Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-09-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A nicotina e altamente consumida, por ser um componente do cigarro. Em gestantes, atravessa a membrana placentaria e esta presente no leite materno. A nicotina induz apoptose em celulas de diferentes orgaos, interfere nas funcoes endocrinas e pode causar atrofia testicular, disfuncoes de erecao e das gonadas, bem como infertilidade masculina. Ela tambem suprime a secrecao de testosterona em ratos tratados na fase adulta. Como a testosterona e produzida por celulas de Leydig a partir do colesterol e este mecanismo envolve a participacao de macrofagos testiculares (importantes para o desenvolvimento pos-natal da celula de Leydig), gerou-se a hipotese de que a nicotina poderia provocar toxicidade testicular via alteracoes morfofuncionais em celulas de Leydig, com possivel envolvimento dos macrofagos. Desta forma, o objetivo desta pesquisa foi investigar se a nicotina administrada a ratas prenhes e lactantes, em dose equivalente a um maco diario de cigarros, consumida por gestantes fumantes, provoca na prole: a) alteracoes dos niveis plasmaticos e intratesticulares de colesterol e dos hormonios sexuais; b) alteracao morfologica e das densidades numericas de celulas de Leydig e macrofagos testiculares; Para tanto, 22 ratas foram tratadas com nicotina durante a gravidez e a lactacao. A nicotina foi administrada atraves de uma minibomba osmotica, calibrada de forma a liberar 2 mg/kg/dia de nicotina (equivalente ao consumo de 20 cigarros/dia). A minibomba foi implantada subcutaneamente, no dorso da rata, no primeiro dia de prenhez e substituida no 1 ‹ dia apos o nascimento (periodo de lactacao), garantindo a exposicao ate o desmame (22dpp). Minibombas sem nicotina foram implantados em outras 22 ratas prenhes e lactantes (grupo controle gSham h) com o objetivo de verificar a inocuidade deste procedimento. Mais 22 ratas prenhes e lactantes nao receberam qualquer tratamento ou manipulacao (grupo controle absoluto). Os filhotes machos provenientes de cada rata foram distribuidos em 4 subgrupos de acordo com a idade de eutanasia (1, 30, 60 e 90dpp). Apos a analise biometrica (peso e volume), os testiculos foram processados para analise histopatologica (historresina e parafina; metodo do PAS+H) e para analises imuno-histoquimicas (inclusoes em parafina) para marcacao de celulas de Leydig adultas (anticorpo anti-enzima esteroidogenica 11ƒÀ-HSD II) e de macrofagos residentes (anticorpo anti-ED2). As densidades numericas das celulas de Leydig e dos macrofagos foram computadas atraves do sistema de analise de Imagem Leica Q-Win. Foram realizadas dosagens plasmáticas de colesterol e testosterona (em todas as idades) e estradiol (30, 60 e 90 dias), além das dosagens intratesticulares de colesterol e testosterona (60 e 90 dias). Para comprovação da presença de nicotina no leite e de sua transferência para os filhotes, a nicotina e seu metabólito, a cotinina, além de seus subprodutos, foram detectados no leite materno, na urina e no plasma dos filhotes em fase de amamentação, por cromatografia. Os resultados da cromatografia confirmaram a passagem destas substâncias para a circulação sanguínea dos neonatos. Animais do subgrupo tratado apresentaram, ao nascimento, redução de peso corpóreo (p<0,05) e do colesterol plasmático (p<0,05), além de uma sugestiva redução da quantidade de gotículas de lipídeo no citoplasma das células de Leydig fetais. Aos 30 dias de idade, os testículos da prole exposta à nicotina apresentaram redução do peso (p<0,05) e do volume testicular (p<0,05) em relação ao controle absoluto. Aos 60 e 90 dias, os animais dos subgrupos tratados apresentaram peso corpóreo levemente maior (p<0,05) que o subgrupo controle absoluto e, aos 90 dias, tanto a dosagem de colesterol (p<0,05) quanto a dosagem de testosterona plasmática foram maiores no subgrupo tratado (p<0,05) em relação a ambos os controles. Embora não tenham ocorrido diferenças nas densidades numéricas de células de Leydig e macrófagos, a análise histopatológica mostrou, aos 60 e 90 dias, uma incidência maior de células de Leydig em degeneração, além de intensa descamação e desorganização do epitélio seminífero. Aos 90 dias, acompanhando o aumento de colesterol e testosterona, observou-se também uma sugestiva hipertrofia das células de Leydig e maior incidência de anáfases e metáfase meióticas, além de núcleos de célula de Sertoli soltos no lúmen. Como os níveis de estradiol se mostraram sutilmente reduzidos nas três idades analisadas (30, 60 e 90 dias), é possível que a ação da nicotina sobre o testículo possa ter provocado também alterações das células de Sertoli. Concluiu-se que a nicotina afeta o metabolismo de colesterol e testosterona, causa alterações morfofuncionais nas células de Leydig e alterações da espermatogênese e provoca redução do número de neonatos oriundos de ratas tratadas durante toda a prenhez, induzindo nestes a ocorrência de baixo peso corpóreo e de baixo índice de colesterol plasmático. Contudo, alterações quantitativas das populações de células de Leydig e de macrófagos testiculares das proles não foram observadas nas diferentes fases do desenvolvimento sexual. / Nicotine is largely consumed by worldwide people since it is a component of cigarettes. It reaches the maternal milk and is able to cross the placental membrane. Nicotine induces apoptosis in different cell types and interferes with endocrine functions. Reproductive side effects of this drug, such as testicular atrophy, erectile dysfunction and male infertility were also described. Nicotine suppresses testosterone secretion in adult male rats. Testosterone is produced from cholesterol and is synthesized by Leydig cells, with participation of the testicular resident macrophages, which are important for post-natal Leydig cell development. These data raised the hypothesis that the testicular damage induced by nicotine could be mediated by alterations or even apoptosis of Leydig cells. Because macrophages are also involved in testosterone synthesis and Leydig cell development, it is reasonable to consider the role of these cells in the nicotine-induced testicular damage. Given the complex testicular paracrine regulation, it is probable that such alterations induce germ cell damage in the post-natal phase. Thus, the aim of this study was to investigate whether the administration of nicotine to pregnant and lactating rats, in a dose equivalent to the consumption of one packet of cigarettes per day, provokes: a) alterations of cholesterol and sexual hormone levels in the plasma and in the testis; b) morphological and numerical alterations of Leydig cells and testicular macrophages. For this, 22 rats were treated with nicotine during pregnancy and lactation. Nicotine was administrated using an osmotic minipump calibrated in way to release 2mg/Kg/day of nicotine (equivalent to the consumption of 20 cigarettes/day). The minipump was implanted subcutaneously at the first day of pregnancy and replaced just after birth (lactation period). The second minipump was removed at the weaning day (22dpp). Minipumps without nicotine were implanted in other 22 pregnant and lactating rats (Sham group) with the aim to check the innocuousness of this procedure. More 22 pregnant and lactating rats did not receive any treatment or manipulation (Control group). The male pups of each offspring were distributed in 4 subgroups according to the age of euthanasia (1, 30, 60 and 90dpp). The testes were submitted to biometric analysis (weight and volume) after what they were processed for histopathological study (historesin and paraffin sections/PAS+H) and immuno-detection of adult Leydig cell (anti-11â-HSD type 2) and resident macrophages (anti-ED2). The numerical densities of Leydig cells and ED2+ macrophages were obtained using the Leica Q-Win image analysis system. Plasma levels of cholesterol and testosterone (all ages) and estrogen (30, 60 and 90 dpp) as well as intratesticular cholesterol and testosterone (60 and 90 dpp) were investigated. Plasma, urine and milk cotinine and nicotine levels were obtained at 22ddp by chromatography. The results showed that nicotine provoked decrease of body weight (p<0.05) and cholesterol plasma level (p<0.05) at (1dpp), besides the suggesting reduced lipids in the fetal Leydig cells cytoplasm. Decrease of testicular weight and volume occurred at 30dpp (p.0.05) but not at 60dpp and 90dpp. At 60 and 90dpp, the nicotine-treated rats showed increase of body weight and at 90dpp the nicotine-treated rats show increased in plasma cholesterol and testosterone levels (p<0.05). Although no alterations of the numerical densities of macrophages and Leydig cells were observed, the histopathological analysis showed that, at 60 and 90dpp, there was an increase of the frequency of degenerating Leydig cells and a pronounced disorganization and sloughing of the seminiferous epithelium. At 90dpp a suggestive hypertrophy of Leydig cells was also observed, what parallels the increase of cholesterol and testosterone levels. At this age a suggestive increase of the frequency of meiotic anaphase and metaphase figures and Sertoli cell nuclei in the tubular lumen were also observed. Since a subtle reduction of the estradiol levels was observed at the three ages studied (30, 60 and 90dpp), it is possible to suggest that the action of nicotine in the testis caused Sertoli cell alterations. Finally, it was concluded that nicotine provokes a reduction of the offspring number, body weight and cholesterol plasma level when administered to females during the whole pregnancy period. It was also concluded that nicotine administration in rats during the whole pregnancy period and during lactation affects the metabolism of cholesterol and testosterone and leads to morphofunctional alterations of Leydig cells and of spermatogenesis in the adult offspring. On the other hand, this treatment does not cause quantitative alterations of Leydig cell and macrophage populations. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-11-27T18:25:19Z No. of bitstreams: 1 Djalma Gomes Ferrão Carvalhal Um ensaio de adesao... 2001.pdf: 31649822 bytes, checksum: cea5fde124b280c0b60a4b69bc0b6cb3 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-27T18:25:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Djalma Gomes Ferrão Carvalhal Um ensaio de adesao... 2001.pdf: 31649822 bytes, checksum: cea5fde124b280c0b60a4b69bc0b6cb3 (MD5) Previous issue date: 2001 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / O objetivo deste trabalho é desenvolver um ensaio de adesão, baseado no ensaio de Stamper- Woodruff, para o estudo das interações entre macrófagos e matriz conjuntiva. Foram induzidos bolsões inflamatórios em camundongos da linhagem BALB/c para obtenção de secções de pele inflamada, e células macrofágicas da linhagem J774G.8 foram utilizadas na padronização do ensaio. Secções de 7 i^m de espessura foram colocadas em lâminas de vidro, fixadas com acetona e bloqueadas com BSA. Foi estabelecida a concentração de 10® células/100 fil como a mais apropriada para a realização do ensaio, através de diluições seriadas. Células J774G.8 sem tratamento prévio ou tratadas com: ácido tetraacético diamino etileno, Mn++, lipopolissacarídeo, forbol miristato acetato, zimosan, os peptídios CS-1 e RGD, os anticorpos anti-CD49d ou contra a cadeia (32 de integrinas, foram adicionadas ás secções e incubadas por 30 minutos á temperatura ambiente. Como resultado, as células macrofágicas aderem preferencialmente ás áreas de inflamação. A adesão das células é dependente de cátions divalentes e pode ser modulada por substâncias que promovam a ativação celular. Além disso, a adesão mediada por integrinas pode ser inibida por peptídios RGD e CS-1 ou com anticorpos contra integrinas da família (31 e (32. A adesão das células macrofágicas é inibida mais intensivamente pela infecção com Leishmania mas não com a infecção por Mycobacterium ou por fagocitose de partículas de látex. Desta forma, o ensaio desenvolvido foi capaz de demonstrar a especificidade da adesão de células macrofágicas pela matriz conjuntiva bem como de sugerir a existência de mecanismos específicos de regulação das interações entre macrófagos e a matriz conjuntiva durante a infecção por Leishmania. / The aim of this work was to develop an adhesion assay, based on the Stamper-Woodruff’s assay to study the interactions between macrophages and the connective matrix. Inflammatory pouches were produced in BALB/c mice to obtain inflammed skin sections, and J774G.8 macrophage cell line was applied to standardize the assay. Sections of 7|im thick were placed onto glass slides, fixed with acetone and blocked with bovine serum albumin. The cell concentration of 10®/100 |xl was proved to be most appropriate for the assay, through serial dilutions. J774G.8 cells, with or without ethylene diamine tetraacetic acid, Mn'"'", Lipopolysaccharide, phorbol myristate acetate, zymosan, CS- 1, RGD peptide, antibodies anti-CD49d or against (32 chain integrin treatment, were added onto the sections and incubated for 30 minutes at room temperature. Macrophage cells adhered preferentially to inflammed areas. The adhesion of cells was dependent on divalent ions and could be modulated by substances that promote cell activation. Moreover, the adhesion mediated by integrin can be inhibited either by RGD or CS-1 peptides or by antibodies against integrins of the |31 or |32 sub-family. Adhesion of macrophage cells was intensively inhibited by infection with Leishmania and was not affected by infection with Mycobacterium or by endocytosis of latex beads. Thus, the developed assay was able to show the specific adhesion of macrophages to connective matrix, as well to illustrate a specific downregulation of macrophage adhesion to inflammed skin in Leishmania infection.

Made available in DSpace on 2015-11-11T12:09:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 leonardo_silva_ioc_dout_2014.pdf: 1893436 bytes, checksum: a728c60780229234c48d95aea41671ad (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fagócitos mononucleares são as células-alvo para micobactérias patogênicas que geralmente requerem um ambiente intracelular adequado para sua sobrevivência e replicação. Mycobacterium leprae, o agente etiológico da Hanseníase, é capaz de subverter mecanismos microbicidas de macrófagos e sobreviver e replicar no interior dessas células. Contudo o mecanismo molecular envolvido na modulação da célula hospedeira, não étotalmente compreendido. O presente estudo mostrou o potencial papel exercido pelo IGF-I na patogênese causada pelo M. leprae. Foi demonstrado que o M. leprae induz a expressão do fator de crescimento semelhante a insulina (IGF-I), em macrófagos RAW 264.7. Curiosamente, apenas quando as células foram tratadas com anticorpo neutralizante para o receptor do tipo I de IGF-I (IGF-1R) o M. leprae foi capaz de regular positivamente a expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) em macrófagos RAW 264.7 ou ativar o promotor de iNOS em células transfectadas com a construção contendo gene repórter da luciferase sob o controle do promotor de iNOS O bloqueio da sinalização de IGF-I reduziu a viabilidade intracelular do M. leprae determinada por qPCR. As células RAW 264.7 pré-tratadas com IGF-I apresentaram uma redução significativa da atividade do promotor iNOS em resposta ao Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis e consequentemente um aumento na viabilidade intracelular monitorada através de contagem de Unidades Formadoras de Colônia (CFU). Outro fato é que IGF-I foi capaz de atenuar a ativação de macrófagos mediada por IFN-\F067 medida através da expressão de iNOS e da quantificação da fosforilação de Ativador de transcrição e de transdução de sinal (pSTAT1). Além disso, o IGF-I foi capaz de induzir aumento de PGE2 em macrófagos, um eicosanoide previamente implicado na persistência micobacteriana no hospedeiro. Finalmente, a análise imuno-histoquímica de lesões cutâneas de pacientes lepromatosos (LL) revelou uma expressão abundante de IGF-I por macrófagos espumosos altamente infectados Além disso, uma alta expressão da proteína Supressora de sinalização de viii citocinas 3 (SOCS3) e diminuição a ativação STAT1 foi observada em lesões LL, em comparação com lesões tuberculóide BT. Esses resultados sugerem que o IGF-I pode contribuir para a persistência micobacteriana no hospedeiro, modulando negativamente s mecanismos microbicidas do hospedeiro durante a infecção / Mononuclear phagocytes are target ed cells for pathogenic mycobacteria that gener al ly require a favorable intracellular environment in wi c h they survive and replicate. Mycobacterium leprae, the etiologic agent of leprosy , is able to subvert macrophage microbicid al mechanisms and survive and replicate within these cells. However, the molecular mechanism involved in pathogen driven host cell modulation is not fully understood. The present study investigated the potenti al role of insulin - like growth factor - I (IGF - I) i n M. leprae pathogenesis. We showed that M. leprae induces IGF - I expression in RAW 264.7 macrophages in a dose - dependent manner . Notably, only when cells were treated with a neutr al izing antibody to IGF type 1 receptor (IGF - 1R) , M. leprae infection was able to upregulate inducible nitric oxide sintase ( iNOS ) expression in RAW cells or to activate the iNOS promoter in cells transfected with the iNOS - luciferase reporter construct . . The blockage of IGF - I sign al ing al so decreased the intracellular M. le prae viability as measured by qPCR . Mo reover, RAW cells p re - treated with IGF - I showed a significant reduction in iNOS promoter activity in response to Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium smegmatis with subsequent increase in bacteri al intracellular surviv al as accessed by colony - forming unit counts (CFU) . Of note, IGF - I was able to attenuate interferon gamma (IFN -  ) activating effects on macrophages as acessed by iNOS expression and quantification of phosphorylate d Sign al Transducers a nd Activators of Transcription 1 (p - STAT1). Addition al ly, IGF - I was able to induce PGE 2 secretion in murine macrophages, an eicosanoid previously implicated in mycobacteri al persistence in the host. Fin al ly, i mmunohistochemic al an al ysis of skin lesions of lepromatous leprosy (LL) patients reve al ed an abundant expression of IGF - I by highly infected foamy macrophages. Moreover, LL lesions reve al ed higher expression of Suppressor of cytokine sign al ing 3 (SOCS3), as well as decreased levels of p - STAT1 when compared to borderline tuberculoid (BT) lesions. Al together, our data suggest that IGF - I produced by macrophages in response to M. leprae infection constitutes a critic al regulator in subverting the immune response in leprosy

Made available in DSpace on 2016-03-04T14:02:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 priscila_andrade_ioc_dout_2014.pdf: 6946480 bytes, checksum: 1eca06682311d8d83fb18d7d32053a36 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Na hanseníase, a reação reversa (RR) é considerada um fenômeno de reativação imune, no qual uma resposta inflamatória abrupta se inicia, comprometendo a pele e os nervos periféricos. A RR ocorre ao longo do espectro da hanseníase, sendo descrita, inclusive, nas formas anérgicas lepromatosas (LL) subpolares. É sugerido que nas formas reacionais, células imunes da pele como macrófagos e células dendríticas, se tornam ativadas espontaneamente e iniciam uma resposta imune contra componentes do Mycobacterium leprae (ML), o que levaria a quebra da imunossupressão pré-existente. O objetivo desse estudo é caracterizar as populações celulares que constituem as lesões de pele L-lep (BL e LL) antes e no início da RR, assim como, determinar a programação genética envolvida na quebra da anergia tecidual nesse grupo durante esse episódio. O início da RR altera drasticamente a organização e morfologia da lesão L-lep, levando ao aparecimento de novas estruturas e tipos celulares, como células epitelioides, granulomas e uma grande diversidade fenotípica de macrófagos e células dendríticas. O marcador de células dendríticas plasmocitoides, CD123, foi mais expresso em lesões de pele RR do que no tecido não reacional, com a população CD123+ exibindo tanto marcadores fenotípicos de macrófagos quanto de células dendríticas. Por sua vez, o ML pôde induzir a expressão dessa molécula in vitro A análise de expressão gênica mostrou um aumento dos níveis de RNA mensageiro da interleucina-3 (IL-3), fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF), fator estimulador de colônias de macrófagos e granulócitos (GM-CSF), fator de necrose tumoral-\03B1 (TNF\03B1), interferon-\03B3 (IFN-\03B3), indoleamina-2,3-dioxigenase (IDO), interleucina-15 (IL-15), receptor de vitamina D (VDR), quimiocina CXCL10 e receptor Toll-like 2 (TLR2) nas lesões RR quando em comparação com o grupo L-lep. Em síntese, nosso estudo demonstrou que o microambiente da lesão RR favorece a diferenciação e plasticidade celular, além de exibir uma variedade de populações mielomonocíticas, destacando o papel das células CD123+ e de um eixo de ativação dependente de IL-3 durante a RR / In leprosy, type 1 reaction (T1R) is considered a Th1 immune reactivation in which a sudden inflammatory response takes place that compromises t he skin and peripheral nerves. T1R occurs across the leprosy clinical spectrum and has even been d escribed in the anergic subpolar lepromatous (LL) forms. It is hypothesized that in the T1R forms, skin immune cells such as macrophages and dendritic cells (DCs) become activated, which in turn could initiate a local innate immune response against the exi sting Mycobacterium leprae (ML) components, overwhelm ing the predominant immunosuppressive state. The aim of the present study is to characterize the skin cellular populations that constitute the BL and LL (L - lep) skin lesion before and during the T1R epis ode , as well as to determine the gene programming involved in the disruption of the tissue immunosuppression brought about by this phenomenon. The outset of T1R drastically alters the morphological landscape of the LL skin lesion, leading to the appearance of new structures and cell types such as epithelioid granulomas and a wide variety of macrophagic and DC phenotypes. The plasmacytoid DC marker, CD123, was more intensely expressed in T1R skin lesions than in non - reactional tissue, with CD123 + cells exhibiting both macrophag ic and DC phenotypic markers. In turn, ML, but not TNF - α, was able to increase CD123 expression while gene expression analyses demonstrated IL - 3, M - CSF , GM - CSF , TNF α , IFN - γ , IDO , IL - 15 , VDR , CXC L 10, and TLR2 upregulation in the T1R lesions in comparison to the non - reactional group. In summary , our study showed that the T1R lesion environment favors cell differentiation and plasticity in addition to displaying a high diversity of myelomonocytic populations and highlighting the role of CD123 + cells and the IL - 3 axis during the progression of T1R.

Made available in DSpace on 2016-03-28T12:39:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 bruno_alves_ioc_mest_2014.pdf: 1630885 bytes, checksum: 8913e4844c4acbc32212713a6c96f73c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Pacientes infectados pelo HIV-1 apresentam maior permeabilidade intestinal, a qual permite a passagem para a circulação sangüínea de elevada quantidade de produtos microbianos, fenômeno conhecido por translocação microbiana. Tal fenômeno induz crônica ativação do sistema imune, um dos principais mecanismos indutores da queda do número de linfócitos T CD4+ nos pacientes infectados. Dentre os produtos translocados encontram-se ligantes dos receptores tipo Toll (TLR), os quais reconhecem componentes microbianos e podem, portanto, ser ativados por uma grande variedade de patógenos. A ativação de TLR desencadeia uma complexa cascata de sinalização, induz a síntese de diversas citocinas, e modula a função de células dendríticas, macrófagos e linfócitos, células-alvo da infecção pelo HIV-1. Em estudos realizados em nosso laboratório vimos que a ativação de TLR2 resulta na inibição da replicação do HIV-1 em linfócitos e macrófagos, fenômeno este mediado pela citocina IL-10 e por \03B2-quimiocinas. No entanto, tendo em vista a potente resposta imunitária inata desencadeada pela ativação de TLRs, com a produção de ampla variedade de produtos inflamatórios, era possível que outros fatores, como a citocina IL-27, um potente inibidor da replicação do HIV-1, estivessem envolvidos na inibição da replicação viral gerada pela ativação deste receptor. Neste trabalho, investigamos se a IL-27 estaria envolvida na inibição da replicação induzida pela ativação de TLR2. Para tanto, tratamos macrófagos primarios humanos com agonistas de TLR2 para analisar a expressão e produção de IL-27 por qPCR e ELISA Nossos dados mostram que Pam3CSK4, ligante do dímero TLR2/TLR1, promoveu um aumento de expressão de EBI3 e p28 (subunidades da IL-27), e que Pam2CSK4 aumentou a expressão de EBI3. Os mesmos ligantes aumentaram nos níveis de IL-27p28 solúvel medidos por um kit de ELISA que detecta apenas a subunidade IL-27p28. Entretanto, a IL-27 em sua forma heterodimérica não foi encontrada quando um kit de ELISA capaz de detectar as duas subunidades da IL-27 foi utilizado. A seguir, observamos que a inibição da replicação do HIV-1 por ambos os ligantes de TLR2 foi significantemente revertida por anticorpos policlonais bloqueadores da IL-27. Da mesma forma, o bloqueio da via de MyD88, uma proteína adaptadora com papel na sinalização desencadeada pela maioria dos TLRs, o efeito anti HIV-1 de Pam2CSK4, mas não o de Pam3CSK4. Por que a inibição do HIV-1 mediada por IL-27 é dependente de Interferon tipo 1 (IFN-1), a expressão de IFN-1 e APOBEC3G (um gene estimulado por IFN-1 que inibe o HIV-1) também foi avaliada, e descobrimos que a expressão de nenhum dos dois genes foi modulada pela ativação de TLR2. Finalmente, a ativação de TLR2 induziu aumento na expressão de p35 e p40, subunidades de citocinas da família da IL-12/IL-27. Concluindo, nossos resultados sugerem que a subunidade p28 da IL-27 (IL-27p28) está implicada na redução da replicação do HIV-1 induzida por TLR2 em macrófagos humanos. Nosso estudo também abre caminho para a investigação do papel de outros membros da família de citocinas da IL-12 (como a IL-35) no controle da replicação do HIV-1 / HIV - 1 infected patient s present increased intestinal permeability , which allows the passage of microorganisms or microbial antigens to the blood, phenomenon known as microbial translocation . This phenomenon induces a chronic activation of the immune system of these patients, which is one of the main mechanisms contributing for the decrease of the CD4 + T cell number in HIV - 1 - infected patients . Among st the translocated products are several agonists of Toll like receptor (TLR), whic h recognize microbial component s and may , therefore , be activated by a large variety of pathogens . TL R activation triggers a complex signaling pathway , induces the synthesis of several cytokines , and modulates the function of dendritic cells, macrophages and lymphocytes , cells that are target for HIV - 1 infection . Studies performed in our laboratory show t hat TLR2 activation results in inhibition of HIV - 1 replication in lymphocytes and macrophages , a phenomenon mediated by IL - 10 and β - chemokines . However , because of the potent innate i m mune response triggered by TLR activation , resulting in the production of a wide variety of inflammatory molecules , it is possible that other factors contribute to reduce the HIV - 1 replication in this condition. In this study , we investigate whether the cytokine IL - 27, a potent inhibitor of HIV - 1 replication , could be involv ed in inhibition of HIV - 1 replication upon activation of TLR2 . Thus, h uman primary macrophages were treated with different TLR2 agonists in order to analyze the expression and production of IL - 27 by qPCR and ELISA. We found that Pam3CSK4 increased the expr ession of EBI3 and p28 (IL - 27 subunits ) , and Pam2CSK4 increased the expression of EBI3. The same ligands augmented the production of soluble IL - 27p28, as measured by an ELISA kit that detects only the IL - 27p28 subunit . However, the IL - 27 in its heterodi mer ic structure was not found when an ELISA kit able to detec t both IL - 27 subunits was used . Next, we observed that the inhibition of HIV - 1 replication induced by both TLR2 ligands was significantly reversed by anti - IL - 27 monoclonal antibodies. Likewise, the blockage of MyD88 pathway reduced (over 80%) the anti - HIV - 1 effect of Pam2CSK4 , but not the HIV - 1 inhibitory effect induced by Pam3CSK4. Because the IL - 27 - mediated HIV - 1 inhibition is dependent of Interferon type - 1 (IFN - 1), the expression of IFN - 1 and APOBEC3G (an IFN - 1 stimulated gene that inhibits HIV - 1) was also assessed, and we found that the expression of both genes was not modulated by TLR2 ligation. Finally, the TLR2 activation led to an enhanced expression of p35 and p40, subunits of the IL - 12/I L - 27 family of cytokines. In conclusion, our results suggest that the IL - 27 subunit p28 (I L - 27p28) is implicated in the TLR2 - induced reduction of HIV - 1 replication in primary human macrophages. Our study also warrants the investigation of the role of other members of IL - 12 family of cytokines (such as IL - 35) in the control of HIV - 1 replication.

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:35:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 fernanda_silva_ioc_mest_2014.pdf: 3910647 bytes, checksum: 4b04c7f0b0d2eaf5ff868421bef619ec (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A leishmaniose ainda é uma das doenças mais negligenciadas do mundo. Ela está presente nos cinco continentes e é endêmica em 98 países, com 350 milhões de pessoas vivendo em zonas de risco e mais de 12 milhões de pessoas infectadas. Compreende um complexo de doenças causadas por mais de 20 espécies do gênero Leishmania. No Brasil, a Leishmania amazonensis é uma espécie dermotrópica importante. Apesar do progresso na compreensão da bioquímica e biologia deste parasito, este conhecimento ainda não tem refletido na descoberta de novos e eficazes agentes quimioterápicos contra a doença. O tratamento atual é insatisfatório, com altas taxas de toxidez e ineficácia, e não há vacina humana licenciada. A pesquisa de novos medicamentos, a partir de fontes naturais, é amplamente utilizada como uma abordagem bem sucedida na detecção de compostos para o tratamento de doenças parasitárias. Compostos puros obtidos de plantas, como certos flavonoides, exibem atividade antiprotozoária. A apigenina é uma flavona bioativa, abundantemente presente em frutas, ervas e legumes, que mostrou atividade leishmanicida. A apigenina inibiu o crescimento celular de ambas as formas evolutivas de L. amazonensis de maneira dose-dependente. Este efeito inibitório, em promastigotas, foi igual a 74% após 24 h de tratamento com 96 \03BCM de apigenina e, em amastigotas intracelulares, foi igual a 71% após 72 h de tratamento com 12 \03BCM do composto. O IC50/24 h em promastigotas foi 23,68 \03BCM e o IC50/72 h em amastigotas foi 4,33 \03BCM. Observou-se que a apigenina foi capaz de induzir o aumento nos níveis de ERO nos promastigotas e nos macrófagos infectados com L. amazonensis A incubação com os antioxidantes NAC e GSH reduziu a morte induzida pela apigenina nesses parasitos. A apigenina também foi capaz de causar a diminuição no potencial de membrana mitocondrial, a parada do ciclo celular, a diminuição do potencial proliferativo e alterações ultraestruturais mitocondriais e golgienses nos promastigotas tratados, também de maneira dose-dependente. Além disso, os macrófagos infectados mostraram que o tratamento com apigenina induziu um aumento no número de autofagossomos próximo das amastigotas, sugerindo também a contribuição da autofagia no mecanismo de ação do composto. Na avaliação in silico, a apigenina exibiu propriedades ADMET favoráveis e preencheu a "Regra dos 5\201D de Lipinski, mostrando ser bem absorvida, permeável e oralmente viável. O tratamento oral com apigenina (1 e 2 mg/Kg/dia) em camundongos BALB/c infectados com L. amazonensis mostrou controlar o desenvolvimento da lesão na orelha destes animais e reduzir a carga parasitária de maneira dose-dependente. Os resultados in vitro contribuíram para elucidar a atividade leishmanicida da apigenina e, juntamente como os resultados in vivo, entusiasmam em propor essa flavona como um composto suplementar no tratamento da leishmaniose / Leishmaniasis is still one of the most neglected diseases in the world. It is present on five continents and is endemic in 98 countries, with 350 million people living in areas at risk and more than 12 million people infected. Comprises a complex of diseases caused by over 20 species of the genus Leishmania . In Brazil, Leishmania amazonensis is an important dermotropic specie. Despite progress in understanding the biochemistry and biology of this parasite, this knowledge has not been refle cted in the discovery of new and effective chemotherapeutic agents against the disease. The current treatment is unsatisfactory, with high toxicity and ineffectiveness, and there is no licensed human vaccine. The research of new drugs from natural sources is widely used as a successful approach in detecting compounds for the treatment of parasitic diseases. Pure compounds obtained from plants, such as certain flavonoids, exhibit antiprotozoal activity. Apigenin is a bioactive flavone, abundantly present in fruits, herbs and vegetables, which showed leishmanicidal activity. Apigenin inhibited cell growth of both forms of L. amazonensis in dose - dependent manner. This inhibitory effect on promastigotes was equal to 74% after 24 h of treatment with 96 μM apigenin and on intracellular amastigotes was equal to 71% after 72 h of treatment with 1 2 μM of the compound. The IC 50 / 24 h) in promastigotes was 23.68 μM and the IC 50 /72 h in amastigotes was 4.33 μM. It was observed that apigenin was able to induce increased lev els of ROS in treated promastigotes and L. amazonensis - infected macrophages. Pre - incubation with antioxidants, such as NAC and GSH, reduced apigenin - induced death in these parasites. Apigenin was also able to cause a decrease in mitochondrial membrane pote ntial, the cell cycle arrest, the decrease of proliferative potential, and mitochondrial and golgiense’s ultrastructural changes in treated promastigotes, also in dose - dependent manner. In addition, macrophages have shown that apigenin treatment induced an increase in the number of autophagosomes close to the amastigotes, suggesting the involvement of autophagy in the mechanism of action of the compound. When evaluated in silico , apigenin exhibited favorable ADMET properties and filled the Lipinski ’s "R ule of 5" , showing to be well absorbed, permeable and orally viable . In murine cutaneous leishmaniasis model, the oral t reatment with apigenin (1 and 2 mg/K g/day) in BALB/c infected mice showed to control the lesion development on ear of these animals and to r educe the parasite burden in dose - dependent manner. In vitro studies have contributed to elucidate the leishmanicidal activity of apigenin and, together with the in vivo results, enthusiastic in proposing this flavone as an additional compound in the treat ment of leishmaniasis

Made available in DSpace on 2016-05-11T12:56:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 rhaissa_vieira_ioc_mest_2016.pdf: 3046248 bytes, checksum: d61e9828a7069c1879b0fd074610f11a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Burkholderia cenocepacia é uma bactéria gram-negativa associada a infecções pulmonares oportunistas acometendo portadores de fibrose cística, doença granulomatosa crônica ou que apresentem algum tipo de imunodeficiência, podendo resultar em declínio da função pulmonar e no quadro séptico conhecido como síndrome cepacia. Por mecanismos de escape B. cenocepacia promove atraso na maturação do fagolisossomo, enquanto fatores envolvidos na resistência a ROS desempenham papel na sobrevivência intracelular. Dados de nosso laboratório mostram que cultivos in vitro de macrófagos peritoneais de camundongos e da linhagem RAW 264.7 estimulados com IFN\03B3 e LPS, quando desafiados com B. cenocepacia, apresentam reduzidos níveis de NOx nos sobrenadantes. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a resposta efetora de macrófagos alveolares de camundongo da linhagem AMJ2-C11 na infecção por B. cenocepacia. Além disso, avaliamos a infecção de camundongos imunocompetentes C57BL/6 ou geneticamente deficientes para a enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS/NOS2). Nossos resultados indicam que B. cenocepacia é capaz de desativar mecanismos efetores da resposta clássica de macrófagos, redirecionando para o perfil alternativo de ativação. Observamos em cultivos de macrófagos AMJ2-C11 expostos à B. cenocepacia (i) concentrações reduzidas de NOx e concentrações aumentadas de ureia em sobrenadantes, (ii) aumento da expressão da enzima arginase e baixa expressão de iNOS/NOS2 nestas células, (iii) menor frequência de células expressando MHC-I e moléculas coestimuladoras (CD80, CD86 e CD40), e por fim (iv) baixas concentrações de TNF nos sobrenadantes Semelhante ao encontrado nos sobrenadantes dos cultivos na presença de B. cenocepacia, os lavados pleurais de animais infectados pela bactéria apresentam aumento na produção de ureia em detrimento da produção de NOx. Em 72 horas de infecção, contagem de CFU encontra-se aumentada nos animais deficientes em iNOS/NOS2, enquanto é controlada em animais C57BL/6 imunocompetentes. Todos os camundongos infectados apresentaram perda de peso nas primeiras 72 horas de infecção. Animais C57BL/6 recuperaram peso corporal, apresentando ao término da análise ganho ponderal semelhante aos não infectados. Por outro lado, animais inos-/- infectados acumularam perda ponderal no decorrer do tempo analisado, apresentando em torno de 40% de perda de massa corpórea e apresentaram 100% de mortalidade em 13 dias pós-infecção, ao passo que não houveram mortalidade em animais controles (NI). Os pulmões dos animais inos-/- infectados apresentam alterações histológicas agudas, comparados tanto aos controles não infectados, e mais intensas que os animais C57BL/6 infectados. Em conjunto nossos dados sugerem que a infecção por B. cenocepacia interfere no balanço das vias óxido nítrico sintase induzível e arginase, favorecendo esta última, o que poderia promover a atenuação da resposta inflamatória e a persistência da infecção / Abstract: Burkholderia cenocepacia is a gram-negative bacteria associated with opportunistic lung infections affecting patients with cystic fibrosis, chronic granulomatous disease or immunodeficiencies, which can result in decreased pulmonary function and sepsis known as cepacia syndrome. By escape mechanisms B. cenocepacia promotes delay in maturation of phagolysosome, since cell factors involved in ROS resistance play a role in intracellular survival. Data from our laboratory show that cultures in vitro of mouse peritoneal macrophages and RAW 264.7 cell line stimulated with LPS and IFN\F067\F02C when challenged with B. cenocepacia present reduced NOx levels in the supernatants. The aim of the present work was to evaluate the effector response of mouse alveolar macrophages of the cell lineage AMJ2-C11 challenged by infection with B. cenocepacia. In addition, we evaluated the infection of mice immunocompetent (C57BL/6) or genetically deficient for the enzyme inducible nitric oxide synthase (iNOS/NOS2). Our results indicate that B. cenocepacia can disable effector mechanisms of classical response of macrophages, redirecting to the alternative profile of activation. We observed in AMJ2-C11 macrophage exposed to B.cenocepacia (i) reduced concentrations of NOx and increased concentrations of urea in supernatants, (ii) increased expression of arginase and low expression of iNOS/NOS2 in these cells, (iii) lower frequency of cells expressing MHC-I and costimulatory molecules (CD80, CD86, CD40), and finally (iv) lower TNF concentrations in the supernatants Akin the findings in supernatants of AMJ2-C11 macrophage exposed to B. cenocepacia, pleural washes recovered from infected mice show increased production of urea, while NOx was barely detected. At 72 hours of infection, CFU counts were increased in pleural washes of iNOS/NOS2-deficient mice, while bacteria growth was controlled in immunocompetent mice. All infected mice showed initial weight loss. After 72 hours of infection, C57BL/6 mice recovered body weight, showing similar weight gain to uninfected mice. On the other hand, B. cenocepacia-infected inos-/- mice accumulated body weight loss (~ 40%) during the course of infection, showing 100% of mortality at 13 days post-infection, whereas none of the control mice showed mortality. The lungs of B. cenocepacia-infected inos-/- mice showed acute histological alterations in comparison with uninfected controls, and more intense abnormalities when compared to infected C57BL/6 mice. Taken together our data suggest that the infection by B. cenocepacia interferes with the balance of the inducible nitric oxide synthase and arginase, favoring the latter, which could promote the attenuation of the inflammatory response and the persistence of infection / 2017-05-09

Made available in DSpace on 2016-05-11T13:01:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 natalia_roque_ioc_dout_2015.pdf: 13428594 bytes, checksum: 3b9534ef5ab8b753d140d8d49bb0c9a0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os corpúsculos lipídicos (CL), também chamados de gotas lipídicas, são organelas ricas em lipídios que tem sido frequentemente associadas às condições inflamatórias e infecciosas. O aumento no número e tamanho dessas organelas é um fenômeno bem regulado que tem sido associado com a persistência bacteriana. Nesse trabalho, nós investigamos os mecanismos pelos quais os CL induzidos pela micobactéria podem atuar em favor da infecção. Por microscopia eletrônica de transmissão (MET), nós mostramos que os CLs marcados com ADRP interagem com fagossomas durante a infecção por M. bovis bacillus Calmette-Guérin, (BCG) in vivo. Por microscopia de fluorescência, nós observamos que a interação entre os CL e os fagossomas não é dependente da viabilidade bacteriana. Nós mostramos uma maior frequência de CLs em proximidade com os fagossomas contendo partículas de látex revestidas com Lipoarabinomanana (LAM) ou Fosfatidilinositol manosídeo (PIM) de M. tuberculosis (M.tb), mas não com as partículas de látex não revestidas, sugerindo um mecanismo de recrutamento de CL para próximo dos fagossomas. Partículas de látex revestidas com LAM interagem com os CL, 102,60% mais do que as partículas de látex não revestidas em macrófagos carregados com ácido oleico. Além disso, nós observamos que a Rab7, uma importante GTPase endocítica e, marcador de endossoma tardio, assim como seu efetor RILP, mas não a Rab5 co-localizou com os CL marcados por Bodipy® induzidos pela infecção com BCG em 24 h. Por MET, nós observamos a imunolocalização da Rab7 co-localizada com os CL no local de interação com um fagossoma infectado durante a infecção experimental por BCG in vivo. De maneira interessante, nós observamos uma diminuição na aproximação das partículas revestidas com LAM e os CL após os macrófagos terem sidos tratados com CID1067700, um inibidor competitivo da Rab7 Nós observamos que o BCG e o LAM, mas não, a micobactéria não patogênica M. smegmatis, ou partículas de látex não revestidas, foram capazes de induzir a formação de CL em macrófagos in vitro. O papel dos CL na modulação da infecção micobacterianas foi avaliado pelo tratamento com C75 (inibidor de ácido graxo sintase) que modulou negativamente a formação dos CL e a síntese de PGE2 induzidos por BCG. Além disso, esse tratamento foi capaz de aumentar o TNF-\03B1 enquanto inibiu a produção de IL-10 e a sobrevivência micobacteriana, determinado por contagens de UFC. Esses resultados sugerem que a interação dos CLfagossomas é um fenômeno bem regulado e modulado pelo componente da parede micobacterina, LAM e dependente de Rab7. O sequestro da Rab7 ativa para os CL pode permitir a interação com o fagossomas e favorecer a troca de lipídios atuando como nutrientes para sobrevivência micobacteriana. Além disso, nossos resultados indicam que os CL modulam mediadores pro- e anti- inflamatórios em favor da replicação e sobrevivência do BCG. Assim, sugerindo que a inibição da formação e/ou função dos corpúsculos lipídicos como um alvo promissor para intervenções terapêuticas na infecção micobacteriana / Lipid bodies (LB) also named lipid droplets, are lipid rich organelles that have been often associated with inflammatory and infectious conditions. The increase in number and size of these organelles is a well-regulated phenomenon that have been involved with bacterial persistence. In this work, we investigated the mechanisms by which mycobacteria induced -lipid bodies may act in favor of infection. By Transmission electron microscopy (TEM), we showed ADRP-marked LB interacting with phagosomes during M. bovis bacillus Calmette- Guérin, (BCG) infection in vivo. By fluorescence microscopy we observed that the interaction between LB and phagosomes is not dependent of bacterial viability. We showed an increase in the frequency of LB proximity with phagosomes containing beads coated with Lipoarabinomannan (LAM) or Phosphatidylinositol mannoside (PIM) from M. tb, but not with non-coated beads suggesting a recruitment mechanism for LB-phagosome proximity. LAM coated beads interacts with LB 102,60% more than non- coated beads in macrophages loaded with oleic acid. Moreover, we observed that Rab7, an important endocytic GTPase and late endosome marker, as well as its effector RILP but not Rab5 was co-localized with LB stained with Bodipy® induced by BCG infection at 24 h. By MET, we observed an immunolocalization of Rab7 co-localized with LB in the site of interaction with an infected phagosome during the experimental BCG infection in vivo. Interestingly, we observed a decrease of LAM coated bead and LB apposition after macrophages were treated with CID1067700, a competitive inhibitor of Rab7. We observed that BCG and LAM, but not nonpathogenic mycobacteria M. smegmatis or non-coated latex beads, was able to induce LB formation in macrophages in vitro. Next, we evaluated the role of LB modulation on mycobacterial infection Treatment with C75 (fatty acid synthase inhibitor) down-regulated LB formation and PGE2 synthesis induced by BCG. Also, these treatment were able to enhance TNF-\03B1 while inhibit the IL-10 production and down-modulation of mycobacterial survival and growth assessed by CFU count. These results suggest that LBphagosome interaction are well-regulated phenomena modulated by mycobacteria cell wall component, LAM and dependent on Rab7. The hijack of active Rab7 to LB may enable the interaction with phagosome, and may favour the exchange of lipids acting as nutrients to mycobacterial survival. In addition, our results indicate that LB modulate proand anti- inflammatory mediators in favor of BCG survival and replication. Thus suggesting that inhibition of LB formation and/or function as a promising target for therapeutic interventions in mycobacterial infection

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-08-09T19:14:17Z No. of bitstreams: 1 Camila Victória Sousa Oliveira Avaliaçao do papel... 2015.pdf: 3464299 bytes, checksum: ca91c962ae5b021bf250ea2db05e1dd6 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-08-09T19:21:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Camila Victória Sousa Oliveira Avaliaçao do papel... 2015.pdf: 3464299 bytes, checksum: ca91c962ae5b021bf250ea2db05e1dd6 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-09T19:21:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camila Victória Sousa Oliveira Avaliaçao do papel... 2015.pdf: 3464299 bytes, checksum: ca91c962ae5b021bf250ea2db05e1dd6 (MD5) Previous issue date: 2015-09-25 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A leishmaniose é uma antropozoonose causada por protozoários do gênero Leishmania e é considerada uma das principais doenças negligenciadas. Modelos experimentais são amplamente utilizados para uma melhor compreensão da doença e dos mecanismos relacionados à resistência e susceptibilidade à infecção. Macrófagos de camundongos CBA controlam a infecção por Leishmania major ao passo que são permissivos a Leishmania amazonensis. Além disso, estudos baseados em abordagem proteômica demonstraram padrões distintos de expressão proteica em macrófagos derivados de medula óssea (BMMΦ) infectados por essas espécies de Leishmania. Dentre as proteínas diferentemente expressas, foram identificadas proteínas envolvidas no metabolismo de ferro moduladas positivamente em macrófagos infectados por L. amazonensis. Adicionalmente, embora ainda existam controvérsias, diversos estudos têm abordado a participação do elemento ferro na interação parasito-hospedeiro e no estabelecimento das infecções por tripanossomatídeos, incluindo Leishmania. Assim, para melhor compreender os mecanismos envolvidos nessa doença, o presente estudo buscou explorar o modelo comparativo de resistência e suscetibilidade do camundongo CBA para determinar o papel do ferro na infecção por Leishmania. Nossa hipótese é que a expressão de proteínas envolvidas no metabolismo de ferro é modulada diferentemente em macrófagos de camundongos CBA infectados por L. amazonensis, em comparação à L. major, favorecendo a sobrevivência intracelular do parasito. Nosso objetivo foi avaliar a expressão de proteínas que participam do metabolismo de ferro, como receptor de transferrina (Tf), CD71, e heme oxigenasse-1, HO-1, e determinar o efeito da modulação da disponibilidade de ferro na infecção por Leishmania. Observamos maior expressão de HO-1 em BMMΦ infectados por L. amazonensis (18,34 ± SD ng/mL), quando comparados a BMMΦ infectados por L. major (7,07 ± SD ng/mL), utilizando ELISA. Maior expressão de CD71 também foi observada na infecção por L. amazonensis (MFI 2.103) em comparação à infecção por L. major (MFI 472), utilizando FACS, além de uma maior ligação e captação de HoloTf (Tf carregada com ferro). Embora tenha sido observado que essas proteínas encontram-se diferentemente expressas em BMMΦ infectados por essas duas espécies de Leishmania, não foram observadas diferenças significativas na concentração intracelular do ferro. Em seguida, ensaios funcionais a partir da modulação da disponibilidade intracelular de ferro foram realizados com o objetivo de avaliar seu papel no desfecho da infecção por Leishmania. Os resultados mostraram que a depleção de ferro reduz em 90% o percentual de BMMΦ infectados por L. amazonensis e 70% dos infectados por L. major. Adicionalmente, a suplementação de ferro aumenta o percentual de BMMΦ infectados por L. amazonensis, de 69,64 para 82,79%, e a carga parasitária, de 2,996 para 4,001 parasitos/célula, assim como a viabilidade intracelular de L. amazonensis e L. major. Em conjunto, os dados obtidos nesse estudo indicam que, apesar de L. amazonensis modular positivamente a expressão de proteínas envolvidas no metabolismo de ferro, esse metal apresenta um papel importante na infecção pelas duas espécies de Leishmania, favorecendo a sobrevivência intracelular desse parasito. / Leishmaniasis is an anthropozoonosis caused by the protozoan parasite Leishmania and is considered one of the main neglected diseases. Animal models are widely used to better understand the disease and the mechanisms involved in resistance and susceptibility to infection. CBA mouse macrophages control the infection by L. major, while are permissive to L. amazonensis. Proteomic studies showed different protein profiles in bone marrow macrophages (BMMΦ) infected these species of Leishmania. We also observed that proteins involved in iron metabolism were positively modulated in L. amazonensis-infected macrophages. In addition, although literature review showed controverse data, several studies have addressed the role iron plays in host-parasite interaction and the establishment of trypanosomatids infections, including Leishmania. To better understand the mechanisms of the disease, this study sought to evaluate in a comparative model of resistance and susceptibility, using CBA macrophages, the role iron plays in Leishmania infection. Our hypothesis is that the expression of proteins involved in iron metabolism is differently modulated in CBA mice macrophages infected with L. amazonensis in comparison to L. major, favoring the intracellular survival of the parasite. Our goal was to evaluate the expression of proteins involved in iron metabolism of CBA mice macrophages, such as transferrin receptor (Tf), CD71, and heme oxygenase 1 (HO-1) and determine the effect of the modulation of intracellular iron in Leishmania infection. Using ELISA, we confirmed a higher expression of HO-1 in L. amazonensis- (18.34 ng/mL) compared to L. major-infected CBA macrophages (7.07 ng/mL). Using FACS analysis, CD71 showed to be higher expressed in L. amazonensis- (MFI 2.103) than in L. major-infected macrophages (MFI 472), in addition to higher binding and take up of HoloTf in these cells. Although it has been observed that proteins involved in iron metabolism were differently expressed in BMMΦ infected with these Leishmania species, no significant differences were observed in intracellular iron concentration. To further evaluate the role iron plays in the outcome of Leishmania infection, we modulated iron availability to Leishmania-infected cells using iron chelates or iron supplements. The results show that iron depletion reduces in 90% L. amazonensis infection and in 70% L. major infection. In addition, iron supplementation increased the percentage of L. amazonensis-infected cells from 69.64 to 82.79% and parasite load from 2,996 to 4,001 Leishmania/cell, as well as in the intracellular viability of both Leishmania species. In sum, these data indicate that although there is a positive modulation of proteins involved in iron metabolism in L. amazonensis infection, this metal seems to favor the survival of both parasite species in CBA macrophages.

O Transtorno Bipolar (TB) é uma doença psiquiátrica grave, altamente incapacitante que está associada com diversas comorbidades médicas e altas taxas de suicídio. Embora sua fisiopatologia não esteja completamente elucidada, inúmeros estudos têm mostrado alterações no sistema imune de indivíduos com TB. A resposta crônica destes indivíduos ao estresse parece gerar um aumento da inflamação sistêmica bem como da neuroinflamação. A micróglia ativada devido aos estímulos inflamatórios contínuos deve ocasionar diferentes prejuízos tanto bioquímicos quanto funcionas. Os macrófagos, primeira linha de defesa, são células de característica plástica de extrema importância do sistema imune e podem ser estimulados a polarizar para diferentes formas com liberação de fatores pró e antiinflamatórios, estimulando ou mantendo a homeostase no ambiente agredido de alguma forma. Desta forma, nosso trabalho buscou investigar a resposta fenotípica dos macrófagos contra o meio ambiente pró-inflamatório sistêmico observado no plasma de pacientes bipolares eutímicos, maníacos e depressivos em comparação aos controles. A amostra incluiu 5 controles saudáveis, 8 pacientes bipolares remetidos, 5 pacientes maníacos e 5 pacientes depressivos. As citocinas e quimiocinas de RNAm em células U937 tratadas com plasma mostraram um padrão de expressão diferente relativo entre controles saudáveis e pacientes com TB. As citoquinas inflamatórias tais como IL-1β e TNF-α, em pacientes bipolares maníacos e depressivos demonstram maiores quantidades de IL-1β mRNA do que os pacientes eutímicos e pacientes depressivos induziram maiores quantidades de RNAm de TNF-α do que os pacientes eutímicos em células U937. Já a expressão das quimiocinas CXCL9 e CXCL10 no plasma de pacientes com TB depressivos, demostraram ser de menor expressão significativa no grupo de pacientes maníacos quando comparados a controles e pacientes bipolares eutímicos. Nossos resultados sugerem que as citocinas periféticas devem modular a polarização M1 ou M2 de macrófagos no TB. / Bipolar Disorder (BD) is a severe and highly incapacitating psychiatric disorder which is associated with the presence of medical comorbidities. The progression of BD is related to an important cognitive deficit and also to biological and clinical manifestations that lead to treatment resistance and worse prognosis. Immune disturbances have been widely observed and investigated in BD patients. Chronic inflammatory responses induce neuroinflammation, mainly by pro-inflammatory microglial activation, and result in biochemical and functional impairment. Macrophages are the first line of defense of the immune system and exhibit cell plasticity. As well, microglia represents the resident macrophage of the central nervous system been responsible for its protection. Both cells can be stimulated to polarize into two different phenotypes, mainly pro- and anti-inflammatory, maintaining the homeostasis under physiologic and pathologic conditions. Therefore, we aimed to investigate macrophages phenotypical response when submitted to BD patients plasma in different episodes, which is considered a pro-inflammatory environment, and healthy controls plasma. Subjects included healthy controls (n=5), remitted BD patients (n=8), manic patients (n=5) and depressive patients (n=5). The mRNA expression of chemokynes and cytokines from U937 cells treated with BD patients plasma were different from those submitted to healthy controls plasma. Higher mRNA expression of IL-1β was observed in those cells submitted to manic and depressive BD patients plasma when compared to euthymic patients. Also, depressive BD patients plasma induced higher expression of TNF-α compared to euthymic patients. However, chemokynes expression, such as CXCL9 and CXCL10, were reduced in depressive BD patients. However, chemokynes expression, such as CXCL9 and CXCL10, were reduced in depressive BD patients. Inflammatory cytokines such as IL-1β and TNF-α in bipolar manic and depressive patients demonstrate higher amounts of IL-1β mRNA that euthymic patients and depressive patients induced higher amounts of TNF-α mRNA levels than the patients in euthymic U937. Since the expression of CXCL9 and CXCL10 chemokines in plasma from patients with depressive TB, proved less significant expression in the group of manic patients when compared to controls and euthymic bipolar patients.