecidos nas análises dos resultados de qPCR, foi avaliada a integridade do material genético de cada amostra. Desta forma, 52 animais apresentaram resultados que atendiam aos critérios de seleção para baço, sangue e linfonodo, e destes, 24 animais também atendiam aos critérios para medula óssea. Utilizando-se a qPCR e considerando pelo menos um dos tecidos avaliados, foi detectado o DNA do parasito em todos os cães. A qPCR detectou DNA do parasito em 98,1% dos aspirados esplênicos, 80,8% das amostras sanguíneas, 53,8% dos linfonodos e 41,7% dos aspirados de medula óssea. A carga parasitária foi melhor detectada nos aspirados esplênicos, em relação ao linfonodo, nos animais oligossintomáticos e polissintomáticos (p ≤ 0,05). O aspirado esplênico foi o tecido com maior taxa de detecção do DNA de Leishmania sp. pela qPCR. No entanto, não foi achada diferença estatística entre a carga parasitária do aspirado esplênico e do sangue. Desta forma, a amostra sanguínea, por ser a segunda amostra de melhor taxa de detecção, e por necessitar uma coleta menos invasiva, foi considerada como uma amostra alternativa válida para a detecção do DNA de Leishmania sp. em cães sintomáticos, utilizando a qPCR. / Because infected dogs are widely considered to be the main domestic reservoir for Leishmania infantum (syn. L. chagasi) parasites in Brazil, the diagnosis of canine visceral leishmaniasis (CVL) must be made both accurately and promptly. The aim of the present study was to compare the performance of the Polymerase Chain Reaction (PCR) to detect parasite DNA in different clinical sample for CVL diagnosis. For this purpose, in the first stage of the study, a conventional PCR (cPCR) protocol was standardize to detect the presence of Leishmania sp. kinetoplast minicircle DNA (kDNA) in 45 canine spleen fragments. The same samples were evaluated using a quantitative PCR (qPCR) technique targeting the Leishmania sp. sub-unit of the ribossomal RNA (SSU rRNA) gene. A comparison was made between the efficacies of these molecular diagnostic techniques and conventional parasitological and serological methods. The cPCR presented the highest sensitivity for Leishmania sp. DNA detection (88,9%), when compared to qPCR was (83.3%). Possibly the cPCR best performance was due to a higher copies number of the kDNA in the Leishmania sp. genome. Given the promising results presented by the cPCR targeting the kDNA, a new qPCR protocol with the same target was standardized in the second stage of the study, aiming increase the technique sensitivity. Sixty-one stray dogs were randomly selected and classified according to the number of clinical signs of CVL. All dogs were euthanized and lymph node fragments and splenic, bone marrow and blood aspirates were obtained during necropsies. ELISA and parasite culture of spleen aspirates were performed to confirm parasite infection. The qPCR was used to determine the parasite DNA detection rate and the parasite load in the clinical samples. Differences between parasite loads of each tissue were evaluated using Friedman test (p ≤ 0.05). In order to include the samples in the qPCR data analysis, the DNA integrity of each sample was analyzed. This way, 52 dogs fulfilled the selection criteria for DNA results for spleen, blood and lymph nodes, with 24 of these dogs also fulfilling the criteria for bone marrow results. Using qPCR, all the 52 dogs showed positivity, considering at least one of the tissues evaluated. Positivity in qPCR was detected in 98.1%8 of the splenic aspirates, 80.8% of blood samples, 53.8% of lymph node fragments and 41.7% of bone marrow samples. Using qPCR, parasite DNA was better detected in splenic aspirates in comparison with lymph node in both polysymptomatic and oligosymptomatic (p ≤ 0.05) dogs. Splenic aspirates have shown to be the tissue with highest Leishmania sp. DNA detection rate using qPCR, however no statistical difference was found between blood and splenic aspirate to detect. Thus, the blood sample, being the second sample with best DNA detection rate and requiring a less invasive collection, was considered a valid alternative sample for Leishmania sp. DNA detection in symptomatic dogs using the qPCR.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-31 / Com o intuito de obter informações sobre a expressão de lipídeos de formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis, parasitas foram analisados durante o crescimento logarítmico e estacionário quanto à composição de glicolipídeos e fosfolipídeos. Em paralelo, dois anticorpos monoclonais (mAbs), denominados LST-1 e LST-2, foram produzidos, caracterizados e utilizados neste estudo. A expressão de fosfolipídeos em promastigotas durante o crescimento logarítmico e estacionário foi analisada por cromatografia em camada delgada de alta resolução (HPTLC). O extrato lipídico total de promastigotas de L. (L.) amazonensis apresenta fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserina (PS), fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), Liso-PI e inositol fosforilceramida (IPC), este último caracterizado por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa, contendo esfingosina (d18:1) e ácidos graxos, principalmente ácido esteárico (C18:0) e ácido palmítico (C16:0). Enquanto as proporções molares de IPC, PS, PE, Liso-PI aumentaram com o decorrer do tempo de cultura, as proporções molares de PI e PC diminuíram. O perfil cromatográfico dos glicolipídeos se manteve constante durante o crescimento logarítmico e estacionário. Os mAbs LST-1 e LST-2 foram produzidos contra a fração enriquecida em glicolipídeos e IPC de formas promastigotas de L. (L.) amazonensis. Os dois anticorpos pertencem a classe IgM. O mAb LST-1, por imunocoloração de placas de HPTLC, reconhece um componente lipídico acídico, eluído da coluna de DEAE-Sephadex com acetato de sódio 0,2 M, que apresenta migração cromatográfica característica de IPC, o qual é resistente à hidrólise alcalina e é corado com reagente de Dittmer-Lester. Já, o mAb LST-2 foi reativo com a fração de glicolipídeos não retida na coluna de DEAE-Sephadex, e visibilizada nas placas de HPTLC com orcinol/H2SO4. Por IFI, os dois mAbs mostraram alta reatividade com formas promastigotas de L. (L.) amazonensis. O tratamento dos parasitas com isopropranol:hexano:água (IPA:Hex:água) (55:20:25; v/v/v) aboliu a reatividade, indicando que os antígenos reconhecidos pelos mAbs estão presentes somente na fração lipídica. LST-1 não foi reativo com parasitas vivos, sugerindo que o IPC está críptico na membrana, sendo talvez expresso somente no folheto interno da membrana plasmática. Já, o mAb LST-2 apresentou forte reatividade com promastigotas vivos, aglutinando-os, indicando que os glicolipídeos reconhecidos por LST-2 encontram-se na superfície do parasita. Por imunofluorescência indireta com LST-1 e LST-2 verificou-se que amastigotas isoladas de lesão não são reconhecidos pelos mAbs, e por outro lado, forte fluorescência foi detectada com amastigotas axênicos. Por cromatografia em placas de HPTLC, de extratos lipídicos purificados de amastigotas, verificou-se que os amastigotas isolados de lesão de animais infectados por L. (L.) amazonensis, apresentam diferentes perfis cromatográficos de glicolipídeos e fosfolipídeos em relação aos promastigotas e aos amastigotas axênicos. Enquanto os amastigotas isolados de lesão são ricos em glicoesfingolipídeos, os amastigotas axênicos e promastigotas apresentam glicoinositolfosfolipídeos (GIPLs) reconhecidos pelo mAb LST- 2 e IPC reconhecido pelo mAb LST-1. O mAb LST-1 apresentou reatividade com formas promastigotas de todas as espécies de Leishmania analisadas, e também com formas epimastigotas de T. cruzi. Nestes parasitas, foi observado que LST-1 reconhece especificamente IPC, sendo o resíduo de inositol e a ceramida essenciais para a reatividade do mAb LST-1. Já, o mAb LST-2, por imunofluorescência indireta, apresentou forte marcação somente com formas promastigotas ou amastigotas axênicos de L. (L.) amazonenis, reconhecendo 4 componentes glicolipídicos denominados bandas a, b, c, e d, que correspondem a GIPLs. A porção carboidrato é fundamental para a reatividade do mAb LST-2. Analisando-se macrófagos infectados com promastigotas de L. (L.) amazonensis, verificou-se por imunofluorescência indireta com o mAb LST-2, que os promastigotas durante a adesão/infecção de macrófagos, secretam ou transferem para os macrófagos os antígenos glicolipídicos, reconhecidos pelo mAb LST-2. Forte fluorescência na superfície de macrófagos infectados é observada já na primeira hora de infecção, e com o decorrer da infecção (até 4 horas) observa-se, somente nos macrófagos infectados, pequenas vesículas fluorescentes, que não correspondem a fagossomos contendo os parasitas. Assim, nesta tese, foi demonstrado que amastigotas isolados de lesão em relação a amastigotas axênicas e promastigotas de L. (L.) amazonensis apresentam padrões distintos de glico(fosfolipídeos). Enquanto amastigotas isoladas de lesão expressam GSLs, amastigotas axênicas e promastigotas expressam IPC e GIPLs, sendo que estes últimos sendo liberados pelo promastigota durante a infecção de macrófagos. / In order to obtain information about the lipid expression of promastigote forms of Leishmania (Leishmania) amazonensis, the parasites lipid composition profile was analyzed during log and stationary phase. Two monoclonal antibodies (mAb) termed LST-1 and LST-2 were produced, characterized and used in this study. Promastigote phospholipid expression on log and stationary growth phases were analyzed by high performance thin layer chromatography (HPTLC). At either phase the total lipid extract of L. (L.) amazonensis promastigotes presents phosphatidylinostol (PI), phosphatidylserine (PS), phosphatidylcholine (PC) phosphatidylethanolamine (PE), Lyso- PI and inositol phosphorylceramide (IPC). IPC was characterized by GC/MS, and it was detected sphingosine (d18:1) and fatty acids, mainly palmitic acid (C16:0), and stearic acid (C18:0). It was noted that the molar proportions of IPC, PS, PE and Lyso-PI increased during the culture time, while the percentage of PI and PC decreased. Unlikely, the glycolipid chromatographic profile did not change during the promastigotes growth at log and stationary phases. The mAbs LST-1 and LST-2 were produced against a glycolipid and IPC enriched fraction purified from promastigote forms of L. (L.) amazonensis. Both antibodies are IgM. By HPTLC immunostaining it was demonstrated that mAb LST-1 recognized an acidic lipid component, eluted with 0.2 M of sodium acetate from DEAE-Sephadex column. The LST-1 reactive component presents: i) chromatographic migration characteristic of IPC, ii) is resistant to alkaline hydrolysis; iii) is stained with Dittmer-Lester reagent. On the other hand, the mAb LST-2 was reactive with the glycolipid fraction not retained in DEAE-Sephadex column, and this fraction was visualized on HPTLC by primuline and orcinol/H2SO4 staining. By indirect immunofluorescence, both antibodies showed high reactivity with L. (L.) amazonensis promastigotes. Parasites delipidation with isopropanol:hexane:water (55:20:25; v/v/v), abolished the mAbs reactivity, indicating that the antigens recognized by LST-1 and LST-2 are present exclusively in the lipid fraction. MAb LST-1 did not react with non-fixed parasites, suggesting that IPC is cryptic in the membrane, and maybe localized only in the inner leaf of plasma membrane. Contrasting, mAb LST-2, showed a strong reactivity with live L. (L.) amazonensis promastigotes, also parasite agglutination was observed, indicating that the glycolipids recognized by LST-2 are in parasite surface. By indirect immunofluorescence with LST-1 and LST-2 no reactivity was observed with amastigotes isolated from L. (L.) amazonensis infected hamsters, conversely axenic amastigotes showed a strong fluorescence with both mAbs. By HPTLC it was verified that the lipid fractions of promastigotes, axenic amastigotes and amastigotes isolated from footpad lesions, presented distinct glycolipids and phospholipids profiles. Amastigotes isolated from lesions are rich in glycosphingolipids, whereas axenic amastigotes and promastigotes present glycoinositolphospholipids (GIPLs) recognized by LST-2, and IPC recognized by mAb LST-1. The LST-1 antibody recognized promastigotes from all species of analyzed, and also T. cruzi epimastigotes. It was determined that LST-1 recognizes specifically IPC in these parasites, and it was established that the inositol residue and the ceramide are essential for LST-1 reactivity. By indirect immunofluorescence with mAb LST-2 a strong labeling of only L. (L.) amazonensis promastigotes and axenic amastigotes was observed. LST-2 recognizes 4 glycolipid components termed a, b, c and d, which correspond to GIPLs. It was demonstrated that the carbohydrate moiety is fundamental for LST-2 reactivity. L. (L.) amazonensis promastigotes infected macrophages showed by indirect immunofluorescence, that promastigotes during the macrophage adhesion/infection, secrete or transfer GIPLs recognized by mAb LST-2 to the macrophage. Strong fluorescence in infected macrophage was observed in the first hours of infection. During the next hours of infection (up to 4 hours) also small fluorescent vesicles were observed in the infected macrophages, which did not correspond to phagossomes containing parasites. Thus, these studies describe distinct (glyco)phospholipid profile in lesion amastigotes, axenic amastigotes and promastigotes, and GIPLs vesicles formation during macrophage infection by promastigotes. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2012-05-07T14:43:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000016.pdf: 4291233 bytes, checksum: f149ce1f280b020c58832d513c7acb8b (MD5) Previous issue date: 2007 / O presente estudo teve como objetivo caracterizar a eco-epidemiologia da leishmaniose tegumentar americana no município de São Vicente Férrer, Zona da Mata Norte de Pernambuco, visando identificar e incriminar hospedeiros reservatórios silvestres e ou domésticos envolvidos na manutenção da endemia, identificar a(s) espécie (s) de Leishmania circulantes e identificar as espécies de flebotomíneos. No período de dezembro de 2002 a novembro de 2003, foram realizadas capturas de flebotomíneos, através de coleta manual, com armadilha de Shannon, e armadilhas luminosas CDC. Os animais silvestres foram capturados com armadilhas do tipo Tomahawk, no período de março a outubro de 2006. Um inquérito epidemiológico foi realizado com cães onde foi aplicado um questionário. Na ocasião foi coletado material de medula óssea para confecção de lâminas e realização da PCR onde obtivemos um cão positivo. Outro inquérito epidemiológico foi realizado na população humana da localidade de Mundo Novo onde de um total de 181 pacientes, 68 (37,6 por cento) foram positivos para IDRM. Um isolado foi obtido de paciente e a cepa caracterizada através de isoenzimas e anticorpos monoclonais como sendo L. (V.) brazileinsis. Dos 118 animais silvestres e sinatropicos examinados 22 (9,32 por cento) foram positivos L. (V.) braziliensis de três espécies diferentes: Nectomys squamipes, Rattus rattus e Holochilus sciureus. Foi realizado também um isolamento de L. braziliensis, caracterizado através de anticorpos monoclonais, obtido através de hamster incoculado com material do animal silvestre Nectomys squamipes. 23.156 exemplares de flebotomíneos foram coletados em resquícios de Mata Atlântica, domicílios e peridomicílios, dos quais L. complexa obteve predominância com 14.445 (62,5 por cento) do total, seguido de L. migonei, com 7.677 (33,2 por cento). L. whitmani, vetor de L. (V.) braziliensis foi encontrado em baixa densidade nesta região.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-07-20T21:20:40Z No. of bitstreams: 1 Kiyoshi Ferreira Fukutani Aplicação de técnicas sorológicas e moleculares....pdf: 8948929 bytes, checksum: 731ecff23760ac556b55cf07dd7c1cc5 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-20T21:20:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kiyoshi Ferreira Fukutani Aplicação de técnicas sorológicas e moleculares....pdf: 8948929 bytes, checksum: 731ecff23760ac556b55cf07dd7c1cc5 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / Aplicação do Exame sorológico (ELISA) e do PCR na detecção de Leishmania chagasi em doadores de sangue na cidade de Salvador. A leishmaniose é causada por protozoários do gênero Leishmania e constitui um problema grave de saúde pública na Bahia. A transmissão do protozoário pela transfusão de sangue já foi relatada e existe a possibilidade dos hemoderivados serem um potencial risco para a manutenção da doença. O presente trabalho teve como objetivo avaliar positividade sorológica contra Leishmania e a presença deste parasita no sangue periférico de doadores, na cidade de Salvador, BA. Para estipulando a soroprevalência de leishmaniose em doadores de sangue, foram coletadas amostras de sangue periférico de 700 indivíduos, no Hemocentro da Bahia (HEMOBA/SESAB), de janeiro a setembro de 2010. As amostras foram processadas para a obtenção de plasma e de DNA. A sorologia anti-Leishmania foi feita por ELISA, empregando antígeno solúvel de Leishmania chagasi (SLA). A presença de parasitas foi determinada por PCR qualitativo e por PCR quantitativo (qPCR). A população amostral foi composta por 74.5% de indivíduos masculinos, com média de idade de 34 anos. A partir de uma curva ROC, empregando soros de pacientes com leishmaniose visceral e soros de pacientes residentes em área não endêmica, o ponto de corte para o teste sorológico foi estabelecido em 0,0167 (DO em 405nm). A sorologia anti-Leishmania foi positiva em 5.4% (38/700) das amostras. Destes indivíduos, 73% (28/38) apresentaram amplificação para uma região repetitiva do genoma de Leishmania, empregando-se o PCR qualitativo. Empregando o qPCR, foi possível determinar a presença de parasitas em 0.4% (3/700) amostras e, nestas, a quantificação foi inferior a 10 parasitas. Nossos resultados mostram a prevalência de sorologia anti-Leishmania é de 5.4%, em doadores do HEMOBA/SESAB, similar ao encontrado em outras área onde ocorre a leishmania. / Application of serological examination (ELISA) and PCR detection of Leishmania chagasi infection in blood donors in Salvador. Leishmaniasis is caused by protozoa of the genus Leishmania and is a serious public health problem in Bahia. The transmission of the parasite by blood transfusion has been reported and the possibility of blood products being a potential risk for disease transmission currently exists. This study aimed to evaluate seropositivity against Leishmania and the presence of parasites in peripheral blood from blood donors in Salvador, Bahia. To assess the prevalence of anti-Leishmania antibodies in blood donors, we collected peripheral blood samples from 700 individuals in the Blood Bank of Bahia (HEMOBA/SESAB), from January to September 2010. The samples were processed to obtain plasma and DNA. The anti-Leishmania serology was performed by ELISA employing Leishmania chagasi soluble antigen (SLA). The presence of parasites was determined by qualitative PCR and quantitative PCR (qPCR). The sample population comprised 74.5% of males with a mean age of 34 years. From a ROC curve, using sera from patients with visceral leishmaniasis and sera from patients residing in non-endemic areas, the cutoff for the serologic test was set at 0.0167 (OD at 405nm). The anti-Leishmania serology was positive in 5.4% (38/700) samples. Of these, 73% (28/38) showed amplification of a repetitive region of the genome of Leishmania, using the qualitative PCR. Using the qPCR, we determined the presence of parasites in 0.4% (3 / 700) samples, and in these, the amount was less than 10 parasites. Our results show the prevalence of anti-Leishmania serology is 5.4% in donors, similar to that found in other areas where Leishmania is.

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-11-19T18:30:11Z No. of bitstreams: 1 karen_s_charret_ioc_bp_0055_2011.pdf: 28875915 bytes, checksum: 38bf86603dba71d83a48b9e25560c47f (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-19T18:30:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 karen_s_charret_ioc_bp_0055_2011.pdf: 28875915 bytes, checksum: 38bf86603dba71d83a48b9e25560c47f (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / Atualmente, não há vacina eficaz e o controle das leishmanioses depende principalmente da quimioterapia. Recentemente, novos compostos sintéticos os derivados carbohidrazidas pirazolocas apresentaram atividade em Leishmania amazonensis in vitro e quando testadas em modelo experimental murino de infecção de L. amazonensis mostraram eum efeito um efeito terapêutico significativo. Um estudo com compostos intermediários da síntesedas carbohidrazidas poderia ser interessante, pois estes possuem uma potencial atividade leishmanicida e ajudaria a cmpreender os mecanismos de ação dos compostos finais. Por outro lado, é necessário conhcer o comportamento do sistema imune frente a estes compostos na infecção por leishmaniose.Os compostos precursores naão foram ativos em formas promastigotas de L. amazonensis. No entanto, todos os compostos apresentaram atividade sobre formas de amastigotas e sem citotoxicidade em célula de mamíferos. Aqui, foi sugerida a contribuição farmacofórica do anel N-heteroaromático para a atividade leishmanicida e do grupamento hidrazina para o composto intermediário. Além disso, foi mostrado que todos os componentes podem induzir um aumento da produção de óxido nitrico em macrófagos estimulados ou não. Em camundongos CBA infectados com L amazonensis e tratados por via oral com os derivados carbohidrazidas, o estudo histopatológico rervelou que mudanças na derme foram correlacionadas com o tamanho macroscópico da lesão. Camundongos CBA infectados e tratados tinham lesões cutâneas menores, e as estruturas da epiderme e derme tinham níveis mais baixos de infiltrtado inflamatório, comparadas com as de camundongos controles infectados e não tratados. Também foi observado um infiltrado inflamatório misto contendo linfócitos e neutrófilos. Além disso, expressão de IL-4 RNAm foi menor no grupo tratado.. Um aumento dos níveis de anticorpos das subclasses específicas anti-Leishmania IgG2a e IgG3 foi observado nos grupos tratados com as pirozol carbohidrazidas exercem efeitos terapêuticos significativos, podendo agir diretamente sobre o parasito e/ou sobre as células dos sistemas imune do hospedeiro.. / Currently, there is no effective vaccine and control of leishmanioses depends mainly on the chemotherapy. Recently, new synthetic carbohidrazidas derivatives pirazolocas compounds showed activity on Leishmania amazonensis when tested in vitro and in experimental murine model of infection of l. amazonensis showed a significant therapeutic effect effect. A study of intermediate compounds síntesedas carbohidrazidas could be interesting, as these have a potential activity leishmanicida and help cmpreender the mechanisms of action of compounds. On the other hand, it is necessary to know the behavior of the immune system against these compounds in leishmaniasis infection.The precursor compounds are active in ways does promastigotas of l. amazonensis. However, all compounds showed activity on amastigote forms and without cytotoxicity in mammalian cell. Here, it was suggested the contribution farmacofórica of the ring N-heteroaromatic compound for leishmanicida and activity of hydrazine to the intermediate grouping. In addition, it was shown that all components can induce an increase in nitric oxide production in macrophages stimulated or not. In CBA mice infected with l. amazonensis and treated orally with carbohidrazidas derivatives, the histopathologic study rervelou that changes in the DermIS were correlated with the macroscopic size of the lesion. CBA mice infected and treated tin

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-12-05T19:29:14Z No. of bitstreams: 1 Marco Antonio Araujo Silvany Avaliacao de antigenos... 2001.pdf: 74793034 bytes, checksum: af0b4fec858d7beea9f14722f79bec72 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-05T19:29:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marco Antonio Araujo Silvany Avaliacao de antigenos... 2001.pdf: 74793034 bytes, checksum: af0b4fec858d7beea9f14722f79bec72 (MD5) Previous issue date: 2001 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / Como a leishmaniose visceral (LV) ocorre principalmente em áreas onde os serviços de saúde são pouco desenvolvidos, o seu diagnóstico baseia-se principalmente no exame clínico, podendo ela ser confundida com outras doenças. Este estudo tem como objetivo a avaliação de antígenos recombinantes (rAg) visando o desenvolvimento e a validação de um “kit” para imunodiagnóstico da leishmaniose visceral, que seja simples, barato e possa ser aplicado em condições precárias. O sistema a ser desenvolvido baseia-se no uso concomitante de múltiplas proteínas recombinantes. [MATERIAL E MÉTODOS] Vários rAg foram clonados e alguns deles foram analisados para o uso em sorodiagnóstico em 93 soros de pacientes com leishmaniose visceral, selecionados clinicamente e com diagnóstico confirmado parasitológicamente. [RESULTADOS] Um total de oito rAgs foi avaliado. Todos os soros de LV reconheceram pelo menos um dos rAgs, sendo portanto a sensibilidade do teste para o conjunto de antígenos, testados isoladamente, de 100%. A especificidade do teste para o conjunto de antígenos, avaliada bem preliminarmente em um total de 36 soros controle (de indivíduos sem leishmaniose), foi também de 100%. Nesta dissertação é descrita também uma maneira simples de identificar em bibliotecas de DNA exatamente rAgs que vão aumentar a sensibilidade de um ensaio imunodiagnóstico. / Since visceral leishmaniasis (VL) occurs in areas where health services are scarce, its diagnosis is based mainly on clinical examination, making possible it to be confounded with other diseases. The objective of this study is to evaluate recombinant antigens (rAg) aiming at developing and validating a kit for immunodiagnosis of the visceral leishmaniasis that were simple, cheap and could be put into practice under precarious CQnditions. The system to be developed is based on the concomitant use of multiple recombinant proteins. [MATERIAL AND METHODS] Several recombinant antigens have been cloned and analysed in order to be used in serodiagnosis with reference to the antibody detection in 93 sera of patients with visceral leishmaniasis, clinically selected and with diagnosis parasitologically confirmed. [RESULTS] A total of eight rAgs were evaluated. All sera of VL were recognized at least by one rAg, so that the sensitivity for the group of antigens, isolated tested, was 100%. The specificity, preliminarily evaluated in a total of 36 control sera (of individuals without leishmaniasis) was also 100%. This dissertation describes also a simple way to identify, in genetic libraries, exactly the rAgs that will increase immunoassay sensibility.