Orientador: Simone Baldini Lucheis / Coorientador: João Pessoa Araújo Junior / Banca: Lúcia Helena O'Dwyer de Oliveira / Banca: Virgínia Bodelão Richini Pereira / Banca: José Eduardo Tolezano / Banca: Tricia Maria Ferreira de Sousa Oliveira / Resumo: Animais silvestres são importantes fontes de infecção de leishmanioses e doença de Chagas, para espécies domésticas e o homem. A PCR com emprego de iniciadores da região ITS1 associando-se clonagem e seqüenciamento de DNA alvo permite caracterizar espécies parasitas. Pelo uso de imunorreagentes específicos também possibilitam a investigação da infecção natural entre diferentes espécies de animais silvestres para ambas enfermidades. Foram avaliados isolados flagelares em meio LIT (hemocultura) de 103 animais procedentes do Centro de Conservação da Fauna Silvestre de Ilha Solteira/SP e 118 amostras de soros. Em ensaios imunoenzimáticos utilizaram-se as proteínas recombinantes CRA e FRA de Trypanosoma cruzi e rK39 de Leishmania infantum. Conjugados espécie-específicos foram produzidos para diferentes espécies e empregados no teste de ELISA indireto e a proteína A conjugada foi avaliada para testes sorológicos com emprego da rK39. Soros de cães reagentes para leishmaniose visceral e de humanos para doença de Chagas foram testados para verificar a reatividade contra estas proteínas. Observou-se na hemocultura, flagelados para as seguintes espécies de vida livre: cotia, gambá e tatu-galinha; espécie em cativeiro: bugio-preto. Produtos foram amplificados pela PCR (585 pb) a partir de hemocultura em animais de vida livre e de um animal em cativeiro (650 pb) em amostra de sangue total. Os amplificados foram inseridos em vetor de clonagem e sequenciados resultando-se em 97% de similaridade com T. cruzi para gambá e cotia (acesso nº: AF362825.1) e tatu-galinha (acesso nº: GQ258720.1) com 98%. No isolado de bugio-preto houve 90% de similaridade com T. minasense (acesso nº: AB362411.1). Estes resultados apresentam o primeiro relato destas espécies parasitárias de importância epidemiológica na área de estudo e demonstraram vantagem ao associar-se a hemocultura às técnicas moleculares para caracterização de... / Abstract: Wild animals are important sources of infection of leishmaniasis and Chagas disease to domestic animals and humans. The employment of PCR with ITS1 primers plus cloning and sequencing target DNA allows to characterize parasitic species. By using specific immunoreagents also enable investigation of natural infection between different species of wild animals for both diseases. Flagellate isolates in LIT medium (blood culture) were assessed of 103 animals coming from the Wildlife Conservation Center of Ilha Solteira -SP and 118 serum samples. In immunoassays, recombinant proteins CRA and FRA fromTrypanosoma cruzi and rK39 from Leishmania infantum were used. Species -specific conjugates were produced for different animal species and used in indirect ELISA and the protein A conjugate was evaluated for serological tests with use of rK39. Sera from dogs reagents for visceral leishmaniasis and for humans reagents for Chagas disease were tested for reactivity against these proteins. Flagellate protozoa were observed in LIT culture medium, at the following free-living species: common agouti (D. agouti), white-eared opossum (D. albiventris) and nine-banded armadillo (D. novemcinctus); and from a captive black howler monkey (A. caraya). Products were amplified by PCR (585bp) from blood culture in wild animals and from an animal in captivity (650bp) in whole blood sample. The amplified products were inserted into cloning vector and sequenced resulting in 97% similarity with T. cruzi to white-eared opossum an common agouti (acess number: AF 362825.1) and 98% to nine-banded armadillo (acess number: GQ 258720.1). The isolated from black howler monkey was 90% similar to T. minasense (acess number: AB 362411.1). The results present the first report of these parasitic species of epidemiological importance in the studied area and demonstrated advantage in the association of blood culture to molecular techniques to characterize flagellates. For ... / Doutor

Orientador: Aureo Evangelista Santana / Coorientador: Karina Paes Bürguer / Banca: Annelise Carla Camplesi dos Santos / Banca: Ana Maria Centola Vidal / Banca: José Ribamar Privado Filho / Banca: Maria Angélica Dias / Resumo: A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) preocupa as autoridades sanitárias devido ao aumento de sua incidência nos últimos anos, aliado ao fato da situação epidemiológica da enfermidade ser desconhecida na maioria das regiões. Desta forma, o presente estudo objetou realizar o diagnóstico de situação epidemiológica da leishmaniose visceral canina (LVC) no Município de Rio Verde/GO. Para tanto, a pesquisa foi desenvolvida em bairros pré-definidos da região norte do município com a avaliação das condições das três esferas da saúde (animal, humana e ambiental) relacionadas à LVC, por meio de questionários semiestruturados com a participação dos tutores dos animais; a avaliação clínica dos cães e classificação segundo a sintomatologia; a realização do diagnóstico sorológico (ELISA, RIFI e TR DPP) e o geoprocessamento da localidade dos cães reagentes. Na avaliação das condições da saúde animal, os resultados evidenciaram superpopulação canina, especialmente aqueles animais considerados sem controle de mobilidade e sem supervisão, com trânsito livre, sem assistência médicoveterinária. Com relação à saúde humana, destacou-se o convívio íntimo entre o ser humano e o seu animal de estimação, além do agravante do desconhecimento da enfermidade pela população, de seus mecanismos de transmissão, de controle e de prevenção. Sob o olhar ambiental, observou-se problemas de infraestrutura, sendo a falta de saneamento básico a principal delas, além da presença de árvores frutíferas e animais de produção favorecendo o acúmulo de matéria orgânica, facilitando e promovendo o desenvolvimento do vetor. A classificação segundo a avaliação clínica dos cães reagentes (ELISA e RIFI) foi de 65% (13/20) assintomáticos e 35% (7/20) oligossintomáticos. Na avaliação sorológica, 10,38% (55/530) foram reagentes no ELISA, desses 36,37% (20/55) foram... / Abstract: Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) is a concern to sanitary authorities due increase on incidence observed recently and lack of knowledge about the disease epidemiological situation in most regions. So, this study focused on to perform epidemiological diagnosis of canine visceral leishmaniasis situation in Rio Verde Municipality, state of Goiás, Brazil. For this purpose, the research was performed in pre-selected neighborhoods in the north region of the municipality embracing all three areas in health (animals, human beings and environment) related to CVL using semi-structured questionnaires to animals' owners, clinical evaluation of animals and classification according to clinical signs, serological diagnosis (ELISA, RIFI and TR DPP) and geospatial analyses of positive dogs. ). A canine overpopulation, especially on those animals that lives free in streets, without supervision of owners and veterinaries were highlighted. In relation to human health, the close contact among humans and animals and the ignorance about this disease epidemiology, prevention and control by the population were shown. About the environmental situation, infrastructural problems, as the needs of basic sanitation, were observed. Also, fruit trees and production animals' presence were observed, which favors organic matter accumulation and allows the vector's development. The clinical classification of the reagents animals (ELISA and RIFI) was 65% (13/20) asymptomatic and 35% (7/20) oligosymptomatic during evaluation on CI. On serological evaluation, 10.38% (55/530) were positive on ELISA and from these animals, 36.37% (20/55) were also positive on RIFI. None of the samples were considered as positive on TR DPP®. The animals considered as positives in ELISA and RIFI were located in nearby houses agreeing with the results of serological tests. The human beings and canine populations in the studied areas have ... / Doutor

Orientador: Maria Jaqueline Mamprim / Banca: Sheila Canavese Rahal / Banca: Maria Lúcia Gomes Lourenço / Banca: Luciana Del Rio Pinoli Ciarlini / Banca: Priscilla Macedo de Souza / Resumo: Alterações locomotoras são incomuns em cães com leishmaniose visceral. Embora a origem dos sinais clínicos permaneça obscura, a poliartrite deve ser considerada como um potencial diagnóstico nestes casos. Muitos agentes etiológicos podem causar poliartropatias, sendo estas classificadas em não inflamatórias e inflamatórias. Acredita-se que a poliartrite induzida por Leishmania spp. seja decorrente de uma reação inflamatória granulomatosa, causada pela presença de parasitos ou por uma resposta celular e humoral. O diagnóstico clínico ainda é um desafio para os profissionais de saúde, devido à grande variedade de sinais inespecíficos em decorrência da leishmaniose visceral. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivos avaliar radiotomograficamente as articulações umeroradioulnares, radiocarpicametacárpicas, femurotibiopatelares e tibiotarsicametatársicas, a fim de caracterizar as lesões osteoarticulares, fornecendo subsídios para os clínicos que atuam em áreas endêmicas. Para tanto, foram utilizados 46 cães, naturalmente infectados, com diagnóstico firmado por meio dos exames imunocromatográfico (95,65%), ELISA (97,82%) e/ou parasitológico direto (95,65%), provenientes do Centro de Controle de Zoonoses de Bauru. Não houve predileção quanto ao sexo (1:1). A maioria dos animais não apresentava precisa definição racial (78,26%). A idade variou entre um a 12 anos, com mediana igual a três anos. Sinais clínicos compatíveis com poliartrite foram observados em 32,60%. Alterações radiográficas e tomográficas importantes foram observadas em 77% e 91% dos caninos, respectivamente, sendo as articulações tibiotarsicametatársicas a mais afetada em ambos os testes, acomentendo cães sintomáticos e assintomáticos. Os sinais imaginológicos foram variados, não sendo possível determinar um padrão específico para a doença, porém a presença de trabeculado ósseo evidente, ... / Abstract: Locomotor alterations are uncommon in dogs with visceral leishmaniasis (VL). Although the origin of clinical signs remain unclear, polyarthritis should be considered as a potential diagnosis in these cases. Many etiological agents may cause polyarthropathies, which are classified into inflammatory and non-inflammatory. It is believed that the polyarthritis induced by Leishmania spp. may be due to a granulomatous inflammatory reaction caused by the presence of parasites or by cellular and humoral response. Clinical diagnosis is still a challenge for health professionals, due to the great variety of nonspecific clinical signs on VL. Thus, the aim of the present study were to evaluate radiographically and tomographically elbows, carpal, stifle and tarsal joints, in order to characterize the osteoarticular lesions, providing subsidies for veterinary practitioners in endemic areas. For this, 46 dogs were used, naturally infected, with diagnosis confirmed by immunochromatography (95.65%), ELISA (97.82%) and/or cytological (95.65%) methods, from the Zoonoses Control Center of Bauru. There was no preference to gender (1:1). The majority of animals were mixed breed (78.26%). Ages varied from 1 to 12 years, with a median of 3 years. Clinical signs consistent with polyarthritis were observed in 32.60%. Radiographic and tomographic alterations were observed in 77% and 91% of dogs, respectively, with tarsal joints the most affected on both methods, on asymptomatic and symptomatic dogs. Imaging signs varied, and it was not possible to establish a pattern for the disease, however the presence of apparent trabecular bone, bone sclerosis and osteolysis were the most frequently observed. Furthermore, we noticed a tendency for bilateral and symmetric involvement. It was observed a lack of significance when comparing the radiographic and tomographic lesions between symptomatic and asymptomatic ... / Doutor

Orientador: Raul Borges Guimarães / Banca: José Eduardo Tolezano / Banca: Paulo Cesar Peiter / Banca: Samuel do Carmo Lima / Banca: Umberto Catarino Pessoto / Resumo: Leishmaniose Visceral Americana (LVA) e Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) são doenças negligenciadas que acometem 2.000.000 de pessoas por ano no mundo. No Brasil, são doenças prevalentes em diferentes níveis em todos os estados. No estado de São Paulo foram notificados 1.769 casos de LVA na ultima década, e 5898 casos da LTA. Este estudo se justifica uma vez que é muito pouco conhecida a relação entre as leishmanioses e o processo de transformação espacial. Historicamente, o município de Teodoro Sampaio possui transmissão da LTA e, recentemente, foram encontrados casos de leishmaniose visceral em cães na área urbana do município, tornando o município uma possível área de convergência das duas manifestações da doença. O estudo teve dois níveis de agregação: a) estudo de caso do município de Teodoro Sampaio, Pontal do Paranapanema, São Paulo, com base populacional, no delineamento quantitativo, descritivo, transversal e b) municípios do estado de São Paulo, com base populacional, no delineamento retrospectivo, quantitativo, observacional, descritivo. O que justifica a escolha de duas frentes de estudo é a reflexão sobre as articulações escalares que permitem a formação de circuitos de produção das leishmanioses no espaço. O objetivo geral é relacionar transformações espaciais recentes com o padrão da distribuição espacial dos vetores, hospedeiros e da infecção, tendo em vista uma abordagem geográfica integrada da LTA e da LVA. O levantamento de dados para o estudo de caso em Teodoro Sampaio se deu em duas fases: no campo e nas fontes de dados secundário... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Visceral Leishmaniasis (AVL) and American Cutaneous Leishmaniasis (ACL) are neglected diseases affecting 2,000,000 people per year worldwide. In Brazil, diseases are prevalent at different levels in all states. In the state of São Paulo were reported 1,769 cases of AVL in the last decade, and 5,898 cases of ACL. This study is justified since very little is known of the relationship between Leishmaniasis and the spatial transformation process. In the past, the municipality of Teodoro Sampaio has spread ACL and recently cases of visceral Leishmaniasis have been found in dogs in the urban area, making the municipality a likely area for the convergence of both manifestations of the disease. The study has two levels of aggregation: (a) a population-based case study of the municipality of Teodoro Sampaio, Pontal do Paranapanema, in the state of São Paulo, designed to be quantitative, descriptive and cross-sectional, and (b) population-based across the municipalities of São Paulo state, designed to be retrospective, quantitative, observational and descriptive. The choice of two approaches to the study is justified by a consideration of the articulations which enable the formation of production circuits for Leishmaniasis in the region. The overall aim is to relate recent spatial transformations with the pattern of spatial distribution of the infection's vectors and hosts, keeping in mind the integrated geographic distribution of ACL and AVL. The gathering of data for the Teodoro Sampaio case study underwent two phases: field study and by means of secondary official data sources. As it is a focal disease, the data presented allows us to infer that AVL spreads from Sector 1 of the urban area to Sector 3, because... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by Simone Souza (simonecgsouza@hotmail.com) on 2018-04-30T14:51:55Z No. of bitstreams: 1 DISS_2015_Patrícia Lazari.pdf: 1908360 bytes, checksum: 5c0cb095c70321b58bc79e57b6f59453 (MD5) / Approved for entry into archive by Jordan (jordanbiblio@gmail.com) on 2018-05-16T14:36:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISS_2015_Patrícia Lazari.pdf: 1908360 bytes, checksum: 5c0cb095c70321b58bc79e57b6f59453 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-16T14:36:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISS_2015_Patrícia Lazari.pdf: 1908360 bytes, checksum: 5c0cb095c70321b58bc79e57b6f59453 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / CNPq / A Leishmaniose Visceral (LV) é uma doença causada pelo protozoário Leishmania chagasi e transmitida pela picada de fêmeas de flebotomíneos. O cão é considerado o principal reservatório do agente em áreas urbanas e a eutanásia de cães sororreagentes é um dos métodos de controle da LV. As técnicas utilizadas para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina (LVC) no Brasil, Ensaio Imunoenzimático (ELISA) e Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), foram amplamente questionadas devido à precisão desses testes. Neste contexto, testes moleculares têm sido utilizados para caracterizar o agente. Com o objetivo de isolar por cultura axênica, identificar a espécie de Leishmania circulante em cães e comparar a detecção pelas técnicas de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e eletroforese de isoenzimas, foram submetidos à eutanásia, 101 cães sororreagentes para LV aos testes de ELISA e RIFI, pertencentes à área urbana de Jaciara, Mato Grosso, município endêmico para LV e coletadas as amostras de baço, medula óssea, pele e sangue para estudo. Através da PCR, o baço apresentou melhor percentual de detecção, seguido da medula óssea e em 97 (96,03%) cães foi detectado DNA de Leishmania, confirmada como L. chagasi. A cultura axênica apresentou 60 (15%) isolados com a medula óssea apresentando maior percentual de isolamento da L. chagasi. Em 13 (12,87%) cães foi possível a caracterização do agente através da eletroforese de isoenzimas. Os resultados deste trabalho concluem que a L. chagasi circula em cães pertencentes à área urbana de Jaciara, ampliando informações sobre a distribuição do parasito no Estado e ressaltam a importância da identificação etiológica em área de simpatria com outros agentes, principalmente onde a eutanásia é método de controle de expansão da doença. / The visceral leishmaniasis (VL) is a disease caused by Leishmania chagasi and transmitted by the bite of female sand flies. The dog is considered the main agent reservoir in urban areas and euthanasia of seropositive dogs is one of the LV control methods. The techniques used for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis (CVL) in Brazil, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) and Reaction Immunofluorescence Assay (IFA), were widely questioned due to the accuracy of these tests. In this context, molecular tests have been used to characterize the agent. In order to isolate by axenic culture, identify the species of Leishmania circulating in dogs and compare the detection by reaction techniques Polymerase Chain (PCR) and isozyme analysis were euthanized, 101 seropositive dogs for LV to test ELISA and IFA, from the urban area of Jaciara, Mato Grosso, an endemic county for LV and collected the spleen samples, bone marrow, skin and blood to study. Using PCR, the spleen showed better detection percentage, followed by bone marrow and 97 (96.03%) dogs Leishmania DNA was detected and confirmed as L. chagasi. The axenic culture showed 60 (15%) isolates with bone marrow showing higher percentage of isolation of L. chagasi. In 13 (12.87%) dogs was possible to characterize the agent by isoenzyme electrophoresis. These results conclude that L. chagasi circulating in dogs from the urban zone of Jaciara, expanding information on the distribution of the parasite in the state and emphasize the importance of etiological identification sympatric area with other agents, especially where euthanasia is method expansion of disease control.

Submitted by Mariana Gatto (marianagatto11@hotmail.com) on 2018-05-21T17:47:50Z No. of bitstreams: 1 Tese Mariana Gatto.pdf: 3235524 bytes, checksum: b7c9938cd744aff0ff8a8ee5f858831e (MD5) / Approved for entry into archive by Sulamita Selma C Colnago null (sulamita@btu.unesp.br) on 2018-05-22T14:28:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 gatto_m_dr_bot.pdf: 3235524 bytes, checksum: b7c9938cd744aff0ff8a8ee5f858831e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-22T14:28:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gatto_m_dr_bot.pdf: 3235524 bytes, checksum: b7c9938cd744aff0ff8a8ee5f858831e (MD5) Previous issue date: 2018-04-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A leishmaniose visceral (LV) é uma doença negligenciada causada por Leishmania donovani na Índia e África ou Leishmania infantum na Europa e América Latina. O desenvolvimento de resposta imune eficaz e subsequente eliminação destes patógenos, requer o reconhecimento inicial da Leishmania, o qual é intermediado por receptores de reconhecimento padrão expressos por células da imunidade inata, entre eles os receptores de ligação a nucleotídeo (NLRs). Alguns NLRs ativam uma plataforma de proteínas, os inflamassomas, responsáveis pela ativação da caspase-1 e maturação de IL-1β e IL-18 e outra classe de NLRs, chamada NODs, ativam vias que culminam na ativação de NF-κB e produção de mediadores inflamatórios. O envolvimento desses receptores na LV ainda é pouco elucidado. Mesmo diante dos mecanismos de defesa do hospedeiro, esses parasitas conseguem sobreviver dentro dos macrófagos utilizando várias estratégias para escapar da resposta imune. Para um melhor entendimento dos mecanismos imunes envolvidos na LV, caracterizamos o perfil transcricional e a formação de inflamassomas e NODsomas de células THP-1 infectadas com L. infantum. Os resultados mostram que a L. infantum não induziu produção de TNF-α, IL-6 e IL-1β e nem ativação de caspase-1 após 8, 24 e 48 horas de infecção. Além disso, a infecção resultou em padrão de expressão gênica similar às células sem estímulo e distinto de células estimuladas com LPS, indicando que os parasitas entram nas células de forma mais silenciosa. Após a infecção houve aumento da expressão de alguns genes como ACTG1, ACTB, CD36 e DUSPs relacionados com vias de motilidade celular e regulação de MAPKs. Os genes CSF1 e CDC20 foram dois dos 30 mais expressos após infecção e estão relacionados com ciclo celular e diferenciação de macrófagos para um perfil anti-inflamatório. O gene GBP1, associado com ativação de inflamassomas, foi sub expresso após a infecção. Além disso, infecção com L. infantum resultou na expressão de poucos genes relacionados com a via dos NLRs, destacando-se entre esses o TNFAIP3 e IL1RN, referentes à modulação negativa dessa via. Os resultados obtidos indicam que a L. infantum entra nas células THP-1 de forma mais silenciosa, desativa vias inflamatórias, entre essas a via de receptores NLRs e evita a montagem de uma resposta imunológica efetora. Provavelmente o parasita usa esses recursos como mecanismos adicionais de escape para garantir sua sobrevivência dentro das células. / Visceral leishmaniasis (VL) is a neglected infectious disease caused by Leishmania donovani in India and Africa or Leishmania infantum in Europe and Latin America. The development of an effective immune response and subsequent elimination of these pathogens requires the initial recognition of the Leishmania that is mediated by pattern recognition receptors expressed in innate immunity cells, such as nucleotide-binding receptors (NLRs). Some NLRs activate a multiprotein platform named inflammasomes, responsible for the activation of caspase-1 and consequent maturation of IL-1β and IL-18; and another class of NLRs, the NODs, activate pathways that trigger NF-κB activation and production of inflammatory mediators. The involvement of NLRs in LV is poorly elucidated. Even in the presence of host defense mechanisms, these parasites can survive within the macrophages by employing successful strategies to escape from immune response. For a better understanding of the immune mechanisms involved in LV, we characterized the transcriptomic profiling and assembly of inflammasomes and NODsomas during infection with L. infantum in THP-1 cells. The results show that L. infantum did not induce the production of TNF-α, IL-6 and IL-1β nor activation of caspase-1 after 8, 24 and 48 hours of infection. In addition, the infection resulted in a pattern of gene expression similar to the non-stimulated cells and distinct from LPS-stimulated cells, indicating that the parasites enter inside cells in a more silent way. After infection, there was increased expression of some genes, such as ACTG1, ACTB, CD36 and DUSPs related to cellular motility and regulation of MAPKs pathways. The CSF1 and CDC20 genes were two of the 30 most expressed after infection and were related to cell cycle pathway and macrophage differentiation to an anti-inflammatory profile. The GBP1 gene, associated with inflammasome activation, was downregulated after infection. In addition, infection with L. infantum resulted in the expression of few genes related to the NLRs pathway, such as TNFAIP3 and IL1RN that are related to down modulation of this pathway. The results indicate that L. infantum enters inside the THP-1 cells more quietly, deactivates inflammatory pathways, including the NLR receptor pathway, and avoids the assembly of an effector immune response. Probably the parasite uses these strategies as additional escape mechanism to ensure its survival within host cells.

Orientador: Sueli Aparecida Calvi / Banca: Ana Paula Fávero Trombone Garlet / Banca: Rita Cristina Chaim / Resumo: A leishmaniose visceral (LV) é um problema emergente de saúde pública, sendo uma das principais doenças negligenciadas no Brasil e no mundo. É causada por L. donovanie L.chagasi/infantum. A resistência à infecção está associada à produção de citocinas de perfil Th1 e a suscetibilidade às citocinas do perfil Th2. Os receptores Toll-like (TLRs) da imunidade inata têm importante papel no reconhecimento microbiano e no desenvolvimento da resposta imune adaptativa. Além disso, o estado nutricional possui grande impacto na resposta imune. Desse modo, nosso objetivo foi avaliar o perfil bioquímico-nutricional, o envolvimento dos TLR2 e TLR4 na produção de citocinas e NO e relacionar as lipoproteínas com a resposta imune em pacientes com LV antes e após o tratamento. Foram estudados 13 pacientes com LV antes e após o tratamento e 16 indivíduos controles.A avaliação bioquímica-nutricional foi realizada através da impedância biolétrica e testes bioquímicos de colesterol total (CT), HDL, LDL, triglicerídeos (TG), glicose e proteínas totais e frações. A expressão de TLR2 e TLR4 em linfócitose monócitosfoi realizada através da citometria de fluxo. A produção das citocinas e NO em sobrenadantes de cultura de PBMCs estimuladas ou não com agonistas dos receptores TLR2 (PGN) e do TLR4 (LPS), foi avaliada através da técnica de CBA Flex e de kits comerciais. Pacientes prétratamento apresentaram menor ângulo de fase em relação aos controles, níveis diminuídos de CT, HDL, LDL e albumina e níveis aumentados de triglicerídeos em relação ao póstratamento e controles. Além disso, mostraram maior porcentagem de linfócitos expressando TLR2 e TLR4 e aumento da expressão destes receptores em monócitos. Quanto às citocinas, foi verificado aumento da produção de TNF-α, IL-10 e TGF-β enquanto os níveis de IFN-γ, IL-17 e NO foram menores. Os resultados também mostraram o envolvimento dos receptores TLR2 e TLR4 na ... / Abstract: Visceral leishmaniasis (VL) is an emerging public health problem, being of the major neglected diseases in Brazil and worldwide. It is caused by L. chagasi and L. donovani/infantum. Resistance to infection is associated to production of Th1 cytokines and susceptibility to Th2 cytokine profile. The toll-like receptors (TLRs) of the innate immunity plays an important role in microbial recognition and development of the adaptive immune response. In addition, nutritional status has a great impact on the immune response. Our objective was to evaluate the biochemical and nutritional profile, the involvement of TLR2 and TLR4 in the production of cytokines and NO and relate the lipoproteins to the immune response in VL patients, before and after the treatment. Were studied 13 patients with LV before and after the treatment and 16 control subjects. Biochemical and nutritional evaluation was performed by bioelectrical impedance and biochemical assays of total cholesterol (TC), HDL, LDL, triglycerides (TG), glucose, and total protein and fractions. Expression of TLR2 and TLR4 in lymphocytes and monocytes was performed by flowcytometry. The production of cytokines and NO in culture supernatants of PBMCs stimulated or not with agonists of TLR2 (PGN) and TLR4 (LPS) receptors was evaluated by CBA Flex technique and commercial kits. Patients on pre-treatment had lower phase angle compared to controls, reduced levels of TC, HDL, LDL and albumin and increased triglycerid elevels in relation to post-treatment and controls. In addition, pre-treatment patients presented a higher percentage of lymphocytes expressing TLR2 and TLR4 and increased expression of these receptors on monocytes. Regarding the cytokines, was observed increased of the production of TNF-α, IL-10 and TGF-β, while production of IFN- γ, IL-17 and NO were lower. The results also demonstrated the involvement of TLR2 and TLR4 receptors on TNF-α, IL-10 and NO production. With treatment ... / Mestre

Resumo:A leishmaniose visceral (LV) canina é uma zoonose de grande importância epidemiológica. Seu amplo espectro de sinais clínicos dificultam o diagnóstico na rotina clínica e laboratorial, sendo necessário a utilização de técnicas mais específicas, como o qPCR, o qual possui grande sensibilidade e especificidade. A anemia é um sinal clínico muito comum nesta doença, sendo que sua causa ainda é muito discutida. O estresse oxidativo é caracterizado por desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes,sendo que esta alteração pode ser um dos fatores da presença de anemia em cães com LV. Considerando-se que a anemia seja causada pelo estresse oxidativo, propusemos investigar a hipótese de que alterações hematológicas, bioquímicas e sinais clínicos de cães com LV variam com a carga parasitária (CP). Para tal, foram avaliados marcadores de estresse oxidativo plasmático (albumina, ácido úrico, bilirrubina, capacidade antioxidante total-TAC, capacidade oxidante total-TOC, índice de estresse oxidativo TOC/TAC e espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico-TBARS) e eritrocitário (TBARS em papa de hemácias). Para avaliação geral dos animais foram analisados perfil bioquímico e hemograma completo e os animais foram classificados com presença e ausência de sinais clínicos. A CP foi obtida através de coleta de pele, conjuntivas, sangue e papa de leucócito, a partir da quantificação dos tecidos foi calculada a CP total, através de análise de componentes principais. Os parâmetros hematológicos não se alteram conforme ocorre aumento da carga parasitária e não foi observado qualquer tipo de hemólise ou icterícia nas amostras coletadas. Ao contrário do perfil hematológico, os sinais clínicos e laboratoriais se alteram conforme ocorre aumento da carga parasitária. Conclui-ser que a anemia independe da CP e que a sua causa não está associada ao metabolismo oxidativo, peroxidação lipídica ou mecanismos hemolíticos. / Abstract:Canine visceral leishmaniasis (CVL) is a zoonosis of great epidemiological relevance. Infected dogs usually present nonspecific clinical and laboratory alterations that hampers the diagnosis of the disease in routine screening, and the use of techniques with higher sensitivity and sensibility, such as the detection of the parasite by polymerase chain reaction (PCR), are often necessary. Among the nonspecific alterations, anemia is one of the most frequently found, but the mechanism underlying its occurrence is still under dispute. Oxidative stress, the imbalance between oxidants and antioxidants, has been recently incriminated as one of the possible triggers of anemia in CVL. Here, we investigated the putative relationships between parasite load and markers of oxidative stress and hematologic, biochemical and clinical alterations in dogs naturally infected with Leishmania spp. Markers of oxidative stress included albumin, uric acid, bilirubin, total antioxidant capacity (TAC), total oxidant capacity (TOC), oxidative stress index (TOC/TAC) and serum and packed red cells Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS). Additional laboratory analysis included complete blood count (CBC) and biochemical profile. Observation of clinical alterations was scored as present or absent. Quantitative PCR (qPCR) of tissue samples of skin, conjunctiva, whole blood and packed white cells was used to estimate tissue-specific parasite load. In order to represent the total parasite load (i.e., the parasitism across different analyzed tissues), we applied a principal components analysis to the matrix of tissue-specific qPCR results to create a single synthetic variable that captures the information content present in the four different original variables. We found no significant associations between hematologic parameters and parasite load, and previously reported alterations such as sample hemolysis or icteric serum were not observed. However, significant differences / Orientador:Paulo César Ciarlini / Banca:Mirela Tinucci Costa / Banca:Caris Maroni Nunes / Mestre

Resumo:A leishmaniose visceral (LV) é uma doença crônica que pode ser fatal para os humanos. A doença é causada por um parasita intracelular, Leishmania infantum e é transmitida pela picada do mosquito flebótomo. Em cães com LV observa-se uma intensa reação inflamatória crônica no fígado, baço, pele, medula óssea e gânglios linfáticos. A atividade arginase é importante na LV, pois o aumento dessa enzima pode contribuir para a multiplicação do parasita e para a redução da síntese de óxido nítrico (NO), predispondo o macrófago à infecção. A prostaglandina E2 (PGE2) pode regular a produção do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e da interleucina-10 (IL-10), porém nenhum estudo ainda foi realizado em cães com LV. O presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade arginase em macrófagos aderentes de cultura de linfonodos de 23 cães naturalmente infectados e 18 saudáveis, e os níveis de NO e PGE2 no sobrenadante dessas culturas. O efeito regulatório de PGE2 na produção de TNF-α e IL-10 também foi avaliado em cultura de leucócitos totais de linfonodo. Esse estudo ajuda a esclarecer o mecanismo da resposta imunológica na LVC. / Abstract:Visceral leishmaniasis (VL) is a chronic disease that can be fatal to humans and dogs. The disease is caused by the intracellular parasite Leishmania infantum and is transmitted by the bite of the sandfly (phlebotomines). In dogs, VL is observed as an intense chronic inflammatory reaction in the liver, spleen, skin, bone marrow and lymph nodes. Arginase activity is important in VL because an increase of this enzyme may contribute to the multiplication of the parasite and a reduction of nitric oxide (NO) synthesis, predisposing a macrophage to infection. Prostaglandin E2 (PGE2) can play a regulatory role in the production of tumor necrosis factor (TNF-α) and interleukin-10 (IL-10), however, there have been no studies in dogs with LV. This study aimed to evaluate the arginase activity in adherent macrophages cultivated from the lymph nodes of 18 healthy and 23 naturally infected dogs and to examine levels of NO and PGE2 in the supernatant of these cultures. The regulatory effect of PGE2 on the production of TNF-α and IL-10 was also evaluated in supernatants of total lymph node leukocytes cultures. These results help to clarify the mechanisms of the immune response in CVL. / Orientador:Valéria Marçal Felix de Lima / Banca:Alexandra Ivo de Medeiros / Banca:Caris Maroni Nunes / Mestre

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No entanto, nem todas as pessoas infectadas desenvolvem doen?a; na verdade, a maioria apresenta resolu??o espont?nea da infec??o sem sintomas caracter?sticos de LV. Tradicionalmente a avalia??o do perfil imunol?gico tem sido realizada utilizando a reestimula??o de c?lulas mononucleares de sangue perif?rico em cultura. Esses estudos revelaram que pacientes com LV apresentavam inibi??o tanto da prolifera??o linfocit?ria quanto da resposta pr?-inflamat?ria anti-Leishmania. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a resposta imune na LV sintom?tica, na cura p?s-tratamento e assintom?tica. Para isso, analisamos caracter?sticas imunofenot?picas relacionadas ? ativa??o, Treg e mem?ria de linf?citos, por citometria de fluxo, assim como a produ??o de citocinas ex vivo ou em cultura de sangue total. Para os volunt?rios com LV, foi realizado um estudo longitudinal com reavalia??o imunol?gicas aos 4 e 14 meses ap?s a cura cl?nica. O grupo controle incluiu pessoas provenientes de regi?o end?mica, sendo dividido em 2 grupos: Controle Positivo, formado por pessoas que apresentaram sorologia e?ou PCR anti-Leishmania positivos e Controle Negativo formado por pessoas com sorologia e PCR anti-Leishmania negativos. Durante a LV os linf?citos CD4 apresentam um maior perfil de ativa??o e mem?ria, al?m de serem maiores produtores de citocinas em cultura, quando comparado aos linf?citos CD8, contudo essa ativa??o n?o ? Leishmania espec?fica, visto que ocorreu tanto em aus?ncia (CD4+CD25+:10,60%, CD8+CD25+:5,36%; p<0,0001) quanto em presen?a de ant?genos sol?veis de Leishmania (SLA), (CD4+CD25+: 10,20%, CD8+CD25+:3,28%; p=0,0003). H? ativa??o de linf?citos durante a LV (CD4+CD69+: 4,9%), quando comparado aos grupos Controle Positivo (CD4+CD69+: 1,96% p=0,0045) e Negativo (CD4+CD69+: 1,35% p=0,0062), mas esta ativa??o tamb?m n?o ? Leishmania espec?fica. O perfil de ativa??o linfocit?ria permanece elevado mesmo 14 meses ap?s o fim do tratamento, por?m ap?s a cura a ativa??o ? Leishmania espec?fica (CD4+CD25+ em aus?ncia de SLA: 8,44%, presen?a de SLA: 10,70% p=0,0279). Linf?citos CD8+CD25+ foram capazes de produzir IFN-? em presen?a de ant?geno tanto em Controles Positivos (aus?ncia de SLA: 5,17%, presen?a de SLA: 9,52% p=0,0391) como em LV curados (Curado 4 meses: aus?ncia de SLA: 3,90%, presen?a SLA: 10,70% p=0,0098). C?lulas presentes no sangue total de pessoas com LV ativa s?o capazes de produzir IFN-? em resposta ao SLA (IFN-? em aus?ncia de SLA: 3,61 pg?mL e em presen?a de SLA: 44,26 pg?mL; p=0,0020), assim como LV recuperado (IFN-? em aus?ncia de SLA: 2,29 pg?mL e presen?a de SLA: 139,80 pg?mL; p=0,0005). Contudo o elevado n?vel de IL-10 parece estar inibindo a atividade pro-inflamat?ria de IFN-? e TNF-? em pacientes na fase sintom?tica. Contrariamente as demais citocinas pro-inflamat?rias, a cultura de sangue total do grupo LV ativa n?o apresentou produ??o de IL-2 Leishmania espec?fica (em aus?ncia de SLA: 2,42 pg?mL e em presen?a de SLA: 2,56 pg?mL). Com base nesses dados n?s conclu?mos que a restaura??o da ativa??o de linf?citos e a diminui??o da produ??o de IL-10, Leishmania espec?fica, est?o relacionados ? um perfil imunol?gico protetor. / Visceral Leishmaniasis (VL) is endemic in Brazil and the northeast region had the highest incidence of the disease , despite, in the last 30 years, it has spread to all geographic regions of the country. Leishmania infantum is the m ain etiological agent of VL in Latin America, Europe and North Africa. However, not all infected individuals develop the disease; in fact, the majority present spontaneous re solution of infection without symptoms. The evaluation of the immunological profil e has been mostly conducted stimulating, with Leishmania spp. antigen, peripheral blood mononuclear cells isolated from subjects with VL. These studies showed that VL patients had an inhibition of both, lymphocyte proliferation and proinflammatory response to Leishmania spp. antigen. Our study aimed to evaluate the immune response in active LV, cured post treatment and asymptomatic infection. To reach this aim, we analyzed immunophenotypic features related to activation, Treg and memory lymphocytes, by flow cytometry, as well as, evaluation of cytokine production, in ex vivo or in whole blood culture. In active VL volunteers, a longitu dinal study was conducted with reassessment at 4 and 14 months after clinical cure. The control group included individuals th at live d in endemic region and were either Positive Control, consisting of individuals with positive anti - L eishmania spp. serology and/or positive PCR for Leishmania ? spp. and Negative Control composed by individuals with negative anti - Leishmania antibodie s serology and negative PCR for Leishmania . During VL, CD4 lymphocytes showed greater activation and memory profile s and were the major source of cytokines in culture when compared to CD8 lymphocytes , and these were not Leishmania specific. There were act ivated lymphocytes during VL (CD4 + CD69 + :4.9%) when compared to control groups, Positive (CD4 + CD69 + :1.96%, p=0.0045) and Negative (CD4 + CD69 + :1.35%, p=0.006), on the other hand, this was non - specific activation. The lymphocyte activation profile remain ed el evated even 14 months post treatmen t. A fter clinical cure , the activation was Leishmania specific (CD4 + CD25 + absence of SLA: 8.4%, and presence of SLA: 10.7% p=0.0279). CD8 + CD25 + lymphocytes were able to produce Leishmania specific IFN - ? in both, Positive Controls (absence of SLA 5.2% and presence of SLA: 9.5%, p=0.0391) and Cured 4 month (absence of SLA: 3.9%; presence of SLA: 10.7% p=0.0098). Whole blood culture cells, of VL patients, were able to produce IFN - ?, by SLA stimulation (absence of SLA: 28.0 pg ?mL, and presence: 44.3 pg?mL p=0.0020) as well as recovered groups (absence of SLA 2.3 pg?mL and presence of SLA 139.8 pg?mL, p=0.0005). However, the high level of IL - 10 seem ed to inhibit pro - inflammatory activity of IFN - ? and TNF - ? during symptomatic dis ease . Unlike other pro - inflammatory cytokines, active VL group d id not produce Leishmania specific IL - 2 (absence of SLA 2.4 pg?mL and presence of SLA: 2.6 pg?mL). Based on these data we conclude that the restoration of lymphocyte activation and decreased i n IL - 10 Leishmania specific production were related to a protective immune profile.