The unveiling of small RNA (sRNA)-mediated gene regulatory pathways has profoundly shaped our understanding of the complexity of gene regulation. In eukaryotes, sRNAs have been found to control cellular metabolism, growth and differentiation, to maintain genome integrity, and to combat viruses and mobile genetic elements. To gain insight into the roles of small RNAs in apple and peach, we conducted sRNA-seq, computational analysis and molecular experiments to genome-widely characterize their microRNAs (miRNAs) and trans-acting siRNA (tasiRNA) pathways. We identified totally 75 miRNAs or families, including 23 conserved, 10 less-conserved and 42 apple-specific ones, and 118 miRNA target genes in apple. Two classical trans-acting siRNA (tasiRNA) pathways, miR390-TAS3 and miR828-TAS4, were characterized with similar but unique tasiRNA biogenesis profiles and target specificities. Importantly, miR159, miR828 and miR858 can collectively target up to 81 MYB genes potentially involved in diverse aspects of plant growth and development. In contrast to the location of the miR159 target site in a sequence-divergent region, the target sites of miR828 and miR858 are located in the region encoding the conserved R3 repeat domain of MYB proteins. 10 out of the 19 miR828-targeted MYBs undergo the biogenesis of various phased siRNA (phasiRNA), which potentially regulate diverse genes outside the MYB family. In peach, totally 94 miRNAs or families and 80 target genes were identified. Similar pathways of tasiRNA (miR828-TAS4 and miR390-TAS3) or phasiRNA (miR828-MYB-siRNA) processing were also characterized in peach. Taking advantage of reverse computation and public available deep-sequencing data, we demonstrated that the miRNA-TAS-PPR-siRNA pathway is a highly dynamic and widespread feature of eudicots. Nine eudicot plants, representing six different plant families, have evolved similar tasiRNA pathways to instigate phasiRNA production from PPR �genes, which are triggered by different 22-nt miRNAs, including miR7122, miR1509, and fve-PPRtri1/2 and through distinct mechanistic strategies, like miRNA direct-targeting or indirect-targeting through TAS-like genes, one-hit or two-hit, or even two layers of tasiRNA-TAS interactions. We found that the MIRNA genes of these miRNA triggers show great identity with the Arabidopsis MIR173, implying a common origin of this group of miRNAs (super-miR7122). Combined results from phylogenetic analyses and conservation extent profiling revealed that the super-miR7122 was potentially evolved from another miRNA superfamily (super-miR4376), which probably originated from the miR390. Additionally, the miR482/2118-NB-LRR-siRNA pathway was found to be conserved, but evolved with distinct features, in apple and peach. Taken together, widespread and complex miRNA and tasiRNA regulatory networks have been adapted in apple and peach. They add another crucial layer of regulation on gene activity and stability, and must exert essential functions in all aspects of plant life. / Ph. D.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第18345号 / 農博第2070号 / 新制||農||1024(附属図書館) / 学位論文||H26||N4852(農学部図書室) / 31203 / 京都大学大学院農学研究科応用生命科学専攻 / (主査)教授 梅澤 俊明, 教授 矢﨑 一史, 教授 間藤 徹 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DGAM

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Chez les arbres, la formation du bois dépend de la différenciation d'un tissu vasculaire appelé xylème secondaire. Les parois cellulaires du xylème sont riches en lignines, ce qui leur confère rigidité et imperméabilité indispensables au transport de la sève brute et au maintien du port dressé. La xylogénèse requiert la coordination de l'expression de plusieurs centaines de gènes dans le temps et dans l'espace. Cette coordination est assurée au niveau transcriptionnel par différents médiateurs protéiques, parmi lesquels il y a des facteurs de transcription de la famille MYB-R2R3. Peu de gènes de cette sous famille ont été préalablement caractérisés chez les conifères. Mon travail de thèse a consisté dans un premier temps à identifier plusieurs gènes MYBR2R3 potentiellement impliqués dans la formation du xylème chez les conifères, en particulier chez le pin loblolly (Pinus taeda) et l'épinette blanche (Picea glauca), et à réaliser leur caractérisation moléculaire. Différentes analyses phylogénétiques ont permis de mettre en évidence des similarités et des différences significatives dans la structure de cette famille entre les gymnospermes et les angiospermes. L'expression de ces mêmes gènes a été quantifiée par RT-QPCR, ce qui a révélé que PgMYB2, 4 et 8 sont préférentiellement exprimés dans le xylème secondaire de l'épinette et que leurs transcrits s'accumulent dans le bois de compression. La deuxième partie de mon travail a visé la caractérisation fonctionnelle de deux MYB-R2R3 de pin (PtMYBl et 8) réalisée via leur surexpression constitutive chez des transformants stables d'épinette. Ces deux facteurs MYB induisent une lignification ectopique cependant plus intense avec PfMYB8, qui bloque le développement normal des racines et conduit à la mort des plantules in vitro. L'analyse du transcriptome des plantules transgéniques par biopuces à ADN a dévoilé entre autres, l'augmentation de l'expression des gènes de la synthèse des lignines. La dernière partie de ma thèse est consacrée à la caractérisation fonctionnelle de PtMYBM placé en parallèle sous le contrôle d'un promoteur constitutif et d'un promoteur préférentiel du xylème (gène codant l'alcool cinnamylique deshydrogénase). Les plantules transgéniques ont une synthèse accrue de plusieurs terpènes et produisent de nombreux transcrits potentiellement associés aux mécanismes de défense. / In trees, wood formation depends on the differentiation of a vascular tissue refered to as secondary xylem. Xylem cell walls are rich in lignins, which confer stiffness and impermeability, properties essential for the mechanical support of the tree and for the transport of water and minerals. Xylogenesis requires the coordinated expression of several hundred genes in time and space. The regulation of gene expression is controled at the transcriptional level by different protein mediators, including transcription factors of the R2R3-MYB family. Hitherto, very few genes of this sub-family have been characterized, specially in conifers. The first part of my thesis consists in the identification and molecular characterization of several genes belonging to this family and potentially involved in xylem formation in conifers, particularly in loblolly pine (Pinus taeda) and white spruce (Picea glauca). Phylogenetic analyses highlight the major similarities as well as significant differences in the MYB family structure between gymnosperms (trees) and angiosperms (herbaceous plants and trees). I used qRT-PCR to determine transcript levels of these genes and assess their expression profiles in spruce. The data showed that the spruce transcripts for PgMYB2, 4 and 8 accumulate preferentially in secondary xylem and are upregulated in compression wood. The second part of my work aimed the functional characterization of two pine R2R3-MYB (PtMYBl and 8) via their constitutive overexpression in stable spruce transformants. The overexpression of both of these MYB transcription factors led to ectopic lignification. However, the overexpression of PtMYB8 led to a more intense lignification; it also prevented normal root development leading to the death of the in vitro plantlets. Microarrays analyses of the transgenic plantlets showed that there was a significant upregulation of many lignin biosynthesis genes, among others. The final section of my thesis describes the functional characterization of PtMYB14 based on its overexpression with either a constitutive promoter or a xylem-preferential promoter (gene coding for the cinnanyl alcohol dehydrogenase). Both types of transgenics plantlets accumulated several terpenes compounds and produced numerous transcripts potentially involved in defence mechanisms.

Le xylème secondaire (appelé bois chez les arbres), est un tissu vasculaire caractérisé par la présence d'un composé phénolique caractéristique, la lignine qui confère hydrophobicité et résistance mécanique aux parois. La différenciation du xylème est un processus complexe qui fait intervenir plusieurs centaines de gènes dont l'expression doit être strictement régulée dans l'espace et dans le temps. Cette coordination spatiotemporelle très fine est assurée au niveau transcriptionnel par, des facteurs de transcription. Certains membres de la famille MYB sont par exemple connus pour réguler l' èxpression des gènes de la voie de biosynthèse des phénylpropanoides, incluant la lignine. Le but de mes travaux était de caractériser fonctionnellement deux facteurs de transcription MYB, EgMYBl et EgMYB2, isolés à partir d'une banque d'ADNe de xylème d'Eucalyptus gunnii. La majeure partie de mes résultats concerne la caractérisation d'EgMYBl qui phyl 0 génétiquement, fait partie du sous-groupe 4 des MYB R2R3. Ce sous-groupe comprend plusieurs répresseurs des gènes du métabolisme phénolique. Des expériences de co-expression in vivo dans le tabac appuient l'hypothèse qu'EgMYBl pourrait agir en tant que régulateur négatif de l'expression des gènes de la voie de biosynthèse de la lignine. Ce rôle potentiel en accord avec l'expression préférentielle d' EgMYB 1 dans le xylème de racines et de tiges d'Eucalyptus a été vérifié in planta chez des peupliers transgéniques. En réponse à la surexpression d'EgMYB1, le contenu en lignine du xylème secondaire des tiges est réduit. On note également une diminution ~u nombre de fibres de phloème, et des taux de ' transcrits des gènes de la biosynthèse de la lignine. De plus, des analyses transcriptomiques réalisées à partir d'ARNs de xylème et d'écorce de tiges de peupliers surexprimant EgMYBl met en évidence des classes de gènes sous-exprimés ou surexprimés. De nombreuses similitudes sont retrouvées avec les classes de gènes dérégulées chez les mutants affectés dans une des étapes de la voie de biosynthèse de la lignine, renforçant le rôle initialement proposé pour EgMYB1. Les peupliers surexprimant EgMYBl montrent également d'intéressants phénotypes foliaires qui ont été étudiés. La caractérisation fonctionnelle d'EgMYB2 réalisée chez des tabacs transgéniques surexpresseurs, nous a amenés à proposer un rôle d'activateur transcriptionnel de la voie de biosynthèse des lignines. Les résultats- 1 - présentés dans cette thèse, apportent des indications claires quant aux rôles opposés des facteurs de transcription EgMYBl et EgMYB2 dans la lignification lors de la fonnation du bois.- 11

Notre objectif était de mieux comprendre la régulation de la biosynthèse des parois secondaires lors de la formation du bois chez l'Eucalyptus, le feuillu le plus planté au monde et le deuxième dont le génome est séquencé. Nous avons caractérisé trois facteurs de transcription de la famille MYB-R2R3 et montré que EgMYB137 était un nouveau régulateur de la biosynthèse des parois secondaires. Nous avons aussi démontré que l'activité transcriptionnelle de EgMYB1, un répresseur de la biosynthèse des lignines, était régulée par une interaction protéine-protéine impliquant une histone linker (EgH1.3). Enfin, nous avons mis au point une méthode de transformation homologue chez l'Eucalyptus via A. rhizogenes. Les " hairy roots " transgéniques sont adaptées à la caractérisation fonctionnelle de gènes reliés à la formation du xylème. Nos résultats ont permis de découvrir de nouveaux acteurs impliqués dans la régulation des parois secondaires, mettant en lumière la complexité de ce processus mais aussi offrant de nouvelles perspectives pour l'amélioration du bois pour des applications industrielles comme la production de bioéthanol de deuxième génération. / Our objective was to better understand the regulation of the biosynthesis of the lignified secondary cell walls during wood formation in Eucalyptus, the most planted hardwood tree, and the second whose genome has been sequenced. We functionally characterized three Eucalyptus transcription factors of the R2R3-MYB family and identified EgMYB137 as a new regulator of secondary cell wall deposition. We also showed that the transcriptional activity of EgMYB1, a repressor of lignin biosynthesis was modulated by protein-protein interactions involving a linker histone (EgH1.3). Finally, we set up a homologous transformation system for Eucalyptus using Agrobacterium rhizogenes. The transgenic hairy roots are suitable for high throughput functional characterization of cell wall-related genes. Our findings not only allowed getting new insights into the complexity of the network regulating secondary cell walls but also open new avenues to improve wood quality for industrial applications such as second-generation bioethanol.

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Le développement érythrocytaire du parasite Plasmodium falciparum est composé de deux phases successives : une prolifération intense responsable de la maladie et une différenciation en gamétocytes responsable de la dissémination du parasite. Ce changement de statut de la cellule serait en partie dû à une expression différentielle des gènes, notamment à une régulation transcriptionnelle. Cette régulation nécessite l'interaction de deux acteurs dont la caractérisation devrait aboutir à une meilleure connaissance du développement du parasite et permettre de trouver de nouvelles voies pour combattre la maladie.<br />Après identification des promoteurs de gènes, des éléments connus chez les autres eucaryotes ainsi que des éléments dits spécifiques de Plasmodium ont été recherchés à l'aide de différents programmes bioinformatiques, puis regroupés en modules. Les différentes familles de gènes dont l'expression est cordonnée ou altérée par l'expression diminuée d'un facteur de transcription, devraient partager dans leurs promoteurs des éléments de régulation leur permettant d'être exprimées à un moment précis du développement.<br />Des facteurs se liant à l'ADN et impliqués dans la régulation transcriptionnelle ont été recherchés dans le génome du parasite. Des phases ouvertes de lecture codant des facteurs appartenant aux familles de protéines à domaine Myb, à doigt de zinc ou encore avec une architecture beta ont été identifiées et les protéines correspondantes modélisées. Le clonage et la caractérisation biochimique de trois de ces facteurs ont confirmé la pertinence de la mise en évidence informatique de ces protéines.

Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2015. / ENGLISH ABSTRACT: Biotechnology is an important tool that is used to isolate and characterise genes. It is also used to produce clones that are genetically and phenotypically similar. Many Arabidopsis thaliana transcription factors have been isolated and characterised, but many have yet to be fully described. MYB proteins are members of a super-family of multifunctional transcription factors that can also interact with other transcription factors in the control of pathways. To date, more than 126 AtMYBs have been identified, but most have not been fully characterised, particularly in terms of the molecular role(s) they play in plants. Arabidopsis thaliana MYB3, MYB6, MYB7, MYB8 and MYB32 have been reported to be negative regulators of general phenylpropanoid metabolism. It has been reported that the five transcription factors mentioned above are likely to negatively regulate flavonoid biosynthesis, even though they may have different target genes. Studies on AtMYB13, AtMYB14 and AtMYB15 reported that they are likely regulators of general phenylpropanoid metabolism. The mentioned roles of the eight AtMYB transcription factors means that they can be manipulated in order to see what effect they have on primary and secondary metabolites in plants. The transcription factors ligated into the pUBI510-GRFCA vector were then used to transform sugarcane callus (Chapter 3). Sugarcane produces sucrose which makes up 70% of the sugar produced in the world, making sugarcane a commercially important and profitable plant. The sugarcane callus was transformed via particle bombardment. The transcription factors AtMYB3, AtMYB6, AtMYB7, AtMYB13 and AtMYB32 were successfully incorporated into the genomic DNA of the sugarcane callus. The data obtained for callus over-expressing AtMYB3, AtMYB13 and AtMYB32 on solid media and the callus in liquid media were contradictory (i.e callus on solid media producing more sucrose than the wildtype whereas the same transgenic line will poduce less sucrose that the wildtype in liquid media or vice versa). However, AtMYB13 transgenic lines produced more sucrose than the wildtype. Transgenic lines of AtMYB7 all produced less sucrose as compared to the wildtype both on solid and in liquid media. The transcription factors which resulted in increased production of starch when over-expressed were AtMYB7 and AtMYB13. The data obtained for AtMYB6 transgenic lines was highly inconsistent in lines grown on same media and across the two media. The effects of these transcription factors in the overall metabolism of the sugarcane callus, either on MSC3 solid or liquid media, could not be fully determined from the GC-MS analysis as there was no consistent phenotypic effect between different transgenic lines for any of the MYB transcription factors used. In Chapter 4, a micropropagation strategy was developed and phytochemicals and their biological activities were determined for the medicinal plant Salvia repens. Salvia plants have been found to be medicinally important due to the secondary metabolites, particularly the essential oils that they produce. The plant extracts have been found to have many biological activities such as antibacterial, anti-inflammatory, antioxidant and anticancer activities. Salvia repens was successfully germinated in vitro,with 60% germination being achieved in MS media containing 1x10-5 times diluted smoke water following scarification for 12 min in 75% (v/v) H2SO4. Success rates of 100% were achieved in the hardening off process when the seedlings were moved into the greenhouse. Germination of S. repens ex vitro was 100% in an autoclaved soil mixture of 1:1 (v/v) sand and vermiculite. Importantly the medicinal value of S. repens produced in vitro or ex vitro was not lost as the GC-MS metabolite analysis showed that the plants produced the chemicals that are medicinally important. Metabolite extracts of S. repens were for the first time reported to be active against fungi with MIC values lower than 1 mg/ml over 4-5 d period against four Fusarium spp. tested. Lastly (Chapter 5), transcription factors AtMYB6 and AtMYB13 were used to trasnform Salvia stenophylla via Agrobacterium-mediated transformation, in order to determine whether the over-expression of these transcription factors could up-regulate the production of medicinally and commercially important secondary metabolites in S. stenophylla. Whilst both A. tumefaciens and A. rhizogenes strains were utilised for the transformation procedure, transformation was only achieved using A. rhizogenes and no transformants could be generated from the A. tumefaciens-treated material. Transgenic hairy roots did not produce any of the medicinally important metabolites. The GC-MS analysis of the transgenic root material identified mainly sugars and other primary metabolites. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Biotegnologie is 'n belangrike instrument wat gebruik kan word om gene te isoleer en te karakteriseer. Dit word ook gebruik om klone wat geneties en fenotipies identies is te produseer. Baie Arabidopsis thaliana transkripsiefaktore is al geïsoleer en gekarakteriseer, maar baie moet nog volledig beskryf word. MYB proteïene is lede van 'n super-familie van multifunksionele transkripsiefaktore wat ook interaksie het met ander transkripsiefaktore tydens die beheer van metaboliese weë. Tot op hede is meer as 126 AtMYBs geïdentifiseer, maar die meeste is nie volledig gekarakteriseer nie, veral nie ten opsigtigte van die molekulêre rol(le) wat hulle in plante speel nie. Arabidopsis thaliana MYB3, MYB6, MYB7, MYB8 en MYB32 is gevind om negatiewe reguleerders van algemene fenielpropanoied-metabolisme te wees. Daar is ook berig dat dié vyf transkripsiefaktore moontlik flavenoied-biosintese negatief kan reguleer, selfs al kan hulle verskillende teikengene hê. Studies op AtMYB13, AtMYB14 en AtMYB15 het berig dat hulle waarskynlik reguleerders van algemene fenielpropanoied-metabolisme is. Die genoemde rolle van die agt AtMYB transkripsiefaktore beteken dat hulle gemanipuleer kan word om te bepaal watter effek hulle op primêre en sekondêre metaboliete in plante het. Die transkripsiefaktore, wat in die pUBI510-GRFCA vektor geligeer was, is toe gebruik om suikerriet-kallus te transformeer (Hoofstuk 3). Suikerriet vervaardig sukrose wat tot 70% van die suiker wat in die wêreld geproduseer word opmaak. Dít maak suikerriet 'n kommersieel belangrike en winsgewende plant. Die suikerriet-kallus is getransformeer deur middel van partikel-bombardering. Die transkripsiefaktore AtMYB3, AtMYB6, AtMYB7, AtMYB13 en AtMYB32 was suksesvol in die DNA van die suikerriet-kallus opgeneem. Data wat verkry was vir kallus wat AtMYB3, AtMYB13 en AtMYB32 ooruitgedruk het op soliede media en kallus in vloeibare medium was teenstrydig (m.a.w. kallus op soilede media wat meer sukrose as die wildetipe op soliede media geproduseer het, terwyl dieselfde transgeniese lyn minder sukrose as die wildetipe geproduseer het in vloeibare medium, en anders om). Nietemin, het AtMYB13 transgeniese lyne meer sukrose geproduseer as die wildetipe. Transgeniese lyne van AtMYB7 het almal minder sukrose geproduseer as die wildetipem op beide soliede en vloiebare media. Die transkriopsiefaktore wat gelei het tot 'n styging in stysel produksie wanneer hulle ooruitgedruk was was AtMYB7 en AtMYB13. Data wat verkry is van die AtMYB6 transgeniese lyne was hoogs veranderlik in lyne wat op dieselfde medium gegroie was en oor die twee media. Die effek van hierdie transkripsiefaktore op die algehele metabolisme van die suikerriet-kallus, hetsy op MSC3 soliede of vloeibaremedia, kon egter nie van die GC-MS analise ten volle bepaal word aangesien daar geen konsekwente fenotipiese effek tussen die verskillende transgeniese lyne vir enige van die gebruikte MYB transkripsiefaktore was nie. In Hoofstuk 4 was ‘n mikropropagerings strategie ontwikkel. Fitochemikalieë en hul biologiese aktiwiteite was ook bepaal vir die medisinale plant Salvia repens. Salvia plante is gevind om medisinaal belangrik te wees as gevolg van die sekondêre metaboliete, veral die essensiële olies, wat hulle produseer. Dit is ook bevind dat die plant-ekstrakte baie biologiese aktiwiteite soos anti-bakteriese, anti-inflammatoriese, anti-oksidant en anti-kanker aktiwiteite het. Salvia repens is suksesvol ontkiem in vitro, met 60% ontkieming wat bereik is in MS media met 1x10-5 maal verdunde rook-water na insnyding vir 12 min in 75% (v/v) H2SO4. Suksessyfers van 100% was behaal in die afhardingsproses wanneer die saailinge na die glashuis verskuif was. Ontkieming van S. repens ex vitro was 100% in 'n geoutoklaveerde grondmengsel van 1:1 (v/v) sand en vermikuliet. Gewigtig het die medisinale waarde van S. repens wat in vitro of ex vitro geproduseer was nie verlore gegaan nie. Die GC-MS data metaboliete analise het aangetoon dat die plante die medisinaal belangrike chemikalieë geproduseer het. Metaboliet-ekstrakte van S. repens was vir die eerste keer na berig aktief teen swamme, met MIK waardes laer as 1mg/ml oor ‘n tydperk van 4-5 d, teen vier Fusarium spp wat getoets was. Laastens (Hoofstuk 5), transkripsiefaktore AtMYB6 en AtMYB13 was gebruik om Salvia stenophylla te transformeer deur Agrobacterium-bemiddelde transformasie, om sodoende te bepaal of die ooruitdrukking van hierdie transkripsiefaktore die produksie van medisinale en kommersieël-belangrike sekondêre metaboliete in S. stenophylla kan verhoog. Alhoewel beide A. tumefaciens en A. rhizogenes stamme gebruik was vir die transformasie proses, kon transformasie slegs deur die gebruik van A. rhizogenes bereik word. Geen transformante kon gegenereer word vanuit die A. tumefaciens behandelde materiaal nie. Transgeniese harigewortels het geen van die medisinaal belangrike metaboliete vervaardig nie. Die GC-MS analise van die transgeniese wortel materiaal het hoofsaaklik suikers en ander primêre metaboliete geïdentifiseer.

An effective electrochemical sensor for myoglobin (Myb) detection was developed using a simple procedure of denaturing the protein with guanidine hydrochloride and detecting the released heme group by cyclic voltammetry. The concentration of denaturant was optimized to obtain maximum current response for the analyte (Myb). To improve the sensitivity of the sensor, the working electrode, glassy carbon electrode was modified with a layer of Titania nanotubes (TNT). The direct electrochemical behavior of the modified electrode (TNT-GCE) was studied using cyclic voltammetry (CV). The performance of the sensor was investigated and optimized and the system was evaluated by monitoring the Myb concentration. Despite the reduced current response for the modified electrode compared to bare GCE, the sensitivity of the system was improved significantly by overcoming the large background current due to denaturant. The developed TNT modified electrode improved the detection limit of Myb and showed good stability, sensitivity and reproducibility. Under optimal conditions, the catalytic currents are linearly proportional to the concentrations of Myb in the wide range from 50 nM to 6 M. This approach provides improved sensitivity in the given range, and may provide a novel and efficient platform for the fabrication of sensors for other heme proteins.