Submitted by Maykon Nascimento (maykon.albani@hotmail.com) on 2015-08-19T18:55:05Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Estudo sobre acetilacaoo da isoniazida em pacientes com Tuberculose pulmonar e da sua implicacao na reducao ou eliminacao da carga bacilar no escarro.pdf: 4242930 bytes, checksum: a16179fb880340385234f8f9fad6bdee (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barros (patricia.barros@ufes.br) on 2015-08-20T16:11:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Estudo sobre acetilacaoo da isoniazida em pacientes com Tuberculose pulmonar e da sua implicacao na reducao ou eliminacao da carga bacilar no escarro.pdf: 4242930 bytes, checksum: a16179fb880340385234f8f9fad6bdee (MD5) / Made available in DSpace on 2015-08-20T16:11:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Estudo sobre acetilacaoo da isoniazida em pacientes com Tuberculose pulmonar e da sua implicacao na reducao ou eliminacao da carga bacilar no escarro.pdf: 4242930 bytes, checksum: a16179fb880340385234f8f9fad6bdee (MD5) Previous issue date: 2013 / A N-acetiltransferase 2 é a principal enzima responsável pelo metabolismo e inativação da isoniazida no organismo humano. Mutações no gene NAT2 levam a 3 perfis genotípicos de acetilação que alteram os níveis séricos do fármaco: acetiladores lentos, intermediários e rápidos, o que pode alterar o desfecho terapêutico. O objetivo do estudo foi investigar se os diferentes perfis podem influenciar no tempo de negativação da cultura de escarro, e se existe correlação entre carga bacilar e gravidade da doença com tempo de conversão da cultura. A população de estudo foi composta por 62 pacientes, que tiveram seus DNAs sequenciados para identificação de mutações no gene NAT2 e seus perfis de acetilação determinados. A análise genotípica detectou 10 SNPs, sendo as mutações 341 T>C (39,65%) e 481 C>T (38,71%) as mais frequentes. A determinação das variantes alélicas identificou NAT2*5B (29,03%), NAT2*6A (23,39%) e NAT2*4 (24,19%) como os alelos mais frequentes e NAT2*5B/*5B como o genótipo mais frequente (20,4%). Dentre os 62 pacientes, foi possível correlacionar tempo de negativação da cultura e perfil de acetilação entre 43 deles, os quais 58,3% e 55,6% tiveram o genótipo lento com maior frequência no mês 1 e mês 3, respectivamente. Por meio de dados microbiológicos, a carga bacilar e a gravidade da doença também foram comparadas com o tempo de negativação, indicando que os pacientes com doença moderada ou avançada (76,7%) e aqueles com carga bacilar alta (60,4%), não tiveram associação estatística com o tempo de conversão da cultura. Por último, curvas de crescimento de isolados de M. tuberculosis de pacientes foram construídas para verificar possíveis diferenças na duração da fase lag entre os isolados, porém não foi observada diferença estatística entre elas. Com base nos resultados encontrados, verifica-se que não existe associação entre o perfil de acetilação do paciente, a carga bacilar, a gravidade da doença e o tempo de negativação da cultura de escarro / N-acetyltransferase 2 is the main enzyme responsible for the metabolism and inactivation of isoniazid in humans. Mutations in the gene NAT2 lead to 3 profiles of acetylation genotype that modify serum levels of the drug: slow acetylators, intermediate and fast, which can change the therapeutic outcome. The aim of the study was to investigate whether different profiles can influence the time of negativation sputum culture, and if there is a correlation between bacterial load and disease severity with time to culture conversion. The study population comprised 62 patients who had their DNAs sequenced for identification of mutations in the gene NAT2 and to determine the acetylation. Genotypic analysis detected 10 SNPs, and SNPs 341 T>C (39.65%) and 481 C>T (38.71%) were the most frequent. The determination of allelic variants identified NAT2*5B (29.03%), NAT2*6A (23.39%) and NAT2*4 (24.19%) as alleles more frequent and NAT2*5B/5B as the most frequent genotype (20.4%). Among 62 patients, it was possible to correlate time of negative culture and acetylation profile of 43 them, which 58.3% and 55.6% had genotype slow with greater frequency in month 1 and months 3, respectively. Through microbiological data, the bacterial load and severity of disease were also compared with the time of negativation, indicating that patients with moderate or advanced disease (76.7%) and those with high bacterial load (60.4%) had no statistical association with the conversion time of culture. Finally, growth curves of strains of M. tuberculosis of patients were constructed to evaluate possible differences in the duration of the lag phase between the isolates, but there was no statistical difference between them. Based on these results, it is found that there is no association between the profile acetylation of the patient, bacterial load and the severity of the illness and the time of negative sputum cultures

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambiental / Made available in DSpace on 2013-03-04T20:20:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 311998.pdf: 1164437 bytes, checksum: a53b2f44a7ea7f70d713030e3377b6b3 (MD5) / Uma das alternativas de produção de biodiesel, atualmente, em pauta, é o uso de biomassa de microalgas para a obtenção de lipídios, entretanto, existem alguns processos da sua produção que precisam de mais estudos, tais como os insumos utilizados. Uma das alternativas de matéria-prima para o cultivo é o efluente do cultivo superintensivo de camarões marinhos com bioflocos (BF). Dessa forma, o objetivo geral deste trabalho foi realizar a avaliação técnica e ambiental de diferentes culturas para a produção de microalgas destinadas a biodiesel. Para a avaliação técnica, foi considerada a produção de microalgas utilizando três meios de cultivo: (i) f/2 - elaborado com fertilizantes químicos; (ii) BF - emprego de 100% de efluente e (iii) 50/50 - elaborado com 50% de cada. A produtividade foi avaliada em relação a ganho de biomassa e a acumulação de lipídios e ésteres. Para o desempenho ambiental, foi utilizada a ACV, sendo estabelecida a unidade funcional de 1 kg de biomassa de algas contendo 25% de lipídios, produzida em 30 dias. Os limites do sistema vão da aquisição de matéria-prima até a biomassa seca de algas. Foram propostos cenários de avaliação ambiental semelhantes aos anteriores, sendo BF dividido de acordo com o procedimento de alocação adotado: BFa e BFb. Para Avaliação de Impacto Ambiental, foram consideradas categorias do método CML 2000 e a Demanda Acumulada de Energia. A produtividade de biomassa obtida em BF foi 17,5% superior às demais e, em relação à acumulação de lipídios, os valores foram semelhantes em todos os meios. Porém, a produtividade obtida nesses cultivos foi baixa. O consumo de energia foi o principal responsável também pelos principais impactos ambientais observados, no que se refere à acidificação, toxicidade humana e potencial de aquecimento global, sendo BFb o cenário menos impactante e f/2 o mais impactante. eutrofização, o cenário BFa foi o mais impactante devido as emissões de nitrato e fosfato e o cenário BFb apresentou impactos positivos, devido a dispensa do tratamento do efluente do cultivo de camarões. Percebe-se que o sistema de produção necessita de modificações a fim de tornar-se viável em escala industrial, especialmente no que se refere ao consumo de energia elétrica.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2012 / Made available in DSpace on 2013-07-16T04:40:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 315365.pdf: 1980119 bytes, checksum: 8b0c36ac4789de47d6ac113dc979681d (MD5) / A celulose bacteriana (CB) secretada por bactérias como a Gluconacetobacter hansenii é composta por uma rede de nanofibras de celulose que apresenta como principais características a moldabilidade e a biocompatibilidade. Apesar das excelentes características deste biomaterial, pode-se ainda alterar tanto suas propriedades físico-químicas como sua forma de estruturação, para se obter um material diferenciado. As modificações estruturais da CB podem ser realizadas por meio da combinação da CB com outros compostos in situ e as modificações morfológicas podem ser realizadas pela fermentação da CB em diferentes recipientes com diferentes metodologias, estendendo assim sua área de aplicação. Esta dissertação está dividida em duas partes, na primeira foram produzidas e caracterizadas membranas de CB modificadas in situ com a adição de glicose ou dextrina ao meio de cultura contendo manitol, em cultura estática (CBGl e CBDe, respectivamente). As imagens de MEV mostraram que houve modificações na rede de fibras das membranas. Ambas as modificações diminuíram a área superficial específica, a capacidade de retenção de água (CRA) e a taxa de reidratação (TR). Já os resultados da espectroscopia no infravermelho (FTIR-ATR) revelaram que não houve nenhuma alteração na estrutura química da CB. A modificação com a adição de glicose no meio de cultura (CBGl) influenciou positivamente o comportamento dos fibroblastos, aumentando a adesão e a proliferação celular quando comparado com o controle (CBC). Na segunda parte foi desenvolvida uma plataforma 3D multicompartimentalizada de CB (CM3D). Por meio da semeadura de fibroblastos no interior da matriz compartimentalizada e de um modelo matemático da difusão do corante fucsina básica neste dispositivo, demonstrou-se as aplicações potenciais como um dispositivo com capacidade de separação e/ou compartimentalização de ambientes diversos tanto para seu uso como scaffold nas aplicações de engenharia tecidual como para dispositivo de liberação. <br> / Abstract : Bacterial cellulose (BC) is secreted by bacteria such as Gluconacetobacter hansenii and consist on a network of cellulose nanofibers that provides the main characteristics of biocompatibility and moldability. Despite the excellent characteristics of the biomaterial, one can further alter both their physicochemical properties and their structure form to obtain a differentiated material. The BC structural changes can be made by combining the BC with other compounds in situ and morphological changes can be made by the fermentation of BC in different containers with different methods, thereby extending their application area. This work is divided into two parts, the first membranes BC modified were produced and characterized by adding in situ glucose or dextrin to the culture medium containing mannitol in static culture (BCGl and BCDe, respectively). The SEM images showed that there were changes in the network fiber membranes. Both modifications have decreased the specific surface area, the water holding capacity, and the rehydration rate. The results of infrared spectroscopy showed that there was no change in chemical structure of BC. The modification with by addition of glucose on culture medium (BCGl) influenced positively the behavior of fibroblasts, enhancing the adhesion and cell proliferation compared with the control (BCC). In the second part we developed a multicompartmentalized BC 3D platform (CM3D). By seeding fibroblasts into the matrix compartment and a mathematical model of the basic fuchsin dye diffusion on this device, it was demonstrated the potential for applications as a device capable of separate and/or compartmentalization of different environments for both their use as scaffold in tissue engineering applications and as release device. Keywords: bacterial cellulose

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T17:39:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 202857.pdf: 952008 bytes, checksum: 3939b6964c1743c4c50c155741cf4974 (MD5) / Os objetivos foram estabelecer um protocolo preliminar de cultivo primário de fibroblastos gengivais humanos e conseqüentemente, estabelecer uma linhagem celular; avaliar a viabilidade celular e os danos que os procedimentos precedentes poderiam causar na molécula de DNA. Uma biópsia de 20mm2 de mucosa ceratinizada foi fragmentada em 15 partes menores e divididas em 5 garrafas de cultura. A proliferação celular foi verificada através de microscópio invertido. Após subconfluência 70%, as células foram tripsinizadas. Foram usadas as células da 6a passagem. A viabilidade foi determinada através do teste de exclusão do azul de Trypan. Os possíveis danos nos DNA foram avaliados pelo Ensaio do Cometa. Uma das garrafas foi tratada com peróxido de hidrogênio. A viabilidade dos grupos-teste foi maior que 90%. Os DNAs dos grupos-teste não apresentaram danos significativos (p<0,01). Foi possível, estabelecer uma linhagem de fibroblastos viáveis e sem alterações significantes no seu DNA. Os achados permitem o uso destas células em futuras pesquisas.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal. / Made available in DSpace on 2012-10-20T12:40:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-08-10Bitstream added on 2014-06-13T20:02:14Z : No. of bitstreams: 1 salles_lp_dr_arafo.pdf: 1231496 bytes, checksum: 3488f858f33655af04a14dc9aa04ee94 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi analisar as respostas biológicas `a materiais utilizados em Endodontia que apresentam na formulação Mineral Trióxido Agregado (MTA) ou cimento Portland (PC) utilizando sistemas de cultura de células. O estudo foi dividido em três capítulos: No capitulo 1 foram avaliados bioatividade e biocompatibilidade de dois novos cimentos endodônticos comercialmente disponíveis; MTA Fillapex (MTA-F, cimento endodôntico à base de MTA, Ângelus) e Ephiphany SE (EP-SE, cimento endodôntico a base de resina metacrilato, SybronEndo). A linhagem de osteoblastos humanos (Saos-2) foi utilizada como modelo de estudo. Os resultados de MTT mostraram uma taxa significante de morte celular nas primeiras horas de exposição para todos os materiais avaliados. Entretanto, o grupo MTA-F apresentou aumento de células viáveis após 7 dias de presa. As imagens de microscopia eletrônica de varredura e o resultado de EDS (energia de dispersão atômica) mostraram diferenças na morfologia dos nódulos minerais formados pelos osteoblastos expostos ao MTA-F. No capítulo 2, células de folículo dental humanos (hDFCs) de dois terceiros molares inclusos indicados para exodontia por razões ortodônticas foram isoladas para avaliação da bioatividade e da biocompatibilidade do PC associado a diferentes agentes radiopacificadores em cultura primária de células. Os materiais estudados foram o cimento Portland branco (PC) e as associações de PC com: óxido de bismuto (CPBi), óxido de zircônio (CPZir) e tungstato de cálcio (CPCa). Além dos resultados de viabilidade celular e atividade de fosfatase alcalina, a biocompatibilidade do PC e das associações com agentes radiopacificadores foi analisada por imagens de microscopia eletrônica de varredura, que mostraram as hDFCs aderidas aos materiais. O capítulo 3 apresenta um estudo original de pesquisa básica, no qual foi avaliada... / The aim of this study was to analyze the biological responses to new endodontic materials based on Portland cement (PC) and the PC itself in cell culture systems. The study was divided into three chapters as follows: The first chapter describes a research in which the bioactivity and biocompatibility of two new commercially available sealers; MTA Fillapex (MTA-F, PC-based sealer, Angelus) and Ephiphany SE (EP-SE, resin-based sealer, SybronEndo); were evaluated in human osteoblast-like cells (Saos-2). The MTT results showed a significant cell death rate during the first hours of exposure to all test materials. After 7 days of exposure, MTA-F group showed a suitable increasing rate of cell viability. Interestingly, the images of scanning electron microscopy and the result of EDS (energy-dispersive X-ray spectroscopy) showed morphological differences in the mineralized nodules formed by osteoblasts exposed to MTA-F. In Chapter 2, human dental follicle cells (hDFCs) were isolated from two included third molars, which were extracted for orthodontic reasons. The hDFCs were suitable to assess the bioactivity and biocompatibility of PC associated with different radiopacifying agents in primary cell culture system. The materials tested were the white Portland cement (PC) and PC associations with radiopacifying agents: bismuth oxide (PCBi), zirconium oxide (PCZir) and calcium tungstate (PCCa). Besides the results of cell viability and alkaline phosphatase activity, the biocompatibility of the PC was corroborated by the images of scanning electron microscopy, which allowed us to visualize the hDFCs adhered to the material surfaces. Chapter 3 presents an original study of basic research, aimed to evaluate the hypothesis of the transcription factor NFATc1 activation in human osteoblast-like cells as a result of exposure to PC... 9Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-17Bitstream added on 2014-06-13T19:21:22Z : No. of bitstreams: 1 machado_mf_dr_botib.pdf: 3725562 bytes, checksum: d4f694ed133c9c007068eeeff7ba0042 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Fatores de crescimento fibroblástico (FGFs) regulam o desenvolvimento folicular e a maturação oocitária através de ligação aos seus receptores (FGFRs). Os RNAm que codificam o FGFR2c e o FGFR3c foram detectados em folículos antrais bovinos. Com o objetivo de identificar FGFs que poderiam regular a foliculogênese por meios desses, investigou-se os padrões de expressão do FGF16 e FGF20 em folículos antrais bovinos, bem como os níveis de RNAm desses FGFs e seus receptores (FGFR2c e FGFR3c) durante a maturação in vitro de complexos cumulus-oócito (COCs). Além disso, dados preliminares do nosso laboratório indicativos de que a expressão do FGF17 em oócitos é regulada ao longo da maturação oocitária motivaram a investigação da função dessa proteína na maturação de COCs in vitro. Sendo assim, avaliou-se o efeito do FGF17 na expansão do cumulus e no controle da transcrição de fatores EGF-like [ampiregulina (AREG), epiregulina (EREG) e betacelulina (BTC)] e outros genes reguladores da expansão [cicloxigenase 2 (COX2), hialurona sintase 2 (HAS 2), pentraxina 3 (PTX3), proteína indutora do fator de necrose tumoral 6 (TSG6)]. Os RNAm dos FGF16 e FGF20 e as respectivas proteínas foram detectados no ovário bovino. A abundância de RNAm de FGF16 e FGF20 foi maior em células da granulosa e da teca de folículos atrésicos comparados a folículos saudáveis ou transicionais. O tratamento com FSH diminuiu a abundância de RNAm para FGF16 e FGF20 e o IGF1 inibiu FGF16 em células da granulosa cultivadas in vitro. Ao longo da maturação a expressão do FGF16 e do FGF20 foi estável no oócito, enquanto que a expressão dos receptores FGFR2c e FGFR3c foi estimulada nas células do cumulus pelo FSH. A proteína FGF16 foi localizada no oócito, células do cumulus e da teca e o FGF20 em oócitos, células do cumulus, da granulosa e da teca. O FGF17 aumentou a proporção... / Fibroblast growth factors (FGFs) regulate follicular development and oocyte maturation. Messenger RNA encoding receptors FGFR3c and FGFR2c have been detected in bovine antral follicles. Aiming to identify FGFs that can potentially regulate folliculogenesis through these receptors, the expression patterns of FGF16 and FGF20 were assessed in bovine antral follicles. Messenger RNA expression of these FGFs and their receptors (FGFR2c and FGFR3c) was also assessed in oocytes and cumulus cells, respectively, during in vitro maturation. In addition, previous data suggesting that FGF17 mRNA expression is regulated in the oocyte led us to investigate the effects of FGF17 on cumulus expansion and on the expression of EGF-like factors [amphiregulin (AREG), epiregulin (EREG) and betacelullin (BTC)] and other genes that regulate expansion [cyclooxygenase 2 (COX2), hyaluronan synthase 2 (HAS 2), pentraxin 3 (PTX3), protein-inducing tumor necrosis factor 6 (TSG6)]. FGF16 and FGF20 mRNA and proteins were detected in the bovine ovary. Messenger RNA abundance of FGF16 and FGF20 was higher in granulosa and theca cells from atretic follicles compared with healthy or transitional follicles. Treatment with FSH decreased mRNA expression of FGF16 and FGF20 and IGF1 inhibited FGF16 mRNA abundance in cultured granulosa cells. During maturation, mRNA expression of FGF16 and FGF20 was stable in the oocyte, while FGFR2c and FGFR3c were stimulated in cumulus cells by FSH. FGF16 protein was localized to the oocyte, cumulus and theca cells, and FGF20 was detected in the oocyte, cumulus, granulosa and theca cells. Supplementation of maturation medium with FGF17 increased the proportion of fully expanded COCs, but did not alter mRNA expression of COX2, HAS2, PTX3, TSG6, AREG, EREG and BTC in cumulus cells during in vitro maturation. In conclusion, FGF17 enhances bovine cumulus expansion... (Complete abstract click electronic access below)

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-08-03T19:51:12Z No. of bitstreams: 1 2017_MartizaOcampoBetancur.pdf: 8305814 bytes, checksum: 5836c0b5d49fa976faaa55a8e11cd642 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-09-15T14:49:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_MartizaOcampoBetancur.pdf: 8305814 bytes, checksum: 5836c0b5d49fa976faaa55a8e11cd642 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-15T14:49:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_MartizaOcampoBetancur.pdf: 8305814 bytes, checksum: 5836c0b5d49fa976faaa55a8e11cd642 (MD5) Previous issue date: 2017-09-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / O aumento do número de cópias do gene heterólogo é uma das abordagens empregadas no melhoramento genético de Komagataella phaffii como sistema de expressão. O uso de marcas auxotróficas defectivas é uma estratégia para a obtenção de integrantes multicópia. Para garantir estabilidade mitótica, os cassetes de expressão são integrados no genoma por recombinação homóloga, portanto é necessário haver no vetor sequências genômicas que propiciem esses eventos de integração. O foco deste trabalho foi identificar sítios repetitivos no genoma de K. phaffii nunca antes testados como alvos de integração, em combinação com o uso da marca defectiva leu2-d, para aumentar a expressão heteróloga. Como alvos para integração múltipla foram avaliados os seguintes loci: rDNA 5S, região NTS do rDNA e regiões repetidas dos cromossomos 2 e 3. Um vetor contendo a marca leu2-d e o gene repórter EGFP (Enhanced Green FluorescentProtein) foi construído e foi usado como plataforma para clonar as diversas sequências repetidas. Todas as construções foram utilizadas para transformar K. phaffii M12 (leu2). A determinação do número de cópias integradas do cassete de expressão confirmou a obtenção de clones multicópia com todas as construções. Até 78 cópias do cassete contendo a sequência repetitiva do cromossomo 2 foram integradas. Todos os clones multicópiaapresentaram uma maior produção intracelular de GFP em comparação a um clone contendo uma única cópia do gene, chegando a se obter um aumento de 197 vezes com o clone contendo 78 cópias integradas do cassete. Para validar a estratégia apresentada neste estudo, foi testada a produção extracelular da proteína repórter α-amilase. Clones multicópia foram obtidos com as diferentes construções e até 43 cópias do cassete contendo a sequência repetitiva do cromossomo 2 foram integradas. A atividade amilolítica no sobrenadante confirmou a produção de amilase, que foi maior para os clones multicópia em comparação a um clone contendo uma cópia do gene, chegando a se obter um aumento de 4,6 vezes com o clone contendo 43 cópias integradas do cassete. A produção das duas proteínas avaliadas, demonstrou a possibilidade de obter clones multicópia que produzem uma maior quantidade da proteína recombinante. Contudo, foi observada perda de algumas cópias do cassete quando os clones transformantes foram crescidos em meio complexo, indicando baixa estabilidade genética na falta de pressão seletiva. Além disso, dependendo do local de integração, um alto número de cópias mostrou ter um efeito negativo no crescimento da levedura, porém, em nenhum dos casos a produção da proteína heteróloga diminuiu. / Increasing heterologous gene copy number is one of most commonly used strategies to improve Komagataellaphaffii as an expression system. The use of defective auxotrophic markers is an approach to obtain multicopy integrants. Expression cassettes must be integrated into the K. phaffii genome by homologous recombination to ensure mitotic stability. Therefore, it is necessary that the vector carries genomic sequences that will promote integration events. The aim of this work was to identify different sites for the integration of vectors carrying the auxotrophic defective marker leu2-d into the genome in order to increase the expression levels of heterologous genes in K. phaffii. The targets for integration studied were the following loci: 5S rDNA, NTS rDNA and repetitive regions of chromosomes 2 and 3. A vector carrying defective marker leu2-d and the EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein) reporter gene was constructed. This vector was used as platform to test repetitive sequences as targets for DNA integration. All constructions were used to transform K. phaffii M12 (leu2). Copy number determination confirmed the generation of multicopy clones with all the constructions. Up to 78 copies of the cassette containing the sequence of chromosome 2 were integrated. All multicopy clones showed more intracellular GFP production compared with a single-copy clone. A 197- fold increase of protein production was observed with the clone containing 78 copies of the cassette. To validate the strategy presented in this study, the expression of the reporter protein α- amylase was evaluated. Multicopy clones were obtained with the diverse constructions. Up to 43 copies of the cassette containing the sequence of chromosome 2 were integrated. Amylolytic activity in culture supernatants confirmed amylase production, which was higher for multicopy clones in comparison with a single-copy clone. A 4.6-fold increase of protein production was observed with the clone containing 43 copies of the cassette. Production of the two proteins tested showed the possibility to obtain multicopy clones which produce a larger quantity of the recombinant protein. Nevertheless, loss of some copies of the expression cassette was observed when transformants were grown in complex medium. This indicated low genetic stability in the absence of selective pressure. Moreover, depending of the integration locus higher copy number showed a negative effect in yeast growth. However, heterologous protein production was not decreased.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2010. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2015-10-07T12:05:17Z No. of bitstreams: 1 2010_FernandaPaulini.pdf: 3347183 bytes, checksum: 0e98600795c2662d94596a82b63bcf05 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-10-07T12:05:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_FernandaPaulini.pdf: 3347183 bytes, checksum: 0e98600795c2662d94596a82b63bcf05 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-07T12:05:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_FernandaPaulini.pdf: 3347183 bytes, checksum: 0e98600795c2662d94596a82b63bcf05 (MD5) / Os sistemas de cultivo de células da granulosa vêm se desenvolvendo com o intuito de assemelhar-se às condições esteroidogênicas encontradas in vivo no folículo ovariano. A remoção do ovócito resulta na luteinização espontânea das células somáticas foliculares, com alteração no padrão esteroidogênico, que também acontece quando estas células são colocadas em cultivo. Os fatores secretados pelo ovócito GDF9 e BMP15 possuem uma atuação importante, entretanto, ainda não totalmente esclarecida durante o processo de luteinização das células da granulosa. Com este trabalho objetivou-se expressar os genes GDF9 e BMP15 em cultivo de células da granulosa bovinas transgênicas e avaliar seus efeitos no processo de luteinização. Para a análise da luteinização, foram utilizados cultivo de células da granulosa transfectadas por lipossomos com vetores portando os genes GDF9 e BMP15, com coleta de meio e células obtidas diariamente durante 21 dias para dosagens de hormônios esteróides e análise da expressão gênica. Como marcador do processo de luteinização foi utilizado o gene StAR. A partir do mRNA das células foi possível verificar a expressão do GDF9, BMP15 e de seus respectivos receptores (ALK5, ALK6 e BMPRII). A análise da atividade esteroidogênica das células transgênicas demonstrou que a presença de GDF9 e BMP15 exerce inibição na produção do hormônio progesterona. O gene StAR, principal fator limitante da esteroidogênese, foi inibido após o pico de produção de progesterona, o que indicou uma provável atuação do GDF9 e BMP15 por meio desta via. Esse estudo aborda novas informações, que contribuem para o entendimento dos mecanismos moleculares e parácrinos pelos quais o ovócito é capaz de inibir a luteinização das células da granulosa, antes do início dos processos de maturação ovocitária e ovulação iniciados pelo pico de LH. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Granulosa cell culture is carried out to establish a similar steroidogenesis environment found in ovarian follicles. Somatic follicular cells spontaneously luteinize and modify their steroidogenesis activity when the oocyte is removed in the same away it happens in vivo. The GDF9 and BMP15 are oocyte secreted factors that have an important role on the luteinization of granulosa cells, but their effects are not totally understood. With the culture of transgenic bovine granulosa cells this work aimed to express the genes GDF9 and BMP15 and evaluate their effects on the luteinization process. Samples of cells and culture medium were obtained during 21 consecutive days to analyze the steroidogenic hormones concentration and gene expression. To confirm the expression of GDF9, BMP15 and their respective receptors (ALK5, ALK6 e BMPRII) the cDNA were amplified by PCR. The analysis of steroidogenic activity of transgenic cells demonstrated that the presence of GDF9 e BMP15 inhibits the production of progesterone and StAR gene expression. The StAR gene is the most limiting factor of steroidogenesis, and was used as a molecular marker of the luteinization process. This indicates that the inhibitory effect of GDF9 and BMP15 on the stereidogenesis use the StAR pathway. This study shed light in the molecular and paracrine mechanisms, by which the oocyte can inhibit the luteinization of granulosa cells before the induction of maturation and ovulation by the LH peak.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, 2015. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2015-10-08T20:46:08Z No. of bitstreams: 1 2015_FilipeSathlerMeira_Parcial.pdf: 525021 bytes, checksum: 2bc1cd17f89bb1f5d9a043e3565a1e0a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-10-08T20:47:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_FilipeSathlerMeira_Parcial.pdf: 525021 bytes, checksum: 2bc1cd17f89bb1f5d9a043e3565a1e0a (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-08T20:47:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_FilipeSathlerMeira_Parcial.pdf: 525021 bytes, checksum: 2bc1cd17f89bb1f5d9a043e3565a1e0a (MD5) / Este trabalho teve como objetivo induzir a embriogênese somática em macaúba a partir de tecidos foliares de plantas adultas, além de elucidar morfoanatomicamente as diferentes etapas envolvidas no processo. Foram utilizadas folhas jovens e não expandidas (palmito) de Acrocomia aculeata, provenientes de plantas adultas. Os explantes foram inoculados em meio de indução de calos, formado pelos sais e vitaminas do meio Y3, adicionado das auxinas 2,4-D e picloram na concentração de 450 µM, além da presença ou ausência de 20 µM de 2iP. Durante a indução, foi avaliada a influência da região do palmito utilizada na formação de calos. Assim, uma vez coletado e desinfestado, os palmitos (30 cm de comprimento) foram subdividido em regiões basal, mediana e apical, todas de igual tamanho (10 cm direção ápice meristemático para o ápice foliar), de onde foram excisados explantes de 1,0 cm2 que foram inoculados em meio de indução. As avaliações sobre a formação, assim como a coleta dos calos formados foram realizadas aos 6, 9 e 12 meses de cultivo. Após cada período de coleta, os calos foram multiplicados por até quatro subcultivos de 30 dias cada em meio de cultura Y3, com 450 µM de picloram, sendo avaliados quanto à taxa de multiplicação e incremento de massa fresca. Para a etapa de diferenciação dos calos embriogênicos em embriões somáticos, três ensaios foram realizados: o primeiro, em meio de cultura Y3 semissólido com de 2,4-D e picloram (0, 10, 20, 40, 80 e 120 µM). No segundo, utilizou-se meio de cultura Y3 líquido sob agitação com 2,4–D (0 ou 5 µM). Por fim, no terceiro avaliou-se a influência do tempo de permanência dos calos em meio líquido. Os embriões somáticos diferenciados foram germinados em meio de cultura Y3, desprovido de reguladores de crescimento. Em todas as etapas do processo embriogênico, a caracterização morfoanatômica das diferentes etapas envolvidas no processo foram realizadas. Verificou-se resultados significativamente superiores quanto à percentagem de formação de calos utilizando a auxina picloram com relação ao 2,4-D em todos as condições testadas. A adição de 2iP ao meio de indução não proporcionou melhoria na formação de calos. Independentemente da região do palmito, os melhores resultados para indução de calos foram observados aos 9 meses em cultivo, com 59,9% dos explantes formando calo. Quando somente a região do palmito foi avaliada, independentemente do tempo da coleta, a mais distal ao meristema foi a que proporcionou maior formação de calos (52,9%). De maneira geral, os tratamentos utilizados para a diferenciação de embriões somáticos dos calos embriogênicos não diferiram nas respostas obtidas, podendo ser considerado um processo lento e irregular, fato também observado durante a etapa de germinação dos embriões somáticos. Durante a avaliação da ontogenia dos calos, foi observado o desenvolvimento de células hipertrofiadas no explante aos 30 dias de cultivo dos explantes foliares em meio de indução. Aos 60 dias de cultivo foram verificados os primeiros sinais visíveis de divisão celular ativa e presença de células indiferenciadas no mesofilo foliar, progredindo até a formação de calos na região do feixe vascular aos 90 dias de cultivo. Os calos primários apresentaram constituição celular meristemática, com células de tamanho reduzido e com razão núcleo:citoplasma elevada. Na fase de multiplicação, observou-se a formação de calos com aspecto nodular amarelo, nodular esbranquiçado ou granular. A linhagem de calos nodulares amarelos apresentou as características anatômicas semelhantes à dos nodulares esbranquiçados, sendo constituído predominantemente por células meristemáticas. Ainda nessa fase, observou-se a formação de embriões somáticos, visualizados em estádio globular. Durante as análises histoquímicas, observou-se que o acúmulo de amido concentrou-se próximo aos centros de intensa divisão celular. No entanto, não foi observada a presença de amido nas linhagens de calos e embriões somáticos. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / This work aimed to induce somatic embryogenesis in macaw palm from leaf tissues of adult plants, besides elucidating morpho-anatomically the different stages involved in the process. Young and not expanded (heart of palm) leaves from adult plants of Acrocomia aculeata were used. The explants were cultured on callus induction medium, consisting of salts and vitamins of Y3 medium with 2,4-D and picloram at 450 µM, alone or in combination with 20 µM 2iP. During induction the influence of the heart of palm region used in the calluses formation was also evaluated. Thus, once collected and disinfected, the heart of palm (30 cm length) was divided in basal, middle and apical regions (explant position), all of equal size (10 cm toward apex meristem to the leaf apex), from where explants were excised in 1.0 cm2 and inoculated on callus induction medium. In order to evaluate calluses formation, the isolation and collection of calluses were performed after 6, 9 and 12 months of culture. After each collection period, the calluses were multiplied on Y3 medium supplemented with 450 µM picloram for up to four subcultures of 30 days each. At the end of each period, the multiplication rate and the callus fresh weight were determined. For somatic embryos differentiation, embryogenic calluses were cultured under three condition: Y3 semisolid culture medium with 2,4-D and Picloram (0, 10, 20, 40, 80 and 120 µM); Y3 liquid culture medium with 2,4-D (0 or 5 µM) under agitation; and finally, Y3 liquid medium were the influence of the calluses cultivation time was evaluated. Somatic embryos were regenerated on an Y3 culture medium devoid of growth regulators. During all embryogenic process, the morpho-anatomical characterization of different stages involved in the process was carried out. It was verified significant differences in calluses induction when picloram was used as auxin. The addition of 2iP not provided effects on callus formation. Independently of explant position (basal, middle or apical), the best results for callus induction was observed when explants were maintained for 9 months on culture medium, where 59.9% of explants presented callus formation. When only the explant position was evaluated, the most distal region of the meristem (apical region) proportioned higher callus formation (52.9%). In general, the treatments used for somatic embryos differentiation do not presented differences, suggesting that it is a slow and irregular process, a fact also observed during somatic embryos germination. Detailed morpho-anatomical analysis revealed the development of hypertrophied cells after 30 days of explants culture on callus induction medium. At 60 days the first visible signs of active cell division and the presence of undifferentiated cells were observed in leaf mesophyll, progressing to callus formation in the region of the vascular bundle at 90 days. The primary calluses showed meristematic cell constitution, characterized by small size and a high nucleoplasmic ratio. In the multiplication phase, it was observed the formation of calluses with aspect yellow nodular, whitish granular or nodular. In general, the lineages of yellow nodular calluses showed anatomical features similar to whitish nodular, consisting predominantly of meristematic cells. Still in this phase, it was observed the formation of somatic embryos in the globular stage. Histological analysis revealed starch accumulation near the centers of intense cell division, but not in the lineages of calluses and somatic embryos.