Submitted by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-06-01T20:02:08Z No. of bitstreams: 1 TESE Leslie Clifford Noronha Araújo.pdf: 1451824 bytes, checksum: fe84cfc90617851c91791c636966ada7 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-01T20:02:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE Leslie Clifford Noronha Araújo.pdf: 1451824 bytes, checksum: fe84cfc90617851c91791c636966ada7 (MD5) Previous issue date: 2016-07-19 / CNPQ / As neoplasias malignas urológicas mais prevalentes são o câncer de próstata, de bexiga e o de rim. Estas três neoplasias estão relacionadas a uma perda importante da qualidade de vida dos pacientes e possuem tratamentos agressivos. O diagnóstico de cada uma destas doenças é realizado, na maioria das vezes, de forma invasiva e possui complicações inerentes a cada procedimento. Neste sentido, a busca de métodos por diagnóstico não invasivos tem sido estudada, e a via metabonômica através da espectometria por ressonância nuclear magnética de hidrogênio (RNM 1H) fornece informações de vias metabólicas que podem diagnósticas patologias sem a necessidade de procedimentos invasivos. Os voluntários foram distribuídos em grupo controle (07 voluntários) composto de homens com idades entre 60 e 67 anos, grupo CP com voluntários portadores câncer de próstata (09 voluntários) com idades entre 61 e 69 anos, grupo CB com voluntários portadores câncer de bexiga (05 voluntários), sendo dois homens com idade de 70 e 76 anos e três mulheres com idades entre 57 e 75 anos e grupo CR com voluntários portadores câncer de rim (05 voluntários), sendo um homem com 35 anos e 4 mulheres com idade entre 54 e 64 anos. Uma amostra de 3ml de urina foi colhida de 26 voluntários para a elaboração do estudo piloto. Este material foi submetido à RNM 1H seguindo o protocolo do Departamento de Química Fundamental da UFPE com posterior geração de espectros. A estatística multivariada para a elaboração de modelos metabonômicos e a análise de comparação de grupos foi realizada. Esses modelos mostraram uma discreta separação entre o grupo controle e cada um dos três grupos de voluntários com patologias oncológicas. Para criação de modelos definitivos foi necessário agrupar os voluntários com câncer de bexiga e rim (CB/CR) devido ao pequeno número de amostras por grupo. O modelo metabonômico quando comparado ao grupo controle mostrou uma sensibilidade de 90,9%, especificidade de 100%, VPP de 100% e VPN de 85,7% para o grupo CB/CR e sensibilidade, especificidade, VPP e VPN de 100% para o grupo CP. Este estudo piloto demonstra que o método é simples, de fácil execução, não invasivo e com possibilidade de diagnóstico das patologias oncológicas com uma única coleta de urina. / The most prevalent urological malignancies are prostate cancer, bladder cancer and kidney cancer. The first one is the most common solid cancer in men and the others can affect men and women. These three malignancies are related to a significant loss of quality of life of patients and have aggressive treatments. The diagnosis of each of these diseases is conducted, in most cases, invasively and including all complications inherent to each procedure. In this sense the search for noninvasive diagnostic methods has been studied, and the metabonomics spectrometry method by nuclear magnetic resonance of hydrogen (1H NMR) provides pathways of diagnostic information that can identify pathologies without the need of invasive procedures. A sample of 3ml of urine was collected of 26 volunteers for the preparation of this pilot study. They were distributed in 4 groups. The control group (07 volunteers) comprised men aged 60 to 67 years, CP group of volunteers with prostate cancer (09 volunteers) aged 61 to 69, CB group included volunteers with bladder cancer (05 volunteers), two men aged 70 and 76 years and three women aged between 57 and 75 years and CR group of volunteers with kidney cancer (05 volunteers), one man of 35 years and four women aged between 54 and 64 years. This material was subjected to 1H MRI following the protocol of the Fundamental Chemistry Department of UFPE with generation of spectra. The multivariate statistics for the development of metabonomics models and comparison analysis groups was performed. These models showed a slight separation between the control group and each of the three groups of patients with oncological diseases. For the elaboration of the definitive models it was necessary to incorporate the volunteers of the CB and CR due to the small number of samples per group. The metabonomic method when compared to control group shown sensitivity of 90.9%, specificity of 100%, 100% PPV and NPV of 85.7% for the group CB/CR and sensitivity, specificity, PPV and NPV of 100% for the CP group. This pilot study demonstrates that the method is feasible with easy execution, showing simplicity besides being not invasive and allowing the diagnosis of oncological diseases with a single urine collection.

Orientador: Anita Jocelyne Marsaioli / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-13T13:31:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martins_LucasGelain_M.pdf: 1200827 bytes, checksum: 8708dd4e868d8749ef0f4a5d27b03248 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Técnicas de RMN de H foram aplicadas no estudo de metabolômica de Theobroma cacao e interações proteínas ¿ ligantes. Esses dois tópicos são reportados em dois capítulos. O primeiro descreve a análise quantitativa por RMN de H de 8 metabolitos de Theobroma cacao endógenos ou produzidos durante a fermentação de 10 diferentes variedades resistentes ao fungo Moniliophthora perniciosa. Os espectros foram obtidos de extratos aquosos saturando o sinal da água com pressaturação. Os metabólitos monitorados foram: glicose, sacarose, frutose, etanol, cafeínas e os ácidos acético, lático e succínico. O teor dos metabólitos presentes em 7 dessas variedades são similares àqueles de T. cacao comum e análise sensorial selecionou aquelas com maior teor de cafeína como as melhores. O segundo capítulo descreve as interações acetilcolinesterase/alcalóides de Amaryllidaceae e proteína de membrana bacteriana/fosfomicina, com os mapas de epitopo de interação dos ligantes com as macromoléculas determinados por RMN de H ¿ STD (Saturation Transfer Difference). O mapa de epitopo para acetilcolinesterase/fisostigmina foi confirmado por cálculos de ¿doking¿ molecular. A constante de dissociação aparente da fisostigmina com acetilcolinesterase foi obtida através das medidas de T1 seletivo. Interação entre células integras de Escherichia coli CCT 5050, Serratia liquefaciens CCT 7262 e fosfomicina indicaram que microrganismo resistente ao antibiótico (Serratia liquefaciens) não apresentaram sinais no experimento de RMN de H ¿ STD enquanto que o microrganismo não resistente (Escherichia coli) apresenta sinais no mesmo experimento. Esses resultados certamente contribuirão para a elucidação do mecanismo de ação da fosfomicina / Abstract: H NMR tecniques were applied to study Theobroma cacao metabolomics and protein-ligand supramolecular interactions. These two topics are reported in two chapters. First chapter describes the H NMR quantitative analysis of 8 Theobroma cacao secondary metabolites which are endogenous or produced during the fermentation process of 10 different varieties resistent to the Moniliophthora perniciosa fungus. The spectra were obtained from the aqueous extracts saturating the water signal with the PRESAT tecnique. The monitored metabolites were: glucose, sacharose, fructose, ethanol, cafeine and the acids acetic, latic and succinic. The abundance of the metabolites present in 7 of these varieties were similar to those in comon T. Cacao and sensory analysis selected those with high cafeine content as the best. The second chapter describes the supramolecular interactions of acetylcholisterase/Amaryllidaceae alkaloids and bacterial membrane protein /fosfomicine, with the epitope mapping of the interactions of the ligands to the macromolecules obtained by H NMR STD (saturation transfer difference). The epitope mapping of acetylcholisterase/Amaryllidaceae alkaloids was confirmed by molecular docking calculations. The apparent dissociation constant of the fisostigmine which is an acetylcholinesterase inhibitor was obtained by applying selective T1. Interactions of Escherichia coli CCT 5050, Serratia liquefaciens CCT 7262 whole cells and fosfomycin indicated that microorganisms resistent to this antibiotic (Serratia liquefaciens) did not show signal in the H NMR STD experiment while non resistent microorganism (Escherichia coli) showed signals in the same experiment. This data will certainly contribute to the elucidation of fosfomycin action mechanism / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

Orientador: Anita Jocelyne Marsaioli / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-21T04:07:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lopes_ThiagoInacioBarros_M.pdf: 3472847 bytes, checksum: 6ec44b5e5d2ad869887d1d1a884a0682 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A organização mundial de saúde (OMS) estima que existam atualmente mais de 1,5 bilhões de adultos com sobrepeso, número que é esperado dobrar até 2015. Obesidade e sobrepeso são enfermidades caracterizadas pelo acúmulo excessivo de gordura corporal e têm sido associadas a vários problemas de saúde. Vários fármacos têm sido utilizados no tratamento desta enfermidade, entre os mais utilizados se encontra o Orlistate, um inibidor de lipases gástricas utilizado na redução da absorção de gordura da dieta, auxiliando na perda e manutenção do peso. Esta dissertação teve como objetivo principal avaliar as alterações metabólicas sofridas por pacientes com sobrepeso tratados com Orlistate por 120 dias. Para tornar mais didático, o trabalho foi divido em duas Partes: Parte I, implementação da metodologia analítica para análise de ácidos graxos por CG-EM e avaliação do perfil de ácidos graxos em indivíduos com sobrepeso tratados com Orlistate; e Parte II, avaliação do perfil metabólico de plasma por RMN de ¹H de indivíduos com sobrepeso tratados com Orlistate. Na primeira etapa do trabalho, análise de componentes principais foi aplicada na seleção íons (m/z) para quantificação de ácidos graxos, após preparação de ésteres metílicos correspondentes, por CG-EM usando monitoramento de íons selecionados. Quatro íons foram então selecionados de forma a aumentar a detectividade sem perda completa de informação qualitativa. Os íons de m/z 74, 79, 81 e 87 foram selecionados e permitiram a quantificação de vários ácidos graxos, além da determinação do número de insaturações dos mesmos relacionando a abundância relativa dos íons à presença de insaturações. A metodologia analítica implementada permitiu quantificar ácidos graxos esterificados em vários lipídios presentes no sangue, após transesterificação para produção dos ésteres metílicos de ácidos graxos, com adequada precisão, repetitividade e baixos limites de detecção e quantificação. Na segunda etapa, a metodologia analítica foi aplicada no estudo do perfil de ácidos graxos de 20 mulheres com sobrepeso tratadas com Orlistate durante 120 dias. O tratamento não reduziu o índice de massa corpórea contribuiu para diminuição significativa dos níveis de colesterol-HDL no plasma e do conteúdo de colesterol na membrana de eritrócitos, além de alterar as proporções relativas de vários ácidos graxos essenciais e exógenos em vários lipídios estudados. Adicionalmente foi observado um perfil de ácido graxo significativamente diferente para os indivíduos magros (controles) em comparação com indivíduos com sobrepeso. Na última etapa, o perfil metabólico de plasma por RMN de ¹H foi estudado por uma abordagem metabolômica. A análise discriminatória por quadrados mínimos parciais (PLS-DA) revelou que alterações nos níveis de lactato e magnésio são importantes na diferenciação entre indivíduos com sobrepeso tratados e não-tratados com Orlistate, sinalizando diminuição destes metabólitos relacionada ao tratamento. Não há relatos anteriores da alteração dos níveis de lactato devido ao tratamento. Adicionalmente, os níveis de triacilglicerídios, alanina e lactato contribuíram significativamente na distinção entre indivíduos magros e com sobrepeso / Abstract: The World Health Organization (WHO) estimates that there are currently more than 1.5 billion overweight adults, a number that is expected to double until 2015. Obesity and overweight are diseases characterized by excessive accumulation of body fat and linked to various health problems. Several drugs have been used to treat such diseases. Orlistat is a gastric lipase inhibitor largely used to reduce the absorption of dietary fat, helping weight loss. Thus this thesis aimed at the metabolic variation of overweight subjects treated with Orlistat for 120 days. This work is divided into two parts: Part I, implementation of the analytical methodology for analysis of fatty acids by GC-MS and evaluation of the fatty acid profile in overweight subjects treated with Orlistat; and Part II, evaluation of the metabolic profile of plasma of overweight subjects treated with Orlistat using ¹H NMR. In the Part I of this work, principal component analysis was applied to selected ions (m/z) for determination of fatty acids, after preparation of the corresponding methyl esters, by GC-MS using selected ion monitoring. Four ions were selected. The ions of m/z 74, 79, 81 and 87 allowed the quantification of various fatty acids and determination of the number of double bounds in theo fatty acids through the relative abundance of these selected ions. The analytical methodology implemented permitted quantify esterifing fatty acids in various lipids in blood, after transesterification for production of methyl esters of fatty acids, with adequate accuracy, repeatability and low limits of detection and quantification. In the second step, the analytical methodology was applied to study the fatty acid profile of 20 overweight women treated with Orlistat for 120 days. Although there was no significant reduction in body mass index, the treatment contributed to significant reduction of HDL-cholesterol levels in plasma and the cholesterol content in erythrocyte membranes. The Orlistat also alters the relative proportions of various fatty acids in the several lipids studied. Additionally, a significantly different fatty acid profile was observed for lean subjects (controls) compared to overweight subjects. In Part II, the metabolic profile of plasma obtained by ¹H NMR was studied by a metabolomics approach. The partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) revealed changes in lactate and magnesium level, these metabolites were important to differentiating between overweight subjects treated and not-treated with Orlistat, suggesting that the level of these metabolites decreased with treatment. There are no previous reports of changes in lactate levels. Additionally, levels of triglycerides, alanine and lactate were highlighted by PLS-DA into distinguishing between lean and overweight individuals / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

A seleção de animais para consumo alimentar residual (RFI) está intrinsecamente associada com a diminuição do consumo matéria seca e é independente do ganho de peso corporal, selecionando animais de eficiência produtiva e econômica, além também de diminuir a emissão de gases de efeito estufa provinda do gado. Neste estudo, amostras de soro de 16 animais selecionados divergentemente para eficiência de alimentação foram coletadas antes do confinamento (dia -21) e avaliadas em uma abordagem metabolômica global, com o objetivo de usar análise diferencial, análise de co-expressão e enriquecimento funcional, identificando marcadores para eficiência de alimentação antes do confinamento. Um analito foi diferencialmente presente entre os animais de baixo e alto RFI. A análise WGCNA identificou 22 e 25 módulos no modo positivo e negativo, respectivamente e, 1 módulo de cada modo foi fortemente associado a RFI (r = 0,53, p-valor <0,05 e r = 0,52, p-valor <0,1 nos modos negativo e positivo, respectivamente). A análise de enriquecimento funcional predize 13 processos biológicos associados à eficiência alimentar, incluindo alterações no metabolismo de vitaminas lipossolúveis, inflamação, estresse oxidativo, metabolismo de aminoácidos e metabolismo de ácidos graxos. Esse trabalho evidencia a possibilidade de se identificar um biomarcador para eficiência alimentar e também sugerem que as diferenças nas respostas ao estresse oxidativo e nos processos inflamatórios já influenciam na variação da eficiência alimentar previamente ao confinamento. / Animal selection for residual feed intake (RFI) is intrinsically associated with decreased consumption of dry matter independent of body weight gain, selecting yielding increased production and economic efficiency but also decreasing the greenhouse gas emission of livestock. In this study, serum samples of 16 animals selected for divergent feed efficiency were collected prior to feedlot (day -21) and evaluated in an untargeted metabolomics approach, with the goal of using differential analysis, co-expression analysis and functional enrichment to identifier markers for feed efficiency prior to the feedlot. One feature was differentially accumulated between low and high RFI. WGCNA analysis identified 22 and 25 modules in positive and negative mode, respectively, of 1 module of each mode was strongly associated with RFI (r= 0.53, p-value <0.05 and r=0.52, p-value < 0.1 to negative and positive mode, respectively). Pathway enrichment analysis yielded 13 biological processes associated with feed efficiency including alterations in vitamins liposoluble metabolism, inflammation, oxidative stress, amino acid metabolism and fatty acid metabolism. Our findings suggest the possibility to identify a biomarker for feed efficiency and also discuss that differences in oxidative stress responses and inflammatory processes could explain the feed efficiency variation prior to feedlot.

O etanol possui grande importância estratégica para o setor energético brasileiro devido a sua natureza renovável e grande capacidade de geração de emprego e renda. Atualmente um dos principais desafios enfrentados pelas indústrias brasileiras de produção de etanol é a presença de bactérias contaminando as fermentações. Essas atuam modificando o sistema, competindo por nutrientes essenciais, produzindo compostos tóxicos para a levedura e induzindo processos indesejáveis para a indústria como a floculação. Para equilibrar as populações e controlar os efeitos negativos é necessário uma melhor compreensão dos mecanismos genéticos e fisiológicos envolvidos nas interações de bactérias e leveduras em fermentações em fermentações etanólicas de primeira geração (1G). Neste sentido o presente trabalho realizou o sequenciamento, montagem e anotação completa dos genomas de três linhagens bacterianas isoladas diretamente de usinas brasileiras de produção de etanol: Lactobacillus sp. I-2, Lactobacillus sp. L-10 e Acetobacter sp. A-3. Além disso, foram feitas simulações da condição de co-existência entre bactérias lácticas e Acéticas com as leveduras de S. cerevisiae em fermentações semi-industriais em batelada alimentada (\"Melle-Boinot\") com tratamento ácido e reciclo de células. Três condições experimentais foram avaliadas: (i) fermentações contendo apenas leveduras de S. cerevisiae CAT-1, (ii) fermentações contendo leveduras de S. cerevisiae CAT-1 e bactérias de Lactobacillus sp. I-2, e (iii) fermentações contendo leveduras de S. cerevisiae CAT-1 e bactérias de Acetobacter sp. A-3. Por fim, os metabolomas das bactérias e leveduras da condição de coexistência nos ensaios fermentativos foram obtidos por metodologias de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (GC-MS). Foram identificados 3056, 2112 e 3557 genes nos genomas de Lactobacillus sp. L-10, Lactobacillus sp. I-2 e Acetobacter sp. A-3, respectivamente. As leveduras de S. cerevisiae, independente da condição experimental avaliada, consumiram totalmente os açúcares redutores totais (ART) presentes no melaço de cana-de-açúcar ao longo das fermentações em batelada alimentada. A glicina, aminoácido polar contendo apenas um hidrogênio na cadeia lateral, apresentou maior abundância durante as fermentações contaminadas com bactérias lácticas e acéticas em detrimento da condição controle sem contaminação bacteriana. Especula-se que o acúmulo intracelular deste aminoácido seja resultado do desvio de intermediários das vias Glicólise e Ciclo do Ácido Cítrico para a produção de compostos nitrogenados. Provavelmente, ambos os microrganismos, bactérias e leveduras, acumularam glicina no ambiente intracelular como alternativa a deficiência de nitrogênio no melaço de cana-de-açúcar. O sequenciamento dos genomas das bactérias e os ensaios fermentativos em biorreatores foram realizados no Laboratório Nacional de Biorrenováveis (LNBR) do Centro Nacional de Pesquisas em Energias e Materiais (CNPEM). As análises de metabolômica foram realizadas no Laboratório Max Feffer de Genética de Plantas da Escola Superior de Agricultura \"Luiz de Queiroz\" (ESALQ). Espera-se que os resultados apresentados neste trabalho agreguem mais informações a cerca das interações entre bactérias e leveduras e contribua, num futuro próximo, no apontamento de novas estratégias de controle bacteriano que sejam mais eficientes e sustentáveis que as usadas atualmente em fermentações industriais brasileiras. / Ethanol has great strategic importance for the Brazilian energy sector due to its renewable nature and great capacity to generate jobs and income. Currently, one of the main challenges faced by the Brazilian ethanol industry is the presence of contaminating bacteria in the fermentation tanks. They act by modifying the system, competing for essential nutrients, producing toxic compounds to the yeast and inducing undesirable processes for the industry like flocculation. To better balance populations and to control the negative effects, it is necessary a better understanding of the genetic and physiological mechanisms involved in the interactions among bacteria and yeasts from Saccharomyces cerevisiae. In this sense, the present work carried out the sequencing, assembly and complete genome annotation of three bacterial strains isolated directly from Brazilian ethanol production plants: Lactobacillus sp. I-2, Lactobacillus sp. L-10 and Acetobacter sp. A-3. In addition, simulations of the co-existence condition between lactic and acetic bacteria with yeasts from S. cerevisiae were carried out in semi-industrial fed-batch (Melle-Boinot) fermentations with acid treatment and cell recycling. Three experimental conditions were evaluated: (i) fermentations containing only yeasts from S. cerevisiae CAT-1, (ii) fermentations containing yeasts of S. cerevisiae CAT-1 and bacteria from Lactobacillus sp. I-2, and (iii) fermentations containing yeasts from S. cerevisiae CAT-1 and bacteria from Acetobacter sp. A-3. Finally, the metabolomes of bacteria and yeasts in the coexistence condition on fermentation assays were obtained by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS). 3056, 2112 and 3557 genes were identified in the genomes of Lactobacillus sp. I-2, Lactobacillus sp. L-10 and Acetobacter sp. A-3, respectively. The yeasts from S. cerevisiae, regardless of the experimental condition evaluated, all the total reducing sugars (ART) present in sugarcane molasses were consumed and the ethanol production was consistent with that observed in first generation (1G) ethanolic fermentations. Glycine, an apolar amino acid containing only one hydrogen in the lateral chain, showed greater abundance during fermentations contaminated with lactic and acetic bacteria. It is speculated that the intracellular accumulation of this amino acid results from the shift of intermediates from the Glycolysis/Glycogenogenesis and the Citric Acid Cycle pathways to the production of nitrogen compounds. Probably, both microorganisms, bacteria and yeasts, used the intracellular accumulation of glycine as an alternative to nitrogen deficiency in sugarcane molasses in the fermentations carried out in bioreactors. The Bacterial genomes sequencing and fermentation assays in bioreactors were performed at the Brazilian Bioethanol Science and Technology Laboratory (CTBE) of the Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM). The metabolomics analyzes were performed at the Max Feffer Laboratory of Plant Genetics at the \"Luiz de Queiroz\" School of Agriculture (ESALQ). It is hoped that the results presented in this work will add more information about the interactions among bacteria and yeasts and will contribute, in the near future, to new bacterial control strategies in Brazilian industrial fermentations that are more efficient and sustainable than those currently used.

Orientador: Maysa Furlan / Banca: Angela Regina Araujo / Banca: Hosana Maria Debonsi / Resumo: As espécies das famílias Celastraceae mostram o acúmulo de substâncias de interesse biológico, com destaque para a friedelina, com potentes efeitos anti-inflamatórios, analgésicos e gastroprotetores, e os triterpenos quinonametídeos, promissores agentes antitumorais. Entretanto, para que sejam utilizados como fármacos, novas metodologias e/ou técnicas para obtenção dos mesmos em larga escala se fazem necessárias. Nesse contexto, um sistema heterólogo composto pela levedura Saccharomyces cerevisiae, foi modificado geneticamente com a inserção de plasmídeos (vetores) contendo genes oriundos de Maytenus ilicifolia que codificam a enzima friedelina sintase, a qual leva a produção de friedelina. A introdução dos genes heterólogos pode perturbar as vias metabólicas do sistema heterólogo e, além do metabólito alvo, outras classes e/ou substâncias de interesse biológico e/ou comercial podem ser produzidas. Para tanto, as leveduras foram cultivadas em meio sintético completo (0,67% de base para levedura nitrogenada sem adição de aminoácidos e 2% de glicose), suplementado com aminoácidos, bases e ácido p-aminobenzóico, sem adição de uracila. Para os estudos de variabilidade metabólica, análises por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas foram realizadas utilizando os extratos etanólicos, clorofórmicos e hexânicos obtidos do sistema heterólogo com e sem modificação genética. Com o auxílio de técnicas metabolômicas foi possível a identificação de uma variedade de substâ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The species of the Celastraceae family shows the accumulation some compounds of biological interest, with emphasis on friedelin, with potent anti-inflammatory, analgesic and gastroprotective effects, as well as quinonemethide triterpenes, promising antitumor agents. However, in order to be used as drugs, new methodologies and / or techniques for obtaining them in large scale are necessary. In this way, a heterologous system of Saccharomyces cerevisiaeyeast was genetically modified with the insertion of plasmids (vectors) containing genes from Maytenus ilicifoliathat encode the enzyme friedelin synthase, looking for the production of friedelin by metabolic engineering. The introduction of the heterologous genes may disrupt the metabolic pathways of the heterologous system and, in addition to the target metabolite, other classes and / or compounds of biological and / or commercial interest may be produced. For this, yeasts were grown in complete synthetic medium (0.67% yeastnitrogen basewithout addition of amino acids and 2% glucose), supplemented with amino acids, bases and p-aminobenzoic acid, without addition of uracil. For metabolic variability studies, gas chromatographic analysis coupled with mass spectrometry were performed using ethanolic, chloroform and hexane extracts, obtained from the heterologous system with and without genetic modification. With the aid of metabolomic techniques it was possible to identify avariety of substances including various fatty acids and derivatives from 1to 5, as well as amides, such as (Z)-9-ocatadecenamide (7), terpenoid precursors such as squalene (8) and 2,3-oxidosesqualene (10), the triterpenes; friedelin (21) and lupeol (15), and alsosteroids ergosterol (14) and lanosterol (19). Due to perturbations in metabolic pathway of mevalonate, different substances were also observed, both in yeasts with the empty vector, plasmid considered as control... / Mestre

This thesis presents a more in-depth understanding of the interaction between the pathogenic fungus Sporisorium scitamineum and sugarcane, a disease known as \"cane smut\". The development of a long structure like a \"whip\" from the meristem of infected plants is the main characteristic of the disease, allowing the effective dispersion of teliospores in the field. Infected plants have a reduced sucrose content and juice quality, leading to considerable economic losses. In the first chapter, the gene expression profile of the pathogen during its development in planta - in the first moments of infection and after the emission of the whip - and in vitro was evaluated using the RNAseq technique. Were analyzed genes preferentially expressed in each condition, differentially expressed in comparison to its growth in vitro, and expressed only during interaction. The results allowed the identification of some potential pathogenicity mechanisms, active effectors and gene clusters expressed only during interaction. In the second chapter, the transient expression technique was used to determine the target cell compartment of some of the candidate effectors and to establish a viable protocol for the study of S. scitamineum proteins. The four putatively secreted genes most expressed during the initial moments of the interaction were fused to the gene encoding the fluorescent green protein (Citrine) and expressed in Nicotiana benthamiana. The results of confocal microscopy and westernblots indicated an accumulation of each candidate protein in the membrane, cytosol and/or nucleus, in addition to the occurrence of post-translational modifications. These data offer new study opportunities for the identification of plant proteins that interact with such effectors. In the third chapter, the transcriptional responses of sugarcane in the first moments of a compatible interaction and after the development of the whip were analyzed using again the data obtained from the dual RNAseq cane-smut. Among the main responses, was identified an increase in MADS-type transcription factors expression, indicating that the whip development may use a route similar to flowering, whose signaling seems to start as early as the colonization. In addition, whip development is accompanied by increased transcription of genes involved in energetic pathways, and hormones synthesis and signaling pathways. Genes encoding RGAs were differentially expressed and may be related to pathogen effector\'s recognition. In the fourth chapter, the metabolic profile of sugarcane was evaluated during disease progression, confirming that in the meristem of infected plants carbon allocation is channeled to energetic pathways, besides the regulation of several amino acids and changes in plant cell composition in response to whip development. Metabolomics approach also allowed the identification of a probable mycotoxin derived from S. scitamineum. The results obtained in this study contributed to increase the understanding of the interaction between S. scitamineum and sugarcane that is characterized by high complexity and specialization to the host, and can be used in a way to help the characterization of resistant varieties and contribute to the improvement of sugarcane with resistance to smut. / Esta tese apresenta uma compreensão mais aprofundada da interação entre o fungo patogênico Sporisorium scitamineum e a cana-de-açúcar, doença conhecida como \"carvão da cana\". O desenvolvimento de uma longa estrutura similar a um \"chicote\" a partir do meristema de plantas infectadas é a principal característica da doença, permitindo a efetiva dispersão dos teliósporos no campo. As plantas doentes apresentam um teor reduzido de sacarose e qualidade do sumo, levando a perdas econômicas consideráveis. No primeiro capítulo, o perfil de expressão gênica do patógeno durante o seu desenvolvimento in planta - nos primeiros momentos da infecção e após a emissão do chicote - e in vitro foi avaliado utilizando a técnica RNA-Seq. Foram analisados os genes preferencialmente expressos em cada condição, diferencialmente expressos em relação ao crescimento em meio de cultura, ou expressos apenas durante a interação. Os resultados permitiram a elaboração de hipóteses sobre os mecanismos de patogenicidade, sobre os genes candidatos a efetores ativos e a identificação de agrupamentos de genes expressos apenas durante a interação. No segundo capítulo, para determinar o compartimento celular alvo de alguns dos efetores candidatos e estabelecer um protocolo viável para o estudo de proteínas de S. scitamineum foi utilizada a técnica de expressão transiente. Os quatro genes mais expressos durante os momentos iniciais da interação que fazem parte do secretoma do fungo foram fusionados ao gene que codifica a proteína verde fluorescente (Citrina) e expressos em Nicotiana benthamiana. Os resultados de microscopia confocal e westernblots indicaram um acúmulo de cada uma das proteínas candidatas na membrana, citosol e/ou núcleo, além da ocorrência de modificações pós-traducionais. Esses dados oferecem novas oportunidades de estudo para a identificação de proteínas vegetais que interagem com tais efetores. No terceiro capítulo, as respostas transcricionais da cana-de-açúcar nos primeiros momentos de uma interação compatível e após o desenvolvimento do chicote foram analisadas utilizando novamente os dados obtidos a partir do dual RNAseq cana-carvão. Entre as principais respostas da cana destacou-se um aumento da expressão de genes que codificam fatores de transcrição do tipo MADS, indicando que o desenvolvimento do chicote pode usar uma rota semelhante à do florescimento, cuja sinalização parece iniciar logo nos primeiros momentos de colonização. Além disso, o desenvolvimento do chicote é acompanhado pelo aumento da transcrição de genes envolvidos em vias energéticas, e vias de síntese e sinalização hormonal. Genes que codificam para RGAs foram diferencialmente expressos e podem estar relacionados ao reconhecimento de efetores. No quarto capítulo, foi avaliado o perfil metabólico da cana-de-açúcar durante a progressão da doença, confirmando que no meristema de plantas infectadas ocorre um aumento da alocação de carbono em vias energéticas, além da regulação de vários aminoácidos e mudanças em relação à composição da parede celular em resposta ao desenvolvimento do chicote. A abordagem metabólica também permitiu a identificação de uma provável micotoxina derivada de S. scitamineum. Os resultados obtidos neste estudo contribuíram para aumentar a compreensão da interação entre S. scitamineum e a cana-de-açúcar que se caracteriza pela alta complexidade e especialização ao hospedeiro, e poderão ser utilizados de forma a auxiliar a caracterização de variedades resistentes e contribuir para o melhoramento da cana-de-açúcar com resistência ao carvão.

Orientador: Ian Castro-Gamboa / Coorientador: Rafael Teixeira Freire / Banca: Alberto José Cavalheiro / Banca: Letícia Veras Costa Lotufo / Banca: Alberto Colnago / Banca: Cristiano Soleo de Funari / Resumo: A descoberta de novos alvos farmacêuticos derivados de fontes naturais vem diminuindo ao longo das últimas décadas, impulsionando o uso de matrizes naturais novas e incomuns para a busca de metabólitos secundários bioativos. Dentre essas, a microbiota de plantas e os microrganismos marinhos demonstraram um grande potencial para fornecer novos metabólitos biologicamente ativos, produzindo uma alta diversidade de estruturas químicas encontradas em populações microbianas extensas e pouco exploradas. Convencionalmente, a triagem de metabólitos microbianos é realizada em monoculturas, na ausência de interações bióticas e abióticas. No entanto, a falta dessas interações encontradas na natureza limita a diversidade química que pode ser obtida por uma única cepa, permanecendo silenciadas diversos outros genes que codificam novos metabólitos secundários. Durante a última década, vários métodos têm sido desenvolvidos para compreender as condições sob as quais os genes cripticos são ativados. Dentre elas, as estratégias pós-genômicas revelaram um amplo potencial para o aumento da diversidade química, modificando diferentes níveis da maquinaria celular para uma regulação holística do metaboloma microbiano. Estas estratégias incluem co-cultivo, alimentação por metabólitos e One Strain Many Compounds (OSMAC) e têm sido utilizados com sucesso como uma alternativa rápida e barata para a indução de novos metabólitos. Apesar da eficácia das estratégias pós-genômicas na expansão do metaboloma m... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The discovery of new drug leads from natural sources has decreased over the last decades, emerging the use of new and uncommon matrices for the screening of bioactive secondary metabolites. Among those, the plant microbiota and marine microorganisms have demonstrated a great potential to provide new pharmaceutical leads, producing a high diversity of chemical structures encountered in little-explored and extensive microbial population. Conventionally, microbial metabolite screening is performed in monocultures, in the absence of biotic and abiotic interactions. However, the lack of these communications commonly found in nature seriously limit the chemical diversity that can be obtained by one single strain, remaining silenced many other genes encoded for new secondary metabolites. Over the last decade, several methods have been developed aiming to understand the conditions under which biosynthetic cryptic genes are activated. Among those, the post genomic strategies have revealed widespread potential for the enhancement of chemical diversity, modifying different levels of the cellular machinery for a comprehensive regulation of the microbial metabolome. These strategies include co-cultivation, biotransformation and One Strain Many Compounds (OSMAC) and have been successfully used as a fast and inexpensive alternative for the induction of new bioactive compounds. Notwithstanding these strategies for the expansion of the microbial metabolome, in the screening of these complex m... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

O gênero Baccharis compreende de 433 espécies, as quais estão distribuídas por todo o continente americano, tendo como hábito ervas perenes, lianas, subarbustos e pequenas árvores. A grande quantidade de espécies e a imensa variabilidade tem dificultado os pesquisadores na circunscrição taxonômica do gênero, sendo que recentemente uma nova classificação foi proposta com base em morfologia e dados moleculares. Sabe-se que dados químicos oriundos de substâncias do metabolismo secundário podem auxiliar, corroborar ou sugerir alterações na taxonomia, sendo que a metabolômica é uma ferramenta poderosa para a coleta destes dados. Dessa forma, os estudos de metabolômica não direcionada do gênero Baccharis objetivaram: determinar um método de extração eficiente e único para 306 espécimes (211 espécies distintas); realizar um estudo quimiotaxônomico para o gênero a partir de dados de LC-MS e análise multivariada; realizar triagem de espécies com potencial anti-inflamatório a partir de modelos de predição utilizando espécies de outros gêneros de Asteraceae. Os resultados dos estudos de extração mostraram que ambos os solventes etanol ou metanol em solução aquosa propiciaram uma extração eficiente de metabólitos em banho de ultrassom >= 10 min. A extração pode ser realizada na faixa de 48,3-85,8% de etanol ou acima de 67% de metanol acidificado com ácido fórmico na faixa de 0,12-0,27%. Os resultados do estudo quimiotaxônomico empregando dados de LC-MS e análise multivariada mostraram uma forte similaridade com a recente classificação taxonômica baseada em morfologia e dados moleculares. Na classificação quimiotaxônomica, 10 grupos principais foram observados, formados quase que exclusivamente por seções de subgêneros: quatro grupos formados por espécies do subgênero Baccharis, três grupos formados principalmente por espécies do subgênero Molina, dois grupos formados principalmente por espécies do subgênero Tarchonanthoides e um grupo formado por espécies do subgênero Coridifolia. Substâncias como flavonoides e diterpenos foram determinadas como discriminantes dos grupos formados. Os resultados da triagem de espécies com potencial anti-inflamatório mostraram que a partir de um bom modelo de predição obtido por OPLS-DA, com coeficientes R2X = 0,27, R2Y = 0,987 e Q2 = 0,83, foi possível predizer 30 espécies de Baccharis capazes de promover a dupla inibição das enzimas 5-LOX e COX-1 e que as substâncias correlacionadas a esta inibição são da classe dos flavonoides e fenilpropanoides. Portanto, o uso de dados de LC-MS com abordagem metabolômica não direcionada foi capaz de gerar descobertas importantes tanto para a quimiotaxonomia do gênero Baccharis, quanto na triagem de espécies com potencial anti-inflamatório. Essas descobertas poderão auxiliar tanto os taxonomistas quanto os estudos bioguiados na descoberta de novos fármacos / The genus Baccharis comprises 433 species which are widespread throughout the American continent and their habit consists of perennial herbs, lianas, sub-shrubs and small trees. The great amount of species and the enormous variability have made difficult the taxonomic circumscription of the genus. Recently, a new classification has been proposed based on morphological and molecular data. It is known that chemical data from compound of the secondary metabolism can help to corroborate or suggest alterations in the taxonomy of plants. Thus, the untargeted metabolomic studies of the genus Baccharis aimed to: determine an efficient and unique extraction method for 306 specimens (211 distinct species); to carry out a chemotaxonomic study for the genus from LC-MS data and multivariate analysis; to screen species with anti-inflammatory potential from prediction models using species from other genera of Asteraceae. The extraction results showed that both solvents ethanol or methanol in aqueous solution provided an efficient extraction of metabolites in ultrasonic bath >= 10 min. The extraction can be carried out in the range of 48.3-85.8% ethanol or above 67% in methanol acidified with formic acid in the range of 0.12-0.27%. The results of the chemotaxonomic study using LC-MS and multivariate analysis showed a strong similarity with the recent taxonomic classification based on morphology and molecular data. In the chemotaxonomic classification, 10 main groups were observed, which are formed almost exclusively by sections of the following subgenera: four groups formed by species of the subgenus Baccharis, three groups formed mainly by species of the subgenus Molina, two groups formed mainly by species of the subgenus Tarchonanthoides and one group formed by species of the subgenus Coridifolia. Substances such as flavonoids and diterpenes were determined as discriminants of the groups formed. The results of the screening of species with anti-inflammatory potential showed that from a good prediction model made by OPLS-DA with coefficients R2X = 0.27, R2Y = 0.987 and Q2 = 0.83 it was possible to predict 30 species of Baccharis able of promoting double inhibition of the 5-LOX and COX-1 enzymes and that the substances correlated to this inhibition are from the flavonoids and phenylpropanoids classes. Therefore, the use of LC-MS chemical data using a non-targeted metabolomic approach generated important discoveries both to the chemotaxonomy of the genus Baccharis and also for the screening of species with anti-inflammatory potential. These findings can help both taxonomists and bioguided studies for the discovery of new drugs

A metabolômica é uma ciência emergente na era pós-genômica que almeja a análise abrangente de pequenas moléculas orgânicas em sistemas biológicos. Técnicas de cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS) figuram como as abordagens de amostragem mais difundidas. A extração e detecção simultânea de metabólitos por LC-MS produz conjuntos de dados complexos que requerem uma série de etapas de pré-processamento para que a informação possa ser extraída com eficiência e precisão. Para que as abordagens de perfil metabólico não direcionado possam ser efetivamente relacionadas às alterações de interesse no metabolismo, é estritamente necessário que os metabólitos amostrados sejam anotados com confiabilidade e que a sua inter-relação seja interpretada sob a pressuposição de uma amostra conectada do metabolismo. Diante do desafio apresentado, a presente tese teve por objetivo desenvolver um arcabouço de software, que tem como componente central um método probabilístico de anotação de metabólitos que permite a incorporação de fontes independentes de informações espectrais e conhecimento prévio acerca do metabolismo. Após a classificação probabilística, um novo método para representar a distribuição de probabilidades a posteriori em forma de grafo foi proposto. Uma biblioteca de métodos para o ambiente R, denominada ProbMetab (Probilistic Metabolomics), foi criada e disponibilizada de forma aberta e gratuita. Utilizando o software ProbMetab para analisar um conjunto de dados benchmark com identidades dos compostos conhecidas de antemão, demonstramos que até 90% das identidades corretas dos metabólitos estão presentes entre as três maiores probabilidades. Portanto, pode-se enfatizar a eficiência da disponibilização da distribuição de probabilidades a posteriori em lugar da classificação simplista usualmente adotada na área de metabolômica, em que se usa apenas o candidato de maior probabilidade. Numa aplicação à dados reais, mudanças em uma via metabólica reconhecidamente relacionada a estresses abióticos em plantas (Biossíntese de Flavona e Flavonol) foram automaticamente detectadas em dados de cana-de-açúcar, demonstrando a importância de uma visualização centrada na distribuição a posteriori da rede de anotações dos metabólitos. / Metabolomics is an emerging science field in the post-genomic era, which aims at a comprehensive analysis of small organic molecules in biological systems. Techniques of liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS) figure as the most widespread approaches to metabolomics studies. The metabolite detection by LC-MS produces complex data sets, that require a series of preprocessing steps to ensure that the information can be extracted efficiently and accurately. In order to be effectively related to alterations in the metabolism of interest, is absolutely necessary that the metabolites sampled by untargeted metabolic profiling approaches are annotated with reliability and that their relationship are interpreted under the assumption of a connected metabolism sample. Faced with the presented challenge, this thesis developed a software framework, which has as its central component a probabilistic method for metabolite annotation that allows the incorporation of independent sources of spectral information and prior knowledge about metabolism. After the probabilistic classification, a new method to represent the a posteriori probability distribution in the form of a graph has been proposed. A library of methods for R environment, called ProbMetab (Probilistic Metabolomics), was created and made available as an open source software. Using the ProbMetab software to analyze a set of benchmark data with compound identities known beforehand, we demonstrated that up to 90% of the correct metabolite identities were present among the top-three higher probabilities, emphasizing the efficiency of a posteriori probability distribution display, in place of a simplistic classification with only the most probable candidate, usually adopted in the field of metabolomics. In an application to real data, changes in a known metabolic pathway related to abiotic stresses in plants (Biosynthesis of Flavone and Flavonol) were automatically detected on sugar cane data, demonstrating the importance of a view centered on the posterior distribution of metabolite annotation network.