Future changes in the incidence and prevalence of OA are difficult to predict. As incidence and prevalence rise with increasing age, extending life expectancy will result in greater numbers with OA. Actually, usual therapeutic approaches are really restricted because of important side effects with long-term use. Therefore, there is a need to develop improved formulations which are well tolerated, biocompatible and biodegradable. Ideally, these new treatments should be able to deliver locally sufficient amount of anti-inflammatory or analgesic drugs into the site of arthritic inflammation while stabilizing or better restoring the mechanical integrity of the joint. In this way, the objective of this project is to develop slow-release gels that are sterile, injectable, characterized by viscoelastic properties and capable to sustain the in situ release of both hydrophilic and lipophilic drugs. The intraarticular delivery combined to sustained-release property should be interesting to reduce the number of injection required while prolonging the local drug activity over weeks. For that purpose, glycerol monooleate (GMO), also called “monolein” was selected for its capacity to form highly viscous crystalline phase structures upon contact with an aqueous fluid (e.g. synovial fluid). <p>In the first step of this work, it was decided to develop and characterize hydro-lipidic gels based on the use of monolein and hyaluronic acid in order to provide in vitro sustained release of hydrophilic drugs such as clonidine and lipophilic drugs such as betamethasone. Initially, a compatibility study was performed on the main ingredients selected in order to check that there were not physico-chemical incompatibilities, which could be deleterious regarding to their stability in formulation. Then, the development of hydro-lipidic gels was initiated by considering on the first hand the solubility of each ingredient and on the other hand the syringeability, the rheological properties and the in vitro dissolution profiles obtained for the developed formulations. The objective of this preformulation program was to identify potential candidates that presented suitable syringeability while being able to sustain the release of drugs over weeks and being characterized by interesting viscoelastic properties for the long-term management of osteoarthritis. Moreover, several methods of quantification and characterization were developed in order to allow the physico-chemical properties (rheology, syringeability, water uptake, stability and dissolution profiles) of the developed formulations to be studied.<p>Results of the compatibility study showed that the concomitant use of monolein, hyaluronic acid and clonidine/betamethasone is not contraindicated. Next, the preformulation program allowed many injectable drug delivery systems to be prepared. However, the carrier that best meets our needs was composed of 10,0 % (wt/wt) absolute ethanol ;15,0 % propylene glycol (wt/wt) ;15,0 % (wt/wt) water ;55,0 % (wt/wt) de monolein ;5,0 % (wt/wt) purified soybean oil ;0,03 % (wt/wt) α-tocophérol and 7,5 mg/g sodium hyaluronate (1.9 MDa). This carrier assured suitable syringeability and rheological properties. Indeed, it presented marked pseudoplastic flow behavior that allowed relatively fast injection through a narrow needle, followed by an increase in viscosity upon contact with aqueous fluids to obtain an in vitro sustained release of hydrophilic and lipophilic drugs over a few weeks. As a consequence, it was assumed that this carrier should be able to jellify in situ upon contact with physiological fluid such as synovial fluid. Then, according to EMA recommendations, a fast and easy manufacturing process that could be applied in a cleanroom at industrial scale was validated in our Laboratory. Finally, according to these promising results obtained in vitro, a stability study was performed on the carrier alone and containing clonidine or betamethasone according to ICH recommendations described for products intended for storage in a refrigerator. In that purpose, several parameters such as the quantification of drugs, the pH, the molecular weight of hyaluronic acid, the dissolution profiles of drugs and the rheological properties of the formulations were recorded depending on time and conditions of storage. This stability study showed clearly the importance to adjust the pH value of the formulation. Indeed, it was demonstrated that a pH value of 6.5, adjusted with diluted NaOH, allowed the stability of the formulation to be significantly improved. During this first step of this project, our Laboratory initiated two new collaborations. On the first hand, collaboration with the Laboratory of Professor Siepmann (University of Lille 2 – Faculty of Pharmacy) was started for their expertise on mathematical modeling. On the other hand, collaboration with the Laboratory of Professor Jerôme (ULg – Faculty of sciences) was started for their expertise on macromolecular chemistry and more particularly on rheological properties.<p>In the second step of this work, it was decided to evaluate in vitro the safety and the efficiency of the developed carrier and formulations containing clonidine or betamethasone. In this way, it was suggested to test selected drugs and potential candidates formulations on equine polymorphonuclear leukocytes (PMN) by measuring the production of reactive oxygen species (ROS) by PMNs stimulated or not with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). For that purpose, our Laboratory initiated a new collaboration with the Laboratory of Professor Serteyn (ULg – Faculty of veterinary) for their expertise on equine PMNs and quantification of (ROS) produced in particular in inflammatory diseases.<p>This in vitro study has shown that no pro-inflammatory effect appeared by incubating carrier with unstimulated PMNs in comparison with the control assay. However, the production of ROS was quickly and considerably decreased when stimulated cells were placed in contact with carrier regardless on the incorporation of clonidine or betamethasone. This observation demonstrated that developed carrier provided a strong antioxidant effect, certainly by trapping the ROS produced. These results were very promising because that antioxidant effect of carrier could inhibit oxidative damages and might consequently potentiate the prevention of inflammatory conditions. Concerning the clonidine and betamethasone, only the last one provided significant inhibition of the ROS activity.<p>Finally, by considering the very promising results obtained with the in vitro study on PMNs, an in vivo study on rabbits, which seemed to be the most appropriate small animal model for this kind of intraarticular formulations, was performed to evaluate the toxicity and the efficiency of the developed carrier and formulation containing betamethasone. Therefore, our Laboratory started collaboration with the unit of research in osteo-articular pathologies (UROC) of Pr. Henrotin (ULg) for their expertise in animal models, in particular rabbits with osteoarticular pathologies such as osteoarthritis. For this purpose, this in vivo study was outsourced by TNO (Delft, Holland) and was designed as follow: (i) 0.9 % saline buffered (n=8); (ii) carrier (n=8); (iii) formulation containing betamethasone (n=8); (iv) Durolane® (n=8) a marketed product of HA. Surprisingly, it seemed that the control group (saline buffered) presented macroscopical and histological scores that were globally low according to literature. As a consequence, it was difficult to conclude about the efficiency of the developed treatments by considering only this pilot study. However, it is important to note that it seemed that the expected viscoelastic protection of the carrier to prevent the degradation of articular cartilage was not optimal regardless on the incorporation of betamethasone. Nevertheless, the histological analyses of synovial membranes from each treated groups demonstrated that there was no pro-inflammatory reaction. This meant that all formulations tested were well tolerated despite of the apparition of lumps (in 37.5 % of treated rabbits) that are probably due to both the high volume injected (900 µL) and an excessive and unexpected in situ water uptake of developed formulations based on GMO. However, this lack of rejection of the developed carrier could be very important since it allowed new perspectives to be considered. For example, other articular disorders could be targeted by incorporating drugs, for which in situ sustained release or mechanical protection could be beneficial. <p>Our laboratory is member of a collaborative project "JOINT-AIC" from BioWin and is supported by a grant from the Walloon Region. The development of analytical methods, the evaluation of physico-chemical properties and finally the preparation of sterile batches of formulations based on GMO intended for in vitro and in vivo studies were performed in the Laboratory of Galenic and Biopharmacy of the Faculty of Pharmacy of ULB./L’arthrose est une pathologie dont la prévalence et le coût ne font qu’augmenter dans notre société vieillissante. Les moyens thérapeutiques actuels étant fort limités suite à de sérieux effets secondaires à long terme, il existe réellement un besoin médical important de développer de nouveaux traitements locaux qui soient bien tolérés, biocompatibles et biodégradables. Idéalement, ceux-ci devraient être actifs au niveau du processus inflammatoire ou de la douleur tout en étant capable de stabiliser, voire de restaurer, l’intégrité mécanique de l’articulation. <p>Dans cette optique, l’objectif de ce projet a été de développer des systèmes hydrolipidiques stériles, injectables et viscoélastiques qui soient capables de prolonger in situ la libération de principes actifs hydrophiles et lipophiles. Cette caractéristique devait permettre de réduire le nombre d’injections nécessaires dans le cadre du traitement symptomatique de l’arthrose et de maintenir l’effet des composés sur un minimum de quatre à six semaines. Cette étude entre dans le cadre du projet JOINT-AIC entièrement financé par le programme BioWin de la Région Wallonne. Le développement, la validation des méthodes analytiques, l’évaluation des propriétés physico-chimiques ainsi que la préparation stérile des lots de formulation destinés aux tests in vitro et in vivo ont été réalisés au sein du Laboratoire de Galénique et Biopharmacie de la Faculté de Pharmacie de l’ULB. <p>Au cours de ce projet, il a donc fallu dans un premier temps développer et caractériser des formulations hydrolipidiques à base de monoléine et d’acide hyaluronique permettant une libération in vitro prolongée de principes actifs tels que la clonidine (hydrophile) et le dipropionate de bétaméthasone (lipophile). Une étude de compatibilité a ainsi été préalablement réalisée afin de s’assurer qu’aucun des constituants principaux de la formulation ne présentaient d’incompatibilité physico-chimique qui pourrait être délétère vis-à-vis de leur stabilité en formulation. Ensuite, le développement de préparations hydro-lipidiques a été initié en tenant compte, d’une part de la solubilité des différents composants et, d’autre part de l’injectabilité, des propriétés rhéologiques et des profils de libération de la clonidine obtenus à partir des gels développés. Cette étude visait à obtenir une composition de référence qui soit à la fois injectable et capable de libérer un principe actif hydrophile sur plusieurs jours, voire plusieurs semaines, tout en possédant des propriétés rhéologiques intéressantes dans le cadre d’une viscosupplémentation articulaire. Enfin, un protocole de fabrication en milieu aseptique a été développé et plusieurs méthodes pour étudier les propriétés physico-chimiques des gels développés telles que la rhéologie, l’injectabilité, l’indice de gonflement, la stabilité et les profils de libérations ont été mises en place. <p>Les résultats ont montré qu’aucune incompatibilité ne semblait exister entre les trois composés majeurs de notre préparation, la monoléine, l’acide hyaluronique et la clonidine. Le développement des formulations nous a ensuite permis d’obtenir de nouveaux systèmes hydrolipidiques stériles et injectables à délivrance prolongée. Le véhicule qui remplissait au mieux nos objectifs était composé de 10,0% (m/m) d’éthanol ;de 15,0% de propylène glycol (m/m) ;de 15,0% (m/m) d’eau ;de 55,0% (m/m) de monoléine ;5,0% (m/m) d’huile de soja purifiée ;0,03% (m/m) d’α-tocophérol, de 7,5 mg/g d’HA et son pH était ajusté à 6,5 avec du NaOH 1N. Ce véhicule a montré un intérêt réel dans le cadre du développement de préparations biodégradables et biocompatibles pour le traitement de pathologies articulaires.En effet, cette composition présentait un écoulement de type pseudoplastique et des propriétés rhéologiques qui lui procuraient une bonne injectabilité. De plus, cette formulation a démontré in vitro une excellente capacité à gélifier au contact de fluides aqueux et à ralentir efficacement sur plusieurs semaines la libération des différents principes actifs incorporés (clonidine et dipropionate de bétaméthasone). Nous pouvions, dès lors, envisager que celle-ci serait capable de gélifier in situ au contact d’un fluide physiologique tel que le liquide synovial. Ensuite, suivant les recommandations de l’EMA, nous avons décidé d’utiliser l’association d’une filtration stérilisante et d’une préparation en milieu aseptique pour obtenir des formulations qui répondaient aux exigences en matière de préparation parentérale. C’est ainsi qu’un protocole de fabrication stérile de nos gels a été développé par nos soins en vue d’une éventuelle mise à l’échelle industrielle. Enfin, une étude de stabilité sur une année, suivant les normes ICH décrites pour des formulations destinées à être conservées au frigo, a été réalisée sur différents véhicules développés et contenant soit la clonidine, soit le dipropionate de bétaméthasone. Dans cette optique, plusieurs paramètres, tels que le dosage en principe actif, l’évolution du pH et du poids moléculaire de HA, le profil de libération ainsi que la rhéologie des formulations ont été évalués au cours du temps aux différentes conditions de conservation testées. Cette étude a permis de démontrer toute l’importance d’ajuster le pH de la préparation pour prévenir l’hydrolyse de l’HA, et cela indépendamment de l’incorporation de principe actif. Ainsi, il a pu être montré que l’ajustement du pH du véhicule à 6,5 à partir de NaOH dilué permettait d’améliorer considérablement la stabilité de la formulation puisqu’aucune modification significative de ses différents paramètres physico-chimiques et teneurs n’a été observée après un an de conservation à 5 et à 25 °C (60% HR) mais également après six mois à 30 °C (65% HR). Au cours de cette première partie, deux collaborations ont été initiées, l’une avec le Laboratoire du Prof. Siepmann de l’Université de Lille 2 et l’autre avec le Prof. Jerôme de l’Université de Liège. Avec l’aide du Prof. Siepmann, il a été possible de mettre au point un modèle mathématique pour caractériser les profils de libération des principes actifs à partir des différents véhicules développés. Le Prof. Jerôme a, quant à elle, mis à notre disposition un rhéomètre qui a permis d’approfondir nos connaissances sur les propriétés rhéologiques et viscoélastiques des formulations.<p>Ensuite, la seconde partie de notre travail a consisté à évaluer la tolérance, ainsi que l’efficacité des principes actifs sélectionnés et des formulations développées, à travers un modèle in vitro de cellules de l’inflammation (neutrophiles équins). Cette étude avait pour objectif d’évaluer deux aspects importants de la formulation :d’une part vérifier l’absence de réaction pro-inflammatoire qui pourrait être in vivo destructrice vis-à-vis du véhicule ainsi que des tissus environnants, et d’autre part vérifier l’effet anti-inflammatoire propre à la clonidine et au dipropionate de bétaméthasone seuls et en formulation. Cette étude a été réalisée avec la collaboration du Laboratoire du Prof. Serteyn de l’Université de Liège.Cette étude in vitro a démontré que les cellules restaient viables au moins pendant quatre heures lorsqu’elles étaient exposées à la matrice épurée de ses solvants. Ensuite, de manière surprenante, il a même pu être démontré que le véhicule permettait à la fois de prévenir et de réduire significativement la production des espèces réactives de l’oxygène (ROS) par les neutrophiles équins lorsque ceux-ci étaient stimulés au phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Cette propriété peut être d’un grand intérêt dans le cadre de la prise en charge de l’arthrose car cette activité antioxydante pourrait permettre d’inhiber les dommages oxydatifs générés par les ROS et ainsi prévenir les dommages liés au développement du processus inflammatoire et qui peut, à long terme, s’avérer délétère pour les tissus environnants tels que le cartilage. Cette propriété du véhicule semble trouver son origine dans la monoléine qui, de par sa composition en alpha-tocophérol (200 ppm), présente également une activité antioxydante vis-à-vis des ROS. Toutefois, une action synergique liée à l’HA, à l’huile de soja ou à l’alpha-tocophérol incorporés aux formulations, n’est pas à exclure. Enfin, parmi les deux principes actifs sélectionnés, seul le dipropionate de bétaméthasone a montré une inhibition significative de la production des ROS.<p>Enfin, en tenant compte des résultats obtenus sur cellules, une étude in vivo pilote a été réalisée sur base d’un modèle de lapins. Cette étude visait à vérifier la tolérance ainsi que l’efficacité en prophylaxie de l’arthrose du véhicule développé ainsi que de la formulation contenant le dipropionate de bétaméthasone. Dans ce but, quatre groupes d’animaux (n=8) ont été constitués pour chacun des traitements testés :(i) groupe témoin :0,9 % tampon salin pH 7,4 ;(ii) véhicule à base de GMO développé; (iii) véhicule contenant du dipropionate de bétaméthasone ;(iv) groupe référence :Durolane®. Cette étude a été réalisée avec l’aide du Laboratoire du Prof. Henrotin de l’Université de Liège. L’hébergement des animaux ainsi que les actes chirurgicaux ont, quant à eux, été sous-traités par TNO (Delft, Pays-Bas).<p>De manière étonnante, il s’est avéré que le groupe contrôle présentait des scores macroscopique et histologique globalement peu élevés par rapport à ce qui est rapporté dans la littérature. Compte tenu de cette observation, il est difficile de se prononcer, sur base uniquement de cette étude, sur l’efficacité des différents traitements testés. Toutefois, il faut reconnaître que l’effet protecteur attendu pour le véhicule vis-à-vis de la dégradation du cartilage ne semble pas optimal et cela indépendamment de l’incorporation de dipropionate de bétaméthasone. Par ailleurs, l’étude des membranes synoviales a permis de démontrer qu’il n’y avait aucune différence significative en termes d’inflammation et de structure entre le groupe contrôle et les différents groupes traités. Ce qui signifie qu’aucun rejet n’a été observé vis-à-vis des formulations et que celles-ci ont, par conséquent, été bien tolérées malgré la formation de masses liées probablement au volume important injecté (900 µL) et au gonflement in situ du produit chez 37,5 % des lapins. Cette observation est importante puisqu’elle permet d’envisager de nouvelles perspectives telles que l’incorporation d’autres principes actifs pouvant éventuellement viser d’autres pathologies articulaires et pour lesquels une libération prolongée ou une protection mécanique du principe actif in situ serait bénéfique. <p><p><p><p><p><p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Lung cancer is the deadliest cancer in the world, with a global 5-year survival rate of about 15%. Despite a notable impact of the latest improvements in prevention, screening, detection and staging, the efficacy of conventional treatments is not sufficient and has reached a therapeutic plateau. These conventional treatments involve a combination of surgery, radiotherapy (RT) and chemotherapy (CT). CT is used in almost all stages: in operable and inoperable stages to limit tumour cell invasion and in latest stages as a palliative treatment. Cisplatin is one of the most frequently used and most potent drugs available. It is administered by parenteral route at doses limited by its high and cumulative nephrotoxicity but also by other systemic toxicities (e.g. ototoxicity). Its administration therefore requires many precautions (long hydration procedure, surveillance of the renal function), which mobilize medical personnel. A major limitation of parental CT is the low concentration of drug that successfully reaches the tumour or the metastases. A potential additional modality could be aerosolized CT to localize lung cancer treatment. It has shown a relative local tolerance for cisplatin through preclinical and clinical studies in humans by means of nebulized solutions or liposomal formulations. As a local treatment, aerosolized CT has a clear pharmacokinetic (PK) advantage, as it can increase local exposure while decreasing systemic exposure. However, because CT drugs, such as cisplatin, are active at rather high doses (in the mg range), the duration of administration from nebulizers is very long as it depends on the drug solubility or on drug encapsulation into liposomes. They also pose a high risk of environmental contamination and require HEPA-filtrated hoods during the nebulization procedure. Of all the inhalation devices available to deliver high drug doses, dry powder inhalers (DPIs) were chosen in this work. These were chosen to circumvent the above issues by providing higher deposited doses, in very short timeframes, using a patient-driven device that could help limit environmental exposure to only very low levels of drug. DPI in general also have the advantage of being applicable to both poorly-water-soluble and to water-soluble anticancer drugs. However, because direct deposition of high quantities of anticancer drugs to the lung parenchyma could pose a high risk of local irritation and pulmonary adverse effects, controlled release (CR) of cisplatin from deposited particles in the lung parenchyma was needed. However, in the lungs, foreign undissolved particles are rapidly eliminated by means of naturally occurring clearance mechanisms, in particular macrophage uptake in the alveoli. Therefore, formulation strategies able to limit the particles clearance are needed to assure high lung residence of these CR particles. The formulation strategy of this work was to develop DPI formulation based on solid-lipid microparticles (SLM) able to (i) be deposited into the lung, (ii) control the release of cisplatin and (iii) escape macrophage uptake in order to remain in the lung long enough and at a concentration able to optimize the therapeutic index (i.e. increase the potential therapeutic effect and decrease the potential side effects).The primary objectives of the SLM-based DPI formulations were to (i) exhibit aerodynamic properties compatible with lung cancer patients abilities and cisplatin requirements (e.g. a high deposited fraction, high deagglomeration abilities under low airflow within a low-resistance DPI, deposition in the mg range), (ii) provide a CR matrix for cisplatin in vitro, (iii) be able to be retained into the lung long enough in vivo, (iv) using scalable production techniques and (v) using only potentially well-tolerated excipients.Cisplatin was initially reduced to microcrystals under high-pressure homogenization (HPH) cycles up to 20 000 psi. This procedure permitted uncoated particles with mean diameters below 1.0 μm to be obtained. To assess the cisplatin release abilities of the DPI formulations on the deposited fraction only, a new dissolution test was adapted. This test used a classical paddle apparatus from the pharmacopoeia and a Fast Screening Impactor (FSI). An excipient-free formulation, obtained from the spray dried suspension of cisplatin microcrystals (100% cisplatin) was initially produced. It was compared to a 95:5 cisplatin/tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) formulation, which exhibited a higher deposition ability (fine particle fraction (FPF) of 24.2 vs. 51.5% of the nominal dose, respectively). Both exhibited immediate release (IR), with 90% dissolved under 10 minutes.Solid lipid microparticle (SLM)-based formulations were then produced using the cisplatin microcrystalline suspension and various lipid excipients. Those had previously been screened for their ability to be spray dried following their solubilisation in heated isopropanol. The addition of a triglyceride, tristearin (TS), as the main lipid component and if necessary a polyethylene glycol (PEG) excipient-comprising fraction with TPGS or distearoyl phosphoethanolamine polyethylene glycol 2000 (DSPE-mPEG-2000) as a surface modifier, provided spray dried particles with interesting characteristics. These formulations, comprised of at least 50% cisplatin, exhibited high CR abilities in simulated lung fluid at 37°C for more than 24 h (as low as 56% released after 24 h) and a low burst-effect (as low as 24% and 16% after 10 minutes with and without PEGylated excipients, respectively). They also showed high aerodynamic properties, with a high FPF ranging from 37.3 to 50.3% w/w of the nominal dose and a low median mass aerodynamic diameter (MMAD) between 2.0 and 2.4 μm. The process also offered high production yields (> 60%).The best IR DPI formulation (evaluated on the FPF, i.e. cisplatin/TPGS 95:5) and the most promising CR formulations without (i.e. cisplatin/TS 50:50) and with PEGylated excipients (evaluated on CR abilities, i.e. cisplatin/TS/TPGS 50:49.5:0.5) were then administered to CD 1 mice, concurrently to endotracheal nebulization (EN) of a cisplatin solution. This was done using specific endotracheal devices, the Penn-Century Inc. DP-4M© Dry Powder Insufflatorn and for the cisplatin solution, the Microsprayer™ IA-1C©. They were compared to intravenous (IV) injection during a PK study over 48 hours. The administration of DPI formulations required the development of a spray dried diluent (Mannitol:Leucine 10:1) and specific dilution method (3D mixing for 4 hours and double-sieving) to be able to deliver precise and repeatable quantities of powder into the lungs of mice at 1.25 mg/kg dose. A PK study was carried out of the lungs, blood, kidneys, liver, mediastinum and spleen of the mice. The study used a developed and validated electrothermal atomic absorption spectrometry (ETAAS) method. Results showed that endotracheal administration of DPI formulations permitted the exposure of the lungs to cisplatin, expressed as the area under the curve (AUC) to be greatly increased while decreasing the systemic exposure. More precisely, the only formulation that exhibited prolonged lung retention was the one comprising PEGylated excipient (cisplatin/TS/TPGS 50:49.5:0.5), which was observed for ~7 hours. This lung retention was associated with smoother concentration vs. time profiles in blood (higher tmax and lower Cmax), which also confirmed its CR abilities in vivo as dissolved cisplatin is a highly permeable drug. The overall exposure, established by the AUC, helped calculate the target efficiency (Te: the ratio of AUC in the lungs to the sum of AUC in non-target organs) and the target advantage (Ta: ratio of AUC in the lungs by the tested route to the AUC in the lungs by the IV route). For instance, the Ta of the aforementioned formulation (cisplatin/TS/TPGS 50:49.5:0.5) was of 10.9, as compared to 1 for IV, 3.3 for EN, 2.6 for the IR DPI formulation (cisplatin/TPGS 95:5) and 3.7 for the non-PEGylated CR DPI formulation (cisplatin/TS 50:50). In the meantime, the Te for the same formulations were 1.6, 0.09, 1.1, 0.4 and 0.9, respectively, showing again the great efficiency of the inhaled route vs. the IV route in targeting the lungs. More importantly, it showed the added efficiency of the CR DPI formulation with lung retention abilities, provided by the addition of PEGylated excipients. In the last part of the work, maximum tolerated doses (MTD) of formulations were established. These showed that the best candidate, selected based on the PK results (CR DPI with lung retention abilities composed of cisplatin/TS/TPGS 50:49.5:0.5) had better overall tolerance than IR approaches (DPI formulation at cisplatin/TPGS 95:5 and EN of a cisplatin solution). More precisely, it was possible to double the administered dosage for the CR formulation (1.0 mg/kg) vs. the IR DPI and EN (both at 0.5 mg/kg) under a repeated administration scheme (3 times a week for 2 weeks).Moreover, an assessment of the lung tolerance of this best candidate was realized and compared to the IR DPI, EN and the IV route. It was done through analysis of the broncho-alveolar lavage fluid (BALF) 24 hours following a single administration at the pre-determined MTD. IL-1β, IL-6 and TNF-α cytokines were not increased following the administrations. No evidence of tissue damage or cytotoxicity could be observed through quantification of the protein content and of lactate dehydrogenase (LDH) activity. The only observations were a decrease in total cells and an increase in polynuclear neutrophils (PN) cells in the BALF, which was not observed by IV or following the administration of the vehicle of the CR formulation alone (i.e. PEGylated SLM and dry diluent). This increase was not directly linked to the formulation but rather to cisplatin, as it was observed in each cisplatin inhalation experiments, and not with the vehicle of the CR formulation, which was comparable to the non-treated mice.In parallel, we realized a survival study following the administration of the best DPI formulation candidate (cisplatin/TS/TPGS 50:49.5:0.5) vs. the IR DPI candidate (cisplatin/TPGS 95:5), both at their respective MTD under the aforementioned repeated dosing scheme. Cisplatin was administered to mice bearing a grafted orthotopic M109-HiFR lung tumour model, previously developed in the laboratory. The DPI formulations were evaluated against IV administration at each dose (0.5 and 1.0 mg/kg, respectively). This study first confirmed the lower toxicity of the CR approach, as the IR DPI formulation caused a much higher number of deaths during treatment of the grafted mice. The CR formulation administered at 1.0 mg/kg showed a higher survival than the negative control but a tumour response comparable to IV administered at half this dose (0.5 mg/kg). This unexpected outcome with regard to the PK results is explained by the fact that the tumour model is highly metastatic. Mice treated with inhaled formulations died due to distant tumour involvement, while those treated systemically died due to pulmonary tumour involvement. This led us to believe that this kind of treatment may have greater potential in combination, adjuvant to the parenteral route.This work helped establish the proof-of-concept of a cisplatin CR DPI formulation with an up-scalable process. The SLM approach confirmed that encapsulation of drugs exhibiting low solubility, such as cisplatin, was possible using highly hydrophobic excipients and that surface modification was mandatory to provide notable lung retention in vivo. The SLM approach showed good signs of tolerance during the exploratory study but still needs to be confirmed under a chronic scheme using other determinants such as histopathological analyses of the lung tissue. Moreover, comparison of the nephrotoxicity of formulations against that of the IV route should be conducted with appropriate and sensitive methods. Finally, the survival study of the CR DPI formulation showed mitigated results, partly because of the orthotopic model characteristics. This could be proof that inhaled CT has a role to play combined with classical systemic CT. This needs to be assessed in a further study.Le cancer du poumon est le cancer ayant le taux de mortalité le plus élevé au monde, avec un taux de survie global à 5 ans d'environ 15%. Malgré un impact notable des dernières améliorations en matière de prévention, de dépistage, et de classification du cancer du poumon, l'efficacité des traitements classiques n'est toujours pas suffisante et semble avoir atteint un plateau thérapeutique. Ces traitements classiques comprennent de la chirurgie, de la radiothérapie et de la chimiothérapie, le plus souvent en combinaison. La chimiothérapie est utilisée à presque tous les stades: dans les stades opérables et inopérables afin de limiter l'invasion par les cellules tumorales jusqu’aux derniers stades en tant que traitement palliatif. Le cisplatine est l'un des médicaments anticancéreux les plus fréquemment utilisés et les plus puissants actuellement disponibles. Il est administré par voie parentérale à des doses qui sont limitées par sa néphrotoxicité élevée et cumulative mais également par d'autres toxicités systémiques (par exemple, de l'ototoxicité). Son administration nécessite donc de nombreuses précautions (longue procédure d'hydratation, surveillance de la fonction rénale), ce qui mobilise fortement le personnel médical. Une limitation importante de la chimiothérapie parentérale est la faible concentration d’actif qui atteint avec succès la tumeur ou les métastases. Une autre voie d’accès potentielle pourrait être la chimiothérapie inhalée pour traiter le cancer du poumon. Cette approche a montré une relativement bonne tolérance locale pour le cisplatine à travers différentes études précliniques et cliniques chez l'homme au moyen de solutions ou de formulations liposomales nébulisées. En tant que traitement via la voie pulmonaire, la chimiothérapie inhalée présente un avantage pharmacocinétique évident, car elle permet d’augmenter l'exposition locale tout en diminuant l'exposition systémique. Cependant, du fait que les médicaments chimiothérapeutiques, tels que le cisplatine, soient actifs à des doses relativement élevées (dans la gamme du mg), la durée d'administration à partir des nébuliseurs s’avère en pratique très longue car elle dépend principalement de la solubilité de l’actif ou de son encapsulation dans les liposomes. Les nébuliseurs présentent également un risque élevé de contamination de l'environnement et nécessitent de lourds appareillages (hottes filtrantes en particulier) pendant la procédure d’administration.Parmi tous les dispositifs d'inhalation existants, capables de délivrer des doses élevées de médicaments, les inhalateurs de poudre sèche (DPI) semblent être de bons candidats. Ceux-ci ont été choisis dans ce travail afin de contourner les problèmes énumérés ci-dessus, en fournissant des doses pulmonaires plus élevées, dans des délais très courts. De plus, ces dispositifs sont activés par le flux inspiratoire du patient, ce qui pourrait aider à limiter l'exposition environnementale à des niveaux très faibles. Les inhalateurs à poudre sèche présentent également l'avantage d'être utilisables à la fois avec des médicaments solubles et des médicaments peu solubles dans l’eau. Malgré tout, étant donné que la déposition directe de quantités élevées de médicaments chimiothérapeutiques dans le parenchyme pulmonaire pourrait présenter un risque élevé d'irritation et d'effets indésirables locaux, une libération contrôlée du cisplatine à partir de particules déposées dans le parenchyme pulmonaire s’avère nécessaire. Cependant, dans les poumons, ces particules non dissoutes d’origine étrangère sont rapidement éliminées par les mécanismes d’élimination, en particulier par la clairance par les macrophages au niveau des alvéoles. Par conséquent, des stratégies de formulation capables de limiter la clairance des particules sont nécessaires pour assurer une résidence pulmonaire élevée de ces particules à libération contrôlée.La stratégie de formulation de ce travail a donc consisté à développer une formulation pour inhalateur à poudre sèche à base de microparticules lipidiques solides capable de (i) être déposées dans le poumon, (ii) de contrôler la libération du cisplatine et (iii) de rester dans le poumon suffisamment longtemps dans le but d’optimiser l'indice thérapeutique (c'est-à-dire augmenter le potentiel thérapeutique du cisplatine et diminuer ses potentiels effets secondaires).Les objectifs principaux des formulations basées sur les microparticules lipidiques solides étaient (i) de présenter des hautes charges en cisplatine au sein des microparticules lipidiques tout en présentant des propriétés aérodynamiques compatibles avec la capacité pulmonaire des patients atteints de cancer du poumon (par exemple, une fraction déposée élevée et une capacité élevée à la désagglomération sous faible débit d'air dans un inhalateur de faible résistance), (ii) de fournir une matrice capable de libérer le cisplatine de manière contrôlée in vitro, (iii) d’être capable de rester dans le poumon suffisamment longtemps in vivo, tout cela (iv) en utilisant des techniques de production ayant une bonne capacité d’augmentation d’échelle et (v) de n’utiliser que des excipients potentiellement bien tolérés au niveau du poumon.Le cisplatine a été initialement réduit sous forme microcristalline à l’aide de cycles d'homogénéisation à haute pression jusqu'à 20 000 psi. Cette procédure a permis d'obtenir des particules non enrobées ayant un diamètre moyen inférieur à 1.0 μm. Afin d’évaluer les capacités de libération du cisplatine des formulations à partir de la fraction capable théoriquement de se déposer dans les poumons, un nouveau test de dissolution a été adapté à partir d’un appareil à palettes classique de la pharmacopée et d’un impacteur à cascade « Fast Screening Impactor ». Une formulation sans excipient, obtenue à partir de la suspension de cisplatine, soumise à la technique de séchage par l’atomisation (100% de cisplatine) a été produite comme point de départ. Celle-ci a ensuite été comparée à une formulation de cisplatine/tocophéryl polyéthylène glycol succinate (TPGS) (95:5), qui présentait une capacité de déposition pulmonaire in vitro (fraction de particules fines (FPF) de 24.2% pour la première et de 51.5% pour la deuxième, exprimée par rapport à la dose nominale). Toutes deux ont démontré des capacités de libération immédiate, avec 90% du cisplatin dissous en moins de 10 minutes.D’autres formulations, cette fois élaborées sous la forme de microparticules lipidiques solides ont ensuite été produites à partir de la suspension microcristalline de cisplatine et de divers excipients lipidiques. Ces microparticules avaient préalablement été testées pour leur aptitude à être séchées par atomisation après solubilisation des excipients dans de l'isopropanol chaud. L’ajout d’un triglycéride, la tristéarine (TS), comme excipient lipidique principal et également d’une fraction comprenant un excipient contenant du polyéthylène glycol (PEG), à l’aide de TPGS ou de distéaroyl phosphoéthanolamine polyéthylène glycol 2000 (DSPE-mPEG-2000) a montré des résultats intéressants. Ces formulations, ayant une teneur en cisplatine d’au moins 50%, ont présenté des aptitudes élevées pour la libération contrôlée dans le fluide pulmonaire simulé in vitro à 37 °C, et ce, pendant plus de 24 h (jusqu'à 56% libérées après 24 h) ainsi qu’un faible « burst-effect » (de seulement 24% et 16% après 10 minutes avec et sans excipients PEGylés, respectivement). Elles ont également montré des propriétés aérodynamiques élevées, avec une FPF élevée allant de 37.3 à 50.3% m/m par rapport à la dose nominale et un diamètre aérodynamique compris entre 2.0 et 2.4 μm. Le meilleur candidat à libération immédiate (évaluée sur base de la FPF, soit la formulation cisplatine/TPGS 95:5 m/m) et les formulations à libération contrôlée les plus prometteuses n’incluant pas d’excipients PEGylés (cisplatine/TS 50:50 m/m) et incluant des excipients PEGylés (évalués sur les capacités de libération contrôlée, c'est-à-dire la formulation cisplatin/TS/TPGS 50:49.5:0.5 m/m/m) ont ensuite été administrées à des souris CD-1, en comparaison d’une nébulisation endotrachéale d'une solution de cisplatine. Ceci a été fait à l’aide de dispositifs endotrachéaux dédiés aux poudres pour le DP-4M© « Dry Powder Insufflator » et aux solutions pour le Microsprayer™ IA-1C© de Penn-Century. Ces formulations ont été comparées à l'injection intraveineuse (IV) au cours d’une étude pharmacocinétique étendue sur 48 heures.L'administration de formulations de poudres sèches pour inhalation a nécessité le développement préalable d'un diluant par atomisation (Mannitol:Leucine 10:1 m/m) ainsi que d’une méthode de dilution des poudres (mélange tridimensionnel pendant 4 heures et suivi d’un double-tamisage) afin de pouvoir délivrer des quantités précises et répétables de poudre dans les poumons de souris à la dose d’1.25 mg/kg. Le suivi des paramètres pharmacocinétiques a ainsi pu être réalisé au niveau des poumons, du sang, des reins, du foie, du médiastin et de la rate des souris. Ceci a été fait à l’aide d’une méthode de spectrométrie d'absorption atomique électrothermique, qui a été préalablement développée et validée. Les résultats obtenus ont montré que l'administration endotrachéale de formulations de poudres sèches permettait d’augmenter fortement l'exposition des poumons par le cisplatine, exprimée en aire sous la courbe (AUC) tout en diminuant l'exposition systémique. Plus précisément, la seule formulation présentant une rétention pulmonaire prolongée était celle qui comprenait un excipient PEGylé (cisplatine/TS/TPGS 50:49.5:0.5 m/m/m), ce qui a été observé pendant environ 7 heures. Cette rétention pulmonaire a été associée à des profils de concentration en fonction du temps plus réguliers dans le sang (tmax supérieur et Cmax inférieur), ce qui a également confirmé ses capacités de libération contrôlée in vivo car la perméabilité de l’épithélium pulmonaire pour le cisplatine dissous s’est avérée très élevée. L'exposition globale établie à partir de l’AUC a permis de calculer l’efficacité de ciblage (Te: rapport de l'AUC mesurée dans les poumons et de la somme des AUC mesurées dans les organes non cibles) et l’avantage du ciblage (Ta: rapport de l’AUC mesuré dans les poumons suite à l’administration pulmonaire et de l'AUC mesurée dans les poumons suite à l’administration par la voie IV). Par exemple, le Ta de la formulation décrite ci-dessus (cisplatine/TS/TPGS 50:49.5:0.5 m/m/m) était de 10.9, comparativement à 1 pour l’IV, 3.3 pour la nébulisation endotrachéale, 2.6 pour la formulation de poudre sèche à libération immédiate (cisplatine/TPGS 95:5 w/w) et 3.7 pour la formulation de poudre sèche à libération contrôlée ne comprenant pas d’excipient PEGylé (cisplatine/TS 50:50). Dans le même temps, le Te mesuré pour les mêmes formulations était de 1.6, 0.09, 1.1, 0.4 et 0.9, respectivement, démontrant également le rendement élevé de la voie inhalée par rapport à la voie IV dans sa capacité à cibler les poumons. Plus important encore, ceci a démontré le grand avantage des capacités de rétention pulmonaire de la formulation à libération contrôlée comprenant un excipient PEGylé.Dans la dernière partie de ce travail, les doses maximales tolérées (DMT) des formulations ont été déterminées. Le meilleur candidat, choisi en fonction des résultats de pharmacocinétique (formulation à libération contrôlée ayant des capacités de rétention pulmonaire composé de cisplatine/TS/TPGS 50:49.5:0.5 m/m/m), avait une meilleure tolérance globale que les deux approches à libération immédiate testées (formulation de poudre sèche cisplatine/TPGS 95:5 et la nébulisation endotrachéale d'une solution de cisplatine). Plus précisément, il s’est avéré possible de doubler le dosage administré pour la formulation à libération contrôlée (1.0 mg/kg) par rapport à la poudre sèche à libération immédiate et à la nébulisation endotrachéale (toutes les deux à 0.5 mg/kg) suivant un schéma d'administration chronique (3 fois par semaine pendant 2 semaines). De plus, une évaluation de la tolérance pulmonaire de cette formulation à libération prolongée a été réalisée et comparée à la poudre sèche à libération immédiate, à la nébulisation endotrachéale et à la voie IV. Elle a été réalisée par analyse du liquide provenant du lavage broncho-alvéolaire, 24 heures après une administration unique à la dose maximale tolérée préalablement déterminée pour chaque formulation. Aucune augmentation des cytokines IL-1β, IL-6 et TNF-α n’a pu être détectée à la suite des administrations. Aucunes preuves de lésion tissulaire ou de cytotoxicité n'ont pu être observées au travers du dosage de la teneur en protéines totale et de l'activité de la lactate déshydrogénase. Les seules observations qui ont pu être faites ont été une diminution des cellules totales et une augmentation des polynucléaires neutrophiles dans le lavage broncho-alvéolaire, ce qui n'a pas été observé suite à l’administration IV ou après l'administration du véhicule de la formulation à libération contrôlée seul (c'est-à-dire les microparticules lipidiques solides PEGylées et le diluant). Cette augmentation ne semble pas liée aux microparticules lipidiques solides ou au diluent mais probablement à l’exposition pulmonaire au cisplatine, car cette augmentation a été observée pour chaque groupe inhalé contenant du cisplatine. Le cisplatine a ensuite été administré à des souris qui ont été greffées de manière orthotopique par une lignée murine de carcinome pulmonaire M109-HiFR, modèle préclinique préalablement développé au sein de notre laboratoire. Les formulations de poudres sèches ont été évaluées par rapport à l'administration IV à chaque dose testée (0.5 et 1.0 mg/kg, respectivement). Cette étude a d'abord confirmé la toxicité plus faible de l'approche à libération contrôlée, car la formulation à libération immédiate a causé un nombre beaucoup plus élevé de décès pendant le traitement des souris greffées. La formulation à libération contrôlée administrée à 1.0 mg/kg, a montré une survie plus élevée que le contrôle négatif, mais une réponse comparable à la dose IV administrée à la moitié de la dose (0.5 mg/kg). Ce résultat inattendu par rapport aux résultats de l’étude pharmacocinétique s'explique probablement par le fait que le modèle de tumeur utilisé est hautement métastatique. Les souris traitées avec des formulations inhalées sont mortes en raison de tumeurs secondaires distantes par rapport à la tumeur primaire implantée au niveau du poumon, alors que celles traitées par la voie systémique sont mortes en raison d’un envahissement tumoral pulmonaire. Cela nous amène à penser que ce type de traitement inhalé pourrait avoir un plus grand potentiel en combinaison à la voie parentérale. Ce travail a ainsi permis d’établir la preuve du concept de formulation à base de poudre sèche de cisplatine à libération contrôlée, en utilisant un processus de fabrication capable de subir une mise à l’échelle industrielle. L’utilisation de microparticules lipidiques solides a confirmé que l'encapsulation d’actifs présentant une certaine hydrophilie, comme le cisplatine, était possible en utilisant des excipients hautement hydrophobes et qu'une modification de leur surface était cependant obligatoire pour obtenir une rétention pulmonaire intéressante in vivo. Les microparticules lipidiques solides ont montré de bons signes de tolérance au cours de l'étude exploratoire, mais celle-ci doit encore être confirmée avec une administration chronique des poudres. Ceci doit être fait en suivant des paramètres supplémentaires, tels que des analyses histologiques du tissu pulmonaire. De plus, la comparaison de la néphrotoxicité des formulations avec celle mesurée par la voie IV doit être effectuée avec des méthodes appropriées et sensibles. Enfin, l'étude de survie de la formulation à libération prolongée a montré des résultats mitigés, en partie à cause des caractéristiques du modèle orthotopique de tumeur pulmonaire. Cependant, il semblerait que la chimiothérapie inhalée à un rôle important à jouer en combinaison avec la chimiothérapie systémique classique. Ceci doit être évalué dans une étude future. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

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Le récepteur du facteur de libération de l’hormone de croissance (GHRHR) est un récepteur de la famille des récepteurs couplés aux protéines G. Il est fortement exprimé dans les cellules somatotropes de l’hypophyse antérieure de plusieurs mammifères. Ce récepteur exerce un rôle primordial dans la stimulation de la synthèse et de la sécrétion de l’hormone de croissance ainsi que dans la prolifération des somatotropes. Au niveau extrahypophysaire, les niveaux les plus élevés d’ARNm du GHRHR se retrouvent dans le rein. Toutefois, aucune analyse immunohistochimique n’existe encore sur la localisation précise et la quantification sur les niveaux de GHRHR dans les différents segments du rein de rat et sa dynamique d’expression en situation normale et pathologique telle que l’ischémie. De plus, dans le rein humain normal, aucune information n’est présentement disponible. Le premier article de ce mémoire a pour objectif d’identifier, par immunofluorescence directe, la localisation du GHRHR à travers le système tubulaire rénal, chez le rat jeune en bonne santé. Nos résultats mettent en évidence que dans le rein de rat sain, le GHRHR est exprimé dans les cellules du tubule proximal contourné et droit, de l’anse de Henlé ascendante épaisse corticale et médullaire et de l’anse de Henlé ascendante mince. Le cortex et la bande externe de la médulla externe seraient les deux régions où l’expression est la plus élevée. À la suite d’une insulte rénale comme l’ischémie-reperfusion (IR) chaude, nos résultats démontrent que l’expression du GHRHR est régulée à la baisse dans ces mêmes régions. De plus, une augmentation de certains marqueurs de détérioration cellulaire est présente comme l’enzyme initiatrice, la caspase-9 clivée et effectrice (caspase-3 clivée), des fragments d’ADN et la surexpression d’indication d’injure tissulaire comme la protéine Kidney Injury Molecule 1 (KIM-1). L’ensemble de ces résultats ouvre plusieurs pistes d’études concernant l’importance du GHRHR en rénoprotection. Le deuxième article de ce mémoire a pour objectif d’identifier, par immunofluorescence directe, la localisation du GHRHR à travers le système tubulaire rénal humain. Nos résultats suggèrent que dans le rein humain sain, le GHRHR est davantage exprimé dans le cortex, plus précisément, au niveau du tubule proximal droit et contourné et l’anse de Henlé corticale ascendante épaisse. L’expression du GHRHR est aussi notable au niveau de la région médullaire, pour être plus spécifique, au niveau de l’anse de Henlé médullaire ascendante épaisse et de la médulla. Ainsi, comme chez le rat, l’expression du GHRHR rénal est régio-spécifique. Finalement, le troisième article de ce mémoire est une revue de la littérature ayant pour but d’établir un lien entre les mécanismes connus du stress oxydant dans un contexte d’IR rénale et son impact spécifique dans la médulla. Cet article met en évidence que les différents segments du rein réagissent différemment à une agression oxydante et que la médulla est la région la plus vulnérable. De plus, cette revue de la littérature souligne que les différents types de mécanismes connus du stress oxydant dans un contexte d’IR rénale, tel que la production de dérivés réactifs de l’oxygène, ciblent principalement deux structures du néphron : le tubule proximal et l’anse de Henlé ascendante épaisse médullaire. Les principales répercussions de ces mécanismes observables sont l’inflammation, l’apoptose cellulaire et la diminution des fonctions rénales. Ces mécanismes peuvent aussi être utilisés comme un outil de diagnostic ou de détermination de la santé de l’organe. / The growth hormone-releasing factor receptor (GHRHR) is a receptor of the family of G- protein-coupled receptors. It is highly expressed in the somatotropic cells of the anterior pituitary of several mammals. This receptor plays an essential role in the stimulation of the synthesis and secretion of growth hormone as well as in the proliferation of somatotrophs. At the extra- pituitary level, the highest levels of GHRHR mRNA are found in the kidney. However, no immunohistochemical analysis yet exists on precise localization and quantification of GHRHR levels in the different segments of the rat kidney and its expression dynamics in normal and pathological situations such as ischemia. Additionally, in the normal human kidney, no information is currently available. The first article of this thesis aims to identify, by direct immunofluorescence, the localization of the GHRHR through the renal tubular system, in young healthy rats. Our results show that in the healthy rat kidney, GHRHR is expressed in the cells of the convoluted and right proximal tubule, of the cortical and medullary thick ascending loop of Henle and of the thin ascending loop of Henle. The cortex and the outer band of the outer medulla would be the two regions where the expression is the highest. Following a renal insult such as warm ischemia-reperfusion (RI), our results demonstrate that GHRHR expression is down-regulated in these same regions. In addition, an increase in certain markers of cellular damage is present including initiating enzymes, cleaved and effector caspase-9 (cleaved caspase-3), DNA fragments and overexpression indicative of tissue injury such as protein Kidney Injury Molecule 1 (KIM-1). All these results open up several avenues of study concerning the importance of GHRHR in renoprotection. The second article of this thesis aims to identify, by direct immunofluorescence, the localization of the GHRHR through the human renal tubular system. Our results suggest that in the healthy human kidney, the GHRHR is more expressed in the cortex, more precisely at the level of the right, convoluted proximal tubule and the thick ascending cortical loop of Henle. The expression of GHRHR is also appreciable at the level of the medullary region, more precisely at the level of the thick ascending medullary loop of Henle, and the medulla. Thus, as in rats, the expression of renal GHRHR is region specific. Finally, the third article of this thesis is a review of the literature aimed at establishing a link between the known mechanisms of oxidative stress in the context of renal IR and its specific impact in the medulla. This article highlights that the different segments of the kidney react differently to an oxidative attack and that the medulla is the most vulnerable region. In addition, this review of the literature underlines that the different types of known mechanisms of oxidative stress in a context of renal IR, such as the production of reactive oxygen species, mainly target two structures of the nephron: the proximal tubule and the thick ascending loop of Henle. The main repercussions of these observable mechanisms are inflammation, cellular apoptosis and reduced renal function. These mechanisms can also be used as a diagnostic tool or to determine the health of the organ.

Les conjugués anticorps-médicament (ADC) représentent une avancée révolutionnaire dans la thérapeutique du cancer en délivrant de manière sélective des médicaments cytotoxiques aux cellules tumorales, minimisant ainsi la toxicité systémique. Les ADC se composent de trois composants principaux : un anticorps monoclonal (mAb) ciblant un antigène spécifique associé à la tumeur, un médicament cytotoxique et un lien qui conjugue le médicament à l’anticorps. Malgré leur potentiel thérapeutique, la fabrication des ADC est confrontée à d’importants défis, nécessitant l’optimisation de plusieurs paramètres, en particulier pour obtenir une technologie de conjugaison optimale et un ratio médicament-anticorps (DAR) optimal. Les méthodes de conjugaison traditionnelles basées sur la chimie donnent souvent lieu à des mélanges hétérogènes avec des DAR variables, ce qui peut affecter négativement l’efficacité thérapeutique et la sécurité du produit final. Pour résoudre ce problème, la conjugaison spécifique au site a émergé comme une méthode plus précise, garantissant que les médicaments cytotoxiques sont attachés à des sites spécifiques sur la molécule d’anticorps. Cette technique vise à produire des ADC homogènes avec des DAR constants, améliorant ainsi leur pharmacocinétique et leur pharmacodynamie. Cependant, les conjugaisons spécifiques au site ne sont pas exemptes de limitations. L’un des principaux défis réside dans la complexité de l’ingénierie des modifications nécessaires. L’introduction de sites de conjugaison spécifiques nécessite un génie génétique précis, ce qui peut être techniquement difficile et chronophage. De plus, les processus de fabrication des ADC spécifiques au site sont plus complexes et nécessitent des techniques sophistiquées et des mesures étendues de contrôle qualité. Ces facteurs peuvent donc affecter la production d’ADC basée sur la conjugaison spécifique au site. Le travail présenté dans cette thèse de doctorat propose l’utilisation d’une paire de peptides hétérologues à haute affinité, à savoir les coiled-coils E/K, pour produire des ADC avec une homogénéité améliorée et un DAR contrôlable. Pour commencer, nous avons conçu, produit et purifié une bibliothèque d’anticorps monoclonaux (trastuzumab) marqués avec divers peptides Ecoil et évalué leur manufacturabilité via une transfection transitoire dans des cellules d’ovaire de hamster chinois (CHO) et avons étudié les caractéristiques des anticorps marqués produits. Nos données montrent que l’ajout de peptides Ecoil aux extrémités C-terminales des chaînes d’anticorps (chaînes légères, chaînes lourdes ou les deux) n’entrave pas la production de constructions chimériques de trastuzumab. De plus, les tests analytiques et cellulaires ont confirmé que les constructions de trastuzumab marquées avec Ecoil ont maintenu leur bioactivité. La position, le nombre et la longueur des peptides Ecoil n’ont eu aucune influence sur l’affinité de liaison et la stabilité des anticorps marqués à leur antigène. Dans le cadre d’une étude supplémentaire et d’une étape supplémentaire pour démontrer la polyvalence des peptides E/K, nous avons également évalué la capture et la libération du trastuzumab marqué avec Ecoil produit à partir d’hydrogels de dextrane macroporeux fonctionnalisés avec le peptide Kcoil (le partenaire de liaison du peptide Ecoil). Ensemble, ces données ont révélé que les peptides Ecoil, quelle que soit leur longueur, leur nombre et leur position sur l’anticorps, n’avaient aucun effet significatif sur la manufacturabilité, la capacité de liaison ou le schéma de libération de l’hydrogel. Sur la base de cette fondation, nous avons exploré l’utilisation de deux peptides d’affinité complémentaires, E-coil (EVSALEK) et K-coil (KVSALKE), pour développer des ADC avec une homogénéité améliorée et un DAR contrôlable. En utilisant une méthode d’analyse par résonance plasmonique de surface (SPR) sur mesure et une chromatographie d’exclusion stérique, nous avons mesuré la dissociation cinétique et la stabilité des complexes formés par le trastuzumab marqué avec Ecoil et la protéine fluorescente rouge monomérique (mRFP) marquée avec Kcoil en tant que substitut de médicament. La stabilité in vitro a également été évaluée dans le sérum sanguin à l’aide d’un test ELISA en interne avant les études in vivo. Ensuite, pour évaluer les performances in vivo, nous avons mené des études de biodistribution et de localisation tumorale dans des modèles de souris xénogreffées HER2. Ces expériences ont démontré la stabilité de nos ADC dans la circulation sanguine et leur accumulation efficace sur le site de la tumeur. En général, ce projet vise à démontrer la faisabilité et la polyvalence du système d’affinité E/K pour la conjugaison spécifique au site de molécules thérapeutiques sur le squelette d’anticorps sans modifications chimiques complexes/préjudiciables. La fabrication simplifiée des ADC en utilisant cette méthode de “conjugaison en une seule étape” présentée ici ouvre la voie au développement de nouvelles méthodes dans la production d’ADC avec potentiellement une pharmacocinétique, une bioactivité et une stabilité améliorée. / Antibody-drug conjugate (ADC) represents a transformative breakthrough in cancer therapeutics by selectively delivering cytotoxic drugs to tumor cells, thereby minimizing systemic toxicity. ADC consists of three main components: a monoclonal antibody (mAb) targeting a specific tumor-associated antigen, a cytotoxic drug, and a linker that conjugates the drug to the antibody. Despite their therapeutic potential, the manufacturing of ADCs faces significant challenges, requires the optimization of several parameters particularly in achieving optimal conjugation technology and drug-to-antibody ratio (DAR). Traditional chemical-based conjugation methods often result in heterogeneous mixtures with variable DARs, which can adversely affect the therapeutic efficacy and safety of the final product. To address this issue, site-specific conjugation has emerged as a more precise method, ensuring that cytotoxic drugs are attached to specific sites on the antibody molecule. This technique aims to produce homogeneous ADCs with consistent DARs, thereby enhancing their pharmacokinetics and pharmacodynamics. However, site-specific conjugations are not exempt from limitations. One of the main challenges is the complexity involved in engineering the necessary modifications. Introducing specific conjugation sites requires precise genetic engineering, which can be technically challenging and time-consuming. Moreover, site-specific ADC manufacturing processes are more complex and require sophisticated techniques and extensive quality control measures. These factors can therefore affect ADC production based on site-specific conjugation. The work presented in this doctoral thesis proposed use of a high-affinity peptide pair, namely the E/K coiled-coils, to produce ADCs with improved homogeneity and controllable DAR. To begin with, we designed, produced, and purified a library of monoclonal antibodies (trastuzumab) tagged with various Ecoil peptides and evaluated their manufacturability via transient transfection in Chinese hamster ovary (CHO) cells and investigated the characteristics of the produced tagged antibodies. Our data show that the addition of Ecoil tags at the C-termini of antibody chains (light chains, heavy chains, or both) does not hinder the production of chimeric trastuzumab constructs. Further, analytical and cell-based assays confirmed that the Ecoil-tagged trastuzumab constructs maintained their bioactivity. The position, number, and length of the Ecoil tags had no influence on the binding affinity and stability of tagged antibodies to HER2 antigen. As an additional study and an extra step towards demonstrating the versatility of the E/K affinity peptides, we also evaluated the capture and release of produced Ecoil-tagged trastuzumab from macroporous dextran hydrogels functionalized with Kcoil peptide (the Ecoil peptide binding partner). Together, these data revealed that the Ecoil tags, regardless of their length, number, and position on the antibody, had no significant effect on manufacturability, binding capacity, or release pattern from the hydrogel. Building on this foundation, we explored the use of two complementary affinity peptides, E-coil (EVSALEK) and K-coil (KVSALKE), to develop ADCs with improved homogeneity and controllable DAR. Using a tailored surface plasmon resonance (SPR) assay and size exclusion chromatography(SEC), we measured the kinetics of dissociation and stability of the complexes formed by Ecoil-tagged trastuzumab and Kcoil-tagged monomeric red fluorescent protein (mRFP) as a drug surrogate. The in vitro stability was also assessed in blood serum using an in-house enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) prior to the in vivo studies. Next, to evaluate the in vivo performance, we conducted biodistribution and tumor localization studies in HER2 xenograft mouse models, specifically using SKOV-3 cells, which exhibit deregulated HER2 expression. These experiments demonstrated the stability of our ADCs in blood circulation and their effective accumulation at the tumor site. Overall, this project aims to demonstrate the feasibility and versatility of the E/K coiled coil affinity system for site-specific conjugation of the payload to the antibody backbone without complex/detrimental chemical modifications. The simplified manufacturing of ADCs using this “single-step conjugation” method shown here paves the way for developing new methods in production of ADCs with potentially enhanced pharmacokinetics, bioactivity, and stability.

La mission de la théologie africaine face à une situation socio-politique, culturo-économique catastrophique de l'Afrique, due essentiellement à la question de la spiritualité sociale, d'intelligence sociale et l'aliénation culturelle, est de redynamiser la mission chrétienne, stimuler la renaissance spirituelle africaine et défendre les pauvres et les opprimés, parce que Dieu est toujours du côté d'eux. En effet, l'homme africain et sa société peuvent toujours être au centre de l'engagement théologique et de l'église d'Afrique, pour l'évangélisation comme pour la promotion sociale. Parce que l'homme africain n'est pas seulement individu, il est aussi société et culture. De ce fait, L'église d'Afrique avec ses différentes formes de théologies, n'existe pas pour elle-même, mais pour annoncer la Bonne Nouvelle aux africains. Cependant, cette Bonne Nouvelle n'a aucune pertinence aux yeux des africains si elle tombe en dehors de l'essentiel de leur vie. En d'autres termes, une théologie africaine, quelle que soit sa forme, mais, sans promouvoir la libération totale spirituelle et physique de l'homme Africain et motiver la reconstruction de l'Afrique telle que prônée par Kä Mana n'a pas sa raison d'être. En plus, la théologie africaine peut également stimuler la vraie démocratisation des pays africaines comme principal enjeu de la pastorale théologique et politique des églises chrétiennes et religions traditionnelles africaines. Parce qu'au nom de la dignité de chaque personne, de l'amour de Dieu et l'amour du prochain, de la foi et du salut de tout homme, la théologie africaine ne peut négliger l'identité culturelle et anthropologique du terroir africain et le construit socioculturel inspiré de l'évangile. Cette théologie africaine peut également motiver la remise en question du néocolonialisme africain sous toutes ses formes. Dès lors, le résultat de cette étude peut aider le missiologue/théologien africain qui est l'église de Dieu à bien accomplir sa mission prophétique selon la vision de Dieu, dans le but de transformer spirituellement et physiquement l'Afrique, aussi reconstruirer positivement la société africaine. Evidemment, le développement intégral de l'homme africain, selon moi, suppose le respect de la dignité humaine qui ne peut se réaliser que dans la justice, la paix, l'auto-transformation personnelle, l'éthique et une inculturation personnifiante. Summary The mission of african theology facing African socio-polical, cultural and economic catastrophe that due mainly to social spirituality, social intelligence and cultural alienation, is to revitilise christian mission, stimulate spiritual african renaissance and to defend the poor and oppressed, people by whom God always stands. Of course, the african and their community should always be at the heart of the theological engagement and of the action of the African church concerning evangelism as well ass social promotion. For the African embodies both his or her society and culture. Therefore, the African church and all their different theologies do not exist for their on sake, but rather for the African people to whom they should bring the good news. This good news is not relevant for the Africans as long as it does not deal with their main concern. In other words, whatever the forms of African theology, as long as it overlooks the complete liberation of the Africans, freeing them spirituality, promoting their spiritual and physical liberation and motivating the reconstruction of Africa as promoted by Kä Mana here, it will serve no practical purpose. Besides, African theology has also to stimulate the democratisation of African countries as one of the targets of the African Christian churches and traditional religions. In the name of the dignity of each and every person, of the love of God and the love for the neighbour, that of faith and salvation of the humankind, African theology is not expected to neglect cultural and anthropological identity of the Africans terror and the sociocultural construct inspired by the Gospel. African theology can thus motivate the questioning of African neocolonialism in all its forms. The result of this study can help African missiologists and theologians that are the church of God to fulfil well the prophetic mission after the vision of God, so as to bring about spiritual and physical transformation, and positively reconstruct the African society. As for me, the integral development of the African supposes the respect of their human dignity that can be materialised through peace, justice, personal sel-transformation, ethics and personifying inculturation. / Christian Spirituality, Church History and Missiology / D. Div. (Missiology)

La mission de la théologie africaine face à une situation socio-politique, culturo-économique catastrophique de l'Afrique, due essentiellement à la question de la spiritualité sociale, d'intelligence sociale et l'aliénation culturelle, est de redynamiser la mission chrétienne, stimuler la renaissance spirituelle africaine et défendre les pauvres et les opprimés, parce que Dieu est toujours du côté d'eux. En effet, l'homme africain et sa société peuvent toujours être au centre de l'engagement théologique et de l'église d'Afrique, pour l'évangélisation comme pour la promotion sociale. Parce que l'homme africain n'est pas seulement individu, il est aussi société et culture. De ce fait, L'église d'Afrique avec ses différentes formes de théologies, n'existe pas pour elle-même, mais pour annoncer la Bonne Nouvelle aux africains. Cependant, cette Bonne Nouvelle n'a aucune pertinence aux yeux des africains si elle tombe en dehors de l'essentiel de leur vie. En d'autres termes, une théologie africaine, quelle que soit sa forme, mais, sans promouvoir la libération totale spirituelle et physique de l'homme Africain et motiver la reconstruction de l'Afrique telle que prônée par Kä Mana n'a pas sa raison d'être. En plus, la théologie africaine peut également stimuler la vraie démocratisation des pays africaines comme principal enjeu de la pastorale théologique et politique des églises chrétiennes et religions traditionnelles africaines. Parce qu'au nom de la dignité de chaque personne, de l'amour de Dieu et l'amour du prochain, de la foi et du salut de tout homme, la théologie africaine ne peut négliger l'identité culturelle et anthropologique du terroir africain et le construit socioculturel inspiré de l'évangile. Cette théologie africaine peut également motiver la remise en question du néocolonialisme africain sous toutes ses formes. Dès lors, le résultat de cette étude peut aider le missiologue/théologien africain qui est l'église de Dieu à bien accomplir sa mission prophétique selon la vision de Dieu, dans le but de transformer spirituellement et physiquement l'Afrique, aussi reconstruirer positivement la société africaine. Evidemment, le développement intégral de l'homme africain, selon moi, suppose le respect de la dignité humaine qui ne peut se réaliser que dans la justice, la paix, l'auto-transformation personnelle, l'éthique et une inculturation personnifiante. Summary The mission of african theology facing African socio-polical, cultural and economic catastrophe that due mainly to social spirituality, social intelligence and cultural alienation, is to revitilise christian mission, stimulate spiritual african renaissance and to defend the poor and oppressed, people by whom God always stands. Of course, the african and their community should always be at the heart of the theological engagement and of the action of the African church concerning evangelism as well ass social promotion. For the African embodies both his or her society and culture. Therefore, the African church and all their different theologies do not exist for their on sake, but rather for the African people to whom they should bring the good news. This good news is not relevant for the Africans as long as it does not deal with their main concern. In other words, whatever the forms of African theology, as long as it overlooks the complete liberation of the Africans, freeing them spirituality, promoting their spiritual and physical liberation and motivating the reconstruction of Africa as promoted by Kä Mana here, it will serve no practical purpose. Besides, African theology has also to stimulate the democratisation of African countries as one of the targets of the African Christian churches and traditional religions. In the name of the dignity of each and every person, of the love of God and the love for the neighbour, that of faith and salvation of the humankind, African theology is not expected to neglect cultural and anthropological identity of the Africans terror and the sociocultural construct inspired by the Gospel. African theology can thus motivate the questioning of African neocolonialism in all its forms. The result of this study can help African missiologists and theologians that are the church of God to fulfil well the prophetic mission after the vision of God, so as to bring about spiritual and physical transformation, and positively reconstruct the African society. As for me, the integral development of the African supposes the respect of their human dignity that can be materialised through peace, justice, personal sel-transformation, ethics and personifying inculturation. / Christian Spirituality, Church History and Missiology / D. Div. (Missiology)

Cette thèse de doctorat étudie les mouvements LGBT en Belgique, en France et en Espagne à travers une double comparaison (entre les cas et à travers le temps) qui intègre également les échanges et influences transnationaux et internationaux. Elle examine l’émergence et le développement de la revendication d’ouverture du mariage civil aux couples de même sexe dans ces pays, analysant les convergences en termes de contenu des demandes et de timing des mobilisations. Par conséquent, elle porte sur des convergences au niveau des mouvements sociaux, à l’inverse de la majeure partie de la littérature, qui se concentre sur les convergences de politiques publiques. Cette situation impose de construire une grille d’analyse basée sur la littérature sur les mouvements sociaux, les politiques publiques et les relations internationales (influence des normes internationales). Le développement des revendications relatives au droit au mariage a été retracé de manière généalogique depuis la fin des années 1980. La comparaison repose sur la méthode du most different systems design et un travail empirique important combinant analyse documentaire et entretiens a été réalisé. Cette thèse confirme l’importance de l’étude des échanges et des influences internationaux et transnationaux pour comprendre la politique domestique et insiste sur l’influence cruciale du réseautage transnational sur les revendications des mouvements sociaux. Elle révèle aussi quelques cas de diffusion entre mouvements sociaux et montre comment des caractéristiques et des contraintes communes peuvent inciter les mouvements sociaux à formuler des revendications similaires. Par ailleurs, les discours en faveur du droit au mariage ont été analysés avec soin. L’émergence de cette revendication a aussi été mise en perspective sur le plan historique, ce qui implique de réfléchir aux modalités de transformation des mouvements LGBT au cours des trente dernières années. Pour terminer, la notion de citoyenneté sexuelle a été interrogée et la manière dont l’accès à la citoyenneté a été posé a été examinée à partir du concept de resignification proposé par Judith Butler. <p><p><p>This dissertation looks at LGBT movements in Belgium, France and Spain through a double comparison (between cases and through time), which also takes into account transnational and international exchanges and influences. It investigates the simultaneous emergence and development of same-sex marriage claims in these countries, examining convergences in the content of the claims and the timing of protest. Therefore, it looks at convergences at the level of social movements, unlike most of the literature, which focuses on convergences in public policies. This specific research interests implies building an analytical model based on the literature on social movements, public policies and international relations (influence of international norms). It has also required a genealogical account of the development of same-sex marriage claims in each country from the end of the eighties until now. The comparison is based on the most different systems design method, and an extensive field work combining archives analysis and interviews has been carried out. This dissertation confirms the importance of taking into account international and transnational exchanges and influences to understand domestic politics, and insists on the crucial influence of transnational networking on social movements claims. It also discloses some cases of diffusion between social movements and shows how common characteristics and constraints may induce social movements to make similar but independent decisions. Discourses in favour of same-sex marriage have been carefully analysed, and the emergence of this claim has been put into a historical perspective. This implies a reflection on the transformations of the LGBT movement over the last thirty years. Finally, this dissertation interrogates the notion of sexual citizenship and examines the specific mechanisms through which access to citizenship has been proposed, discussing Judith Butler’s concept of resignification. <p><p> / Doctorat en Sciences politiques et sociales / info:eu-repo/semantics/nonPublished