Protozoários do gênero Acanthamoeba estão presentes nos mais variados ambientes, sendo esta a ameba mais isolada entre as amebas de vida livre (AVL). Acanthamoeba spp. pode causar encefalomielite e outras doenças graves em animais e seres humanos. Os fatores que contribuem para infecções por Acanthamoeba incluem biologia parasitária, diversidade genética, propagação no meio ambiente e suscetibilidade do hospedeiro. Acanthamoeba pode hospedar diversos microrganismos como: algas, bactérias, fungos, protozoários e vírus. Os estudos sobre as interações entre Acanthamoeba e microrganismos tem aumentado nos últimos anos, principalmente para entender como certas bactérias resistem à fagocitose de seus hospedeiros. Existem poucos estudos sobre adesão e a interação in vitro de Acanthamoeba com macrófagos, que são a primeira linha de defesa em doenças infecciosas. Neste trabalho foi proposto o isolamento de AVL do gênero Acanthamoeba de amostras clínicas de cães. Os resultados deste trabalho foram: 14 isolados de Acanthamoeba confirmados pela PCR, sendo o alvo o gene do 18S rDNA, de mucosa nasal e lesões cutâneas de 96 amostras coletadas de 48 cães. Destes, 13 isolados de Acanthamoeba foram sequenciados, o genótipo foi determinado e o potencial de patogenicidade em células VERO de 8 isolados foi avaliado. Os isolados eram pertencentes aos genótipos T3 (3 amostras), T4 (5 amostras), T5 (4 amostras) e T16 (1 amostra). Os 14 isolados de Acanthamoeba continham pelo menos uma espécie bacteriana internalizada e um isolado continha todas as espécies de endossimbiontes pesquisados. Observou-se que 79% dos isolados de Acanthamoeba hospedavam Legionella pneumophila, 50% Mycobacterium, 79% Pseudomonas e 57% Enterobacteriaceae. Os isolados de Acanthamoeba foram co-cultivados com macrófagos e observou-se à aderência em apenas 1h de contato, confirmando que Acanthamoeba é contato dependente. Este estudo descreveu os primeiros isolados de Acanthamoeba de amostras clínicas provenientes de cães. Também foi o primeiro relato da presença de endossimbiontes neste tipo de isolado realizado na América Latina. Neste estudo foi isolado pela primeira vez o genótipo T16 de amostra clínica. A importância deste estudo está no fato de verificar a presença de Acanthamoeba potencialmente patogênica em amostras clínicas de animais e pesquisar bactérias patogênicas internalizadas nestas amebas. Podendo estes microrganismos estar envolvidos em doenças infecciosas e futuras complicações como doenças graves em mamíferos. / Protozoa of the genus Acanthamoeba are present in diverse environments and are the most common free-living amoeba (FLA). Acanthamoeba spp. cause encephalitis and can cause severe illness in animals and humans. The factors that contribute to infections include Acanthamoeba parasite biology, genetic diversity, spreading in the environment and host susceptibility. Acanthamoeba may host various microorganisms such as algae, bacteria, fungi, protozoa and viruses. Studies regarding the interactions between Acanthamoeba and microorganisms have increased in recent years, mainly to understand how certain bacteria resist phagocytosis by their hosts. There are few studies on adherence and in vitro interaction of Acanthamoeba with macrophages, which are the first line of defense in infectious diseases. In this study, we proposed the isolation of the FLA Acanthamoeba from clinical samples from dogs. We found 14 Acanthamoeba isolates confirmed by PCR and by the 18S gene target rDNA in nasal mucosa and skin lesions out of 96 samples collected from 48 dogs. From this 14 isolates, 13 Acanthamoeba isolates were sequenced and the genotype was determined. Regarding the potential for pathogenicity in VERO cells, 8 isolates was assessed. The isolates belonged to genotype 3 (3 samples), T4 (5 samples), T5 (4 samples) and T16 (1 sample). The 14 isolates of Acanthamoeba contained at least one bacterial species internalized and one isolate contained all endosymbionts species studied. It was observed that 79% of isolates of Acanthamoeba carryng Legionella pneumophila, Mycobacterium 50%, 79% Pseudomonas and 57% Enterobacteriaceae. Acanthamoeba isolates were co-cultured with murine macrophages and adherence was observed in 1h of contact, confirming that Acanthamoeba interact with defense cells in a contact-dependent manner. This study describes the first clinical isolates of Acanthamoeba samples from dogs. It was also the first report of the presence of this type of endosymbionts isolated held in Latin America. As far as we know, this is the first study to isolate a T16 genotype amoeba from clinical sample. The importance of this study lies on the fact verify the presence of potentially pathogenic Acanthamoeba in samples from animals and search pathogenic bacteria internalized by these amoebae. These microorganisms may be involved in infectious diseases in mammals.

O diabetes tipo 1 (DT1) é uma doença metabólica associada a uma inflamação sistêmica de baixo grau, responsável por importantes co-morbidades associadas. Nosso grupo demonstrou que esta inflamação depende dos níveis plasmáticos aumentados de leucotrieno-B4 (LTB4), o qual estimula o eixo Myd88/STAT1 amplificando a resposta dos receptores TLR/IL1&#946 em macrófagos. Isso caracteriza o programa pró-inflamatório M1 nestas células, que requer energia proveniente da glicólise e produz substancias tóxicas como espécies reativas de oxigênio (ROS) e óxido nítrico (NO). Isto pode ser minimizado pela respiração mitocondrial desacoplada à síntese de ATP no metabolismo lipídico. Assim, na primeira parte do trabalho os macrófagos de camundongos (C57Bl/6) DT1, expressaram níveis elevados de marcadores de oxidação de ácidos graxos, o que não foi observado em macrófagos de camundongos diabéticos tratados com o antagonista de LTB4 (u75302). Além disso, o u75302 também reduziu a expressão aumentada de CD36, receptor envolvido na captação de lipídios, assim como aumento de lipídios intracelulares nestas células. Os elevados níveis de triglicérides e ácidos graxos presentes no plasma dos diabéticos também foram reduzidos pelo antagonista u75302, e isso foi consistente com o aparecimento de marcadores de lipólise (Prdm16 e Fgf21) no tecido adiposo branco destes animais. Da mesma forma, u75302 reduziu o consumo de oxigênio dos macrófagos de animais diabéticos. Isso foi consistente com os resultados obtidos em macrófagos de camundongos diabéticos deficientes da UCP1, os quais apresentaram maior peso corporal, maior massa de gordura e metabolismo mitocondrial mais baixo do que diabéticos WT. A perda de gordura também foi recuperada pelo tratamento com u75302 indicando o envolvimento do LTB4 na perda de adiposidade e dislipidemia em DT1. Na segunda parte do trabalho, confirmamos a participação dos leucotrienos na inflamação sistêmica em DT1 induzida por estreptozotocina. Camundongos (129SvE) diabéticos apresentaram níveis sistêmicos elevados das citocinas e este aumento não ocorreu em 129Sve deficientes da enzima 5-lipoxigenase (5LO-/-), responsável pela síntese de leucotrienos. A freqüência de monócitos pró-inflamatórios (CD11b&#43Ly6ChighLy6G-) circulantes estava aumentada em camundongos diabéticos WT mas não nos 5LO-/-. Macrófagos peritoneais residentes de camundongos diabéticos também apresentaram um fenótipo semelhante ao M1 classicamente ativado (alta expressão de Nos2 e Stat1, e alta produção de NO), que não foi revertido com o estímulo de IL4 in vitro ou in vivo. Por outro lado, os macrófagos dos 5LO-/- diabéticos apresentaram o fenótipo de macrófagos M2 alternativamente ativados (alta expressão de Ym1 e Arg1, e alta atividade de arginase). Os animais WT diabéticos tiveram cicatrização deficiente que se correlacionou com uma baixa freqüência de macrófagos M2 (CD45&#43F4/80&#43CD206&#43) nas lesões cutâneas comparado com os demais grupos. Juntos, estes dados sugerem que no DT1 os leucotrienos contribuem para a inflamação sistêmica e reprogramação dos monócitos e macrófagos para perfil inflamatório e isto está associado com aumento do metabolismo energético nestas células. Estas alterações induzidas nos macrófagos pelos níveis elevados de leucotrienos, particularmente LTB4, se correlacionam com a cicatrização deficiente, com a perda de gordura e hiperlipidemia nos camundongos DT1, sugerindo que o LTB4 possa ser um alvo terapêutico no diabetes. / Type 1 diabetes (T1D) is a metabolic disease associated to systemic low grade inflammation, which has an important role in co-morbidities. Our group showed that this inflammation depends on the high systemic levels of leukotriene-B4 (LTB4), which stimulateds MyD88/Stat1 axis, amplifying TLR/IL1&#946 response in macrophages. This characterizes pro inflammatory M1 program, which requires energy from glycolysis, and produces harmful molecules, such as reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO). This can be mitigated by mitochondrial respiration uncoupled to ATP synthesis in lipid metabolism. Therefore, in the first part of this study, macrophages from T1D mice (C57Bl/6) expressed high levels of fatty acid oxidation markers, which was not observed in macrophages from T1D mice treated with LTB4 receptor antagonis, u75302. Moreover, u75302 also reduced the high expression od CD36, a receptor involved in lipids uptake, and also reduced intracellular lipids in these cells. The high levels of triglycerides in diabetic plasma were reduced by u75302, and this is consistent with lipolysis markers (Prdm16 and Fgf21) in white adipose tissue of these mice. This was also consistent with results obtained in macrophages from diabetic UCP1 deficient mice, which had higher body weight and lower mitochondrial metabolism then WT diabetics. Fat loss was also recovered by u75302 treatment, indicating an involvement of LTB4 in adiposity loss and dyslipidemia in T1D. In the second part of this study, we confirmed leukotrienes participation in systemic inflammation in T1D streptozotocin-induced. T1D mice (129SvE) increased systemic levels of cytokines, which was not observed in T1D 5-lipoxygenase deficient mice (5LO-/-).The frequency of pro inflammatory monocytes (CD11b&#43Ly6ChighLy6G-) was increased in WT diabetic mice, but not in 5LO-/-. Resident peritoneal macrophages in diabetics had a phenotype similar to M1 classically activated (Nos2 and Stat1 highly expressed, and high production of NO), which was not reversed by IL-4 stimulation in vitro and in vivo. On the other hand, macrophages from diabetic 5LO-/- had a phenotype M2 alternatively activated (Ym1 and Arg1 highly expressed, and high arginase activity). WT diabetic mice had a defective wound healing, which was related to low frequency of M2 (CD45&#43F4/80&#43CD206&#43) macrophages in cutaneous wounds, compared to the other groups. All together, our data suggest that in T1D leukotrienes induce systemic inflammation, and reprogram pro inflammatory phenotype in monocytes and macrophages, and this is related to increased energetic metabolism in these cells. These alteration in macrophages due to leukotrienes effects, mainly LTB4, are correlated to defective healing, with fat loss, and dyslipidemia in T1D mice, suggesting that LTB4 can be a therapeutic target in diabetes.

Considerando a importância do perfil do macrófago na infecção por Leishmania e o potencial papel de CD100 na modulação da ativação do m<font face=\"Symbol\">j, postulamos que essa molécula pode afetar a infectividade dessa célula por este parasita. Portanto, analisou-se e comparou-se a expressão de CD100 em diferentes tipos de m<font face=\"Symbol\">j (BALB/c e C57BL/6) e seus efeitos em termos de ativação e infecção com L. amazonensis. Avaliamos a expressão de CD100 e observamos que m<font face=\"Symbol\">js peritoneais de BALB/c expressam mais CD100 do que os de C57BL/6 e que esta expressão diminui ao longo da infecção. M<font face=\"Symbol\">j de BALB/c pré-tratados com sCD100 antes da infecção tem maior índice no tempo de 4h e quando em contato com o sCD100 antes, durante e após a infecção, o índice aumenta em 4 e 24h. Em m<font face=\"Symbol\">j de C57BL/6 pré-tratados com sCD100 ou no período de infecção, o índice aumenta em 4h. Quando permanecem durante todo o tempo em contato com o sCD100 o índice aumenta nos períodos de 4 e 24h. Concluímos que o CD100 pode estar relacionado com a modulação da infecção, e que a infecção afeta a expressão dessa molécula pelo m<font face=\"Symbol\">j. / Considering the importance of m<font face=\"Symbol\">j in Leishmania´s infection and the potential role of CD100 in the modulation of m<font face=\"Symbol\">j activation, we postulated that this molecule may affect m<font face=\"Symbol\">j infectivity. Therefore, we analyzed and compared the expression of CD100 on different types of m<font face=\"Symbol\">j (BALB/c and C57BL/6) and their effects in terms of m<font face=\"Symbol\">j activation and infectivity by L. amazonensis. We analyzed the expression of CD100 and the results suggest that m<font face=\"Symbol\">j from BALB/c express more CD100 than C57BL/6 and this expression decrease along the infection. M<font face=\"Symbol\">j from BALB/c pre-treated with sCD100 have augmented infection rates in 4h and in contact with the sCD100 before, during and after infection, increase rates in periods of 4 and 24h. In m<font face=\"Symbol\">j from C57BL/6 pre-treated with sCD100 or infection period, the rates increase in 4h. When macrophages remained in contact with sCD100 throughout the infection, rates increase after 4 and 24h. We can therefore conclude that CD100 may be related to modulation of Leishmania´s infection and that the infection itself affects CD100 expression in m<font face=\"Symbol\">j.

INTRODUÇÃO: A incidência de câncer da glândula tireoide é a que mais vem crescendo nas últimas décadas. Dentro desse grupo de diferentes neoplasias, o carcinoma papilífero, um dos carcinomas bem diferenciados, representa a maioria e tem prognóstico favorável, com sobrevida acima dos 90% em 5 anos. Embora sejam utilizadas diversas classificações de risco baseadas em diferentes fatores prognósticos, ainda não se consegue predizer quais pacientes terão maior chance de recorrência, metástases linfonodais e desfecho desfavorável, que se beneficiariam de um tratamento mais agressivo. Já foi demonstrado em diversos tipos de neoplasias que diferenças no perfil do infiltrado imune tumoral têm relação com prognóstico e resposta ao tratamento. Neste estudo caracterizou-se o microambiente imune do carcinoma papilífero através de marcadores imuno-histoquímicos de células inflamatórias e relacionou-se este perfil de infiltração com fatores prognósticos clínico-patológicos e com sobrevida livre de recorrência. MÉTODOS: Foram incluídos 151 casos selecionados com base em um banco de dados que incluiu todos os pacientes submetidos a tratamento cirúrgico para câncer de tireoide no A.C.Camargo Cancer Center entre 2008 e 2010. Casos com tireoidite significante foram excluídos. Estes tumores selecionados foram então submetidos a reação imuno-histoquímica com marcadores de células inflamatórias e foram analisados por dois patologistas experientes. As características clínicas e patológicas foram avaliadas, assim como as recorrências e sobrevida, relacionando-as com as leituras de células marcadas. As análises de sobrevida global e livre de doença foram realizadas pelo método de Kaplan-Meier, com comparação de curvas de sobrevida pelo teste de Logrank. RESULTADOS: Cento e cinquenta e um pacientes foram incluídos, sendo 130 (86,1%) mulheres e 21 (13.9%) homens. Multifocalidade foi encontrada em 41 (27.2%), extensão extratireoidiana em 43 (28.5%) e metástase linfonodal em 36 (23.8%) casos. Apenas dois pacientes apresentaram metástase a distância. O tempo de seguimento médio foi 65,1 meses e observou-se nove (6%) pacientes com recorrências de neoplasia. Os pacientes com tumores com metástase linfonodal e/ou extensão extratireoidiana apresentaram maior risco de recorrência. Dos marcadores analisados, uma maior densidade de CD8 (que marca linfócitos citotóxicos) na área peritumoral esteve associada a uma tendência a melhor sobrevida livre de recorrência: 97,1% versus 87,5% (p=0,057), além de significativos menores índices de multifocalidade tumoral e de metástase linfonodal. A maior infiltração de linfócitos T CD8+ no tumor também se relacionou com menor ocorrência de metástase linfonodal nesta amostra (18,4% versus 38,1%, p=0,011). Além disso, a densidade desta marcação, tanto no interior da lesão neoplásica como em área peritumoral foi significativamente maior nos casos de carcinomas papilíferos restritos à tireoide, ou seja, sem extensão extratireoidiana e sem metástases. Os demais marcadores analisados não apresentaram relação significativa e consistente com recorrência ou outros fatores prognósticos. CONCLUSÕES: Nas neoplasias malignas de tireoide, o microambiente imune parece ter uma relação com características patológicas de agressividade. Este estudo mostrou que em carcinoma papilífero de tireoide quando não associado à tireoidite significativa, a densidade do infiltrado tumoral e peritumoral por linfócitos T CD8+ está inversamente relacionada com chance de disseminação metastática linfonodal e, provavelmente, com recidiva da doença, sendo, portanto, um marcador de melhor prognóstico. Este dado sugere que estes linfócitos exercem efeito antitumoral no carcinoma papilífero de tireoide, corroborando a importância da resposta imune na evolução desta neoplasia / INTRODUCTION: Within the last few decades thyroid cancer has the fastest rising incidence rate among all malignancies. In this group of different neoplasms, the papillary carcinoma, one of the well-differentiated carcinomas, represents the great majority and has favorable prognosis, with overall survival rates above 90% in five years. Although several risk classifications based on different prognostic features have been used, they are not accurate to predict which patients will have higher chance of recurrence, lymphatic metastasis and worse outcome, benefiting from more aggressive treatment. It has been described in several kinds of malignancies that tumor related immune infiltration has relation with prognosis and response to treatment. In this study, we characterize the immune microenvironment in papillary thyroid carcinomas, using immunohistochemical markers to inflammatory cells, and relate it with clinical and pathological prognostic features and with recurrence free survival rates. METHODS: The 151 included cases were selected from a database that included all patients who underwent surgical treatment for thyroid cancer at A.C.Camargo Cancer Center between the years 2008 and 2010. Tumor with significant thyroiditis were excluded. The selected tumors were submitted to immunohistochemical reactions with markers of inflammatory cells and analysis in complete slides by two experienced pathologists. Clinical and pathological features were evaluated, as well as recurrence and survival, relating them with the reading of marked cells. Survival analysis were made using Kaplan-Meier method, comparing survival curves with the Logrank test. RESULTS: One hundred and fifty one patients were included, of which 130 (86.1%) were females and 21 (13.9%) males. Multifocal disease was found in 41 cases (27.2%), extrathyroidal extension in 43 (28.5%) and lymph node metastasis in 36 (23.8%). Only two patients had distant metastasis. The mean follow-up time was 65.1 months and we observed nine (6%) tumor recurrences. Tumors with lymph node metastasis and/or extrathyroidal extension showed significantly higher recurrence rates. Of the analyzed markers, the cases with a higher density of CD8 (which marks cytotoxic T lymphocytes) in peritumoral areas presented a trend to better recurrence-free survival: 97.1% versus 87.5% (p=0.057), in addition to lower rates of mutifocal tumors and lymph node metastasis. A higher infiltration rate of CD8+ T lymphocytes in the tumor also correlated with less risk of lymph node metastasis in this sample (18.4% versus 38.1%, p=0.011). Besides that, the density of this marking both in the tumor and in peritumoral areas, was significantly higher in the papillary carcinomas limited to the thyroid gland (without extrathyroidal extension or metastasis). The other markers analyzed did not presented significant or consistent relation with recurrence or other prognostic factors. CONCLUSIONS: In thyroid cancer, the immune microenvironment seems to relate with pathological features of aggressiveness. This study showed that in papillary thyroid carcinomas without significant thyroiditis, the density of tumoral and peritumoral infiltration by CD8+ T lymphocytes is inversely related with lymph node metastasis rate and probably with recurrence, being therefore a marker of better prognosis. These data suggest that these lymphocytes play an anti-tumoral role in papillary thyroid carcinoma, supporting the implication of immune response in the progression of this neoplasm

Considerando a importância do perfil do macrófago na infecção por Leishmania e o potencial papel de CD100 na modulação da ativação do m<font face=\"Symbol\">j, postulamos que essa molécula pode afetar a infectividade dessa célula por este parasita. Portanto, analisou-se e comparou-se a expressão de CD100 em diferentes tipos de m<font face=\"Symbol\">j (BALB/c e C57BL/6) e seus efeitos em termos de ativação e infecção com L. amazonensis. Avaliamos a expressão de CD100 e observamos que m<font face=\"Symbol\">js peritoneais de BALB/c expressam mais CD100 do que os de C57BL/6 e que esta expressão diminui ao longo da infecção. M<font face=\"Symbol\">j de BALB/c pré-tratados com sCD100 antes da infecção tem maior índice no tempo de 4h e quando em contato com o sCD100 antes, durante e após a infecção, o índice aumenta em 4 e 24h. Em m<font face=\"Symbol\">j de C57BL/6 pré-tratados com sCD100 ou no período de infecção, o índice aumenta em 4h. Quando permanecem durante todo o tempo em contato com o sCD100 o índice aumenta nos períodos de 4 e 24h. Concluímos que o CD100 pode estar relacionado com a modulação da infecção, e que a infecção afeta a expressão dessa molécula pelo m<font face=\"Symbol\">j. / Considering the importance of m<font face=\"Symbol\">j in Leishmania´s infection and the potential role of CD100 in the modulation of m<font face=\"Symbol\">j activation, we postulated that this molecule may affect m<font face=\"Symbol\">j infectivity. Therefore, we analyzed and compared the expression of CD100 on different types of m<font face=\"Symbol\">j (BALB/c and C57BL/6) and their effects in terms of m<font face=\"Symbol\">j activation and infectivity by L. amazonensis. We analyzed the expression of CD100 and the results suggest that m<font face=\"Symbol\">j from BALB/c express more CD100 than C57BL/6 and this expression decrease along the infection. M<font face=\"Symbol\">j from BALB/c pre-treated with sCD100 have augmented infection rates in 4h and in contact with the sCD100 before, during and after infection, increase rates in periods of 4 and 24h. In m<font face=\"Symbol\">j from C57BL/6 pre-treated with sCD100 or infection period, the rates increase in 4h. When macrophages remained in contact with sCD100 throughout the infection, rates increase after 4 and 24h. We can therefore conclude that CD100 may be related to modulation of Leishmania´s infection and that the infection itself affects CD100 expression in m<font face=\"Symbol\">j.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Several immunological mechanisms are responsible for the control of Toxoplasma gondii infection. The immune response occurs initially because of the participation of innate immune cells, in which macrophages play an important role. The existence of atypical strains of T. gondii with a genetic pattern different from clonal strains lead concern worldwide, principally because these strains cause severe symptoms especially in immunocompromised individuals and congenitally infected newborn. In this sense, we investigated the in vitro polarization of human macrophages to M1 or M2 profile after the infection with RH, ME49 clonal strains and TgChBrUD2 Brazilian strain. THP-1 cells were treated with PMA to induce their differentiation into macrophages. The cells were plated and infected with T. gondii tachyzoites from TgChBrUD2, RH or ME49 strains at a 2:1 (parasites: host cell) ratio or incubated only with medium (control uninfected cells). The supernatant was collected for cytokine analysis and measurement of nitrite. The macrophages were used for quantification of urea, evaluation of parasitism, analysis of morphology and surface markers. Our results showed an up-regulation of MIF during infection by TgChBrUD2, RH and ME49, and low levels of IL-10 compared to control. In addition, TgChBrUD2-infected macrophages show high levels of IL-6 production compared to non-infected macrophages and RH infection. Regarding secretion of nitrite, the infection by TgChBrUD2 exhibited high levels of nitrite compared to control and RH infection. The urea production showed a down-regulation in macrophages infected with TgChBrUD2 and ME49 in comparison to control. The analysis of morphology revealed that TgChBrUD2-infected macrophages induced the cells to change their morphology to spindle shaped. On the other hand, PCR analysis showed an increased amount of T. gondii DNA in RH-infected macrophages compared to infection with TgChBrUD2 and ME49. Thus, our results showed that RH strain produced an insuficient pro-inflamatory response that influenced the proliferation of parasite, in contrast, TgChBrUD2 and ME49 induced characteristic factors of polarization to M1 macrophages, in which the atypical strain showed high production of pro-inflamatory mediators that helped to countain the replication of this strain. / Vários mecanismos imunológicos são responsáveis pelo controle da infecção por Toxoplasma gondii. A resposta imune a este patógeno ocorre inicialmente pela participação de células da imunidade inata, na qual macrófagos têm papel importante. A existência de cepas atípicas de T. gondii com padrão genético diferente das clonais desperta grande preocupação mundial, uma vez que, geralmente, causam sintomas graves particularmente em indivíduos imunocomprometidos e naqueles infectados congenitamente. O objetivo deste estudo foi comparar, in vitro, a polarização de macrófagos humanos derivados da linhagem THP-1 para um perfil M1 ou M2 após infecção com as cepas clonais RH, ME49 e a cepa atípica TgChBrUD2. Células THP-1 foram tratadas com PMA para induzir sua diferenciação em macrófagos funcionais. Após a diferenciação, esses macrófagos foram plaqueados e infectados com as cepas TgChBrUD2, RH ou ME49 de T. gondii em diferentes abordagens experimentais. Como controle foram utilizados macrófagos não infectados. Os sobrenadantes de cultura de macrófagos nas diferentes condições experimentais foram coletados para análise de citocinas pelo teste ELISA e dosagem de nitrito pela reação de Griess. As células foram utilizadas para avaliação da morfologia, quantificação da ureia por espectrofotometria, dos marcadores expressos na superfície celular por citometria de fluxo e do parasitismo por PCR. Nossos resultados mostraram um aumento das citocinas MIF durante infecção pelas cepas TgChBrUD2, RH e ME49, bem como uma diminuição de IL-10 quando comparado aos macrófagos não infectados. Além disso, macrófagos infectados pela cepa atípica apresentaram altos níveis de secreção de IL-6 em relação ao controle. Em relação a produção de nitrito, apenas os macrófagos infectados por TgChBrUD2 apresentaram aumento em relação aos macrófagos controle e aos infectados por RH. A dosagem de ureia revelou uma redução da atividade de arginase na infecção por TgChBrUD2 e ME49 comparado aos macrófagos não infectados. A análise da morfologia celular mostrou que a infecção por TgChBrUD2 induziu os macrófagos a mudarem seu formato de circulares para fusiformes. Por outro lado, a análise de PCR mostrou que a cepa RH proliferou significativamente mais nos macrófagos em comparação com as cepas TgChBrUD2 e ME49. Desse modo, nossos resultados mostraram que a cepa RH induziu resposta pró-inflamatória insuficiente que influenciou na proliferação do parasito, por outro lado, TgChBrUD2 e ME49 induziram fatores característicos da polarização para macrófagos M1, de modo que a cepa atípica mostrou maior liberação de mediadores pró-inflamatórios que auxiliaram a conter a replicação desta cepa. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

INTRODUÇÃO: A incidência de câncer da glândula tireoide é a que mais vem crescendo nas últimas décadas. Dentro desse grupo de diferentes neoplasias, o carcinoma papilífero, um dos carcinomas bem diferenciados, representa a maioria e tem prognóstico favorável, com sobrevida acima dos 90% em 5 anos. Embora sejam utilizadas diversas classificações de risco baseadas em diferentes fatores prognósticos, ainda não se consegue predizer quais pacientes terão maior chance de recorrência, metástases linfonodais e desfecho desfavorável, que se beneficiariam de um tratamento mais agressivo. Já foi demonstrado em diversos tipos de neoplasias que diferenças no perfil do infiltrado imune tumoral têm relação com prognóstico e resposta ao tratamento. Neste estudo caracterizou-se o microambiente imune do carcinoma papilífero através de marcadores imuno-histoquímicos de células inflamatórias e relacionou-se este perfil de infiltração com fatores prognósticos clínico-patológicos e com sobrevida livre de recorrência. MÉTODOS: Foram incluídos 151 casos selecionados com base em um banco de dados que incluiu todos os pacientes submetidos a tratamento cirúrgico para câncer de tireoide no A.C.Camargo Cancer Center entre 2008 e 2010. Casos com tireoidite significante foram excluídos. Estes tumores selecionados foram então submetidos a reação imuno-histoquímica com marcadores de células inflamatórias e foram analisados por dois patologistas experientes. As características clínicas e patológicas foram avaliadas, assim como as recorrências e sobrevida, relacionando-as com as leituras de células marcadas. As análises de sobrevida global e livre de doença foram realizadas pelo método de Kaplan-Meier, com comparação de curvas de sobrevida pelo teste de Logrank. RESULTADOS: Cento e cinquenta e um pacientes foram incluídos, sendo 130 (86,1%) mulheres e 21 (13.9%) homens. Multifocalidade foi encontrada em 41 (27.2%), extensão extratireoidiana em 43 (28.5%) e metástase linfonodal em 36 (23.8%) casos. Apenas dois pacientes apresentaram metástase a distância. O tempo de seguimento médio foi 65,1 meses e observou-se nove (6%) pacientes com recorrências de neoplasia. Os pacientes com tumores com metástase linfonodal e/ou extensão extratireoidiana apresentaram maior risco de recorrência. Dos marcadores analisados, uma maior densidade de CD8 (que marca linfócitos citotóxicos) na área peritumoral esteve associada a uma tendência a melhor sobrevida livre de recorrência: 97,1% versus 87,5% (p=0,057), além de significativos menores índices de multifocalidade tumoral e de metástase linfonodal. A maior infiltração de linfócitos T CD8+ no tumor também se relacionou com menor ocorrência de metástase linfonodal nesta amostra (18,4% versus 38,1%, p=0,011). Além disso, a densidade desta marcação, tanto no interior da lesão neoplásica como em área peritumoral foi significativamente maior nos casos de carcinomas papilíferos restritos à tireoide, ou seja, sem extensão extratireoidiana e sem metástases. Os demais marcadores analisados não apresentaram relação significativa e consistente com recorrência ou outros fatores prognósticos. CONCLUSÕES: Nas neoplasias malignas de tireoide, o microambiente imune parece ter uma relação com características patológicas de agressividade. Este estudo mostrou que em carcinoma papilífero de tireoide quando não associado à tireoidite significativa, a densidade do infiltrado tumoral e peritumoral por linfócitos T CD8+ está inversamente relacionada com chance de disseminação metastática linfonodal e, provavelmente, com recidiva da doença, sendo, portanto, um marcador de melhor prognóstico. Este dado sugere que estes linfócitos exercem efeito antitumoral no carcinoma papilífero de tireoide, corroborando a importância da resposta imune na evolução desta neoplasia / INTRODUCTION: Within the last few decades thyroid cancer has the fastest rising incidence rate among all malignancies. In this group of different neoplasms, the papillary carcinoma, one of the well-differentiated carcinomas, represents the great majority and has favorable prognosis, with overall survival rates above 90% in five years. Although several risk classifications based on different prognostic features have been used, they are not accurate to predict which patients will have higher chance of recurrence, lymphatic metastasis and worse outcome, benefiting from more aggressive treatment. It has been described in several kinds of malignancies that tumor related immune infiltration has relation with prognosis and response to treatment. In this study, we characterize the immune microenvironment in papillary thyroid carcinomas, using immunohistochemical markers to inflammatory cells, and relate it with clinical and pathological prognostic features and with recurrence free survival rates. METHODS: The 151 included cases were selected from a database that included all patients who underwent surgical treatment for thyroid cancer at A.C.Camargo Cancer Center between the years 2008 and 2010. Tumor with significant thyroiditis were excluded. The selected tumors were submitted to immunohistochemical reactions with markers of inflammatory cells and analysis in complete slides by two experienced pathologists. Clinical and pathological features were evaluated, as well as recurrence and survival, relating them with the reading of marked cells. Survival analysis were made using Kaplan-Meier method, comparing survival curves with the Logrank test. RESULTS: One hundred and fifty one patients were included, of which 130 (86.1%) were females and 21 (13.9%) males. Multifocal disease was found in 41 cases (27.2%), extrathyroidal extension in 43 (28.5%) and lymph node metastasis in 36 (23.8%). Only two patients had distant metastasis. The mean follow-up time was 65.1 months and we observed nine (6%) tumor recurrences. Tumors with lymph node metastasis and/or extrathyroidal extension showed significantly higher recurrence rates. Of the analyzed markers, the cases with a higher density of CD8 (which marks cytotoxic T lymphocytes) in peritumoral areas presented a trend to better recurrence-free survival: 97.1% versus 87.5% (p=0.057), in addition to lower rates of mutifocal tumors and lymph node metastasis. A higher infiltration rate of CD8+ T lymphocytes in the tumor also correlated with less risk of lymph node metastasis in this sample (18.4% versus 38.1%, p=0.011). Besides that, the density of this marking both in the tumor and in peritumoral areas, was significantly higher in the papillary carcinomas limited to the thyroid gland (without extrathyroidal extension or metastasis). The other markers analyzed did not presented significant or consistent relation with recurrence or other prognostic factors. CONCLUSIONS: In thyroid cancer, the immune microenvironment seems to relate with pathological features of aggressiveness. This study showed that in papillary thyroid carcinomas without significant thyroiditis, the density of tumoral and peritumoral infiltration by CD8+ T lymphocytes is inversely related with lymph node metastasis rate and probably with recurrence, being therefore a marker of better prognosis. These data suggest that these lymphocytes play an anti-tumoral role in papillary thyroid carcinoma, supporting the implication of immune response in the progression of this neoplasm

Os rins são órgãos responsáveis por gerir um conjunto de tarefas fisiológicas que mantém a homeostase do organismo, dentre elas a remoção de metabólitos tóxicos do sangue, produção de hormônios e a regulação do balanço de eletrólitos. As lesões renais agudas (LRA) levam a uma rápida perda das funções do órgão, em horas ou dias. Durante o processo de lesão tecidual, o sistema imune atua, muitas vezes, de forma prejudicial ao órgão. Uma das principais células envolvidas nesse processo de lesão tecidual são os macrófagos, que participam durante a primeira fase da LRA, já diferenciados em um perfil mais pró-inflamatório, descritos como macrófagos M1, e, também, durante a fase de reparo do tecido, diferenciados em macrófagos M2. Produtos como o acetato, um dos os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) mais abundantes, oriundos do metabolismo de bactérias pertencentes à microbiota intestinal são capazes de modular a resposta inflamatória em modelos de lesão tecidual, porém a influência desses produtos, na função, migração e diferenciação dos macrófagos no contexto da LRA ainda não foi bem descrita. Desta forma o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do acetato nas funções biológicas dos macrófagos na LRA. Para isso, desenvolvemos um modelo de LRA induzida por cisplatina em peixes Danio rerio adultos, injetando intraperitonealmente (ip) diferentes doses de cisplatina e avaliando sobrevida e progressão da doença por histologia, imunofluorescência e análise do infiltrado celular. Em seguida para avaliar o efeito do acetato na LRA, os animais foram submetidos ao tratamento com acetato, por gavagem, e depois, injetados com cisplatina para analise de sobrevida, extensão da lesão renal por histologia e infiltrado de células do sistema imune no rim. Os resultados mostraram que a injeção de cisplatina (0,1275 mg/g) induz lesão tecidual no rim 24 hrs pós-injeção com perda de estrutura tubular, levando a morte de 80% dos animais. Porém, os animais sobreviventes foram capazes de regenerar o tecido lesado oito dias após a injeção. Também se observou aumento do infiltrado inflamatório e alta taxa de morte celular, concomitantes a altas taxas de proliferação de células não imunes. O acetato foi capaz de aumentar a sobrevida dos animais injetados com cisplatina e reduzir o dano induzido pela droga no rim, por outro lado, não alterou a atuação das células inflamatórias do sistema imune. Em conclusão, o modelo de injeção intraperitoneal de cisplatina foi capaz de induzir uma LRA em zebrafish adulto, com o máximo de prejuízo às 24 hpi e com recuperação e regeneração do tecido renal em uma semana, demonstrando ser um ótimo modelo para o estudo da regeneração no rim. O acetato parece ser promissor no tratamento da LRA experimental, pois diminui a taxa de morte induzida pela cisplatina. / The kidneys are organs responsible for managing a set of physiological tasks that maintain the homeostasis of the organism, among them the removal of toxic metabolites from the blood, production of hormones and the regulation of electrolyte balance. Acute kidney injury (AKI) leads to a rapid loss of organ function in hours or days. During the process of tissue injury, the immune system often initially acts in a detrimental way to the organ. One of the main cells involved in this process of tissue injury are macrophages, which participate during the first phase of AKI, already differentiated in a more proinflammatory profile, described as macrophages M1, and then during the tissue repair phase, differentiated into macrophages M2. Products derived from the metabolism of bacteria belonging to the intestinal microbiota, such as acetate, one of the main short chain fatty acids (SCFA), are able ofmodulating the inflammatory response in tissue injury models, but the influence of these products on the function, migration and differentiation of macrophages in the context of the AKI has not yet been well described. Thus the objective of this work was to evaluate the effect of acetate on the biological functions of macrophages in AKI. First, we developed a cisplatin-induced AKI model in Danio rerio adult fish, injecting different doses of cisplatin intraperitoneally (ip) and evaluating the survival and progression of the disease by histology, immunofluorescence and analysis of the cellular infiltrate. Subsequently, the animals were treated with acetate by gavage and then injected with cisplatin and analyzed for survival, the extent of the renal lesion by histology and the immune cell infiltrate in the kidney. The results showed that the injection of cisplatin (0,1275 mg/g) induced tissue damage in the kidney 24 h post-injection with loss of tubular structure, leading to the death of 80% of the animals. However, the surviving animals were able to regenerate the injured tissue eight days after the injection. There was also an increase in inflammatory infiltrate and a high rate of cell death, concomitant with high rates of proliferation of non-immune cells. The acetate was able to increase the survival of the animals injected with cisplatin and reduce the damage induced by the drug in the kidney, on the other hand, did not alter the performance of inflammatory cells of the immune system. In conclusion, the intraperitoneal cisplatin injection model was able to induce AKI in adult zebrafish, with maximum damage at 24 hpi and recovery and regeneration of renal tissue in one week, proving to be a good model for the study of regeneration in the kidney. Acetate appears to be promising in the treatment of experimental AKI, as it decreases the rate of cisplatin-induced death.

As lesões periapicais ocasionam destruição dos tecidos apicais e periapicais, por meio da exacerbação da resposta inflamatória e imune. O sistema imunológico é ativado e células são recrutadas para o local da lesão, incluindo os macrófagos, que podem ser polarizados em macrófagos M1 e M2.O presente estudo teve como objetivo quantificar macrófagos M1 e M2 em cistos periapicais de dentes decíduos e permanentes.Foram selecionados 15 casos de cistos periapicais de dentes decíduos e 10 cistos periapicais de dentes permanentes. Em todos os casos foi realizada análise histopatológica em HE, classificando o tipo e o grau do infiltrado inflamatório, por meio de escores. Além disso, foi realizada a quantificação dos marcadores CD68 (M1+, M2+) e CD163 (M1-,M2+) por meio da análise imunohistoquímica. Os resultados obtidos foram submetidos ao teste de Mann Whitney, com nível de significância de 5%.Embora tenham sido detectados macrófagos M1 e M2 tanto nas lesões dos dentes decíduos quanto dos permanentes, houve maior prevalência de macrófagos M2 (p<0,05). A comparação entre dentes decíduos e permanentes evidenciou maior quantificação de macrófagos M1 nas lesões dos dentes permanentes (p=0,002). Pôde-se concluir que os macrófagos M1 e M2 estão presentes nos cistos periapicais de dentes decíduos e permanentes, com maior quantidade de células M2. Além disso, os cistos periapicais dos dentes permanentes apresentaram maior quantidade de macrófagos M1, em comparação aos cistos dos dentes decíduos / The radicular lesion leads to the apical and periapical tissues destruction throughout an inflammatory and immune response. The immune system is activated and cells are recruited to the lesion site, which includes macrophages that can be polarized into M1 and M2 macrophages. The objective of this study was to quantify M1 and M2 macrophages in radicular cysts in permanent and deciduous teeth. In total, 15 radicular cysts cases in deciduous teeth and 10 in permanent teeth were selected. A histopathologic analysis in HE was performed, allowing the type and inflammatory infiltrates level classification in scores. In addition, the CD68 (M1+, M2+) and CD163 (M1-, M2+) markers were quantified through an immunohistochemistry analysis. The data acquired were submitted to a Mann Whitney test, with a 5% significance level. A higher prevalence of M2 macrophages (p<0.05) was observed, despite both M1 and M2 macrophages have been detected in the permanent and deciduous teeth lesions. The comparison between permanent and deciduous teeth presented a higher M1 macrophages quantity in permanent teeth lesions (p=0.002). In summary, the M1 and M2 macrophages are present in deciduous and permanent teeth radicular cysts, with a higher quantity of M2 cells. Moreover, the radicular cysts in permanent teeth have shown a higher M1 macrophages quantity when compared to cysts in deciduous teeth

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniera en Biotecnología Molecular. / Las células dendríticas (DC) son las responsables de iniciar la respuesta inmune adaptativa. Las DC se diferencian a partir de un precursor residente de la médula ósea llamado “progenitor común de macrófagos y células dendríticas” (MDP) el cual puede diferenciarse en un precursor común de monocitos (cMoP), o en un precursor que da origen a las DCs (CDP). Para comprometerse al linaje de DCs, las CDP se diferencian en pre-DCs, las cuales dejan la médula ósea y al llegar al tejido se generan las cDC1 y cDC2. Los mecanismos celulares que regulan la diferenciación de las DCs no han sido claramente elucidados. En este contexto, la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR), que es el mecanismo celular responsable de mantener la homeostasis del retículo endoplásmico (RE) ha emergido como un interesante candidato en la regulación de la diferenciación de DCs. La UPR está coordinada por tres sensores residentes del RE Interesantemente, ratones deficientes de XBP1, el factor de transcripción maestro río abajo del sensor IRE1a, muestran una disminución importante de cDC y pDC in vitro e in vivo. Esto sugiere que el sensor IRE1a es relevante para el desarrollo de las DCs. Sin embargo, se desconoce con precisión en que estadio del desarrollo de las DCs este eje estaría operativo. En este trabajo, identificamos los precursores de las DCs y estudiamos la activación del eje IRE1a/XBP1 de la UPR. Nuestros datos indican que las MDP presentan mayor activación del eje IRE1a/XBP1 comparado con los otros estadios de desarrollo de las DC, lo que sugiere que en esta etapa del desarrollo podrían estar ocurriendo cambios metabólicos mayores comparados con otros estadios, lo que implicaría un aumento en la síntesis proteica, implicando una UPR más activa. / The dendritic cells (DCs) are responsible for the initiation of the adaptive immune response. DCs arise from a common progenitor present in the bone marrow called ‘macrophage-dendritic cell progenitor’ (MDP), which differentiates into a cMoP (common monocyte precursor) or into CDP, the ‘common dendritic cell precursor’, that is committed towards the dendritic linage. After this differentiation process, the CDP will give rise to pre-DC, which exits the bone marrow and constitute the immediate precursors of terminally developed cDC1 and cDC2 in tissues. The cellular mechanism that controls the DC differentiation are not fully understood. In this context, the unfolded protein response (UPR) is a mechanism responsible to maintain the endoplasmic reticulum (RE) homeostasis that has risen as a candidate for the regulation of the DC development. This adaptive response is coordinated by three ER membrane–resident sensors. Remarkably, it has been reported that XBP1 deficient mice, a key transcription factor downstream IRE1a, display a marked diminution of cDCs and pDCs in vitro and in vivo. This implies that IRE1a plays a key role in DC homeostasis and development. Nevertheless, the contribution of the UPR to DC development is still poorly understood. In this work, we identified DC precursors using multiparametric flow cytometry and studied the UPR activation. Our data indicates that the cells at the stage of the MDP have the most prominent XBP1s signal compared to cells in different differentiation stages. These data suggest that in this stage of the DC development may be occurring major metabolic changes comparing to the other stages which could mean an increase of protein synthesis, involving an active UPR. / Mayo 2020