Os ácidos graxos (AG) são ácidos carboxílicos que compõe a estrutura fundamental dos lipídeos e possuem uma cadeia hidrocarbonada (4 a 26 C) e um grupamento carboxila terminal (ácidos carboxílicos). Eles são capazes de gerar mediadores ativos e modular a resposta a hormônios, como também influenciam a resposta imunológica, inflamatória e secreção de insulina e de outros hormônios. Além do efeito sobre o perfil das lipoproteínas plasmáticas, os AG atuam nos processos inflamatórios, têm papel importante na função endotelial, sensibilidade à insulina e mecanismos trombogênicos. Neste sentido, avaliou-se a associação de disfunção endotelial com a proporção de AG séricos em pacientes com diabete melito tipo 2. Os níveis séricos de endotelina-1 apresentaram correlação positiva com os AG saturados e negativa com os AG poliinsaturados (AGP), demonstrando que a composição de AG séricos está independentemente relacionada com disfunção endotelial, avaliada pela dosagem de endotelina-1.Além de estarem relacionados com disfunção endotelial, os AG medidos nos lipídeos totais, apresentam melhor associação com os AG medidos na fração triglicerídeos e também melhor correlação com os lipídeos séricos (colesterol e triglicerídeos) e se correlacionam com os AG de dieta (AGP). Isto demonstra que os AG dosados nos lipídeos totais representam melhor as funções metabólicas dos AG no soro.

Alterações do metabolismo lípídico são comuns em pacientes com Insuficiência Renal Crônica, contribuindo para altos índices de morbimortalidade relacionados à doença cardiovascular e dislipidemia. Avaliamos perfil lipídico de 63 pacientes divididos em 3 grupos: grupo 1 - 28 pacientes com insuficiência renal submetidos à hemodiálise (HD); grupo 2 - 19 pacientes com insuficiência renal submetidos à diálise peritoneal ambulatorial contínua (CAPD) e grupo 3 - 16 pacientes com insuficiência renal em tratamento conservador (TC). Os níveis de triglicerídeos (TG) nos pacientes submetidos à HD e à CAPD demonstraram medianas mais elevadas de151 (97-254) mg/dl e 224 (137-313) mg/dl respectivamente, quando comparados à mediana dos pacientes mantidos em TC de 141 (79-110) mg/dl (P<0.023). Na análise do colesterol total (COL-T), observamos que os pacientes dos grupos de CAPD e TC apresentaram médias mais elevadas que os pacientes do grupo de HD (224 ± 49 mg/dl, 227 ± 71 mg/dl e 187 ± 48 mg/dl respectivamente) (P<0.038). O grupo mantido em TC apresentou níveis significativamente menores da lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL) de 28 (22-36) mg/dl quando comparado aos paciente submetidos à HD, com níveis iguais a 39 (19-51) mg/dl e aos pacientes submetidos à CAPD, cujos níveis foram de 45 (27- 63) mg/dl. Na avaliação da lipoproteína de baixa densidade (LDL), verificamos níveis elevados de 135 ± 50 mg/dl e 148 ± 64 mg/dl para os grupos CAPD e TC respectivamente, enquanto que os pacientes de HD apresentaram níveis de 106 ± 44 mg/dl (P<0.08). As médias da lipoproteína de alta densidade (HDL) apresentaram-se acima de 35 mg/dl nos três grupos. A avaliação da apolipoproteína A (APO A) demonstrou níveis semelhantes de 198 ± 49 mg/dl, 221 ± 41 mg/dl e 201 ± 34 mg/dl para os grupos HD, CAPD e TC respectivamente. Os níveis da APO B de 235 ± 48 mg/dl para o CAPD e 212 ± 98 mg/dl para o TC, apresentaram-se mais elevados quando comparados ao nível de 168 ± 54 mg/dl de HD (P<0.003). As medianas da Lp (a) foram semelhantes entre os três grupos, com níveis de 8 (3.7-19.7) mg/dl, 9 (6.5-28.6) mg/dl e 5.4 (3.2-15.8) mg/dl para os grupos HD, CAPD e TC (P=0.121). Nossa análise quantitativa dos dados determinou que os pacientes com Insuficiência Renal Crônica (IRC) submetidos à Diálise Peritoneal Ambulatorial Contínua (CAPD) apresentaram-se com perfil mais dislipidêmico, determinando portanto, maior tendência à aterogenicidade quando comparados aos pacientes submetidos à Hemodiálise (HD) e à pacientes mantidos em Tratamento Conservador (TC).

Tendo em vista que populações de países industrializados aumentaram significativamente o consumo total de gordura, especialmente a saturada, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do consumo de dietas ricas em gordura saturada ou com azeite de oliva virgem sobre peso corporal, consumo calórico e parâmetros bioquímicos em ratos. Quatro grupos de animais foram alimentados durante 16 semanas com 4 diferentes dietas: normocalórica com 9,12% óleo de soja (NOS); hipercalórica óleo de oliva (HOO), com 43,2% óleo de oliva virgem; hipercalórica com 43,2% de gordura saturada (ácidos palmítico, mirístico e esteárico) (HGS); e normocalórica com 43,2% de gordura saturada (NGS). Após o período de tratamento, foram realizadas medidas de síntese e concentração de glicogênio hepático, dosagens de colesterol total e triacilgliceróis em plasma e fígado e testes de tolerância à glicose (TTG) e à insulina (TTI). Animais foram sacrificados por decapitação, sangue foi coletado para as dosagens bioquímicas e fatias de fígado (100-150mg) foram pesadas para as incubações e dosagens bioquímicas. Tecido adiposo foi retirado e pesado para comparação entre os grupos. Durante todo o período de tratamento, animais do grupo HGS consumiram mais e os do grupo HOO menos calorias diárias. Ratos que comeram dieta com gordura saturada ‘ad libitum’, isto é, HGS e NOS, tinham maior peso corporal do que os outros, mas os ratos com dieta HGS tiveram maior deposição de gordura retroperitoneal. Em fígado, a síntese e a concentração de glicogênio foram maiores nos ratos que comeram dieta rica em gordura saturada (HGS e NGS). Em músculo sóleo a síntese de glicogênio só estava aumentada nos animais do grupo NGS. A captação de glicose em músculo sóleo não apresentou diferenças entre os grupos. O GTT teve área sob a curva (AUC) maior no grupo HOO, mas o ITT foi normal. Em plasma, o colesterol total foi maior em HGS e menor em NGS e os triacilgliceróis foram menores em HOO e maiores em HGS. Em fígado, colesterol total e triacligliceróis estavam elevados em todos os animais com dietas HL, porém, foram mais altos no grupo HOO com relação aos outros grupos. A atividade da enzima paraoxonase 1 (PON1) que é relacionada com colesterol HDL, foi menor no grupo HGS. A dosagem de ácidos graxos livres (AGLs) não mostrou diferença significativa entre os grupos, mas observou-se uma tendência a aumento nos animais HGS. Estes resultados sugerem uma correlação positiva entre o consumo de dietas hiperlipídicas com alterações metabólicas. A dieta hiperlipídica com gordura saturada quando ingerida ‘ad libitum’ causou efeitos negativos sobre parâmetros tais como consumo calórico total, perfil lipídico e deposição de gordura, embora a dieta rica em gordura monoinsaturada tenha causado elevação na AUC do GTT e elevação da concentração de CT e TAG em fígado sem alterações no plasma. Mais estudos são necessários para compreensão dos efeitos de tais dietas em parâmetros como tolerância à glicose, síntese e concentração hepática de glicogênio, concentração de TAG e colesterol hepático. O presente estudo estende o conhecimento sobre suas ações no metabolismo intermediário. / Given that populations of industrialized countries increased the total intake of dietary fat, especially saturated fat, in relation to other types of fat, the objective of the present investigation was to evaluate the effects of consumption of diets rich in saturated fat or with virgin olive oil on body weight, caloric consumption and some biochemical parameters in rats. Four groups of animals were fed for 16 weeks with four different diets: normocaloric with 9.12% of the soybean oil (NSO); hipercaloric olive oil (HOO), with 43.2% of the virgin olive oil; hypercaloric saturated fat (HSF), with 43.2 % of the saturated fat (palmitic, stearic and myristic acids) and normocaloric with 43.2% saturated fat (NSF). After the treatment, animals were sacrificed by decapitation, blood was collected for biochemical testing and liver slices (100- 150 mg) were weighed for incubations and biochemical measurements. Adipose tissue was removed and weighed for comparison between groups. Hepatic glycogen synthesis and concentration, total cholesterol and triacylglycerol in plasma and liver and glucose tolerance test (GTT) and insulin tolerance test (ITT) were performed. Throughout the treatment period, the HGS group consumed more and HOO group less calories daily. Rats that ate a diet with saturated fat ‘ad libitum', ie HGS and HOO, had higher body weight than others, but HGS had higher retroperitoneal fat deposition. In liver, glycogen synthesis and concentration were higher in rats under a diet rich in saturated fat (HGS and NGS). In soleus muscle glycogen synthesis was increased only in group NGS. The glucose uptake in soleus muscle showed no differences between groups. The GTT had area under the curve (AUC) higher in group HOO, but the ITT was normal. In plasma, total cholesterol was higher in HGS and lowest in NGS and triacylglycerols were lower in HOO and larger in HGS. In liver, total cholesterol and tryacliglicerols were elevated in all animals under HL diets, however, were higher in group HOO that in the others. The activity of the paraoxonase 1 enzyme (PON1), that is related to HDL cholesterol, was lower in HGS. The determination of free fatty acids (FFAs) showed no significant difference between groups, but there was a tendency to increase in animals HGS. These results suggest a positive correlation between the consumption of high fat diets with metabolic changes. The high fat diet with saturated fat intake when ‘ad libitum' caused negative effects on parameters such as total calories, cholesterol and fat deposition, although the diet rich in monounsaturated fat has caused an increase in the AUC of GTT and increased concentration of TC and TAG in liver without changes in plasma. More studies are needed to understand the effects of such diets on parameters such as glucose tolerance, synthesis and hepatic glycogen concentration, TAG concentration and hepatic cholesterol. The present study extends knowledge about their actions in intermediary metabolism.

A hipermetioninemia ocorre em muitas doenças metabólicas, dentre elas, na deficiência da enzima metionina adenosiltransferase e na homocistinúria. Pacientes afetados por essas doenças podem apresentar alterações neurológicas e hepáticas; entretanto, os mecanismos responsáveis por essas manifestações não estão totalmente elucidados. No presente trabalho inicialmente avaliamos o efeito in vitro da metionina sobre a atividade da Na+,K+-ATPase e sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo em hipocampo de ratos. Resultados mostraram que a pré-incubação de homogeneizados de hipocampo com metionina diminuiu a atividade da Na+,K+-ATPase e que antioxidantes (glutationa e trolox) preveniram esse efeito. Verificou-se também que a metionina diminuiu o potencial antioxidante total não enzimático (TRAP), aumentou a lipoperoxidação (medida pela quantidade de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico – TBARS e pela quimiluminescência) e não alterou a atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT), glutationa peroxidase (GSH-Px) e superóxido dismutase (SOD). A seguir, desenvolvemos um modelo químico experimental de hipermetioninemia em ratos, a fim de estudar e melhor compreender os mecanismos fisiopatológicos dessa doença. Utilizando esse modelo, verificamos diversos parâmetros bioquímicos cerebrais, como a atividade da Na+,K+-ATPase e da acetilcolinesterase, alguns parâmetros de estresse oxidativo, o conteúdo lipídico total, bem como o aprendizado e a memória em ratos submetidos à tarefa do labirinto aquático de Morris. Também avaliamos parâmetros de estresse oxidativo em fígado de ratos hipermetioninêmicos. O modelo crônico de hipermetioninemia foi realizado do 6o ao 28o dia de vida e as doses de metionina administradas variaram de 1,34 a 2,68 mmol/g de peso corporal. Os ratos controles receberam solução salina no mesmo volume. As concentrações plasmáticas obtidas foram de 2 mmol/L, similares àquelas encontradas no plasma de pacientes hipermetioninêmicos. Os níveis cerebrais de metionina foram de aproximadamente 1 mmol/g de tecido. No tratamento agudo, ratos de 29 dias receberam uma injeção de metionina, na dose VIII de 2,68 mmol/g de peso corporal. Os resultados mostraram que a hipermetioninemia aguda e crônica aumentou o TBARS e reduziu a Na+,K+- ATPase em cérebro de ratos. A hipermetioninemia crônica reduziu o conteúdo total de gangliosídios, fosfolipídios e colesterol, e não alterou a CAT e o conteúdo tiólico total em cérebro de ratos. Também observamos que a administração crônica de metionina provocou um déficit na memória de trabalho e um aumento na atividade da acetilcolinesterase cerebral. Por outro lado, a administração aguda de metionina não alterou a atividade dessa enzima em cérebro de ratos. Por fim, demonstramos que a hipermetioninemia crônica aumentou a quimiluminescência, o conteúdo de carbonilas e a atividade da GSH-Px, e diminuiu o TRAP e a atividade da CAT em fígados de ratos. Em contraste, não houve alteração nos níveis de TBARS, TAR, conteúdo tiólico total e na atividade da SOD em fígado de ratos. Nossos achados, em conjunto, poderão auxiliar na compreensão das alterações neurológicas e hepáticas observadas em pacientes hipermetioninêmicos. / Hypermethioninemia is the biochemical hallmark of many metabolic disorders, such as methionine adenosyltransferase activity deficiency and homocystinuria. Affected patients can present neurological and hepatic alterations, whose underlying mechanisms are not yet fully established. In the present work, we evaluated the in vitro effect of methionine on Na+,K+-ATPase activity and some parameters of oxidative stress in hippocampus of rats. Results showed that incubation of homogenates of hippocampus with methionine diminished Na+,K+- ATPase activity and that simultaneous incubation with some antioxidants, such as glutathione and trolox prevented this effect. We also demonstrated that methionine decreased total radical antioxidant potential (TRAP), increased thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) e chemiluminescence (both are markers of lipid peroxidation), but did not alter the activities of antioxidant enzymes catalase (CAT), glutathione peroxidase (GSH-Px) and superoxide dismutase (SOD) in hippocampus of rats. Afterwards, considering that animal models are useful to better understand the physiopathology of human diseases, we developed a chemically induced experimental model of hypermethioninemia in rats. By using this model, we verified many biochemical parameters, as Na+,K+-ATPase and acetylcholinesterase activities, some oxidative stress parameters, total lipid content, as well as learning and memory in rats on Morris water maze task. We also determined the effect chronic hypermethioninemia on some parameters of oxidative stress in liver of rats. Chronic hypermethioninemia was performed from the 6th to the 28th day of life and methionine doses administered (1.34–2.68 mmol/g of body weight) were chosen in order to induce plasma levels similar to those described in hypermethioninemic patients (around to 2 mmol/L). By this treatment, we also produced high levels of methionine (approximately 1 mmol/g wet tissue) in brain of rats. Control rats received saline in the same volumes. In acute treatment, 29-day-old rats received one single injection of methionine (2.68 mmol/g of body weight). Results showed that acute and chronic administration of methionine X enhanced TBARS levels and decreased Na+,K+-ATPase activity in brain of rats. Chronic hypermethioninemia reduced total content of gangliosides, phospholipids and cholesterol, but did not change CAT activity and total thiol content brain of rats. We also observed that methionine-treated rats presented impaired performance on working memory task and an increase in brain acetylcholinesterase activity. On the other hand, acute administration did not alter this enzyme activity. Finally, we demonstrated that chronic hypermethioninemia increased chemiluminescence, protein carbonyl content and GSH-Px activity, and decreased TRAP and CAT activity in liver of rats. In contrast, TBARS, TAR, total thiol content and SOD activity were not affected by methionine administration in liver of rats. Altogether, our findings may be helpful in the understanding of the neurological and hepatic alterations observed in hypermethioninemic patients.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-07-11T11:14:26Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1434365 bytes, checksum: 2f23d19c271ae947874a54a48ca53665 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-11T11:14:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1434365 bytes, checksum: 2f23d19c271ae947874a54a48ca53665 (MD5) Previous issue date: 2016-07-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O óleo de coco virgem (Cocos nucifera L.) apresenta composição diferenciada dos demais óleos, com maiores proporções de ácidos graxos saturados (SFA), sendo a maior parte ácidos graxos de cadeia média (AGCM). Desses, a maior proporção é representada pelo ácido láurico (C12:0), seguida pelo ácido mirístico (C14:0). Essa composição diferenciada está relacionada a diferenças em sua absorção e metabolismo no organismo. Contudo, os estudos não são claros quanto à quantidade desse óleo que deve ser ingerida por dia. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos metabólicos da substituição da fonte lipídica da dieta por óleo de coco virgem em ratas Wistar. Foi realizado um experimento laboratorial e foram utilizados 32 animais, aleatoriamente divididos em 4 grupos experimentais (n=8). Durante 10 semanas os animais receberam dietas normolipídicas, que diferiam de acordo com a fonte lipídica utilizada, sendo, G1 – controle AIN-93M, óleo de soja; G2 – substituição de 10,4% do total de lipídeos por óleo de coco; G3 – substituição de 50% do total de lipídeos por óleo de coco; G4 – substituição de 95% do total de lipídeos por óleo de coco. Ao final do período experimental, não foram observadas alterações nos parâmetros antropométricos advindos do consumo de óleo de coco (p>0,05), contudo, em G3 houve elevação das concentrações séricas de triglicerídeos, comparado aos demais grupos que receberam óleo de coco (p=0,004). Além disso, no tecido hepático dos animais de G4 foram encontrados maiores teores de ácido cáprico (C10:0) e de ácido mirístico, em comparação a G2 (p=0,002) e a G1 e a G2 (p<0,001), respectivamente. As quantidades de SFA total foram maiores nos grupos G3 e G4, em comparação com os demais grupos (p=0,002). Com relação aos diferentes tecidos adiposos, o tecido adiposo intra-abdominal apresentou maiores concentrações de C10:0 em G3 e G4 (p<0,001). Nos tecidos adiposos mesentérico e perirrenal, foram observadas maiores concentrações desse ácido graxo em G4, seguido por G3 (p<0,001 e p=0,001, respectivamente). As quantidades de C14:0 também foram maiores em G3 e G4 nos tecidos adiposos intra-abdominal (p<0,001) e perirrenal (p=0,001), em comparação aos demais grupos. Já no tecido adiposo mesentérico, esse ácido graxo apresentou-se aumentado em G4, seguido por G3 (p<0,001). A quantidade de SFA total foi maior em G4 nos tecidos adiposo intra- abdominal (p<0,001), mesentérico (p=0,008) e perirrenal (p=0,005). O consumo de óleo de coco também elevou as concentrações das citocinas pró-inflamatórias IL-1β (p=0,039) e IL-12 (p=0,014). Além disso, foi possível observar maior atividade da enzima catalase nos grupos que receberam óleo de coco (p<0,001) e redução de Malondialdeído em G3, em comparação a G1 (p=0,021). Assim, conclui-se que, apesar do consumo de óleo de coco, em uma dieta normolipídica, aumentar a atividade da enzima catalase e reduzir a peroxidação lipídica, a substituição de maiores quantidades dos lipídeos da dieta por óleo de coco pode elevar as concentrações plasmáticas de triglicerídeos, bem como levar ao maior acúmulo de C10:0, C14:0 e SFA total, tanto no fígado quanto nos diferentes tecidos adiposos. Esses resultados, associados ao aumento das concentrações de citocinas pró-inflamatórias no tecido adiposo, ressaltam que o consumo desse óleo deve ser realizado com cuidado e atenção e, portanto, mais estudos se fazem necessários para determinação da quantidade adequada a ser consumida. / Virgin coconut oil (Cocos nucifera L.) presents different composition compared to other oils, with higher proportions of saturated fatty acids (SFA), being most of them medium-chain fatty acids (MCFA). The lauric acid (C12:0) represents the largest proportion, followed by myristic acid (C14:0). This different composition is related to differences in their absorption and metabolism in the body. However, the studies are not clear about the amount of this oil should be consumed per day. Thus, the aim of this study was to evaluate the metabolic effects of replacing the fat source of the diet for virgin coconut oil in Wistar rats. A laboratory experiment was conducted using 32 animals randomly divided into 4 experimental groups (n=8). For 10 weeks, the animals received normolipidics diets, which differed according to the lipid source used, being G1 - AIN-93M control soybean oil; G2 - replacing 10.4% of total lipids for coconut oil; G3 - replacement of 50% of total lipids for coconut oil; G4 - replacing 95% of total lipids for coconut oil. At the end of the trial period, no changes were observed in anthropometric parameters arising from coconut oil consumption (p>0.05), however, in G3 there was an increase of serum triglycerides, compared to other groups who received coconut oil (p=0.004). Furthermore, in liver tissue of animals G4 were found higher capric acid content (C10:0) and myristic acid, in comparison to G2 (p=0.002) and G1 and G2 (p<0.001), respectively. The total amounts SFA were higher in groups G3 and G4, as compared to the other groups (p=0.002). With regard to the different adipose tissue, intra-abdominal adipose tissue showed higher concentrations of C10:0 in G3 and G4 (p<0.001). In perirenal and mesenteric adipose tissue were observed higher concentrations of this fatty acid in G4, followed by G3 (p<0.001 and p=0.001, respectively). The amounts of C14:0 were also higher in G3 and G4 in intraabdominal adipose tissue (p<0.001) and perirenal (p=0.001) compared to the other groups. In the mesenteric adipose tissue, this fatty acid was increased in G4, followed by G3 (p<0.001). The total amount of SFA was higher at G4 in intraabdominal adipose tissue (p<0.001), mesenteric (p=0.008) and perirenal (p=0.005). The consumption of coconut oil also increased IL-1β concentrations (p=0.039) and IL-12 (p=0.014). Furthermore, we observed increased activity of the enzyme catalase in the groups that received coconut oil (p<0.001) and reduced malondialdehyde in G3, compared to G1 (p=0.021). Thus, we can conclude that although coconut oil consumption in a normolipidic diet increase the catalase enzyme activity and reduce lipid peroxidation, the replacement of higher amounts of dietary lipids of coconut oil may raise plasma concentrations of triglycerides and lead to greater accumulation of C10:0, C14:0 and the total SFA, both in the liver and in the different adipose tissues. These results, associated with increased concentrations of pro- inflammatory cytokines in adipose tissue, point out that the consumption of oil should be carried out with care and attention and therefore more studies are necessary to determine the appropriate amount to be consumed.

SOUZA, Adson Ávila de. McLTP1 (Morinda citrifolia LIPID TRANSFER PROTEIN 1): efeito antimicrobiano in vitro e atividade protetora sobre a sepse induzida em camundongos. 2016. 117 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-01-23T21:39:38Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_aasouza.pdf: 2447488 bytes, checksum: 29d7cdd8e4951ca5cb0f7bf3bbe1e1f4 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-01-26T18:13:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_aasouza.pdf: 2447488 bytes, checksum: 29d7cdd8e4951ca5cb0f7bf3bbe1e1f4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-26T18:13:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_aasouza.pdf: 2447488 bytes, checksum: 29d7cdd8e4951ca5cb0f7bf3bbe1e1f4 (MD5) Previous issue date: 2016 / Microbial resistance is a major public health problem of this century, that has led to increased concern of severe sepsis cases in intensive care units. Due to the nonspecific therapy and the absence of drugs approved for sepsis treatment, new therapeutic approaches has been demanded. Among these approaches, plant antimicrobial peptides have emerged as promising molecules with a potential therapeutic intervention in human health. Recently, our research group isolated a lipid transfer protein type 1 (McLTP1 - UniProt Accession Number: C0HJH5) from Morinda citrifolia L. seeds (noni). This study aimed to evaluate the antibacterial and antifungal potential of McLTP1 against species of clinical concern and investigate its protective effect in mice subjected to sepsis. McLTP1 was isolated from noni seeds crude extract by protein fractionation with trichloroacetic acid 2.5% and ultrafiltration in 30 kDa membrane. McLTP1 antimicrobial properties were evaluated in vitro against planktonic cells and biofilm of Candida spp., gram-positive and gram-negative bacteria species in 96-well plates. In addition, it was evaluated the effect of McLTP1 on bacterial virulence factors and its modulatory properties on clinical antimicrobial drugs. Sepsis in mice was induced by cecal ligation and puncture model, being evaluated the survival rate, body weight and fresh organ weights, haematological parameters and antipyretic effect in animals treated intraperitoneally and orally with McLTP1 (8 mg/kg). Although McLTP1 was not able to inhibit Candida spp. biofilm formation, McLTP1 antifungal activity was observed through growth inhibition of Candida parapsilosis planktonic cells at 25 μg/mL (52.72%; p < 0.05), and through the potentiation effect of amphotericin B (0.06 μg/mL; 28.6% inhibition C. parapsilosis growth) when in the cotreatment with McLTP1 (50 μg/mL; 88.1 % inhibition). Regarding to the antibacterial activity, McLTP1 did not inhibit gram-negative bacteria planktonic cells growth, exhibiting effect only against gram-positive bacteria of Staphylococcus genus, being observed inhibitions on planktonic cells ranging from 18.7% (0.78 μg/mL, p < 0.05) to 98.8% (800 μg/mL; p <0.05) and against biofilms from 34.5% (12.5 μg/mL; p < 0.05) to 73.6% (400 μg/mL). McLTP1 reduced the activity of bacterial virulence factors such as catalase and coagulase, and acted in synergism with the antibiotic oxacillin. In prophylactic and therapeutic treatments at a dose of 8 mg/kg by intraperitoneal and oral route, McLTP1 increased the survival of animals with sepsis, showing antipyretic effect within the first hours after sepsis induction. Moreover, McLTP1 significantly reduced leukocytosis condition observed to the animals of vehicle group with sepsis. In conclusion, McLTP1 showed promising antimicrobial properties and protective effects on animals with sepsis, a new activity for this class of proteins, configured as a therapeutic potential candidate to this syndrome. / A resistência microbiana é um dos principais problemas de saúde pública deste século, e que tem levado ao aumento da preocupação dos quadros graves de sepse em unidades de tratamento intensivo. Diante da inespecificidade da terapia e inexistência de drogas aprovadas no tratamento da sepse, tem-se demandado novas abordagens terapêuticas. Dentre essas abordagens, peptídeos antimicrobianos vegetais têm se destacado como moléculas promissoras com possibilidade de intervenção terapêutica na saúde humana. Recentemente, nosso grupo de pesquisa isolou uma proteína transferidora de lipídeos do tipo 1 (McLTP1 - UniProt Accession Number: C0HJH5) das sementes de Morinda citrifolia L (noni). Este trabalho objetivou avaliar o potencial antibacteriano e antifúngico de McLTP1 sobre espécies de interesse clínico e investigar seu efeito protetor em camundongos submetidos à sepse. McLTP1 foi isolada através do fracionamento de proteínas do extrato total das sementes de noni com ácido tricloroacético 2,5% e ultrafiltração em membrana de 30 kDa. Propriedades antimicrobianas de McLTP1 foram avaliadas in vitro sobre crescimento planctônico e biofilmes de espécies de Candida spp. e de bactérias gram-positivas e gram-negativas em placas de 96 poços. Em adição, foi avaliado o efeito de McLTP1 sobre fatores de virulência bacterianos, e sua atividade moduladora sobre antimicrobianos da prática clínica. A sepse em camundongos foi induzida através do modelo de ligadura e perfuração do ceco, sendo avaliados a taxa de sobrevida, peso corpóreo e peso fresco relativo dos órgãos, parâmetros hematológicos e efeito antipirético em animais tratados por via intraperitoneal e oral com McLTP1 (8 mg/kg). Embora McLTP1 não tenha sido capaz de inibir a formação de biofilmes de Candida spp., a natureza antifúngica de McLTP1 foi observada por meio da inibição do crescimento planctônico de C. parapsilosis na concentração de 25 µg/mL (52,72%; p<0,05), e através da potencialização significativa do efeito de anfotericina B (0,06 μg/mL; 28,6% de inibição do crescimento de C. parapsilosis) quando no cotratamento com McLTP1 (50 μg/mL; 88,1% de inibição). Quanto à atividade antibacteriana, McLTP1 não inibiu o crescimento planctônico de bactérias gram-negativas, exibindo efeito contra bactérias gram-positivas do gênero Staphylococcus, sendo observadas inibições sobre células planctônicas variando entre 18,7% (0,78 μg/mL; p<0,05) e 98,8% (800 μg/mL; p<0,05), e sobre biofilmes em 34,5%, (12,5 μg/mL; p<0,05) a 73,6% (400 μg/mL). McLTP1 reduziu a atividade dos fatores de virulência bacterianos catalase e coagulase, e atuou em sinergismo com o antibiótico oxacilina. Em tratamentos profiláticos e terapêuticos na dose de 8 mg/kg pelas vias intraperitoneal e oral, McLTP1 aumentou a sobrevida de animais com sepse, apresentando efeito antipirético já nas primeiras horas após a indução da sepse. Além disso, McLTP1 reduziu significativamente o quadro de leucocitose observado nos animais com sepse do grupo controle. Portanto, McLTP1 possui propriedades antimicrobianas e efeito protetor sobre animais com sepse promissores, fato este inédito para essa classe de proteínas, configurando-se como candidato terapêutico potencial desta síndrome.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-04-01T14:05:54Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 916458 bytes, checksum: 3ba31258a09fab456ccb755153420074 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-01T14:05:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 916458 bytes, checksum: 3ba31258a09fab456ccb755153420074 (MD5) Previous issue date: 2015-12-07 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Esta tese compreende quatro capítulos. Todos os estudos aqui relatados foram executados na Colorado State University (CSU), em Fort Collins-CO/USA. Foram utilizados sêmen de seis garanhões com idade entre 15 e 21 anos, das raças Puro-Sangue Inglês, Quarto de Milha e Árabe; estabulados no Laboratório de Reprodução Equina da CSU. Capítulo 1: dividido em três experimentos. Experimento 1: objetivou-se avaliar efeito do tratamento com 2 mg de ciclodextrina carregada com colesterol e estigmastanol (CCC , CCE); 1, 2 e 3 mg de ciclodextrina carregada com óleo de salmão (S1, S2 e S3) e com óleo de semente de linho (L1, L2 e L3) nas motilidades total (MT) e progressiva (MP) dos espermatozóides após descongelamento. Não foram observadas diferenças entre os tratamentos (p>0,05). Experimento 2: objetivou-se avaliar MT e MP do sêmen tratado com diferentes fontes de lipídeos sonicados em meio Whitten’s Modificado (MW), após congelamento convencional e congelamento precedido por choque pelo frio; e avaliar efeito do tratamento com 2 mg de CCC e CCE sobre motilidades após choque pelo frio. Os tratamentos usando lipídeos foram: 3 e 6 mg de óleo de salmão (S3 e S6), de óleo de semente de linho (L3 e L6), de gema de ovo de galinha (G3 e G6), de óleo fígado de bacalhau (B3 e B6) e de óleo de açafrão (A3 e A6). Nenhum dos tratamentos utilizando lipídeos melhorou motilidade após congelamento convencional (p>0,05). Para o sêmen submetido a 0 oC por 30 minutos, os tratamentos G6, CCC e CCE melhoraram MT e MP (p<0,05). Experimento 3: utilizou-se cromatografia gasosa para avaliar eficiência dos tratamentos em alterar o perfil de ácidos graxos da membrana espermática. Os tratamentos foram: 6 μg de óleo de semente de linho diluído em etanol (L1); 2 mg de ciclodextrina carregada com óleo de semente de linho (L2) e 6 mg de óleo de semente de linho sonicado em MW (L3). Nenhum dos tratamentos foi capaz de alterar o perfil de ácidos graxos da membrana espermática (p>0,05). Capítulo 2: objetivou-se mensurar quantidade de colesterol e estabelecer a relação colesterol:fosfolipídeos na membrana plasmática de células espermáticas tratadas com diferentes quantidades de CCC (0, 2, 4, 6 e 8 mg). Foram utilizados kit comercial (Cholesterol Liquicolor, Stanbio Laboratory, Boerne, TX, USA) para mensuração do colesterol e ensaio de ferrotiocianato de amônio para mensuração dos fosfolipídeos totais. A quantidade de colesterol encontrada nas células tratadas com 0, 2, 4, 6 e 8 mg de CCC foram respectivamente 0,22; 0,58; 0,77; 0,91 e 1,07 μg/10 6 de espermatozóides, e a relação colesterol:fosfolipídeos para os mesmos tratamentos foram 0,39; 0,72; 1,0; 1,16 e 1,36. A quantidade de colesterol na membrana foi maior a partir do uso de 2 mg de CCC (p<0,05), e a relação colesterol:fosfolipídeos a partir do tratamento com 4 mg de CCC (p<0,05). Capítulo 3: neste estudo o objetivo foi avaliar o comportamento do sêmen sem tratamento (CT) ou tratado com 20% de plasma seminal (PS) e 40 μM de PC-12 (PC) em eventos ligados à capacitação espermática durante incubação por 30 minutos (avaliações foram feitas no tempo 0 – T0, 5 – T5, 15 – T15 e 30 minutos – T30). Para isso cada um dos tratamentos foi submetido a quatro diferentes corantes: 1- CoroNa Green, que quantifica sódio intracelular (CG); 2- Fluo-3, que quantifica cálcio intracelular (Fluo); 3- FITC-PNA, que quantifica reação acrossômica (FP) e 4- Merocianina, que caracteriza fluidez/desorganização da membrana plasmática (Mero). Yo-Pro-1 ou iodeto de propídeo foram utilizados para avaliar integridade de membrana plasmática. As amostras foram lidas em citometria de fluxo. O tratamento com PC-12 aumentou o percentual de células com acrossoma reagido, detectada na avaliação aos 30 minutos. Este percentual, de 33%, foi maior que o dos demais tratamentos no mesmo tempo (CT: 13% e PS: 4%) e superior aos percentuais para o próprio PC-12 nos tempos 0 (7%), 5 (9%) e 15 minutos (16%). Com relação à fluidez da membrana plasmática não houve diferença no percentual de células com merocianina elevada entre os diferentes tratamentos, nem entre um mesmo tratamento ao longo do tempo (p>0,05). O estudo revelou efluxo de sódio das células espermáticas equinas viáveis após 15 minutos de incubação, sendo que nos tempos 15 e 30 minutos o percentual de celulas positivas para CG foram menores para tratamento com plasma seminal (8,8 e 4,8%) e maiores para tratamento com PC-12 (36 e 15,4%), em relação ao controle (23,6 e 11,8%, p<0,05). Após 15 minutos de incubação o sêmen dos três tratamentos apresentou percentual de células positivas para Fluo superior ao tempo 0, porém o plasma seminal retardou a entrada deste íon nas células, visto que, no T15 percentual de células Fluo+ foi menor que nos outros tratamentos (CT: 87%; PS: 59% e PC: 95%, p<0,05), voltando a se igualar no tempo 30 minutos (CT: 98%%; PS: 85% e PC: 97%, p>0,05). O meio MW utilizado foi capaz de induzir efluxo de sódio e influxo de cálcio, alterações que caracterizam capacitação espermática. Capítulo 4: os objetivos aqui foram avaliar eficiência de diluidores a base de gema de ovo (Lactose-EDTA) ou gema de ovo associada a leite em pó (FR5 modificado – FR5M) e eficiência do glicerol (GLI) ou da combinação deste com metilformamida (MF) em manter MT e MP dos espermatozóides após congelamento usando diferentes protocolos (0: congelamento sem resfriamento; 20: resfriamento em palhetas por 20 minutos a 5 oC antes do congelamento; 120T: resfriamento do sêmen em tubos por 120 minutos a 5 oC; 120P: resfriamento do sêmen em palhetas por 120 minutos a 5 oC). O FR5M preservou melhor a MP de células espermáticas em todos os protocolos de congelamento utilizados, mostrando benefício da combinação da gema de ovo com leite em pó no diluente de congelamento (15%, 21%, 26% e 25% para 0, 20, 120T e 120P, respectivamente, vs. 9%, 14%, 19% e 17%, para lactose-EDTA, p<0,05). A utilização de Lactose-EDTA 5%GLI apresentou resultados superiores para MT e MP se comparado ao mesmo diluidor com 3%MF + 2%GLI, o que mostra que o glicerol é um crioprotetor que pode ser utilizado em diferentes protocolos de congelamento (MT para Lactose-EDTA 5%GLI = 33%, 45%, 56% e 53% para 0, 20, 120T e 120P vs. 20%, 30% 35% e 36% para Lactose-EDTA 3%MF+ 2%GLI, p<0,05; MP para Lactose-EDTA 5%GLI = 19% e 17% para 120T e 120P vs. 11% e 10% para Lactose-EDTA 3%MF+ 2%GLI, p<0,05). O resfriamento do sêmen antes do congelamento pode ser realizado tanto em tubos quanto em palhetas de 0,5 mL, sem prejuízos às motilidades total e progressiva do sêmen após congelamento. / This thesis is compounded by four chapters. All work reported here were performed at Colorado State University (CSU), located in Fort Collins, CO / USA. Six stallions between 15 and 21 years old (Thoroughbred, Quarter Horse and Arabian breeds) and stabled at Equine Reproduction Laboratory at CSU were used in all experiments. Chapter 1: comprised by three experiments. Experiment 1: aimed to evaluate the effects on total motility (TM) and progressive motility (PM) after semen thawing from treatments with 2 mg of cyclodextrin-loaded-cholesterol and 2 mg of cyclodextrin-loaded-stigmastanol (CLC, CLS); 1, 2 and 3 mg of cyclodextrin-loaded-salmon oil (S1, S2 and S3); and 1, 2 and 3 mg of cyclodextrin- loaded-flax seed oil (F1, F2, and F3). No differences among treatments were detected (p>0.05). Experiment 2: aimed to evaluate TM and PM of semen treated with different sonicated lipids into Modified Whitten’s Medium (MW), after conventional freezing and freezing preceded by cold shock, and assess the effect of treatment with 2 mg of CLC and CLS on motility after cold shock. Treatments using lipids were: 3 and 6 mg of salmon oil (S3 and S6); 3 and 6 mg of flax seed oil (F3, F6); 3 and 6 mg of egg yolk (E3 and E6); 3 and 6 mg of cod liver oil (C3 and C6), 3 and 6 mg of safflower oil (SF3 and SF6). None of the lipid treatments improved motility after conventional freezing (p>0.05). For semen subjected to 0 °C for 30 minutes, TM and PM increased in semen treated with E6, CLC and CLS (p<0.05). Experiment 3: gas chromatography was used to evaluate effectiveness of treatments in altering the sperm membrane fatty acid profile. The treatments were: 6 μg of flax seed oil diluted with ethanol (F1); 2 mg of cyclodextrin-loaded- flax seed oil (F2) and 6 mg of flax seed oil sonicated in MW (F3). None of the treatments was able to change fatty acid profile in the sperm membrane (p>0.05). Chapter 2: aimed to measure the amount of cholesterol and to establish the cholesterol:phospholipids ratio in plasma membrane of fresh equine sperm cells treated with different amounts of CLC (0, 2, 4, 6 and 8 mg). A commercial kit was used to measure cholesterol (Cholesterol Liquicolor, Stanbio Laboratory, Boerne, TX, USA) and an ammonium ferrothiocyanate assay for total phospholipids measurement. Amount of cholesterol found for cells treated with 0, 2, 4, 6 and 8 mg CLC were, respectively, 0.22; 0.58; 0.77; 0.91 and 1.07 micrograms/10 6 sperm, and cholesterol:phospholipids ratios to the same treatments were 0.39; 0.72; 1.0; 1.16 and 1.36, respectively. Increase in cholesterol amount was observed when 2 mg of CLC was used (p<0.05), and cholesterol:phospholipids ratio was higher with 4 mg of CLC (p<0.05). Chapter 3: in this study the objective was to evaluate the response of fresh equine semen without treatment (CT) or treated with 20% of seminal plasma (SP) and 40 μM PC-12 (PC) in events related to sperm capacitation during incubation for 30 minutes (evaluations made at time 0 - T0, 5 - T5, 15 – T15 and 30 minutes - T30). Each treatment was subjected to four different dyes: 1- CoroNa Green, which measures intracellular sodium (CG); 2- Fluo-3, which measures intracellular calcium (Fluo); 3- FITC-PNA, which measures acrosome reaction (FP) and 4- Merocyanine, which characterizes plasma membrane fluidity/destabilization (Mero). Yo-Pro-1 or propidium iodide were used to assess cell membrane integrity. Samples were read in flow cytometry. An increased percentage of cells with reacted acrosome was observed in semen treated with PC-12 at T30. This proportion (33%) was higher than the other treatments at the same time (CT: 13% and SP: 4%) and higher than the proportion for PC-12 at T0 (7%), T5 (9%) and T15 (16%). There was no difference in the percentage of cells with high merocyanine between different treatments or between the same treatment over time (p>0.05). The study showed sodium efflux after 15 minutes incubation, and at times 15 and 30 minutes the percentage of positive cells for GC were lower in SP treatment (8.8 and 4.8%) and higher for PC-12 (36 and 15.4%) compared to the CT (23.6 and 11.8%, p <0.05). At T15 the semen of all treatments showed higher proportion of Fluo positive cells than T0, but seminal plasma delayed entry of the ion into the cells, since at T15 Fluo proportion of positive cells was lower than the other treatments (CT: 87%; SP: 59% and PC: 95%, p<0.05) and became similar at T30 (CT = 98%, SP= 85% and PC=97%, p> 0.05). The semen extender used was able to inducing sodium efflux and calcium influx, changes characterizing sperm capacitation. Chapter 4: the objectives were to evaluate efficiency of an egg yolk–based medium (lactose-EDTA) or egg yolk associated with powdered milk (modified FR5 - MFR5), and efficiency of glycerol (GLY) or a combination between GLY and dimethylformamide (MF) to maintain TM and PM sperm after freezing using different protocols (0: no cooling; 20: cooling straws for 20 minutes at 5 °C before freezing; 120T: cooling in tubes for 120 minutes at 5 °C; and 120P: cooling in straws for 120 minutes at 5 °C). MFR5 preserved PM in all freezing protocols, showing the benefit of the combination of egg yolk with powdered milk for freezing diluent (15%, 21%, 26% and 25% for 0, 20, 120T and 120P, respectively, vs. 9%, 14%, 19% and 17% for lactose-EDTA, p<0.05). The use of lactose-EDTA 5%GLY showed superior results for TM and PM if compared to the same medium with 3%MF + 2%GLY, indicating that glycerol is a cryoprotectant that can be used in several different freezing protocols (TM for Lactose-EDTA 5%GLY = 33%, 45%, 56% and 53% for 0, 20, 120T and 120P vs. 20% 30% 35% and 36% for LactoseEDTA 3%MF + 2%GLY, p <0.05; MP for Lactose-EDTA 5%GLY = 19% and 17% at 120T and 120P vs. 11% and 10% for Lactose-EDTA 3%MF + 2%GLY, p<0.05). The cooling before freezing can be performed either in tubes as in 0.5 mL straws for 120 minutes, without damage to total and progressive motility of thawed semen.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-04-20T09:32:04Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2156013 bytes, checksum: e389a522879f35b71143a4ae366bb488 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-20T09:32:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2156013 bytes, checksum: e389a522879f35b71143a4ae366bb488 (MD5) Previous issue date: 2014-08-11 / Petrobrás / A crescente busca por fontes altenativas de energia impulsiona as pesquisas ligadas a cadeia produtiva de biocombustíveis. Neste contexto, as microalgas podem ser utilizadas como fonte de biomassa alternativa às plantas terrestres. Entre os grupos de microalgas encontrados na natureza as diatomáceas têm recebido grande atenção devido ao acúmulo de lipídeos neutros e produção de lipídeos raros que muitas espécies deste grupo apresentam. Estudos recentes com diatomáceas têm demonstrado que estresses causados por deficiência nutricional podem estimular a biossíntese de lipídeos. O nitrogênio é um dos principais nutrientes cuja disponibilidade esta relacionada com a biossíntese de lipídeos em microalgas. Entretanto, apesar dos efeitos positivos dessa limitação, os mecanismos que levam a reprogramação metabólica em face de limitação de N promovendo a biossíntese de lipídeos ainda são muito pouco conhecidos em diatomáceas. Assim, com intuito de estudar o comportamento de diatomáceas foi realizado um experimento utilizando duas cepas de diatomáceas do gênero Nitzschia sp. BR006 e BR022, cultivadas em meios com 0, 5, 26 e 107 mM de N utilizado no meio BG11, comumente utilizado no cultivo de microalgas. Após a instalação do experimento uma caracterização detalhada de parâmetros fisiológicos e análise metabolômica e lipidômica foi realizada nas fases de adaptação, logaritimica e estacionária. Posteriormente, análises multivariadas revelaram que diferenças metabólicas e fisiológicas entre as duas cepas. As maiores alterações foram encontradas entre o tratamento controle (107 mM de N) e no sem N para cada cepa. Nas células cultivadas sem N (0 mM de N) foram observadas diminuição da taxa de crescimento e das taxas fotossintéticas para ambas cepas, sendo que em BR006 foram encontradas mais alterações. Foi constatado a diminuição de aminoácidos de cadeia ramificada, leucina, isoleucina e valina, quando o cultivos foi realizado na ausência de N, assim como o aumento dos intermediários da via glicolítica e de intermediário do ciclo TCA. No metabolismo de lipídeos pode-se observar aumento de TAGs e diminuição dos lipídeos de membrana como MGDGs e DGDGs nos cultivos sem N. Deve-se ressaltar no entanto, que as alterações foram menos pronunciadas em BR022, evidenciando que esta cepa faz melhor reaproveitamento do N em situações de deficiência. Em um segundo experimento, objetivando o desenvolvimento de meios alternativos a base de água residuária da indústria petrolífera, duas cepas de diatomáceas, Cyclotella sp. BR021 e Nitzschia sp. BR022, foram cultivadas emmeios com diferentes concentrações de ureia e silicato de sódio. Para encontrar as concentrações de uréia e silicato necessárias para maior crescimento e produção de lipídeos utilizou-se um delineamento composto central rotacional (DCCR). Obeservou-se que o silicato de sódio foi importante para o crescimento das duas cepas, sendo que em maiores concentrações deste nutriente foram obtidas as maiores quantidades de biomassa seca. Quanto a produção de lipídeos verificou-se diferentes respostas entre as duas cepas testadas. A BR021 apresentou maior produção de lipídeos em menores doses de N associadas a altas doses de silicato. Enquanto que BR022 não apresentou diferença significativa com as doses de ureia utilizadas e baixas doses de silicato estimularam o acúmulo de lipídeos. Tomados em conjunto podemos concluir que estresses nutricionais podem ser uma forma importante para estimular acúmulo de lipídeos, que são a matéria prima para produção de biodiesel. Ao mesmo tempo, os experimentos realizados sugerem que a água residuária pode ser utilizada como uma fonte viável de nutrientes para o cultivo de diatomáceas em escala industrial. Além de reduzir o custo a utilização de água de efluentes permite e dando um destino ecologicamente correto ao rejeito. / Increasing search for energy source drives research related to biofuels production chain. In this context, microalgae are an alternative to terrestrial plant biomass source. Between microalgae groups found in nature diatoms have received great attention due to accumulation of neutral lipids present in many species. Recent studies have shown thar diatoms stresses caused by nutritional deficiency stimulate lipids biosynthesis. Nitrogen is one of more important nutrient whose availability is related to the lipids biosynthesis in microalgae. However, despite positive impact of this limitation, mechanisms that lead to metabolic reprogramming in nitrogen starvation promoting lipids biosynthesis of are still poorly understood in diatoms. Thus, in order to study diatoms behavior an experiment was performed using two diatoms strains, Nitzschia sp. BR006 and Nitzschia sp. BR022, grown in media with 0, 5, 26 and 107 mM of nitrogen used in BG11 medium, commonly used in microalgae cultivation. After experiment a detailed characterization of physiological parameters, metabolomics and lipidomics analysis was performed on adaptation, logarithmic and stationary growth phase. Thereafter, multivariate analysis revealed that metabolic and physiological differences between two strains. The biggest changes were found between control treatment (100 mM N) and no nitrogen treatment for each strain. Growth rate and photosynthetic rates in starvation (0 mM N) decreased for both strains, and in BR006 more changes were found. The decrease branched chain amino acids leucine, isoleucine and valine was found when strains was conducted in nitrogen absence, as well as increase of glycolytic pathway and TCA cycle intermediate. In lipid metabolism was observed an increase in TAG and decreased I membrane lipids as MGDGs and DGDGs in nitrogen starvation (0 mM de N). However, it should be noted that changes were less pronounced in BR022, indicating that this strain does best nitrogen recycling in deficiency situations. In a second experiment, aimed to developing alternative wastewater medium two diatoms strains, Cyclotella sp. BR021 and Nitzschia sp. BR022, with different concentrations of urea and sodium silicate were cultured. Order to find urea and silicate concentrations necessary for growth and lipids production used a rotatable central composite design (RCCD). It was observed that sodium silicate was important for growth of both strains and in higher nutrient concentration larger quantities of dry biomass were obtained. As lipids production found were different responses between the two strains tested. Strain BR021 showed higher lipids production in lower nitrogen levels associated with high silicate concentration. While BR022 showed no significant difference in urea levels low silicate concentration stimulated lipid accumulation. Taken together we can conclude that nutritional stress may be an important way to stimulate accumulation of lipids, which are feedstock for biodiesel production. At same time, experiments suggest that wastewater can be used as a viable source of nutrients for diatoms cultivation in an industrial scale. Besides reducing cultivation cost use of wastewater allows a correct ecologically destination reject.

Microalgas são conhecidas como excelentes fontes de lipídeos, vitaminas e carotenoides. Contudo, os métodos de extração de compostos intracelulares tradicionais são dispendiosos e não têm se mostrado eficientes. Assim, o desenvolvimento de métodos de extração com maior rendimento e com a substituição de solventes tóxicos por solventes ambientalmente amigáveis se torna essencial para viabilizar a produção em grande escala de produtos derivados das microalgas. Este trabalho teve como objetivo principal avaliar a utilização de campo elétrico moderado (MEF) na extração de carotenoides e lipídeos a partir da microalga Chlorella sp.. Para tanto, foram estudadas diferentes tensões (0-180 V) numa etapa de pré-tratamento de extração. Além disso, o presente trabalho também avaliou a utilização de etanol como solvente de extração; foi avaliada uma concentração fixa de 25 % (v/v) durante a etapa de pré-tratamento em presença de campo elétrico moderado e diferentes concentrações de etanol numa etapa difusiva (25-75 %, v/v). Ainda, este trabalho avaliou a utilização do método sulfo-phospho-vanilina (SPV) como método de quantificação de lipídeos totais em microalgas. Os resultados mostraram que a extração de carotenoides teve influência significativa (p < 0,05) da aplicação de MEF e da concentração de etanol (%), sendo observado um efeito positivo e combinado de ambas as variáveis avaliadas. Esse resultado se deve, possivelmente, ao efeito que o MEF exerceu sobre os cloroplastos; acredita-se que a aplicação de campo elétrico promoveu a eletroporação reversível das membranas dos cloroplastos, favorecendo a extração de carotenoides. Em contrapartida, somente a concentração de etanol apresentou efeito significativo positivo na extração de lipídeos. Dessa forma, a permeabilização reversível da membrana celular não contribuiu para um aumento da extração de lipídeos. Vale enfatizar que, utilizando a tecnologia de MEF, um processo de baixa demanda energética, e etanol, um solvente ambientalmente amigável obteve-se uma extração de até 73 e 83 % de carotenoides e lipídeos, respectivamente. Ainda, o método SPV utilizado para quantificação de lipídeos totais em microalgas, se mostrou uma metodologia simples, rápida e adequada para quantificação de lipídeos em microalgas. / Microalgae are known as good sources of lipids, vitamins and carotenoids. The intracellular compounds extraction methods are time consuming and, in some cases, inefficients. Therefore, the development of new extraction methodologies is important to enable large scale extraction of compounds of interest derived from microalgae. The aim of the present work was to evaluate moderate electric field (MEF) application on lipid and carotenoid extraction from the microalgae Chlorella sp.. For this purpose, voltage was evaluated on a pre-treatment, varying from 0 to 180 V. Also, ethanol was evaluated as extraction solvent during the pre-treatment in the presence of MEF (25%, v/v) and during the diffusive step, at concentrations varying from 25 to 75 %, (v/v). Moreover, this work evaluated sulfo-phospho-vanillin method (SPV) as a total lipid quantification method in microalgae. The results showed that MEF and ethanol concentration significantly influenced (p < 0.05) carotenoid extraction, and a positive combined effect of both variables was observed. It is believed that, MEF promoted reversible electroporation of the cellular and chloroplast membranes. MEF possibly promoted an elongation on chloroplasts structure, which contributed to the increase on carotenoid extraction. On the other hand, only the ethanol concentration showed a positive effect on lipid extraction. In this case, the reversible electroporation on cellular membrane was not sufficient to increase lipid extraction. It is important to point out that the application of MEF and ethanol, an environmentally friendly solvent, promoted an extraction yield of up to 73 and 80 % of carotenoid and lipids, respectively. Also, SPV method showed to be an attractive fast lipid quantification method.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:45:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012 / Objetivo: O presente estudo teve como objetivo analisar as respostas neuroendocrinas, metabolicas e polissonograficas de individuos obesos e eutroficos submetidos a restricao do inicio e final do sono. Metodos: Quinze adultos jovens saudaveis (26,63±2,68 anos) do sexo masculino, sendo 7 obesos (IMC: 33,43±2,84) e 8 com peso normal (IMC: 22,22±2,54), participaram de 3 condicoes de sono crossover randomizadas com 3 noites de duracao, sendo: sono normal (sono: 23-07h), restricao do inicio do sono (RIS) (sono: 03-07h) e restricao do final do sono (RFS) (sono: 23-03h). Em cada condicao, os voluntarios permaneceram 4 dias no laboratorio. Durante a permanencia no laboratorio, foram oferecidas 3 refeicoes normocaloricas ao longo do dia. No terceiro dia de cada condicao, a partir das 07:00 horas, foram iniciadas as coletas de sangue, que se repetiram a cada 1 hora durante 24 horas. Foram analisadas as concentracoes de glicose, insulina, peptideo C, colesterol total e fracoes, triacilglicerol, acidos graxos livres nao-esterificados (NEFA), cortisol, adiponectina, TNF-&#945;, IL-6, proteina C reativa, leptina, grelina total e grelina acilada. No quarto dia, as 07:00 horas foi realizada a medida da taxa metabolica basal. Resultados: No grupo obesidade foram verificadas as seguintes modificacoes estatisticamente significantes: aumento da concentracao de cortisol no periodo da noite e reducao de manha apenas na RFS, aumento da concentracao de leptina ao longo das 24 horas da RIS e no periodo da manha da RFS. No grupo peso normal foram observadas as seguintes modificacoes estatisticamente significantes: reducao da tolerancia a glicose noturna em conjunto com a elevacao da concentracao de insulina e peptideo C em resposta ao cafe da manha na RFS, aumento das concentracoes de IL-6 no periodo da noite na RIS e ao longo das 24 horas na RFS, reducao das concentracoes de grelina total na RIS e RFS e da grelina acilada na RFS. Em ambos os grupos foram verificadas as seguintes modificacoes estatisticamente significantes: reducao das concentracoes de colesterol total e fracoes, triacilglicerol e NEFA na RIS e RFS, reducao das concentracoes de TNF-&#945; no periodo da noite na RIS e RFS e aumento da concentracao de adiponectina na RIS. Verificou-se que a taxa metabolica basal aumentou significantemente na condicao de RFS do grupo obesidade. Conclusao: A restricao de sono por tres noites levou a modificacoes neuroendocrinas e metabolicas distintas entre os grupos avaliados mas que sugerem prejuizo no metabolismo glicidico e lipidico, inflamacao e alteracao dos neuropeptideos associados ao controle do comportamento alimentar, que poderia predispor a resistencia a insulina e doencas cardiometabolicas. Esses dados contribuem para o aprofundamento das multiplas vias metabolicas que ligam a restricao de sono a obesidade / BV UNIFESP: Teses e dissertações