ABSTRACT The morphological premalignant changes in prostate epithelium such as high grade prostatic intraepithelial neoplasia (HGPIN) precede invasive prostate cancer (PC) by several decades. The overall aim of this project was to identify patterns of gene expression in HGPIN and early PC which increase our understanding of the early biology of PC and identify genes and pathways that correlate with an aggressive phenotype. A comprehensive tissue cohort of premalignant prostate lesions was collected in a tissue microarray (TMA) platform that was utilised for high-throughput validation of target genes. Using this unique resource, the expression of the tumour suppressor gene PTEN was assessed using immunohistochemistry in an initial candidate gene approach based on mouse models implicating PTEN in carcinogenesis. No significant difference in expression of PTEN was detected in premalignant and benign epithelium. A transcript profiling approach was undertaken by integrating laser capture microdissection, linear RNA amplification and oligonucleotide microarrays to perform a screen of matched patient samples of normal, HGPIN and PC cells. The expression patterns of two genes encoding secreted proteins, neuropeptide Y (NPY) and macrophage inhibitory cytokine (MIC-1) were validated using immunohistochemistry on TMAs representing the progression model of early PC. Increased expression of these proteins in PC was confirmed to occur early in the disease process and altered expression of NPY and MIC-1 was associated with worse clinical outcome. Further analysis of global gene expression patterns using a structured network knowledge base identified a notable aberration in the expression of extracellular matrix and extracellular matrix associated proteins in HGPIN and provided novel evidence for the role of this class of molecules in the development of PC. In summary, contrary to current dogma based on work in animal models, altered PTEN expression is unlikely to represent an important event in the development of malignancy in the human prostate. In contrast, the expression patterns and prognostic value of NPY and MIC-1 in HGPIN support their further evaluation as biomarkers for the development and progression of PC. The aberrant expression of genes and networks of genes detected in HGPIN will assist in further identification of biological pathways which may be targeted in therapeutic strategies against the development and progression of PC.

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No. of bitstreams: 1 DissRMB.pdf: 1290621 bytes, checksum: 3870f44730785bfd4b123df5cbec0b90 (MD5) Previous issue date: 2015-08-31 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / The high blood pressure levels reach about 22% of the world population, increasing the risk factors for coronary disease, heart attack and heart failure. Many studies have tried to understand the causes of hypertension and possible mechanisms to facilitate the treatment of hypertension. The central nervous system seems to play a key role in the development and maintenance of hypertension. Among the various brain areas, we can highlight the role of the nucleus of the solitary tract (NTS), which is the primary site of visceral afferents. The macrophage migration inhibitory factor (MIF) is an intracellular inhibitory regulator of the actions of angiotensin II (ANG II) in the ANG II type 1 receptors. The spontaneously hypertensive rats (SHRs) and the rats with renovascular hypertension 2 kidney, 1 clip (2K1C) exhibit an increased activity of the renin-angiotensin system, increased sympathetic activity and reduced baroreflex function. We recently demonstrated that MIF overexpression in the NTS of SHRs lowers blood pressure of these animals and improved the function of the baroreflex. Therefore, in this study we tested if increased expression of MIF in the NTS of the 2K1C rats could alter the development of hypertension and improve the baroreflex function in these animals. For this, the left renal artery was partially obstructed in male Holtzman rats (150-180 g) using a silver clip (0.2 mm width) to induce 2K1C hypertension (n = 5-10/group) or sham surgery [normotensive rats (NT); n = 5-11/group] was performed. Three weeks after renal clip placement or sham surgery, rats received AAV2-CBA-MIF microinjections into the NTS to increase MIF expression in the area or AAV2-CBA-eGFP, which promoted the expression of GFP (enhanced green protein), which served as a control vector. Arterial pressure and heart rate were recorded by telemetry and baroreflex tests were performed. At the end of the experiments, the brains were harvested for immunohistochemistry RT-PCR. MIF injections into the NTS attenuated the hypertension in 2K1C rats from 2 weeks after viral transfection until the end of the experiment (4 weeks after viral transfection), (2K1C-MIF: 145 ± 7, vs. 2K1C-eGFP: 176 ± 9 mmHg; p < 0.05). MIF into the NTS also improved the reflex bradycardia (2K1C-MIF slope: -1.4 ± 0.3, vs. 2K1C-eGPF slope: -0.41 ± 0.3 bpm/mmHg; p < 0.05) and reflex tachycardia (2K1C-MIF slope: -4.7 ± 0.6, vs. 2K1C-eGPF slope: -1.7 ± 0.3 bpm/mmHg; p < 0.05). Baseline heart rate was decreased in 2K1C-MIF rats. In contrast to 2K1C rats, MIF overexpressed in the NTS in normotensive rats produced no change in arterial pressure neither baroreflex function. As expected, the transduction of MIF in the NTS increased mRNA levels for MIF at the same site (NT-MIF: 3.80 ± 0.97, vs. NT-eGFP: 1.00 ± 0.16 fold change and 2K1C-MIF: 3.53 ± 0.68, vs. 2K1C-eGFP: 0.88 ± 0.09 fold change; p < 0.05). These results suggest that increased expression of MIF in neurons within NTS attenuates the hypertension and improves baroreflex function in 2K1C rats, possibly through anti-ANG II actions. / Os altos níveis de pressão arterial atingem cerca de 22% da população mundial, aumentando os fatores de risco para doenças coronarianas, infarto e falência cardíaca. Muitos estudos tentam entender as causas da hipertensão e os possíveis mecanismos que facilitem o tratamento da hipertensão. O sistema nervoso central parece ter um papel chave no desenvolvimento e na manutenção da hipertensão. Dentre as diversas áreas encefálicas, podemos destacar o papel do núcleo do trato solitário (NTS), que é o sítio primário das aferências viscerais. O fator inibitório da migração de macrófagos (MIF) é um regulador inibitório intracelular das ações da angiotensina II (ANG II) em receptores do subtipo AT1. Os ratos espontaneamente hipertensos (SHR) bem como os ratos com hipertensão renovascular 2 rins, 1 clipe (2R1C), exibem uma atividade aumentada do sistema renina-angiotensina, do sistema nervoso simpático e uma diminuição da função do barorreflexo. Recentemente demonstramos que a super-expressão de MIF no NTS de SHRs reduziu a pressão arterial destes animais bem como melhorou a função do barorreflexo. Portanto, neste estudo testamos se a expressão aumentada de MIF no NTS de ratos 2R1C poderia altenuar o desenvolvimento da hipertensão e melhorar a função do barorreflexo nestes animais. Para tanto, a artéria renal esquerda foi parcialmente obstruída em ratos Holtzman (150-180 g) utilizando um clipe de prata (0,2 mm de abertura) para induzir a hipertensão 2R1C (n = 5-10/grupo) ou a cirurgia fictícia [ratos normotensos (NT); n = 5-11/grupo] foi realizada. Três semanas após a inserção do clipe renal ou após a cirurgia fictícia, os ratos receberam microinjeções do vetor viral AAV2-CBA-MIF no NTS para aumentar a expressão de MIF na área ou de AAV2-CBA-eGFP, que promoveu a expressão de GFP (proteína fluorescente verde), que serviu como vetor controle. A pressão arterial e a frequência cardíaca foram registradas por telemetria e testes do barorreflexo foram realizados. Ao término dos experimentos, os encéfalos foram colhidos para imunohistoquímica ou RT-PCR. As microinjeções de MIF no NTS atenuaram a hipertensão em ratos 2R1C a partir de 2 semanas após a transfecção viral até o fim dos experimentos (4 semanas após a transfecção), (2R1C-MIF: 145 ± 7, vs. 2R1C-eGFP: 176 ± 9 mmHg; p < 0,05). MIF no NTS também melhorou a bradicardia reflexa (2R1C-MIF slope: -1,4 ± 0,3, vs. 2R1C-eGFP slope: -0,41 ± 0,3 bpm/mmHg; p < 0,05) e taquicardia reflexa (2R1C-MIF slope: -4,7 ± 0,6, vs. 2R1C-eGFP slope: -1,7 ± 0,3 bpm/mmHg; p < 0,05). A frequência cardíaca basal foi diminuída em ratos 2R1C-MIF. Em contraste com os ratos 2R1C, MIF super-expresso no NTS de ratos normotensos não produziu alteração na pressão arterial ou na função do barorreflexo. Como esperado, a transdução de MIF no NTS aumentou os níveis de RNAm para MIF no mesmo local (NT-MIF: 3,80 ± 0,97, vs. NT-eGFP: 1,00 ± 0,16 número de vezes e 2R1C-MIF: 3,53 ± 0,68, vs. 2R1C-eGFP: 0,88 ± 0,09 número de vezes; p < 0,05). Estes resultados sugerem que a expressão aumentada de MIF nos neurônios do NTS atenua a hipertensão, melhora a função do barorreflexo em ratos 2R1C, possivelmente através de uma ação anti-ANG II. / FAPESP: 2013/02607-0

Tuberculosis is one of the most prevalent infectious diseases globally due to the successful survival mechanisms displayed by Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Mtb primarily infects alveolar macrophages (AMs) and is able to live intracellularly for extended periods of time due to a number of virulence factors which inhibit the antibacterial mechanisms of the AMs. This aspect of the Mtb life cycle means TB treatments suffer from poor bioavailability and efficacy. Additionally, the rise in resistant strains of Mtb means the use of higher doses and the use of alternative second and third line drugs which increase the risk of systemic toxicity. Drug encapsulation is a novel approach that can provide more favourable drug pharmacokinetics and pharmacodynamics. The aim of this project was to develop a liposomal drug delivery system to target Mtb infected alveolar macrophages. The system involved the encapsulation of two drugs; the antibiotic gatifloxacin (GFLX) and Mtb virulence factor inhibitor CV7. The hypothesis was that the two different antibacterial mechanisms would work in synergy and increase the efficacy of the treatment. AM targeting and receptor-mediated endocytic uptake was encouraged by the presence of a ligand attached to the surface of the liposome. Furthermore a pH-sensitive release mechanism was to be incorporated into the liposome to encourage the release of the encapsulated drugs in the vicinity of the intracellular bacteria. The intention was to produce a drug delivery system to enable a TB therapy regime of fewer, lower doses to increase compliance and reduce systemic toxicity by increasing efficacy through improved bioavailability. GFLX was successfully encapsulated using a weak base active loading method. To establish encapsulation efficiency, a homogeneous fluorescence assay able to quantify intra- and extra-liposomal gatifloxacin simultaneously was developed. pH-sensitive release of the payload could be achieved using a pH-sensitive peptide with a novel design based on chimeric structure, namely P3. CV7 was successfully encapsulated using a weak acid active loading method. CV7 liposomes were able to be functionalised by the incorporation of a mannose ligand on the surface of the liposome. An inhibition assay using the target enzyme of CV7, MptpB, was optimised to assess efficacy of liposomally encapsulated and released CV7. Flow cytometry and confocal microscopy studies confirmed that the liposomal formulations were internalised by the target macrophage cell line, J774a.1. Mannose liposomes conveyed superior uptake kinetics. Further confocal microscopy showed that after internalisation the liposomes entered the endolysosomal pathway and colocalised with BCG. A BCG-macrophage infection model was used to determine the intracellular efficacy of the liposomal formulations. Encapsulated CV7 displayed increased efficacy over free CV7, while encapsulation in functionalised liposomes showed better efficacy still. The encapsulation of GFLX did not increase the efficacy of GFLX and synergy between the two drugs was not achieved. In conclusion, the liposomal encapsulation of CV7 increased uptake of the drug by the target cell line and facilitated colocalisation of the drug with the target pathogen thereby increasing efficacy. Such a formulation could potentially increase bioavailability and efficacy in vivo for a more tolerable TB therapy.

O gênero Leishmania apresenta espécies capazes de desenvolver doenças de grande importância para a saúde pública, as leishmanioses, que apresentam prevalência mundial de 12 milhões de pessoas. Quando os parasitos entram em contato com o hospedeiro humano passam por um processo de metaciclogênese adquirindo capacidade de interagir com os macrófagos. Inúmeras atividades biológicas são desencadeadas pela ativação de sistemas de transdução de sinais, onde as proteínas cinases e fosfatases desempenham papel fundamental. A proteína cinase CK2 parece estar presente em todas as células eucarióticas (núcleo, citoplasma e superfície). É caracterizada como enzima serina/treonina cinase, embora também seja capaz de fosforilar resíduos de tirosina em suas proteínas-alvo. No presente trabalho, demonstramos que o principal inibidor da CK2, TBB, foi capaz de inibir o crescimento de formas promastigotas de L. donovani e mostrou um mecanismo de ação irreversível, entretanto não foi capaz de induzir apoptose nas formas promastigotas de L. donovani. O pré-tratamento dos parasitos e macrófagos, assim como a adição do TBB durante o processo de infecção induziram uma redução significativa no número de amastigotas por macrófagos possivelmente pelo mecanismo de morte celular programada demosntrada pela técnica do TUNEL. O tratamento de macrófagos com TBB não induziram o aumento de óxido nítrico. Ensaios de imunofluorescência demonstraram a presença de CK2&#945; em promastigotas. Macrófagos não infectados demonstraram pouca marcação para CK2&#945;. Após a interação, a enzima mostrou-se distribuída preferencialmente na periferia dos macrófagos. Os dados do trabalho sugerem que a CK2 é uma importante enzima para a atividade biológica da Leishmania donovani, tendo seu estudo importante relevância para a descoberta de novos alvos terapêuticos. / The genus Leishmania contains multiple species that are responsible for a group of diseases, leishmaniasis. Current estimates suggest that 12 million people are infected. When parasites enter a human host, they undergo metacyclogenesis and acquire the ability to interact with macrophages. This interaction activites signal transduction pathways inducing numerous biological activities, including protein kinase CK2. CK2 has been observed in all eukaryotic cells residing in the nucleus, the cytoplasm and on the cell surface. It appears to have an essential function and recognizes serine/threonine or tyrosine residues in target proteins for phosphorylation. In the present study, we demonstrate that the treatment of L. donovani promastigotes with TBB resulted in inhibition of cell growth and showed an irreversible mechanism of action, however was not able to induce apoptosis in L. donovani promastigotes. The pre-treatment of promastigotes and macrophages, as well as the addition of TBB during infection induced a significant reduction in the number of amastigotes per macrophages, possibly via the mechanism of programmed cell death showed by TUNEL technique. Treatment of macrophages with TBB did not induce the increase of nitric oxide. Immunofluorescence assays demonstrated the presence of CK2&#945; distributed throughout the surface the promastigotes. Uninfected macrophages showed little to no CK2&#945;. After initiating the interaction of parasites with macrophages, CK2&#945; was observed distributed preferentially in the nucleus of macrophages. Job data suggest that CK2 is an important enzyme for the biological activity of Leishmania donovani, and its study important relevance to the discovery of new therapeutic targets.

Objetivo: Uma série de casos sugerindo uma possível associação de pancreatite aguda (PA) e síndrome de ativação macrofágica (SAM) em lúpus eritematoso sistêmico pediátrico (LESP) foi reportada em dez crianças no nosso serviço, no entanto, não existem dados relativos à comparação entre PA e SAM em grandes populações de LESP e LES adulto (LESA). Métodos: Este estudo incluiu 362 pacientes LESP e 1.830 pacientes LESA. SAM foi diagnosticada de acordo com os critérios diagnósticos preliminares e PA de acordo com a presença de dor abdominal e/ou vômitos associados a um aumento de enzimas pancreáticas e/ou alterações radiológicas pancreáticas nos exames de ultrassonografia e/ou tomografia abdominal. Dados demográficos, características clínicas, SLEDAI-2K, SLICC/ACR-DI e tratamento foram avaliados. Resultados: A frequência de PA foi significantemente aumentada no LESP em comparação ao LESA [12/362 (3,3%) vs. 20/1830 (1,1%), p=0,003], com similar duração da PA nos dois grupos [22 (6-60) vs. 15 (4-90), dias, p=0,534]. As frequências de SAM (85% vs 30%, p=0,003) e óbito (31% vs. 0%; p=0,017) foram significantemente elevadas em crianças com PA comparadas com adultos com PA. Na análise dos pacientes com PA e SAM em comparação com os com somente PA sem SAM demonstrou que a idade dos pacientes com PA e SAM foi significantemente menor em comparação com aqueles sem SAM [15 (8,8- 55) vs. 33,5 (10,2-45,7) anos, p=0,007]. As frequências de febre (94% vs. 37%, p=0,001), leucopenia (82% vs. 19%, p=0,0001), trombocitopenia (65% vs. 19%, p=0,013), hipertrigliceridemia (87% vs. 42%, p=0,037) e hiperferritinemia (93% vs. 37%, p=0,011) foram significantemente aumentadas nos pacientes com PA e SAM comparados aos pacientes com somente PA. A concomitância de febre e hiperferritinemia foi significantemente mais freqüente no primeiro grupo (86% vs. 12%, p=0,0015). Conclusões: Este estudo forneceu novos dados que evidenciaram que SAM ocorreu na maioria dos LESP com PA com uma maior mortalidade em comparação com LESA. Além disso, foram identificados em pacientes com PA e SAM, um conjunto de parâmetros clínicos e laboratoriais associado com as duas complicações / Objective: We previously reported a case series of acute pancreatitis (AP) and macrophage activation syndrome (MAS) in childhood (cSLE) patients, however there are no data regarding the comparison of AP and MAS in large populations of cSLE and adult SLE (aSLE). Methods: This study included 362 cSLE and 1,830 aSLE patients. MAS was diagnosed according to preliminary diagnostic guidelines and AP according to the presence of abdominal pain or vomiting associated to an increase of pancreatic enzymes and/or pancreatic radiological abnormalities. Demographic data, clinical features, SLEDAI-2K, SLICC/ACR-DI and treatment were assessed. Results: Higher and significant frequency of AP in cSLE compared to aSLE patients [12/362(3.3%) vs. 20/1830(1.1%), p=0.003], with similar AP duration [22(6- 60) vs. 15(4-90) days, p=0.534]. MAS (85% vs. 30%, p=0.003) and death by MAS complication (31% vs. 0%, p=0.017) were significantly higher in children with AP compared with aSLE with AP. Further analysis of patients with AP and MAS compared with AP without MAS demonstrated that age in MAS patients was significantly lower compared with those without this complication [15(8.8-55) vs. 33.5(10.2-45.7) years, p=0.007]. The frequencies of fever (94% vs. 37%,p=0.001), leucopenia (82% vs. 19%,p=0.0001), thrombocytopenia (65% vs. 19%,p=0.013), hypertriglyceridemia (87% vs. 42%,p=0.037) and hyperferritinemia (93% vs. 37%,p=0.011) were also more frequently observed in AP patients with MAS compared in AP patients without MAS. Fever and hyperferritinemia concomitantly were more frequent in the former group (86% vs. 12%, p=0.0015). Conclusions: This study provides novel data demonstrating that MAS occur in the majority of cSLE with AP with a higher mortality compared to aSLE. In addition, we identified in AP patients, a cluster of MAS clinical and laboratorial parameters more associated with this complication

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) is a cytokine that regulates the proliferation and differentiation of hematopoietic progenitor cells and activates mature granulocytes and macrophages. Clinically is used in enhancing hematopoietic recovery after cancer chemotherapy and bone marrow transplantation. A reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) method was validated for the determination of the non-glycosylated recombinant rhGM-CSF (Molgramostim) in biopharmaceutical formulations. The RP-LC method was carried out on a Jupiter C4 column (250 mm x 4.6 mm i.d.), maintained at 45 ºC. The mobile phase A consisted of 0.1% TFA and the mobile phase B consisted of 0.1% TFA in acetonitrile, run at a gradient from: 0.01 34 min, 37% 50% of B; 34 35 min linear back to 37% of B and 35 40 min, 37% of B. The flow rate was 1 mL/min, and using photodiode array (PDA) detection at 214 nm. The chromatographic separation was obtained with the retention time of 29.2 min, and was linear over the concentration range of 2-300 μg/mL (r2 = 0.9992). The procedure was validated evaluating parameters such as the specificity, linearity, precision, accuracy, robustness, limit of detection and limit of quantitation. The specificity was proven through degradation studies, showing that also there was no interference of the excipients. Moreover, the in vitro cytotoxicity test of the degraded products showed significant differences (p<0.05). The proposed method was applied for the analysis of molgramostim and their related proteins, and the results were correlated to the bioassay, showing mean differences of the potency 1.02% higher for the RP-LC method, contributing to establish alternatives to characterize and monitoring its instability, improving the quality control and assuring the therapeutic efficacy. / O fator estimulador da colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) é uma citocina que regula a proliferação e diferenciação de células progenitoras hematopoiéticas e ativa granulócitos e macrófagos maduros. É clinicamente indicado após quimioterapia para o câncer e após transplante de medula óssea. No presente trabalho foi validado método por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) para a avaliação da molgramostima, forma recombinante não-glicosilada do GM-CSF, em formulação biofarmacêutica. Utilizou-se coluna Júpiter C4 (250 mm x 4,6 mm d.i.), mantida a 45 °C. A fase móvel A foi composta de ácido trifluoracético 0,1% e a fase móvel B de ácido trifluoracético 0,1% em acetonitrila, eluídas no gradiente: 0,01 34 min, 37 50% de B; 34 35 min, 50 37% de B, mantendo-se nesta proporção até 40 min. Utilizou-se vazão de 1 mL/min, usando detector de arranjo de diodos (DAD) a 214 nm. A separação cromatográfica foi obtida no tempo de 29,2 min, sendo linear na faixa de concentração de 2 300 μg/mL (r2 = 0,9992). O procedimento foi validado, avaliando-se os parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez, limite de detecção e quantificação. A especificidade foi comprovada através de estudos de degradação, demonstrando também que não houve interferência dos excipientes. Além disso, realizou-se o teste de citotoxicidade in vitro dos produtos degradados que apresentaram diferença significativa (p<0,05). O método foi aplicado para avaliação de potência de molgramostima e de proteínas relacionadas, e os resultados foram correlacionados com o bioensaio, observando-se diferenças médias de potência 1,02% superiores por CL-FR. Contribuiu-se assim para o estabelecimento de alternativas que aprimoram o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A Echinodorus macrophyllus (Alismataceae), conhecida como chapéu de couro no Brasil, é usada popularmente para tratar doenças reumáticas e inflamatórias. Neste trabalho, foram avaliados os efeitos antiinflamatórios do extrato aquoso de E. macrophyllus (EAEm) e suas frações etanólicas no modelo murino de air pouch. Para a obtenção das frações, 7 g do EAEm foram aplicadas em uma coluna cromatográfica aberta de sílica gel eluída com diferentes concentrações de etanol. Os cromatogramas do EAEm/frações foram obtidos usando um sistema de HPLC. Foram obtidas quatro frações, duas delas com maior rendimento. Resumidamente, a bolha de ar foi induzida pela injeção de 5 mL de ar estéril (s.c) no dorso de camundongos SW machos (25-35 g). Após 3 dias, mas 3 mL de ar estéril foram injetados para manter a bolha. No sexto dia, cada grupo (n = 4) foi tratado intraperitoneal (ip) ou oralmente (v.o) com EAEm (25 ou 250 mg/kg), Fr20 ou Fr40 (2,5, 25, 50 ou 100 mg/kg) e os controles com indometacina (10 mg/kg, v.o.) ou veículo (salina). Uma hora depois, 1 mL de salina ou de carragenina 1% estéril foi injetada dentro da bolha. Após 4 h, a cavidade foi lavada com NaCl 0,9%, EDTA 2 mM (1 mL), para a determinação do número de leucócitos, volume do exsudato e concentração de proteínas. Células do exsudato foram preparadas em citocentrífuga e coradas pelo método do Panótico para a contagem diferencial dos leucócitos. Cortes histológicos coletados dos diferentes grupos foram fixados com formol tamponado 10% (pH 7,4) por 7 dias, corados com HE e analisados em MO. A análise da expressão da iNOS e da COX-2 foi realizada em células do exsudato por RT-PCR. O acúmulo de nitrito (NO2&#8722;) no sobrenadante do cultivo de células RAW 264.7 foi determinado usando um ensaio colorimétrico baseado na reação de Griess. Os resultados foram expressos como média EP e comparados usando ANOVA seguido de teste de Dunnet. Os experimentos foram realizados em triplicata. No modelo air pouch, a injeção de carragenina 1% aumentou tanto a migração celular quanto a concentração de proteína no exsudato. Contudo, enquanto o pré-tratamento com a Fr40 aumentou a resposta inflamatória, o pré-tratamento com o EAEm e a Fr20, sobretudo por via i.p., inibiu esta resposta quando comparado ao grupo controle tratado apenas com o veículo. Assim, foram observadas as seguintes razões de inibição da migração de células: EAEm, i.p. a 25 mg/kg (66,44%) e a 250 mg/kg (87,27%) e Fr20 a 2,5 mg/kg (26,89%), 25 mg/kg (60,06%), 50 mg/kg (63,13%) e a 100 mg/kg (77,47%). Em relação à contagem diferencial, o EAEm e a Fr20 afetaram principalmente o número de neutrófilos, inibindo sua migração no exsudato. O EAEm e a Fr20 também reduziram a concentração total de proteínas no exsudato principalmente no tratamento i.p.; EAEm a 25 e 250 mg/kg mostrou 3,33 0,55 e 2,05 0,51 mg/mL, respectivamente, quando comparado aos grupos controles (Indometacina 2.88 0.64 mg/mL; Veículo 5.48 0.88 mg/mL). A Fr20 a 2,5, 25, 50 e 100 mg/kg mostrou 4,788 0,444, 1,417 0,519, 2,474 0,529 e 2,215 0, 361 mg/mL. A análise histológica mostrou infiltrado celular, principalmente composto de leucócitos polimorfonucleares ao longo da derme inflamada de animais tratados com veículo. O tratamento com o EAEm ou Fr20 reduziu a infiltração de leucócitos no tecido inflamado. Além disso, o tratamento com o EAEm e a Fr20 mostrou atividade supressora sobre a expressão de iNOS e COX-2, e mostrou efeitos inibitórios na produção de NO induzida por LPS. Concluindo, todos estes resultados confirmam o potencial antiinflamatório sugerido para esta planta e fornecem uma base para a compreensão de seus mecanismos moleculares de ação. Contudo, outros estudos devem ser realizados para melhor elucidar as vias pelas quais o EAEm e a Fr20 exercem seus efeitos antiinflamatórios. Além disso, estudos fitoquímicos devem ser realizados para identificar os compostos ativos no EAEm e na Fr20. / Echinodorus macrophyllus (Alismataceae), known as "chapéu de couro" in Brazil, is used popularly to treat rheumatic and inflammatory diseases. In this work we have evaluated the anti-inflammatory effects of the aqueous extract of E. macrophyllus (AEEm) and of its ethanolic fractions in mice air pouch model. Fractions were obtained by applying 7 g AEEm on a silica gel chromatography open column eluted with different ethanol concentrations. The fractions so obtained were evaporated under vacuum and lyophilized. Representatives chromatograms of EAEm/fractions were obtained using a HPLC system. We obtained four fractions, two with higher-yielding. Briefly, the air pouch was induced by 5 mL of sterile air injection (s.c.) on the back of male SW mice (25-35 g). After 3 days, 3 mL of sterile air has been injected again to keep it. After six days each group (n = 4) received intraperitoneal (i.p.) or oral (p.o.) treatment with AEEm (25 or 250 mg/kg), Fr20 or Fr40 (2.5, 25, 50 or 100 mg/kg) or controls indomethacin (10 mg/kg, p.o.) and vehicle (saline). One hour later 1 mL saline or carrageenan 1% sterile was injected into the pouch. After 4 h, the cavity was washed with NaCl 0.9%, EDTA 2 mM (1 mL), for determination of leukocyte numbers, final exudate volume and protein concentration. Cytospin preparations of exudates were stained with Panotic method for differential leukocyte count. Histological sections of tissue collected from different groups were fixed with 10% buffered formalin (pH 7.4) for 7 days and stained with HE and analyzed by MO. The iNOS and COX-2 expression analyses were performed on the exudate cells by RT-PCR. Accumulated nitrite (NO2&#8722;) in the media obtained from the RAW 264.6 cell cultures was determined using a colorimetric assay based on the Griess reaction. Results were expressed as mean SEM and compared using ANOVA and Dunnet&#8223;s test. Experiments were performed in triplicate. In air pouch model, carrageenan 1% increased both the cell migration and the exudate protein level. However, while pretreatment with Fr40 increased inflammatory response, the pretreatment with AEEm and Fr20, mainly i.p. inhibited its when compared to the control group treated only the vehicle. So, the following rates of inhibition of cell migration were observed: AEEm, i.p. at 25 mg/kg (66.44%) and at 250 mg/kg (87.27%) and Fr20 at 2.5 mg/kg (26.89%), at 25 mg/kg (60.06%), at 50 mg/kg (63.13%) and at 100 mg/kg (77.47%). Regarding the differential count, the EAEm and Fr20 affected mainly the content of neutrophils, inhibiting the neutrophils migration in exudate. AEEm and Fr20 also reduced the total protein level in exudates mainly in the i.p. treatment. AEEm at 25 and 250 mg/kg showed 3.33 0.55 and 2.05 0.51 mg/mL, respectively, when compared to controls groups (Indomethacin 2.88 0.64 mg/mL; vehicle 5.48 0.88 mg/mL). Fr20 at 2.5, 25, 50 and 100 mg/kg showed 4.788 0.444, 1.417 0.519, 2.474 0.529 and 2.215 0.361 mg/mL. The histological analysis showed cellular infiltrate, mainly composed by polymorphonuclear leukocytes throughout the inflamed dermis of animals treated with vehicle. Treatment with AEEm or Fr20 reduced the leukocyte infiltrate on inflamed tissue. In addition, treatment with AEEm and Fr20 showed suppressive activity on iNOS and COX-2 expression, and showed inhibitory effects on LPS-induced nitric oxide production. In conclusion, all these findings support an anti-inflammatory potential suggested for this plant and provides a basis for understanding their action molecular mechanism. However, further studies should be undertaken to better elucidate the pathways by which AEEm and Fr20 exert their anti-inflammatory effects. In addition, phytochemical studies must be underway to identify active compounds in AEEm and Fr20.

O gênero Leishmania apresenta espécies capazes de desenvolver doenças de grande importância para a saúde pública, as leishmanioses, que apresentam prevalência mundial de 12 milhões de pessoas. Quando os parasitos entram em contato com o hospedeiro humano passam por um processo de metaciclogênese adquirindo capacidade de interagir com os macrófagos. Inúmeras atividades biológicas são desencadeadas pela ativação de sistemas de transdução de sinais, onde as proteínas cinases e fosfatases desempenham papel fundamental. A proteína cinase CK2 parece estar presente em todas as células eucarióticas (núcleo, citoplasma e superfície). É caracterizada como enzima serina/treonina cinase, embora também seja capaz de fosforilar resíduos de tirosina em suas proteínas-alvo. No presente trabalho, demonstramos que o principal inibidor da CK2, TBB, foi capaz de inibir o crescimento de formas promastigotas de L. donovani e mostrou um mecanismo de ação irreversível, entretanto não foi capaz de induzir apoptose nas formas promastigotas de L. donovani. O pré-tratamento dos parasitos e macrófagos, assim como a adição do TBB durante o processo de infecção induziram uma redução significativa no número de amastigotas por macrófagos possivelmente pelo mecanismo de morte celular programada demosntrada pela técnica do TUNEL. O tratamento de macrófagos com TBB não induziram o aumento de óxido nítrico. Ensaios de imunofluorescência demonstraram a presença de CK2&#945; em promastigotas. Macrófagos não infectados demonstraram pouca marcação para CK2&#945;. Após a interação, a enzima mostrou-se distribuída preferencialmente na periferia dos macrófagos. Os dados do trabalho sugerem que a CK2 é uma importante enzima para a atividade biológica da Leishmania donovani, tendo seu estudo importante relevância para a descoberta de novos alvos terapêuticos. / The genus Leishmania contains multiple species that are responsible for a group of diseases, leishmaniasis. Current estimates suggest that 12 million people are infected. When parasites enter a human host, they undergo metacyclogenesis and acquire the ability to interact with macrophages. This interaction activites signal transduction pathways inducing numerous biological activities, including protein kinase CK2. CK2 has been observed in all eukaryotic cells residing in the nucleus, the cytoplasm and on the cell surface. It appears to have an essential function and recognizes serine/threonine or tyrosine residues in target proteins for phosphorylation. In the present study, we demonstrate that the treatment of L. donovani promastigotes with TBB resulted in inhibition of cell growth and showed an irreversible mechanism of action, however was not able to induce apoptosis in L. donovani promastigotes. The pre-treatment of promastigotes and macrophages, as well as the addition of TBB during infection induced a significant reduction in the number of amastigotes per macrophages, possibly via the mechanism of programmed cell death showed by TUNEL technique. Treatment of macrophages with TBB did not induce the increase of nitric oxide. Immunofluorescence assays demonstrated the presence of CK2&#945; distributed throughout the surface the promastigotes. Uninfected macrophages showed little to no CK2&#945;. After initiating the interaction of parasites with macrophages, CK2&#945; was observed distributed preferentially in the nucleus of macrophages. Job data suggest that CK2 is an important enzyme for the biological activity of Leishmania donovani, and its study important relevance to the discovery of new therapeutic targets.

A cirrose é uma doença cosmopolita que causa milhares de mortes a cada ano e encontra-se em estado de atenção pelos sistemas de saúde governamentais. Em auxílio à sua compreensão, utiliza-se o modelo de indução de cirrose pela tioacetamida (TAA) em ratas. Porém este modelo tem carência de informações sobre a presença de células inflamatórias no fígado, as quais desempenham ação destrutiva e estimulam o desenvolvimento da cirrose. Propusemos nesta pesquisa a detecção de macrófagos e células dendríticas neste modelo nas primeiras sete semanas com o uso de tioacetamida na dose de 200mg/kg em aplicações intraperitoneais, correlacionando-as com a apoptose de hepatócitos, a presença de células MCP-1 positivas e o desenvolvimento da fibrose em fígado de ratas. Com isto, esperou-se encontrar o aumento contínuo de macrófagos teciduais e exsudativos, juntamente com o aumento de células dendríticas, atraídas pela secreção de MCP-1 pelas células estreladas hepáticas. Esperou-se também a detecção de hepatócitos em apoptose e consequente deposição de fibras colágenas pelas células estreladas hepáticas. A ação tóxica da tioacetamida foi observada pela necrose de sacabocado e reação tecidual com proliferação de ductos biliares. A tioacetamida foi eficiente em desencadear a presença de macrófagos e hepatócitos em apoptose nas primeiras semanas, contudo foi ineficaz em manter o aumento destes eventos de forma constante até o final da sétima semana. Além disso, o aumento do tecido colágeno não foi significante, indicando indiretamente a presença de macrófagos e a lesão de hepatócitos não foi suficientemente intensa para desencadear a ação máxima das células estreladas hepáticas durante as sete semanas de tratamento. A utilização de 200 mg/kg de tioacetamida induziu a presença de células inflamatórias, todavia a lesão do parênquima hepático foi atenuada com o tempo. Portanto, a fim de se manter a constante lesão e inflamação do fígado, possivelmente será necessário aumentar a dose de TAA / Cirrhosis is a cosmopolitan disease that causes thousands of deaths each year and is in a state of attention by governmental health systems. In aid for its comprehension, we use the model of cirrhosis induced by thioacetamide (TAA) in rats. But this model has a lack of information about the presence of inflammatory cells in the liver, which play destructive action and stimulate the development of cirrhosis. We have proposed in this research to detect macrophages and dendritic cells in this model using 200mg/kg of thioacetamide via intraperitoneal for seven weeks and correlate them with apoptosis in hepatocytes, the presence of MCP-1 positive cells and the development of fibrosis in the liver of female rats. It was hoped to find steady increase in tissue and exudative macrophages and of dendritic cells attracted by the release of MCP-1 by hepatic stellate cells, to detect apoptosis in hepatocytes and consequent increase collagen deposition by hepatic stellate cells. The toxic action of thioacetamide was observed by piecemeal necrosis and tissue reaction with bile duct proliferation. The thioacetamide was effective in triggering the presence of macrophages and hepatocyte apoptosis in the first weeks, but ineffective in maintaining steadily increase of these events until the end of the seventh week. Furthermore, the increase of collagen tissue was not significant; indicating indirectly that the presence of macrophages and hepatocyte injury was not enough intense to trigger the maximum action of hepatic stellate cells during the seven weeks of treatment. The use of 200 mg / kg of thioacetamide induced the presence of inflammatory cells; however the injury of the hepatic parenchyma was attenuated with time.Therefore, in order to keep the constant liver injury and inflammation possibly will be necessary to increase the dose of TAA

O diabetes mellitus tipo I (DMI) é uma doença crônica autoimune caracterizada por hiperglicemia devido à destruição das células beta pancreáticas produtoras de insulina. Ao final de 30 dias da indução do diabetes por estreptozotocina, os macrófagos peritoneais residentes dos animais diabéticos apresentaram aumento de RNAm de citocinas e quimiocinas inflamatórias, secreção de óxido nítrico, expressão de NLRP3, iNOS e PARP1 e da atividade da via glicolítica. Perfil pró-inflamatório também foi observado em macrófagos peritoneais de animais NOD (non-obese diabetic). Camundongos diabéticos deficientes em NLRP3 (NLRP3 KO) apresentaram diminuição na expressão de iNOS, PARP1 e na produção de NO em relação aos macrófagos dos animais diabéticos selvagens. O estado diabético tipo I influenciou o perfil dos macrófagos peritoneais residentes, causando aumento na produção de NO, via NLRP3-PARP1-iNOS, expressão de citocinas pró-inflamatórias, receptores de quimiocinas e da atividade glicolítica. O tratamento com DHA (ômega-3) ex-vivo reverteu este perfil e atenuou o quadro pró-inflamatório por diminuição da produção de NO e da expressão de citocinas pró-inflamatórias. / Type I diabetes mellitus (DMI) is a chronic autoimmune disease characterized by hyperglycemia due to the destruction of insulin-producing pancreatic beta cells. At the end of 30 days after type I diabetes induced by streptozotocin, macrophages from diabetic animals had increased expressions of inflammatory cytokines and chemokines, secretion of nitric oxide, expression of NLRP3, iNOS and PARP1, and glycolytic activity compared to the cells from control animals. Proinflammatory features was also observed in peritoneal macrophages of NOD (non-obese diabetic) animals. Macrophages from NLRP3 deficient diabetic mice (NLRP3 KO) had decreased expression of iNOS, PARP1 and of NO production when compared to cells from wild type animals. The type I diabetic state led to a proinflammatory feature in resident peritoneal macrophages by increasing NO production, via the NLRP3-PARP1-iNOS pathway, expressions of proinflammatory cytokines, chemokine receptors and glycolytic activity. In contrast, ex-vivo treatment with DHA (omega-3) reversed this profile and attenuated the proinflammatory state by reducing NO production and expression of proinflammatory cytokines.