Introdução: Desde a década de 1970, quando se observou que a transfusão pré-transplante renal diminuía a rejeição ao enxerto, o efeito transfusion-related immunomodulation (TRIM) vem sendo estudado, não havendo, ainda, um entendimento completo de seu mecanismo. Recentemente, a descrição das células T reguladoras (TREG) trouxe novas possibilidades de compreensão desse fenômeno, com grande implicação terapêutica. Objetivos: Avaliar a proporção de células TREG antes e após a transfusão de concentrado de hemácias em uma amostra de pacientes clínicos não imunossuprimidos e correlacionar os resultados com o volume transfundido e o tempo de estocagem do sangue. Métodos: Pacientes com diversas patologias clínicas e com indicação de transfusão de concentrado de hemácias foram recrutados consecutivamente. Após assinatura do consentimento informado, o número de células TREG pré e pós-transfusão foi avaliado, bem como sua correlação com o número de unidades transfundidas e o tempo de estocagem. Resultados: Observou-se um aumento estatisticamente significativo na proporção de células TREG (CD4+, CD25+, FOXP3+) 72 horas após a transfusão (p=0,003). Tal aumento mostrou correlação com o número de unidades transfundidas, mas não com o tempo de estocagem (p=0,017 e 0,49, respectivamente). Conclusão: O aumento do numero de células TREG parece estar presente após transfusão de hemácias não leucodepletadas mesmo em uma amostra heterogênea, o que reforça sua importância clínica. A influência do número de unidades mas não do tempo de estocagem corrobora estudos anteriores. O mecanismo molecular do efeito TRIM, bem como seu impacto clínico em um cenário real, ainda precisam ser melhor avaliados. / Background: Transfusion-related immunomodulation (TRIM) has been the subject of research since the 1970s, when transfusion before kidney transplantation was found to decrease the rates of allograft rejection, but the mechanisms underlying this effect have yet to be fully elucidated. The recent description of regulatory T cells (TREG) has paved the way for a new understanding of this phenomenon, with major therapeutic implications. Objectives: To assess the levels of TREG cells before and after transfusion of packed red blood cells in a clinical sample of non-immunosuppressed patients and to correlate findings with the volume of blood transfused and length of storage. Methods: Patients with a variety of clinical conditions and with an indication for transfusion of packed red blood cells were recruited consecutively. After providing informed consent, pre- and post-transfusion TREG levels were measured, and their correlation with number of units transfused and length of storage was assessed. Results: There was a significant increase in the levels of TREG cells (CD4+/CD25+/FOXP3+) within 72 hours of transfusion (p=0.003). This increase correlated with the number of units transfused, but not with length of storage (p=0.017 and 0.49, respectively). Conclusion: An increase in TREG cell levels appears to follow transfusion of non-leukoreduced packed red blood cells even in a heterogeneous sample, which highlights the clinical relevance of this phenomenon. The influence of number of transfused units, but not of length of storage, on the results corroborates the findings of previous non-clinical studies. Further research is warranted to better investigate the molecular mechanism of the TRIM effect, as well as its clinical impact in real-world settings.

Introdução: A globulina anti-timocitária (ATG) é um anticorpo policlonal depletor de linfócitos amplamente utilizado no transplante de órgãos. O monitoramento deste agente em receptores de transplante renal pode ser realizado por contagem de linfócitos totais e células T CD3+ no sangue periférico. Objetivo: Avaliar a correlação entre estas duas formas de monitorização. Métodos: Estudo retrospectivo, centro único, avaliou 226 pacientes que receberam enxerto renal entre 2008 e 2013 e que foram tratados com ATG para terapia de indução ou para tratamento de rejeição celular aguda grave. A primeira dose foi administrada no intra-operatório e as subsequentes de acordo com os níveis de células T CD3+ ou número de linfócitos totais no sangue periférico. Os coeficientes de correlação e concordância foram avaliados em amostras pareadas. Resultados: No total 664 amostras pareadas foram analisadas para o número de linfócitos totais e células T CD3+. O coeficiente de correlação de Spearman enre os resultados foi 0.416 (P <0.001) para a amostra geral, 0.435 (P < 0.001) para os pacientes em indução e 0.285 (P<0.005) para os pacientes em tratamento de rejeição. O coeficiente de concordância Kappa entre as amostras gerais foi 0.267 (P < 0.001), 0.280 (P < 0.001) para indução e 0.155 (P<0.081) para pacientes em tratamento. Os parâmetros diagnósticos para a contagem de linfócitos totais foram calculados usando o número de células T CD3+ como padrão-ouro com o ponto de corte de > 20 células/mm³. Na curva ROC o melhor ponto (256 linfócitos/mm3) apresenta área sobre a curva de 0.71 (95% CI: 0.67-0.75) com sensibilidade de 66.8%, especificidade 66.5%, valor preditivo positivo 46.6% e valor preditivo negativo 82.1%. Conclusão: Baseados nestes resultados consideramos que a monitorização da administração e do intervalo das doses de ATG deva ser realizada através da contagem de células T CD3+, por citometria de fluxo, em detrimento dos linfócitos totais no sangue periférico. / Background: Anti-thymocyte globulin (ATG) is a preparation of depleting antibodies largely utilized in organ transplantation. The monitoring of this agent in renal transplant recipients can be accomplished by counting total lymphocytes and CD3+T cells in the peripheral blood. Objective: Evaluated the correlation between these two measurements. Methods: Retrospective study, single center study that evaluated 226 patients who received a kidney graft between 2008 and 2013 and where treated with ATG either for induction therapy or for treatment a severe acute cellular rejection. The first dose was given intra-operatively and subsequent doses were administered according to the levels of CD3+ T cells or number of total lymphocytes in the peripheral blood. Correlation and concordance coefficients were evaluated in paired samples. Results: A total of 664 paired samples were analyzed for the number of lymphocytes and CD3+ T. The Spearman’s correlation coefficient between the results was 0.416 (P < 0.001) to all samples, 0.435 (P < 0.001) for induction therapy samples and 0.285 (P<0.005) for therapeutic samples. The Kappa’s concordance coefficient between samples was 0.267 (P < 0.001) to all samples, 0.280 (P < 0.001) for induction therapy samples and 0.155 (P<0.081) for therapeutic samples. The diagnostic parameters for the total lymphocyte counting were calculated using number of CD3+ T cells as the gold standard at the cut off at > 20 cells/mm³. At the ROC curve using the best cut off (256 lymphocytes/mm3) an AUC of 0.71 (95% CI: 0.67-0.75) was found along with a sensitivity 68.8%, specificity 66.5%, positive predictive value 46.6% and negative predictive value 82.1%. Conclusion: Based upon these results it is not possible to reliably replace the flow cytometric assay for CD3+ T cells by the counting of total lymphocytes in the peripheral blood in the monitoring of ATG administration in kidney transplant recipients.

Leishmaniose visceral (LV) é uma doença crônica e potencialmente fatal causada pelas espécies Leishmania infantum/chagasi e Leishmania donovani. O desenvolvimento da resposta Th1 é classicamente associado à proteção contra esses parasitos, mas também há uma correlação positiva entre a produção de citocinas relacionadas com o padrão Th17 e a proteção contra LV por L. donovani em seres humanos. No entanto, a participação de Th17 durante a infecção por L. infantum/chagasi permanece desconhecida. O objetivo desse estudo foi avaliar a participação de Th17 e citocinas relacionadas, além do mecanismo pelo qual tais células operam durante a resposta imune do hospedeiro contra L. infantum/chagasi. Os resultados mostraram que o parasito é capaz de induzir grandes quantidades de TGF-, IL-1, IL-6 e IL-23 por células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDC), citocinas envolvidas na indução e/ou manutenção do perfil Th17. Assim, co-cultivando células do baço de camundongos C57BL/6 naves com BMDCs infectadas com L. infantum/chagasi observou-se uma significativa produção de IL-17 por células T. Esses achados foram confirmados por experimentos in vivo onde se constatou a produção de IL-17 no fígado e no baço de camundongos WT infectados, sendo o pico de produção dessa citocina observado na 4ª e 6ª semanas após a infecção. O padrão de resposta do tipo Th17 é crítica para a imunidade protetora contra L. infantum/chagasi, uma vez que camudongos IL-17R-/-, IL-23p19-/- e IL-6-/- mostraram aumento da carga parasitária nos órgãos alvo da infecção, sendo que a susceptibilidade observada em camundongos IL-17R-/- foi associada com o aumento da produção de IL-10 por linfócitos, sugerindo que a IL-17 regula negativamente a produção de IL-10 levando ao controle da infecção causada pelo parasito. Ainda, a ausência da sinalização via IL-17R gerou uma diminuição da inflamação hepática, decorrente de uma menor capacidade proliferativa de linfócitos frente ao estímulo com conA. De maneira interessante, na ausência de IL-10 houve potencialização na produção de IL-17 por camundongos infectados, e esses foram mais resistentes à infecção, apresentando números reduzidos parasitos no baço e no fígado. Além de promover proteção através da modulação de IL-10, a IL-17 foi capaz de potencializar a produção de NO in vitro e in vivo. Juntos, nossos resultados demonstram que a L. infantum/chagasi é capaz de desencadear o padrão Th17 de resposta imune, o qual promove proteção do hospedeiro durante a infecção. / Visceral leishmaniasis (LV) is a chronic and potentially fatal disease caused by Leishmania donovani and Leishmania infantum/chagasi. The development of Th1 response is classically associated with protection against these parasites, but recent data also show that there is a positive correlation between the Th17-related cytokines production and the protection against LV by L. donovani in humans. However, the role of this CD4+ T cells subset during L. infantum/chagasi infection remains unknown. In this study, our aim was to evaluate the Th17 and related cytokines participation, besides the mechanism by which these cells playing during the L. infantum/chagasi infection.The results showed that the parasite induces high amounts of TGF-, IL-1, IL-6, and IL-23 by bone marrow-derived dendritic cells (BMDC), cytokines involved with Th17 induction and/or maintenance. Accordingly, naïve-C57BL/6 spleenocytes co-cultured with L. infantum/chagasi-infected BMDC produced significant amounts of IL-17 by TCD4+. Interestingly, IL-17 was produced in high amounts in the liver and spleen of WT infected-mice, being peaked at 4th and 6th weeks after infection. The Th17 is critical for protective immunity against L. infantum/chagasi, since that IL-17R-/-, IL-23p19-/- and IL-6-/- infected-mice showed increasing of parasite load associated with enhancement of IL-10 production in IL-17R-/- compared to WT infected-mice. Strictly, in the absence of IL-17 signaling, a smaller inflammatory infiltrate was observed in the liver. Interestingly, IL-17 production was potentiated in IL-10-/- infected-mice, and they were more resistant to infection, showing reduced parasites numbers in the spleen and liver. In addition to promoting protection through the downmodulation of IL-10, IL-17 enhanced the NO production. Together, our results demonstrate that L. infantum/chagasi trigger Th17 response that promotes the host protection during infection.

Os microRNAs são pequenos RNAs, não-codificantes que funcionam como reguladores a nível pós-transcricional da expressão gênica. Nos últimos anos, novas evidências demonstram o papel importante dos microRNAs na regulação e desenvolvimento do sistema imune. Apesar da função de poucos microRNAs ser conhecida, a sua expressão alterada vêm sendo associada a patogênese de diversas doenças autoimunes, incluindo a artrite reumatóide (AR). Recentemente a expressão desregulada de uma série de microRNAs está sendo descrita em pacientes com AR, e o papel patogênico de apenas uma parte deles foi investigada em modelos animais. A artrite reumatóide é uma doença autoimune sistêmica caracterizada por um intenso processo inflamatório na sinóvia, podendo causar destruição óssea e articular. Os linfócitos T apresentam papel importante na indução, manutenção e progressão da doença. A artrite induzida por colágeno é um modelo animal amplamente utilizado por suas características fisiopatológicas muito similares à doença em humanos. A linhagem de camundongos DBA-1/J desenvolve a doença após imunização e booster com colágeno do tipo II, enquanto que a linhagem DBA-2/J se mostra refratária. Isso confere um sistema modelo de susceptibilidade/resistência à artrite, que pode ser estudado em diferentes abordagens. O objetivo do nosso estudo foi identificar o perfil transcricional e as redes de interação entre um grupo de microRNAs e seus respectivos alvos nos timócitos e linfócitos T CD3+ periféricos nos camundongos da linhagem DBA-1/J e DBA-2/J. Para a avaliação da expressão gênica, utilizou-se a tecnologia de microarrays. O uso de programas de análise e para a construção das redes foi imprescindível. Os resultados encontrados evidenciam uma expressão diferenciada de mRNAs e microRNAs em timócitos e linfócitos T CD3+ periféricos entre as duas linhagens utilizadas. Novos microRNAs foram encontrados nos diferentes estágios de desenvolvimento do linfócito T. Nas redes de interação microRNA-RNAm obtidas, genes importantes associados aos processos de sistema imune, adesão e diferenciação celular, apoptose, recombinação, ativação de linfócitos T e resposta inflamatória, foram encontrados como potenciais alvos. Além disso, em uma perspectiva clínica, baseados nos resultados obtidos em camundongo, nos encontramos a expressão do miR-505 nos linfócitos T de pacientes com AR. Nossos resultados contribuem para a melhor compreensão dos mecanismos molecular envolvidos na resistência/susceptibilidade a CIA. / MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNA molecules that modulate the expression of multiple protein-encoding genes at the post-transcriptional level. During the last several years, evidence has emerged to show their critical role for the regulation and development of immune system. Although the function of most mammalian miRNAs has yet to be determined, their aberrant expression has been associated with several autoimmune conditions, including rheumatoid arthritis (RA). Recently, the deregulated expression of a dozen miRNAs has been reported in patients with RA, and the pathogenic role of only a few of these has been investigated in experimental mouse models. RA is a systemic autoimmune disorder mainly characterized by the inflammation of synovial tissue that can lead to destruction of bone and cartilage. The role of effectors T cells in induction, maintenance and progression of the disease is now becoming better understood. Collagen-induced arthritis is an animal model widely studied due to its similarities to human disease. The DBA-1/J mouse strain develops arthritis after immunization process and booster with Type II collagen, and the DBA-2/J strain is refractory to the disease induction. This offers an useful susceptibility/resistance model-system to study RA. The aim of this study was to identify the expression profiles and interaction networks between a set of microRNAs and their mRNA targets in thymocytes and peripheral CD3+ T lymphocytes in DBA-1/J and DBA-2/J mice strain. For this purpose we used the microarray technology to evaluate the expression of the miRNAs and mRNAs as possible targets involved in this process. The use of bioinformatics software to reconstruct the networks was essential. The results show differential expression of mRNAs and miRNAs in thymocytes and peripheral CD3+ T lymphocytes between both strains. New miRNAs were found during all the stages of T cells development. The microRNA-mRNA interaction networks obtained in this study showed that important genes related to apoptose, immune system, recombination, cell adhesion and differentiation, inflammatory process and T cell activation were found as potential targets. In addition, in a clinical prospects, based on the results obtained in mice, we found the expression of the miRNA miR-505 in T cells of RA patients. Our results contribute to a better understand of the molecular mechanisms evolved in the resistance/susceptibility to CIA.

O presente trabalho refere-se ao estudo do papel dos microRNAs no controle pós-transcricional das células T de camundongos Non Obese Diabetic (NOD) modelo que reproduz o diabetes mellitus do tipo 1 (DM-1). Durante o desenvolvimento do trabalho, procurou-se esclarecer a hipótese de que os microRNAs controlam os níveis de determinados RNAs mensageiros (mRNAs) das células T durante a indução ou perda de tolerância imunológica. Portanto, a expressão alterada dos microRNAs estaria contribuindo com o processo da autoimunidade. Sendo assim, o objetivo do estudo foi identificar os perfis de expressão e as redes de interação entre um conjunto de microRNAs e seus respectivos mRNAs alvos nos timócitos e nos linfócitos T CD3+ periféricos durante o desenvolvimento do diabetes mellitus do tipo 1 (DM-1) em camundongos NOD. Para avaliar a expressão de genes codificadores de mRNAs, sendo estes possíveis alvos de microRNAs, utilizou-se a tecnologia de microarrays. O uso de programas de análise e para a construção das redes foi imprescindível. Acreditase que fenômenos complexos como a regulação pós-transcricional de células T e seu envolvimento no processo de tolerância imunológica, bem como o surgimento de doenças autoimunes, podem ser melhor compreendidos por meio da genômica funcional. Os resultados encontrados evidenciam uma expressão diferenciada de mRNAs e microRNAs em timócitos e linfócitos T CD3+ periféricos durante o desenvolvimento do diabetes mellitus do tipo 1 (DM-1). As diferenças nos perfis transcricionais encontradas envolvem expressão de genes (mRNAs) relacionados diretamente ao sistema imune, a diferenciação e ativação de linfócitos T e a apoptose, bem como a outros processos relacionados a resposta imune. Além disso, as redes de interação microRNA-mRNA encontradas no presente trabalho evidenciam interações já conhecidas e apresentam novas interações, mostrando a participação de um grupo de microRNAs que estão atuando no controle pós-transcricional do diabetes do tipo 1 em camundongos NOD, contribuindo com a melhor compreensão do controle genético-molecular das doenças autoimunes, principalmente do diabetes do tipo 1. / This study refers to the role played by microRNAs in the post-transcriptional control of T cells from non obese diabetic (NOD) mice model which reproduces the type 1 diabetes (T1D). During the study, it was tried to clarify the hypothesis that microRNAs control certain messenger RNAs (mRNAs) levels of the T cells during the induction or loss of immunological tolerance. Therefore, the altered expression of microRNAs might be contributing to the process of autoimmunity. Thus, the study aim was to identify the expression profiles and interaction networks between a set of microRNAs and their mRNA targets in thymocytes and peripheral CD3+ T lymphocytes during the development of type 1diabetes (T1D) in NOD mice. The microarray technology was used to evaluate the expression of mRNAs as possible targets of microRNAs involved in this process. The use of bioinformatics software to reconstruct the networks was essential. It was realized that complex phenomena as post-transcriptional regulation in T cells and their involvement in the immune tolerance process, as well as the emergence of autoimmune diseases can be better understood only by means of functional genomics. The results show differential expression of mRNAs and microRNAs in thymocytes and peripheral CD3+ T lymphocytes during the development of type 1 diabetes (T1D). The differences found in the transcriptional profiles involve mRNAs related to the immune system, differentiation and activation of T lymphocytes and apoptosis as well as other processes related to immune response. In addition, the microRNA-mRNA interaction networks obtained in this study evidence the predicted interactions as well as new ones, showing the participation of a group of microRNAs that may be acting in post-transcriptional control of type 1 diabetes in NOD mice contributing to a better understanding of the molecular genetic control of autoimmune diseases in specially type 1 diabetes.

Uma série de fatores como ambiente, nutrição e doenças podem ser consideradas como estressores em sistemas de produção. Frangos de corte expostos a estressores por períodos prolongados de tempo apresentam de forma geral, redução do ganho de peso e consumo de ração, aumento da conversão alimentar, aumento da média de mortalidade e predisposição a doenças. A vacinação é uma prática essencial para um adequado manejo da produção e o desenvolvimento da imunidade do frango de corte frente a desafios bacterianos e virais presentes no ambiente. O entendimento dos fatores que podem interferir com o sucesso da vacinação é essencial para a otimização da saúde e do bem-estar animal, permitindo a utilização de todo o seu potencial genético e nutricional. Poucos estudos têm enfatizado o efeito do estresse por calor na imunidade celular e humoral de frangos de corte. Este trabalho tem como objetivo estudar o efeito do estresse por calor sobre a imunidade celular (linfócitos B e T), humoral sérica (IgM e IgY) e o peso relativo de órgãos (baço, bursa e fígado) de frangos de corte submetidos a um protocolo de vacinação para a Doença de Newcastle (cepa LaSota). Para tanto, 96 frangos de corte Cobb machos foram aleatoriamente divididos em quarto grupos: grupo 1. Frangos de corte não vacinados expostos à temperatura termoneutra; grupo 2. Frangos de corte vacinados expostos à temperatura termoneutra; grupo 3. Frangos de corte não vacinados expostos ao protocolo de estresse térmico por calor (38±2°C); e grupo 4. Frangos de corte vacinados expostos ao protocolo de estresse térmico por calor (38±2°C). Todas as aves foram alojadas em isoladores com água e ração ad libitum. Foi utilizada uma vacina com o vírus atenuado para Doença de Newcastle (cepa LaSota) administrada em duas doses, aos 7 e aos 14 dias de vida. Os frangos submetidos ao protocolo de estresse foram expostos a uma temperatura de (38±2°C) do segundo até o sexto dia de vida. Os dados obtidos demonstraram que o estresse por calor de forma isolada reduziu o peso relativo do fígado e aumenta aquela do baço e da bursa e induziu uma alteração significativa do perfil de células imunes no sangue periférico das aves, como consequência, observou-se alteração no padrão de imunoglobulinas, o que influenciou diretamente a resposta da ave frente ao desafio ambiental (quando o estresse foi avaliado isoladamente) ou vacinal (quando o estresse foi avaliado juntamente ao desafio vacinal com o vírus da Doença de Newcastle). Dessa forma, sugerimos que o estresse por calor diminuiu a eficácia da resposta vacinal aos frangos de corte, em função de mudanças que induziu no perfil de linfócitos e produção de imunoglobulinas. / A number of factors, such as environment, nutritional status and diseases are stressful for animals during livestock production. It has been shown that broilers exposed to stressors for prolonged periods tend to present decreased weight gain and feed intake and to have an increased feed conversion ratio, increase mortality rate and predisposition to diseases caused by secondary agents. Vaccination is an essential practice for adequate management of the livestock and protection of poultry against bacterial and viral infectious agents. Understanding the factors that modify the success vaccination is essential for optimizing animal health and welfare, thus allowing them to use of all the genetic and nutritional potential they have. Few studies have emphasized the effects of heat stress on cellular and humoral broilers immunity. This study aimed at discussing the effects of heat stress on cellular immunity (B and T lymphocytes) and humoral immunity (IgM and IgY) of broilers undergoing a vaccination protocol for Newcastle disease (LaSota strain). For this purpose, 96 male broilers (Cobb) were random divided into four groups: 1. Unvaccinated broiler chickens exposed to thermoneutral temperature; 2. Vaccinated broiler chickens exposed to thermoneutral temperature; 3. Unvaccinated broiler chickens exposed to a heat stress protocol (38±2°C). 4. Vaccinated broiler chickens exposed to a heat stress protocol (38±2°C). All broilers were housed in isolators and provided water ad lib. We used a live Newcastle vaccine disease virus of LaSota strain given in two doses at 7 and 14 days. The broiler chickens were exposed to heat stress (38±2°C) from the 2nd to 6th day of life. It has been observed that when combined with the vaccination challenge, heat stress was able to change immune cells profile from a B to T cytotoxic and T helper immune cells, keeping this change pattern until the end of the study period (over 19 days). This change in the cellular response pattern modified the ability of the broiler chickens´ immune system to react while challenged by vaccination, reducing its efficiency and making them more susceptible to the disease agent. The data obtained suggest that heat stress by itself induced considerable modifications in the liver, spleen and bursa de Fabricius and induced a significant modification in the profile of immune cells in peripheral blood of birds, with responsive modifications in the pattern of immunoglobulins, directly influencing the response of the broilers against the environmental challenge (when the stress is evaluated separately) or the vaccination (when the stress is measured along the challenge vaccination with Newcastle Disease virus). Therefore, we suggest that the heat stress was capable of reduce the efficacy of the vaccinal response in broiler chickens, related to the modification of the lymphocytes and the production of immunoglobulins.

A sepse é causada por microorganismos tais como: bactérias Gram-negativas, Gram-positivas, fungos e vírus. A sepse grave e o choque séptico estão associados a taxas de mortalidade de 40 a 60%. O evento mais importante para a evolução do quadro séptico é a apoptose das células efetoras do sistema imune. A eliminação de um grande número de células do sistema imune compromete a defesa efetiva do hospedeiro. Para estudarmos o papel das células imunes na sepse utilizamos o modelo de tolerância ao LPS. Em nossos estudos induzimos tolerância ao LPS em camundongos Balb-C e analisamos os padrões da expressão gênica nos linfócitos do baço. Para o mapeamento dos genes, utilizamos o macroarray, identificamos o grupo funcional de genes que tem maior relevância na proteção induzida pela tolerância, e em seguida confirmamos os resultados encontrados através do RT-PCR, Western Blotting, atividade de caspase 1 e citometria de fluxo. Encontramos uma importante redução na expressão de genes, como heat shock proteins, óxido nítrico e apoptose. Após análise da membrana contendo os genes integradores da resposta produzida pela tolerância, optamos por enfatizar inicialmente os genes envolvidos no processo apoptótico devido à relevância deste processo no quadro séptico conforme mostraram os trabalhos encontrados na literatura. Demonstramos que animais tolerantes ao LPS apresentam diminuição dos eventos apoptóticos, com redução na expressão dos genes ligados às caspases 7, 8 e 11, assim como a redução dos genes ligados ao Bid e Apaf-1. Ao analisarmos o RNAm através do RT-PCR, encontramos redução na Caspase 3, Bax e Bcl2, resultado que se confirmou ao analisarmos a expressão protéica através do Western- Blotting. Realizamos citometria de fluxo para avaliarmos a ocerrência de apoptose nos linfócitos dos animais submetidos à ligadura cecal. Confirmamos uma redução da apoptose e necrose em linfócitos dos animais tolerantes em relação aos controles. Com estes resultados podemos propor que a tolerância seria benéfica na redução da apoptose e controle do quadro séptico, além disso, a diminuição na expressão do gene ligado à caspase 11 estaria contribuindo para a diminuição do quadro inflamatório, pois a caspase 11 é um mediador essencial na resposta ao choque séptico. / Sepses are caused by microorganisms such as: Gram-negative bacteria, Gram-positive bacteria, fungus and virus. Several sepses and the septic shock have been associated with the mortality rates from 40 to 60%. One of the most important events for the septic evolution is the apoptosis cells of the immune system. The cells immune system elimination compromises the host. We induced LPS tolerance in Balb-C mice and analyzed genes expressions in spleens; we found an important reduction in the genes expressions like: heat shock proteins, nitric oxide and apoptosis. After analysis of the membrane containing the sepses genes produced by tolerance, we emphasized initially the genes involved in the apoptosis. Demonstrated that animals LPS tolerants presented decrease in apoptotic events, with reduction in the genes expression related caspases 7, 8, 11, Bid and Apaf-1. In the mRNA by RT-PCR, we found a reduction in Caspase 3, Bax and Bcl2, and these results were confirmed by Western-blot. We realized flow cytometry and we showed that the results are maintained, presenting reduction in both the apoptotic and necrotic events in tolerants animals. These results showed that the tolerance would be favorable in the apoptosis reduction and control of the sepsis, moreover, the expression reduction to caspase 11 genes would be contributing to the inflammatory reduction because Caspase 11 is an essential mediator in the septic shock.

Com o objetivo de avaliar a evolução clínica, a persistência da infecção e a resposta imune humoral e celular, sete cães adultos desprovidos de anticorpos anti-Ehrlichia canis foram inoculados com E. canis e acompanhados durante vinte semanas. Três cães permaneceram como controle. Exame físico diário e avaliação laboratorial (hemograma, bioquímica sanguínea, fragilidade osmótica eritrocitária, teste de Coombs, teste de redução de tetrazólio nitroazul), reação em cadeia da polimerase (PCR), pesquisa de anticorpos anti-E. canis (IFI) e quantificação dos linfócitos T CD4+ e CD8+ por citometria de fluxo foram realizados, em diferentes momentos, durante o período de observação. A infecção foi comprovada pela presença de mórulas em linfócitos/monócitos no sangue circulante, soroconversão, com títulos de anticorpos entre 1.280 a 20.480 e a reação positiva ao PCR. Febre, esplenomegalia, linfadenomegalia, trombocitopenia, anemia não regenerativa, aumento das atividades séricas de ALT, AST e FA, foram as principais alterações clínicas e de patologia clínica observadas, com pico máximo entre 21 e 28 dias. Também nesses momentos foram observados o aumento de linfócitos T CD8+ e a diminuição dos linfócitos T CD4+. O aumento do metabolismo oxidativo dos neutrófilos, quando estimulados, entre o 28&ordm; e 35&ordm; dia p.i., o aumento de reticulócitos na circulação sanguínea nessa ocasião, a redução dos linfócitos T CD4+ e o aumento de linfócitos T CD8+ indicaram a resposta do hospedeiro, na tentativa de eliminar a infecção. No auge da infecção entre o 21&ordm; e 49&ordm; dia p.i., houve a inversão da relação CD4:CD8, principalmente o aumento dos linfócitos T CD8+. A fragilidade osmótica eritrocitária manteve-se inalterada, bem como o teste de Coombs, comprovando não ter ocorrido a hemólise imunomediada. Nos cães infectados não foram detectados a presença de anticorpos IgM anti-E. canis em nenhum momento de observação. O aumento de reticulócitos na circulação sanguínea a partir do 28&ordm; dia p.i. sugere ser temporária a supressão da atividade eritropoética. O baixo número de linfócitos T CD4+, coincidindo com a esplenomegalia e a PCR positiva até a vigésima semana p.i., sugere a relação entre a persistência da infecção, com a localização esplênica de E. canis e ativação de um mecanismo de escape pelo microrganismo, representado pelo baixo limiar de ativação de linfócitos T CD4+. Por outro lado, o aumento de linfócitos T CD8+ no auge da infecção coincidindo com a melhora clínica, sugere o envolvimento do mecanimo de citotoxicidade na patogenia da erliquiose canina. O bloqueio parcial da atividade dos linfócitos T CD4+, constitui-se provavelmente em um dos mecanismos de escape da E. canis, enquanto a contínua liberação de TNF-&alpha; pelas células citotóxicas, como parte do mecanismo do hospedeiro para a eliminação do parasita pode resultar na pancitopenia terminal observado freqüentemente nos cães cronicamente infectados por E. canis. / The clinical evolution, the persistence of infection and humoral and cellular immune response were evaluated on seven adult naïve dogs experimentally inoculated with an E. canis strain and followed during 20 weeks. Three dogs were remained as control. Daily clinical evaluation and laboratorial exams (hematological, biochemistry, erythrocyte osmotic fragility, Coombs´ test, neutrophils oxidative metabolism by nitroblue tetrazolium reduction test), polymerase chain reaction assay (PCR), anti-E. canis antibodies detection by indirect immunofluorescence assay (IFA) and quantification of CD4+ and CD8+ T lymphocytes by flow cytometry technique were evaluated, at different moments during all the experimental period. The presence of E. canis morulae, seroconversion with high antibodies titers (1,280 to 20,480) and positive PCR had confirmed the infection in all the inoculated animals. Fever, splenomegaly, lymphadenomegaly, thrombocytopenia, non-regenerative anemia and increase on liver´s enzymes serum activity (ALT, AST and ALP) were the main clinical and laboratorial changes observed, with the highest point between days 21 and 28 post-infection (p.i.). Also at these moments were observed increase of CD8+ T lymphocytes and reduction of the CD4+ T lymphocytes. The increase in the stimulated neutrophils oxidative metabolism between days 28 and 35 p.i., and the increase of reticulocytes in the same period, allied to the reduction of the CD4+ T lymphocytes and the increase of CD8+ T lymphocytes, indicated the host´s immune response in the attempt to eliminate the infection. On the peak of the infection, from the 21st to the 49th post-infection day, there was an inversion in the CD4:CD8 ratio of blood lymphocytes, mainly caused by increase of the CD8+ T lymphocytes. There was no variation on erythrocyte osmotic fragility and Coombs? test results, which suggested the absence of immune-mediated hemolysis. It wasn´t detected any anti-E. canis IgM antibodies in the infected group of dogs. The increase of reticulocytes only from the 28th post-infection day suggests a temporary erythropoietic suppression. The low number of CD4+ T lymphocytes, coinciding with the splenomegaly and the positive PCR until the twentieth week p.i., suggest that there is a relation between the persistent infection, the splenic localization of E. canis and an evasion mechanism, represented for the low threshold of activation of CD4+ T lymphocytes. On the other hand, the increase of CD8+ T lymphocytes in the peak of infection, coinciding with clinical improvement, suggests the involvement of the cytotoxicity mechanism on canine ehrlichiosis pathogenesis. The partial blockage of CD4+ T lymphocytes activity could probably be one of the E. canis escape mechanisms, while the continue TNF-&alpha; release by host´s cytotoxic cells, as a mechanism to eliminate the parasite, could result in terminal pancytopenia commonly observed in dogs chronically infected with E. canis.

A demodicidose é uma importante dermatopatia parasitária em cães. É decorrente da proliferação excessiva de ácaros comensais do gênero Demodex sp no tegumento canino. A manifestação clínica da demodicidose juvenil generalizada têm sido associada à disfunção imune hereditária de linfócitos T específica ao parasita, enquanto que, a demodicidose do aduto pode ser consequente a doenças imunossupressoras. A resposta imune celular é considerada crucial na defesa contra o parasita e, encontra-se comprometida em cães com demodicidose. Com o escôpo de se determinar se linfócitos sanguíneos periféricos, TCD4+, TCD8+ e a razão TCD4+:TCD8+ são bons indicadores da evolução clínica da doença e do estado imune de cães demodicidose generalizada, tais parâmetros foram quantificados em 16 animais com demodicidose generalizada, na pré, trans e pós terapia, e em outros 30 animais hígidos, utilizando-se da técnica de citometria de fluxo. Para as análises estatísticas comparativas, foram padronizados quatro momentos de observação dos animais com demodicidose, a saber: primeira consulta: quando do estabelecimento do diagnóstico; segunda consulta; consulta de obtenção do primeiro exame parasitológico negativo e, finalmente, naquela de estabelecimento da alta clínica, preconizada quando da ausência de evidenciação do ácaro no exame parasitológico cutâneo, por três consultas consecutivas. Os valores absolutos médios de linfócitos totais, linfócitos TCD4+ e TCD8+ nos animais com demodicidose, mostraram-se inferiores àqueles do Grupo Controle em todos os momentos de observação. Somente os valores absolutos de linfócitos TCD4+, apresentaram diminuição significativa, em relação ao Grupo Controle, no momento da primeira consulta. Entre o Grupo Experimental, foi observado elevação signficativa entre os valores absolutos dos linfócitos totais, TCD4+ e TCD8+, entre a primeira consulta e aquela de obtenção do primeiro exame parasitológico negativo, quando estes valores se aproximaram daqueles observados no Grupo Controle. Paralelamente, evidenciou-se alta correlação da elevação dos número absoluto médio dos linfócitos TCD4+ e TCD8+, com a diminuição da contagem de ácaros. A razão TCD4+:TCD8+, não diferiu significativamente entre o Grupo Controle e Experimental. O tratamento da demodicidose não alterou a razão TCD4+: TCD8+. Não foi observado correlação entre o período necessário para o estabelecimento da alta clínica e a razão TCD4+:TCD8+. O comportamento dos linfócitos sanguíneos periféricos TCD4+, TCD8+, e da razão TCD4+:TCD8+, demonstra que a participação de outros mecanismos, que não a franca alteração destas subpopulações, sejam importantes na patogenia da doença. Em linhas gerais, não foram observadas diferenças significativas, nos valores dos linfócitos TCD4+, TCD8+ e a razão TCD4+:TCD8+, entre os animais do Grupo Controle, e os animais com demodicidose generalizada , de forma que, o uso da determinação destes parâmetros, é desaconselhado no monitoramento da evolução clínica e no estabelecimento do prognóstico, nos animais com demodicidose generalizada. / Demodicosis is a serious canine parasitic skin disease. It is caused by the presence of increasead amounts of Demodex mite in the skin. Clinical signs of juvenile-onset generalized demodicosis are associated with specific hereditary dysfunction of T lymphocytes while adult-onset can be induced by immunosuppressive diseases. The cellular immunity is crucial in keeping low numbers of skin mites and it is depressed in dogs with generalized demodicosis. The aim of this study was to verify whether CD4+, CD8+ T-lymphocytes counts and CD4+:CD8+ ratio could be good indicators of disease progression and immune status in canine demodicosis. For this, using the flow cytometry technique, the CD4+, CD8+ T-lymphocytes counts and CD4+:CD8+ ratio of 16 dogs with generalized demodicosis were evaluated at four moments: first and second consultation, first time animal was presented without mites in skin scrapings and finally, on clinical improvement. These values were then compared with those of 30 controls healthy dogs. The absolute numbers of CD4+, CD8+ and total lymphocytes were lower than control healthy dogs at all moments of analysis. Only at the first consultation CD4+ lymphocyte counts was significant lower than control group. Dogs with generalized demodicosis had signicant increased counts of CD4+, CD8+ and total lymphocytes from the first consultation until the first negative skin scraping. At this point lymphocyte counts reached levels closesth to control group ones. CD4 : CD8+ ratio didn´t differ throughout treatment of canine demodicosis neither when average level for ill dogs were compared to with those healthy ones. Furthermore CD4+, CD8+ and CD4:CD8+ ratio didn´t correlated with time taken for successfull treatment completion and so they couldn´t be used as prognosis predictor. A high correlation between increased of CD4+, CD8+ T-lymphocytes counts and decreased mites counts was observed in dogs with generalized demodicosis. Circulating lymphocyte subpopulations are therefore similar in dogs with canine demodicosis and healthy dogs and there is no correlation between clinical status or response to therapy and the lymphocytes subpopulations counts. We can than conclude that CD4+, CD8+ T-lymphocytes counts and CD4+:CD8+ ratio cannot be used as a parameters to predict progression of an individual patient in a clinical context.

Os dermatófitos são fungos que apresentam a capacidade de invadir o estrato córneo da pele e de outros tecidos queratinizados como os cabelos e as unhas. Esses fungos podem provocar infecções em qualquer local da pele, no entanto os pés, região inguinal, axilas, couro cabeludo e unhas são mais freqüentemente afetados. O Trichophyton rubrum é um fungo antropofílico responsável por aproximadamente 80% das micoses superficiais em humanos. Indivíduos saudáveis podem apresentar dermatofitoses, embora nesses indivíduos a doença ocorra de forma localizada. Por outro lado, indivíduos que apresentam comprometimento da imunidade celular tendem a apresentar formas mais disseminadas. Tendo o objetivo de avaliar a resposta imunológica celular de pacientes portadores de dermatofitoses extensas causadas pelo Trichophyton rubrum, utilizamos um método bastante sensível de avaliação da imunidade celular que mede a resposta linfoproliferativa a mitógenos como: a fitohemaglutinina (PHA); o anti-CD3 (OKT3); e o Pokeweed (PWM). Foram avaliadas também as respostas linfoproliferativas para antígenos como: o antígeno metabólico de Candida sp (CMA); o extrato antigênico do Trichophyton rubrum, e o peptídeo sintético (YIIDTGIDID) que corresponde ao principal epítopo do fungo. Avaliamos também a dosagem das citocinas IL-4, IL-10, IL-12 e IFN- sob estímulo inespecífico pela PHA e CMA, e sob estímulo específico pelo peptídeo imunodominante do fungo. Os resultados da imunofenotipagem celular para CD3, CD4, CD8, CD19, CD56 e CD206 nos mostraram que não houve diferença entre os grupos de controles e pacientes. Os resultados dos ensaios de linfoproliferação demonstraram diferenças significativas entre os grupos controles e pacientes sob o estímulo inespecífico do PWM e ao antígeno não relacionado CMA. Houve semelhança dos resultados para os grupos controles e pacientes frente ao estímulo pelo extrato antigênico, e diferenças significativas entre os grupos controles e pacientes frente ao peptídeo imunodominante, onde o índice de estimulação foi nitidamente superior para o grupo controle. A quantificação de citocinas demonstrou diferença significativa apenas para IFN- entre os grupos de controles e pacientes sob os estímulos de PHA e do peptídeo sintético. Podemos concluir que o extrato fúngico obtido é antigênico e induz linfoproliferação. No entanto, a resposta ao peptídeo YIIDTGIDID (Tri r2) foi mais específica. Nosso trabalho demonstrou que nem todos os pacientes com Dermatofitoses extensas apresentam uma resposta celular deficiente, pois esses pacientes demonstram respostas tanto para o extrato quanto para o peptídeo antigênico de Trichophyton rubrum / Dermatophytes are fungi that have the ability to invade the stratum corneum of the skin and other keratinized tissues such as hair and nails. These fungi can cause infections anywhere on the skin, however the feet, inguinal region, axillae, scalp and nails are most often affected. Trichophyton rubrum is an anthropophilic fungus responsible for approximately 80% of superficial mycoses in humans. Healthy individuals can present dermatophytoses, although in these individuals the involvement occurs on localized areas. On the other hand, individuals with impaired cellular immunity tend to have disseminated forms. With the aim of evaluating the cellular immune response of patients with extensive dermatophytosis caused by Trichophyton rubrum, we used a very sensitive method for assessing cellular immunity, measuring the lymphoproliferative response to mitogens such as: phytohemagglutinin (PHA); anti-CD3 (OKT3); and pokeweed (PWM). We also evaluated the lymphoproliferative response to antigens as: the metabolic antigen of Candida sp (CMA), the antigenic extract of Trichophyton rubrum; and the synthetic peptide (YIIDTGIDID) that corresponds to the main fungal epitope . We also evaluated the levels of IL-4, IL-10, IL-12 and IFN- after stimulation by PHA, CMA, and the immunodominant peptide of the fungus. The immunophenotyping results showed no differences between the groups of patients and controls. The lymphoproliferation test results showed significant differences between the groups of patients and controls under the PWM and CMA stimuli. There were similar results for the groups of controls and patients after the antigenic stimulation by the extract, and significant differences between the groups of controls and patients against the immunodominant peptide, being the stimulation index significantly higher for the control group. The cytokines quantification showed a significant difference between the groups of controls and patients only for IFN- under PHA and the synthetic peptide stimulation. We can conclude that the obtained fungal extract is antigenic and can stimulate lymphoproliferation. However the response to the peptide YIIDTGIDID (Tri r2) was more specific. We showed that not all patients with extensive dermatophytosis have an impaired cellular response, demonstrating responses to both the extract and the antigenic peptide of T. rubrum