Orientador: Ana Marisa Fusco Almeida / Coorientador: Paulo César Gomes / Banca: Maria Lúcia Taylor / Banca: Mário Sérgio Palma / Banca: Guilherme Targino Valente / Banca: Daniel Guariz Pinheiro / Resumo: Histoplasma capsulatum variedade capsulatum é um patógeno fúngico dimórfico causador de uma importante micose sistêmica, denominada histoplasmose. A patogenia da histoplasmose ocorre como resultado da inalação dos microconídios da fase miceliar, que afetam primariamente os pulmões onde ocorre a diferenciação em leveduras, que posteriormente, induzem uma infecção pulmonar e disseminação para outros órgãos, particularmente em indivíduos imunocomprometidos. Recentemente, foi estabelecida uma correlação entre o modo de infecção de H. capsulatum e a formação de biofilmes, estruturas caracterizadas como redes tridimensionais complexas que induzem, entre outros, a resistência antifúngica. Por esta razão, é emergente a identificação de um novo alvo e/ou biomarcador que possa ser selecionado, a fim de estabelecer um novo regime terapêutico e/ou ferramenta diagnóstica para a histoplasmose. Com base nisto, este trabalho tem como objetivo analisar a regulação transcricional codificante e metabólica diferencial entre as duas formas de crescimento de H. capsulatum, em biofilmes e em crescimento planctônico, bem como determinar o perfil de microRNAs (miRNAs) aberrantes em células hospedeiras em resposta à infecção com leveduras livres e biofilmes. O sequenciamento completo das regiões transcritas foi realizado utilizando a plataforma HiSeq da Illumina e a investigação do padrão de miRNAs em macrófagos (Mø) hospedeiros infectados foi conduzida empregando uma técnica de RT-qPCR (reverse trans... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Histoplasma capsulatum variety capsulatum is a dimorphic fungal pathogen that causes an important systemic mycosis, called histoplasmosis. The pathogenesis of histoplasmosis occurs as a result of the inhalation of mycelial microconidia, which primarily affect the lungs where differentiation occurs in yeast, which subsequently induce pulmonary infection and dissemination to other organs, particularly in immunocompromised individuals. Recently, a correlation was established between the mode of infection of H. capsulatum and the formation of biofilms, structures characterized as complex three-dimensional networks that induce, among others, antifungal resistance. For this reason, it is emerging the identification of a new target that can be selected in order to establish a new therapeutic strategy for histoplasmosis. Based on this, this work aims to analyze the differential transcriptional and coding transcriptional regulation between the two forms of growth of H. capsulatum in biofilms and planktonic growth, as well as to determine the profile of aberrant microRNAs (miRNAs) in host cells post-infection with free yeasts and biofilms. Complete sequencing of the transcribed regions was performed using the Illumina HiSeq platform and the investigation of the miRNA pattern in infected host macrophages (Mø) was conducted using a reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) technique. Subsequently, the production of total polysaccharides was determined in samples of planktonic cultures, biofilms and supernatant of the biofilms and, additionally, the abundance of non-protein metabolites and small peptides in these growth forms was established by LC-MS/MS. In summary, the data obtained showed that the structure of yeasts in biofilms induces a negative regulation in the direct (coding genome - mRNA) and indirectly... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Kátia Cristina Kupper / Banca: Fabio Augusto / Banca: Alessandra Sussulini / Banca: Antonio de Góes / Banca: Jackson Antonio Marcondes de Souza / Resumo: O setor citrícola é o maior produtor de frutos no mundo, porém, encontra-se ameaçado por diversos patógenos, dentre esses, o fungo Phyllosticta citricarpa, agente causal da mancha preta dos citros. Como alternativa à utilização de fungicidas sintéticos para o controle do patógeno, o controle biológico, utilizando bactérias do gênero Bacillus, apresenta destaque. Tais microrganismos possibilitam o biocontrole pela produção de compostos orgânicos voláteis ou não voláteis. Sendo assim, este trabalho teve por objetivos: identificar os isolados de Bacillus spp. por meio de técnicas moleculares; avaliar a produção de compostos orgânicos voláteis produzidos por Bacillus spp. em diferentes meios de cultura; verificar os seus efeitos na evolução dos sintomas da doença em frutos de laranja, na morfologia de P. citricarpa em lesões de mancha preta e na indução de resistência, identificar os compostos voláteis por cromatografia gasosa unidimensional e finalmente, avaliar o efeito de diferentes meios de cultura no antagonismo e metabolismo secundário dos isolados de Bacillus. Os isolados bacterianos foram identificados como pertencentes às espécies de Bacillus subtilis, B. amyloliquefaciens e B. methylotrophicus. Os resultados mostraram que houve maior controle do patógeno, em decorrência da produção de voláteis, quando se utilizou os meios triptona de soja ágar (TSA) e caldo de triptona (TSB) para cultivo da bactéria, apresentando valores de inibição da colônia do fungo de até 73%. Com r... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The citrus sector is the largest producer of fruits in the world, but it is threatened by several pathogens, among them Phyllosticta citricarpa fungus, causal agent of the citrus black spot. As an alternative to the use of synthetic fungicides to control the pathogen, the biological control, using bacteria of the genus Bacillus, is highlighted. Such microorganisms enable biocontrol by the production of volatile or non-volatile organic compounds. Therefore, this work had as objectives: to identify the isolates of Bacillus spp. by means of molecular techniques; to evaluate the production of volatile organic compounds produced by Bacillus spp. in different culture media; to verify its effects on the evolution of orange disease symptoms, P. citricarpa morphology in black spot lesions and induction of resistance, to identify the volatile compounds by one-dimensional gas chromatography and, finally, to evaluate the effect of different culture in the antagonism and secondary metabolism of Bacillus isolates. The bacterial isolates were identified as belonging to the species of Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus methylotrophicus. The results showed that there was greater control of the pathogen, due to the volatile production, when tryptone broth (TSA) and tryptone broth (TSB) were used to culture the bacteria, presenting inhibition values of the fungus colony up to 73%. With regard to the effect of volatile compounds on the evolution of disease symptoms, the best results in terms of inhibition (86%) of freckles that progressed to hard spots were obtained with ACB-65 and ACB-73, when cultured in TSB culture medium. Such antagonists have caused deformations in the hyphae of the pathogen, which may explain the non-evolution of the disease symptoms, as previously reported. The volatiles of Ba... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Prof. Dr. Danilo da Cruz Centeno. / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2015. / A bioenergia destaca-se como um substituto relevante para os combustíveis fósseis e os biocombustíveis vem ganhando destaque nos últimos anos, assim como as tecnologias para a transformação dessa biomassa. No Brasil, os biocombustíveis mais utilizados são o etanol e o biodiesel, provenientes de tecidos vegetais. A demanda de etanol tem aumentado nos últimos anos tendo a produção de etanol em 2011/2012 atingido aproximadamente 27,67 bilhões de litros. Entretanto esta produção ainda é baixa frente à demanda por combustíveis renováveis. O etanol produzido a partir da cana-de-açúcar é proveniente do processo de fermentação da sacarose acumulada nos colmos. A produção de açúcares em organismos vegetais ocorre por meio de processos bioquímicos complexos envolvendo diferentes componentes subcelulares. Esses processos são um conjunto de reações que coordenam o metabolismo e a transferência de nutrientes e fotoassimilados entre os diferentes órgãos das plantas. Esses processos bioquímicos são dinâmicos e podem ser afetados em suas diferentes vias por interferências diversas, como estresses abióticos e bióticos, entre outros. Além da sacarose, outros açúcares são importantes para o acúmulo de carbono em plantas, sendo estes utilizados em diferentes vias metabólicas. Nesse estudo foram analisados colmos maduros de quatro variedades de cana-de-açúcar, divididos em terço superior, médio e inferior, sendo essas variedades RB72454, RB855156, RB867515 e RB92579, através da análise de perfil metabólico e quantificação de açúcares solúveis totais (AST), de modo a avaliar as relações do acúmulo de AST e outros metabólitos em cana-de-açúcar. Os resultados mostram correlações positivas entre alguns compostos chave do metabolismo primário em colmo de cana-de-açúcar e sugere ainda a importância do estudo de açúcares álcool nestas plantas com o intuito de avaliar a contribuição de outros açúcares, como oligossacarídeos da série da rafinose, no armazenamento de carbono em colmo. Estes resultados trazem uma nova perspectiva para estratégias futuras de obtenção de plantas com maior produtividade. / Bioenergy stands out as an important substitute for fossil fuels and biofuels has been gaining momentum in recent years, as well as technologies for the transformation of biomass. In Brazil, the most commonly used biofuels are ethanol and biodiesel from plant tissues. The demand for ethanol has increased in recent years and the production of ethanol in 2011/2012 reached about 27.67 billion liters. However, this production is still low against the demand for renewable fuels. Ethanol produced from sugarcane comes from the fermentation process of the accumulated sucrose in the stalks. The production of sugars in plant bodies occurs by means of complex biochemical processes involving different subcellular components. These processes are a set of reactions that coordinate the transfer and metabolism of nutrients and assimilates among the different plant organs. These biochemical processes are dynamic and can be affected in their different ways by various interferences such as abiotic and biotic stresses, among others. In addition to sucrose, other sugars are important for carbon accumulation in plants, which are used in different metabolic pathways. In this study, mature stalks of four varieties of sugarcane (RB72454, RB855156, RB867515 and RB92579), divided into upper, middle and lower third, were analyzed , through metabolic profiling and quantification of total soluble sugars (TSS) in order to assess the relationship of TSS accumulation and other metabolites in sugarcane. The results show positive correlations among some key compounds of primary metabolism in sugarcane stalks and also suggests the importance of the study of alcohol sugars in these plants in order to assess the contribution of other sugars such as oligosaccharides of the raffinose series, the stem in carbon storage. These results provide a new perspective for future strategies to obtain plants with higher productivity.

Submitted by MARCEL PRATAVIEIRA null (marcelprata93@hotmail.com) on 2016-03-07T15:52:49Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Marcel Pratavieira - 2016.pdf: 8130455 bytes, checksum: a459e73ed4ef0757431f12802bc7f15b (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-03-07T19:51:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pratavieira_m_me_rcla.pdf: 8130455 bytes, checksum: a459e73ed4ef0757431f12802bc7f15b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-07T19:51:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pratavieira_m_me_rcla.pdf: 8130455 bytes, checksum: a459e73ed4ef0757431f12802bc7f15b (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As abelhas têm sido utilizadas como modelos robustos e influentes para o estudo de memória e aprendizagem, contribuindo para o melhor entendimento das bases da cognição. Nesse contexto, diferentes metabólitos foram caracterizados por desempenharem funções distintas no processo de aprendizagem e formação de memória em insetos. Considerando que pouco se sabe sobre os metabólitos em relação ao desenvolvimento das habilidades cognitivas em A. mellifera, ou mesmo em relação aos comportamentos reflexos (condicionados e/ou não condicionados), o presente estudo teve como objetivo a análise metabolômica do cérebro de abelhas submetidas ao ensaio comportamental de reflexo de extensão de probóscide (REP). Para isto, foi padronizada a técnica de análise metabolômica com o uso do sistema LC-ESI- MS e MSn, construindo-se inicialmente uma biblioteca de compostos característicos de cérebro de abelhas (neurotransmissores, aminoácidos livres, poliaminas, nucleotídeos, nucleosídeos, ácidos orgânicos, etc). Nesta primeira abordagem, dentre os 112 compostos da biblioteca, 48 foram identificados e quantificados; alguns destes compostos foram únicos para o grupo controle (cadaverina, espermina, glicose, uracila e n-acetil-L-glutamato 5-semialdeido), enquanto que outros foram únicos para o grupo REP (fenilalanina, betaína, espermidina, serina e creatina). Dentre os compostos identificados em ambos os grupos, apenas 5 compostos apresentaram diferenças quantitativas estatisticamente significantes (arginina, asparagina, guanosina monofosfato, putrescina e 4-guanitinobutanoato). Visando o estudo dos perfis metabólicos regionais (em cada região do cérebro), foi também padronizado o protocolo experimental utilizando-se a estratégia MALDI Spectral Imaging e o desenvolvimento de um método semi-quantitativo de metabólitos. Esta estratégia permitiu o mapeamento e o estudo da distribuição espacial dos metabólitos identificados em cortes de cérebro de abelhas, bem como uma melhor compreensão da distribuição dessas moléculas nas diferentes estruturas do cérebro e sua correlação com o comportamento ensaiado. As duas estratégias aplicadas mostraram-se complementares e fundamentais para a compreensão da cognição em abelhas. De modo geral, o ensaio de REP parece estimular intensa atividade cerebral, alto gasto energético, intensa sinalização química e a ativação de algumas cascatas metabólicas específicas, tais como a rota metabólica da prolina e arginina. Nos indivíduos do grupo REP a arginina provavelmente foi catabolizada nas sínteses de creatina, 4-guanidinobutanoato, putrescina e espermidina. Esses processos bioquímicos provavelmente foram importantes para coordenar o reconhecimento da molécula de sacarose, e associar esse odor com um comportamento reflexo para a extensão da probóscide (estímulo não condicionado). / The honeybee Apis mellifera has long served as an invertebrate model organism for learning and memory research, contributing to a better understanding of cognition bases. In this context, different metabolites (especially neurotransmitters) were characterized by play distinct roles in learning process and in memory formation in insects. Whereas little is known about the metabolites in relation to the development of cognitive skills in A. mellifera, the present study aims to perform a metabolomic analysis of the honeybee brains submitted to the behavioral test of proboscis extension reflex (PER). For this, has been standardized a metabolomic analysis technique through the use of LC-ESI-MS and MSn system. Initially a low molecular weight compounds library was created, containing characteristic compounds of bee brain (neurotransmitters, free amino acids, polyamines, nucleotides, nucleosides, organic acids, etc.). In this first approach, from the library of 112 compounds, 48 compounds were identified and quantified; some of these compounds were only identified in the control group (cadaverine, spermine, glucose, uracil and N-acetyl-L-glutamate 5- semialdehyde), while others were only identified in PER group (phenylalanine, betaine, spermidine, serine and creatine). Among the compounds identified in both groups, only five compounds showed statistically significant differences in quantitative results (arginine, asparagine, guanosine monophosphate, putrescine and 4-guanidinebutanoate). In order to study the metabolic profiles by regions (within each brain region) it was also standardized an experimental protocol using a novel semi-quantitative method of MALDI Spectral Imaging strategy. This strategy allowed the study and the mapping of the spatial distribution of metabolites identified in honeybee brain sections, as well as a better understanding of the distribution of molecules in the different brain structures and their correlation with the behavior tested. Both strategies applied proved to be complementary and essential to the understanding of cognition in bees. Overall, in this study the PER test seems to stimulate intense brain activity, high energy expenditure, intense chemical signaling and activation of some specific metabolic pathways, such the arginine and proline metabolic pathway. In individuals of PER group arginine was probably catabolized in the synthesis of creatine, 4-guanidinobutanoato, putrescine and spermidine. This biochemical process were probably important to coordinate the recognition of sucrose molecule and associate this odor with a reflex behavior for the proboscis extension (unconditioned stimulus). / FAPESP: 2014/05376-1

Made available in DSpace on 2016-03-07T19:20:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-09-18. Added 1 bitstream(s) on 2016-03-07T19:24:13Z : No. of bitstreams: 1 000854399_20170917.pdf: 841767 bytes, checksum: d9701c2b442b36a8040601e348fb5b26 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-09-22T12:16:26Z: 000854399_20170917.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-09-22T12:17:16Z : No. of bitstreams: 1 000854399.pdf: 8066776 bytes, checksum: 2890b7319e866efe0214261d4b186fbf (MD5) / A espécie Casearia sylvestris Sw. (Salicaceae) é um importante representante do gênero Casearia Jacq. destacando-se nos pontos de vista químico, farmacológico, econômico, biotecnológico e ecológico. Por possuir alta capacidade adaptativa, encontra-se amplamente disseminada nas Américas Central e do Sul, sendo que, no Brasil, ocorre em praticamente todos os biomas. Os dados morfo-anatômicos, químicos e genéticos disponíveis sobre C. sylvestris, indicam relação próxima entre variedade lingua e bioma Cerrado e entre variedade sylvestris e Mata Atlântica, havendo também dados descrevendo diferenças genéticas significativas entre estas duas variedades. Em ecótonos Cerrado/Mata Atlântica, estas duas variedades co-existem, havendo principalmente nessas regiões indivíduos com características intermediárias, tanto do ponto de vista morfo-anatômico quanto genético. Há também indícios de que em C. sylvestris var. lingua/Cerrado ocorram predominantemente compostos fenólicos, enquando em C. sylvestris var. sylvestris/Mata Atlântica predominam os diterpenos clerodânicos. Assim, este trabalho tem como objetivo principal avaliar e confirmar indícios de que a composição química, no que concerne a metabólitos secundários, está relacionada e/ou condicionada pelos biomas, e principalmente associada aos respectivos morfotipos predominantes e, portanto, sob forte controle genético. Para tanto, desenvolveu-se e validou-se um método analítico por UHPLC-DAD para a análise simultânea de compostos fenólicos e diterpenos clerodânicos produzidos pelas duas variedades de C. sylvestris. Através do estudo metabolômico destas duas variedades utilizando foram identificados 15 diterpenos clerodânicos em C. sylvestris var. sylvestris e 14 flavonoides glicosilados e uma catequina em C. sylvestris var. lingua. O estudo dos ciclos circadiano e sazonal de ambas as variedades evidenciou um... / The species Casearia sylvestris Sw (Salicaceae) is an important representative of the Casearia Jacq. genus, due to its chemical, pharmacological, economic, environmental and biotechnological aspects. Because of its high adaptive capacity, this species is widespread in Central and South America and, in Brazil, it occurs in practically all biomes. The morpho-anatomical, chemical and genetic data available on C. sylvestris, indicate close relationship between the variety lingua and the Cerrado biome, and between the variety sylvestris and Atlantic Forest. Also, there are data describing significant genetic differences between these two varieties. In ecotones Cerrado/Atlantic Forest, it can be found these two varieties, including individuals with intermediate characteristics, considering both morpho-anatomical and genetic ones. There is evidence that in C. sylvestris var. lingua/Cerrado occur predominantly the phenolic compounds, while in C. sylvestris var. sylvestris/Atlantic Forest the clerodane diterpenes predominate. So, the main objective of this work is to evaluate if the chemical composition, considering the secondary metabolites, is related to and/or conditioned by biomes, and mainly associated to their predominant morphotypes and, therefore, under strong genetic control. To evaluate this, an analytical method using UHPLC-DAD was developed and validated for the simultaneous analysis of phenolic compounds and clerodane-type diterpenes produced by the two C. sylvestris varieties. The metabolomic study allowed the identification of 15 clerodane-type diterpenes in C. sylvestris var. sylvestris and 14 glycosylated flavonoids and one catechin in C. sylvestris var. lingua. The study of the circadian rhythm and seasonal cycle of both varieties showed a decrease in the production of the two secondary metabolites classes in the reproductive period. In the infraspecific chemical...

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:10:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-05-15. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:25:40Z : No. of bitstreams: 1 000841952_20151201.pdf: 224991 bytes, checksum: a69da7c5581929a52fda32ae08e4ea24 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-12-01T09:08:31Z: 000841952_20151201.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-01T09:09:24Z : No. of bitstreams: 1 000841952.pdf: 25693222 bytes, checksum: e7ae26d3803aeca45c78fc76d4168c0b (MD5) / O uso de extratos e tinturas de partir de fontes naturais para fins terapêuticos remonta o aparecimento da humanidade. A ação biológica proveniente destas misturas é justificado pela diversidade estrutural e química de seus compostos na qual, interagem concomitante a diferentes alvos proteicos. No entanto, os últimos anos foram marcados pela substituição das metodologias clássicas de isolamento e teste biológicos por ferramentas de automação como High Throughput Screening (HTS) e o uso da química combinatória para a geração de substâncias. No entanto, os resultados até o momento foram insatisfatórios e a indústria tem retomado o uso dos produtos naturais. Para tanto, ela tem buscado por abordagens mais racionais de detecção e identificação estrutural de biomarcadores. Dentro dessa óptica, a inserção e o desenvolvimento de metodologias de desreplicação associadas a estudos metabolômicos sob a visão da biologia sistêmica torna-se crítica na busca por micromoléculas ativas. Recentemente, o uso de técnicas hifenadas como a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), associadas a métodos espectroscópicos de RMN e a espectrometria de massas de alta resolução (EMAR), tem sido fundamentais na geração de métodos analíticos em estudos metabolômicos e de biologia sistêmica em plantas, fungos endofíticos, e outras organismo, acelerando a escolha de matrizes bioativas promissoras. Este projeto visa ao entendimento das relações moleculares presentes em matrizes dinâmicas gerando ferramentas analíticas para uma abordagem racional no estudo de produtos naturais bioativos. Para tanto, espécimes depositadas na nossa extratoteca, da família Solanaceae, pouco estudadas no que diz respeito a sua composição química serão o objeto de estudo deste projeto. / The use of drugs from natural sources is as old as humanity itself. However, due to the economic impact caused by globalization, many pharmaceutic industries searched for alternatives to speed-up assays aiming for simpler structural molecules and low-costs budgets. Therefore, the insertion and development of methods of dereplication associated to metabolomics studies through an approach in system biology is a key issue when searching for bioactive molecules. Recently, due to the advancement of technology, the use of hyphenated techniques such as high performance liquid chromatography (HPLC) coupled to spectroscopic methods like nuclear magnetic resonance (NMR) and high resolution mass spectrometry (HRMS) intensified the metabolomic and system biology research in plants and fungi thus, accelerating the selection of bioactive substances. This project aims to study the molecular dynamics in complex matrixes using multivariate analysis and in doing so generating analytical tools to apply as a rational approach towards the study of bioactive natural products and the understanding of their complexity. To accomplish this task, specimens deposited in our bank of extracts, from the Solanaceae family, little studied on their chemical composition but that showed interesting bioactivities form initial biological screenings, will be the object of study on this project.

Orientador: Ian Castro-Gamboa / Banca: Luiz Alberto Colnago / Banca: Rodrigo Ramos Catharino / Banca: Patrícia Verardi Abdelnur / Banca: Denise Brentan da Silva / Resumo: O uso de extratos e tinturas de partir de fontes naturais para fins terapêuticos remonta o aparecimento da humanidade. A ação biológica proveniente destas misturas é justificado pela diversidade estrutural e química de seus compostos na qual, interagem concomitante a diferentes alvos proteicos. No entanto, os últimos anos foram marcados pela substituição das metodologias clássicas de isolamento e teste biológicos por ferramentas de automação como High Throughput Screening (HTS) e o uso da química combinatória para a geração de substâncias. No entanto, os resultados até o momento foram insatisfatórios e a indústria tem retomado o uso dos produtos naturais. Para tanto, ela tem buscado por abordagens mais racionais de detecção e identificação estrutural de biomarcadores. Dentro dessa óptica, a inserção e o desenvolvimento de metodologias de desreplicação associadas a estudos metabolômicos sob a visão da biologia sistêmica torna-se crítica na busca por micromoléculas ativas. Recentemente, o uso de técnicas hifenadas como a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), associadas a métodos espectroscópicos de RMN e a espectrometria de massas de alta resolução (EMAR), tem sido fundamentais na geração de métodos analíticos em estudos metabolômicos e de biologia sistêmica em plantas, fungos endofíticos, e outras organismo, acelerando a escolha de matrizes bioativas promissoras. Este projeto visa ao entendimento das relações moleculares presentes em matrizes dinâmicas gerando ferramentas analíticas para uma abordagem racional no estudo de produtos naturais bioativos. Para tanto, espécimes depositadas na nossa extratoteca, da família Solanaceae, pouco estudadas no que diz respeito a sua composição química serão o objeto de estudo deste projeto. / Abstract: The use of drugs from natural sources is as old as humanity itself. However, due to the economic impact caused by globalization, many pharmaceutic industries searched for alternatives to speed-up assays aiming for simpler structural molecules and low-costs budgets. Therefore, the insertion and development of methods of dereplication associated to metabolomics studies through an approach in system biology is a key issue when searching for bioactive molecules. Recently, due to the advancement of technology, the use of hyphenated techniques such as high performance liquid chromatography (HPLC) coupled to spectroscopic methods like nuclear magnetic resonance (NMR) and high resolution mass spectrometry (HRMS) intensified the metabolomic and system biology research in plants and fungi thus, accelerating the selection of bioactive substances. This project aims to study the molecular dynamics in complex matrixes using multivariate analysis and in doing so generating analytical tools to apply as a rational approach towards the study of bioactive natural products and the understanding of their complexity. To accomplish this task, specimens deposited in our bank of extracts, from the Solanaceae family, little studied on their chemical composition but that showed interesting bioactivities form initial biological screenings, will be the object of study on this project. / Doutor

Submitted by Márcio Maia (marciokjmaia@gmail.com) on 2016-09-08T17:34:01Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 3383101 bytes, checksum: e52ccda15daee8307b55ff0e71eeea15 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-08T17:34:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 3383101 bytes, checksum: e52ccda15daee8307b55ff0e71eeea15 (MD5) Previous issue date: 2015-08-31 / Cissampelos sympodialis Eichl., (Menispermaceae) is popularly known as “milona". This species has shown potential to interfere with the pathophysiology of asthma by exerting multiple synergistic effects. Warifteine, a bisbenzilsioquinoline alkaloid has been considered as the main bioactive substance present in the leaves and roots of this species. The present work used a metabolomics approach combined with multivariate data analysis to study quantitative and qualitative chemical variations in the leaf extracts during the phenological development of the plant (between 60 and 210 days after seedling, and the corresponding extracts were coded as CsL60, CsL90, CsL120, CsL150, CsL180 e CsL210) and its relation with the relaxing effect using in vitro guinea pig tracheal. 1H-NMR data from extracts were submitted to PCA analysis and the concentration of the identified compounds was quantified by 1H qNMR. The contents of warifteine and methylwarifteine were determined by HPLC and the total phenolic content of extracts was determined using the Folin-Ciocalteu method, using galic acid as standard. Extracts submitted to 1H-NMR spectroscopy were simultaneously screened to determine their potency in relaxing in vitro guinea-pig tracheal pre-contracted with carbachol. To investigate the relationship between chemical profile and pharmacological activity we used PLS regression. The method was able to identify and to quantitate 20 primary and secondary metabolites in the extracts. The concentration of the major alkaloids decrease from 2.0 ± 0.32 μg/mL for warifteine and 1.0 ± 0.14 μg/mL for methylwarifteine to undetectable levels from 90 days onwards after seedling for warifteine and 120 days for methylwarifteine. Phenolic compounds and derivatives of the flavonols quercetin and kaempferol behave in na opposite fashion, increasing its levels towards fructification (from 0.1 ± 0.05 to 1.0 ± 0.12 mmol/L for quercetin and from 0.4 ± 0.12 to 1.0 ± 0.16 mmol/L for kaempferol). The metabolomics study based on 1H-NMR spectroscopy with PCA was able to discriminate all extracts demonstrating that the phenological cycle is associated with clear differences in chemical composition, mainly due to variations in the concentration of sugars and quinic acid derivatives. The extract obtained during fructification (CsL210) was the most distinctive amongst all samples mainly due to signals from quinic acid derivatives, kaempferol and quercein derivatives. The content of major alkaloids decreased from 2.0 ± 0.32 μg/mL for warifteine and 1.0 ± 0.14 μg/mL to methylwarifteine to undetectable levels from 90 days onwards after seedling for warifteine and 120 days for methylwarifteine. The phenolic compounds and flavonoids quercetin (0.1 ± 0.05 a 1.0 ± 0.12 mmol/L) and kaempferol (0.4 ± 0.12 a 1.0 ± 0.16 mmol/L) behaved in an opposite fashion, increasing its concentration towards fructification. The six extracts relaxed the trachea pre-contracted with carbachol guinea pig, and the CsF210 extract (EC50 = 74.6 ± 7.9 μg/mL) more potent compared to CsL90 extracts (EC50 = 231.6 ± 38.9 μg/ml) and CsL180 (EC50 = 239.7 ± 15.1 μg/ml) in the presence of functional epithelium. There was no correlation between the content of alkaloids as determined by HPLC and the spasmolytic activity of the extracts. PLS analysis revealed a moderate correlation between 1H-NMR signals for quercetin and kaempferol derivatives and the spasmolytic activity of extracts. Taken together our results demonstrate for the first time that bisbenzylisoquinoline alkaloids warifteine and methylwarifteine do not seem to participate in the spasmolytic actions of polar Cissampelos sympodialis extracts. / Cissampelos sympodialis Eichler, pertence a família Menispermaceae, sendo conhecida popularmente como “milona". A espécie tem demonstrado por meio de testes pré-clínicos, potencial de interferir em processos relacionados com a fisiopatologia da asma, exercendo múltiplos efeitos sinérgicos. A warifteína, um alcaloide bisbenzilisoquinolínico, tem sido apontada como a principal substância bioativa presente nas folhas e nas raízes desta espécie. O presente estudo utilizou metodologia metabolômica baseada em RMN e combinação com análise multivariada para analisar a variação química qualitativa e quantitativa dos constituintes presentes nos extratos hidroalcoólicos das folhas durante o desenvolvimento da planta (entre 60 a 210 dias após o plantio, codificados como CsF60, CsF90, CsF120, CsF150, CsF180 e CsF210) e a relação com o efeito in vitro sobre traqueia isolada de cobaia. Os dados de RMN-1H dos seis extratos das folhas foram submetidos à análise por PCA e os teores dos compostos identificados foram quantificados por RMNq-1H. O teor de warifteína e metilwarifteína foram determinados por CLAE e o teor de fenólicos totais determinado pelo método de Folin-Ciocalteu, utilizando ácido gálico como o composto fenólico padrão. Os extratos submetidos à análise por RMN-1H foram simultaneamente testados quanto à sua potência em relaxar in vitro a traqueia de cobaia pré-contraída com carbacol. Para estudar a relação entre o perfil químico e a atividade farmacológica foi empregada a técnica de PLS (Partial Least Squares). O estudo foi capaz de identificar e quantificar vinte substâncias dentre metabólitos primários e secundários presentes em todos os extratos das folhas. Os teores dos alcaloides majoritários decaem de 2,0 ± 0,32 μg/mL para warifteína e 1,0 ± 0,14 μg/mL para metilwarifteína a níveis não detectáveis, a partir de 90 dias após o plantio para a warifteína e a partir de 120 dias para metilwarifteína. Os compostos fenólicos e os flavonóis quercetina (0,1 ± 0,05 a 1,0 ± 0,12 mmol/L) e caempferol (0,4 ± 0,12 a 1,0 ± 0,16 mmol/L) se comportam de forma contrária, aumentando os seus níveis no sentido da frutificação. Através da análise de PCA foi possível diferenciar todos os extratos, demonstrando que o ciclo vegetativo está associado com diferenças claras na composição química, principalmente devido a variações na concentração de açúcares, compostos fenólicos e derivados do ácido quínico. O extrato (CsF210) originado das folhas no período da frutificação foi o mais distinto entre as amostras, sendo os sinais atribuídos aos derivados do ácido quínico, quercetina e caempferol responsáveis por esta discriminação. Os seis extratos foram capazes de relaxar a traqueia de cobaia pré-contraída com carbacol, sendo o extrato CsF210 (CE50 = 74,6 ± 7,9 μg/mL) mais potente em relação aos extratos CsF90 (CE50 = 231,6 ± 38,9 μg/mL) e CsF180 (CE50 = 239,7 ± 15,1 μg/mL) na presença de epitélio funcional. Não houve correlação entre o teor de alcaloides determinados por CLAE e a atividade espasmolítica dos extratos. Por outro lado, a análise por PLS demonstrou correlação entre os sinais de derivados dos flavonóis quercetina e caempferol e a potência espasmolítica dos extratos. Em conjunto nossos resultados demonstram pela primeira vez que os alcaloides bisbenzilisoquinolínicos warifteína e metilwarifteína não parecem estar envolvidos nas ações espasmolíticas dos extratos polares de Cissampelos sympodialis.

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Como alternativa à utilização de fungicidas sintéticos para o controle do patógeno, o controle biológico, utilizando bactérias do gênero Bacillus, apresenta destaque. Tais microrganismos possibilitam o biocontrole pela produção de compostos orgânicos voláteis ou não voláteis. Sendo assim, este trabalho teve por objetivos: identificar os isolados de Bacillus spp. por meio de técnicas moleculares; avaliar a produção de compostos orgânicos voláteis produzidos por Bacillus spp. em diferentes meios de cultura; verificar os seus efeitos na evolução dos sintomas da doença em frutos de laranja, na morfologia de P. citricarpa em lesões de mancha preta e na indução de resistência, identificar os compostos voláteis por cromatografia gasosa unidimensional e finalmente, avaliar o efeito de diferentes meios de cultura no antagonismo e metabolismo secundário dos isolados de Bacillus. Os isolados bacterianos foram identificados como pertencentes às espécies de Bacillus subtilis, B. amyloliquefaciens e B. methylotrophicus. Os resultados mostraram que houve maior controle do patógeno, em decorrência da produção de voláteis, quando se utilizou os meios triptona de soja ágar (TSA) e caldo de triptona (TSB) para cultivo da bactéria, apresentando valores de inibição da colônia do fungo de até 73%. Com relação ao efeito dos compostos voláteis na evolução dos sintomas da doença, verificou-se que os melhores resultados, em termos de inibição (86%) de manchas sardentas que evoluíram para manchas duras, foram obtidos com o ACB-65 e ACB-73, quando cultivados em meio de cultivo TSB. Tais antagonistas causaram deformações nas hifas do patógeno, que podem explicar a não evolução dos sintomas da doença, como relatado anteriormente. Os voláteis de Bacillus spp. não foram capazes de ativar a atividade de enzimas indicativas de indução de resistência em frutos de laranja. As frações voláteis produzidas pelas bactérias foram identificadas e apresentaram álcoois, cetonas, aminas, éteres, aldeídos, fenóis e ácidos carboxílicos que podem servir como arsenal contra o fitopatógeno. Em relação ao efeito de diferentes meios de cultivo no antagonismo microbiano e no metabolismo secundário dos isolados de Bacillus, não houve diferença significativa entre os meios testados, porém proporcionaram redução significativa da colônia do fungo. Os metabólitos difundidos no meio de cultura foram identificados e apresentaram dois tipos de antibióticos, as iturinas e as surfactinas. O presente trabalho demonstrou o potencial de compostos orgânicos voláteis e não voláteis produzidos por Bacillus spp. no controle de P. citricarpa in vitro e in vivo, sendo uma alternativa ao uso de fungicidas sintéticos para o controle da mancha preta dos citros. / The citrus sector is the largest producer of fruits in the world, but it is threatened by several pathogens, among them Phyllosticta citricarpa fungus, causal agent of the citrus black spot. As an alternative to the use of synthetic fungicides to control the pathogen, the biological control, using bacteria of the genus Bacillus, is highlighted. Such microorganisms enable biocontrol by the production of volatile or non-volatile organic compounds. Therefore, this work had as objectives: to identify the isolates of Bacillus spp. by means of molecular techniques; to evaluate the production of volatile organic compounds produced by Bacillus spp. in different culture media; to verify its effects on the evolution of orange disease symptoms, P. citricarpa morphology in black spot lesions and induction of resistance, to identify the volatile compounds by one-dimensional gas chromatography and, finally, to evaluate the effect of different culture in the antagonism and secondary metabolism of Bacillus isolates. The bacterial isolates were identified as belonging to the species of Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus methylotrophicus. The results showed that there was greater control of the pathogen, due to the volatile production, when tryptone broth (TSA) and tryptone broth (TSB) were used to culture the bacteria, presenting inhibition values of the fungus colony up to 73%. With regard to the effect of volatile compounds on the evolution of disease symptoms, the best results in terms of inhibition (86%) of freckles that progressed to hard spots were obtained with ACB-65 and ACB-73, when cultured in TSB culture medium. Such antagonists have caused deformations in the hyphae of the pathogen, which may explain the non-evolution of the disease symptoms, as previously reported. The volatiles of Bacillus spp. were not able to activate the enzyme activity indicative of induction of resistance in orange fruits. The volatile fractions produced by the bacteria were identified and showed alcohols, ketones, amines, ethers, aldehydes, phenols and carboxylic acids that can serve as arsenal against the phytopathogen. In relation to the effect of different culture media on the microbial antagonism and the secondary metabolism of the Bacillus isolates, there was no significant difference between the media tested, but provided a significant reduction of the fungus colony. The metabolites diffused in the culture medium were identified and presented two types of antibiotics, iturins and surfactins. The present work demonstrated the potential of volatile and non-volatile organic compounds produced by Bacillus spp. In the control of P. citricarpa in vitro and in vivo, being an alternative to the use of synthetic fungicides for the control of citrus black spot.

Orientador: Alberto José Cavalheiro / Banca: Paulo Clairmont Feitosa de Lima Gomes / Banca: Carmen Lúcia Cardoso / Resumo: Separações utilizando cromatografia líquida bidimensional têm atraído grande interesse nas últimas décadas devido ao seu elevado potencial no poder de separação para análises de misturas complexas. Apesar do uso de colunas ortogonais e da multiplicação teórica da capacidade de picos quando essa técnica é utilizada, uma questão permanece: "As técnicas bidimensionais são realmente melhores do que as monodimensionais para análises de extratos vegetais?". Esta questão motivou o presente trabalho, que consistiu em comparar o desempenho entre LC e LC×LC, utilizando amostras de folhas de Casearia sylvestris, também conhecida como "guaçatonga", uma árvore amplamente utilizada na medicina popular brasileira por apresentar diversas atividades biológicas. Além disso, devido ao grande volume de resíduos gerados em LC, a substituição de solventes convencionais por etanol (EtOH), um candidato menos tóxico e biodegradável, foi implementada. A parte mais desafiadora de qualquer cromatografia multidimensional é o desenvolvimento do método cromatográfico, pelo grande número de variáveis que devem atuar de forma integrada em uma única análise. Duas estratégias de desenvolvimento foram propostas neste trabalho. A primeira foi dividida em 4 etapas, que consistiram em selecionar o par de colunas mais ortogonal dentre as combinações disponíveis; o desenvolvimento de um método para a 1D utilizando planejamento experimental; seguido do estudo das melhores condições para a 2D (2tc, tempo de modulação ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bidimensional liquid chromatographic separations have attracted intense interest over the past decade based on the potential improvements in resolving power they offer for analysis of complex samples. Despite the use of orthogonal columns and the theoretical multiplication of peak capacity from both dimensions, one question remains: "Are bidimensional techniques superior to monodimensional ones for analysis of vegetal extracts?". This question led to the purpose of the present work, that was to compare the performance between LC and LC×LC, using leaves from Casearia sylvestris, a widely used tree in Brazilian folk medicine by its biological activities. Furthermore, due to the large volume of waste generated by LC, the replacement of conventional solvents by ethanol (EtOH), a less toxic and biodegradable alternative solvent was chosen. The most challenging issue of any multidimensional chromatography is the method development, since the large number of interacting parameters that must work together in a single run. Two strategies for method development were used in this work. The first one was divided into 4 steps: experiments were carried out to select the most orthogonal pair of columns, 1D method development using design of experiments, another design of experiments for 2D conditions was proposed (2tc, modulation time and tre, re-equilibration time after each modulation) and aware of the best conditions for both dimensions, 2D gradient types were evaluated. The second strat... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre