Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2018. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-05-15T20:04:42Z No. of bitstreams: 1 2018_ThainádeMeloLessaAmorim.pdf: 2404105 bytes, checksum: 9fcf175fa9624298e799cbd236095c91 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-05-17T17:45:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_ThainádeMeloLessaAmorim.pdf: 2404105 bytes, checksum: 9fcf175fa9624298e799cbd236095c91 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-17T17:45:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_ThainádeMeloLessaAmorim.pdf: 2404105 bytes, checksum: 9fcf175fa9624298e799cbd236095c91 (MD5) Previous issue date: 2018-05-16 / O teste de amplificação de ácidos nucleicos (NAT) é baseado na PCR em tempo real (qPCR), sendo atualmente utilizado na triagem de doadores em bancos de sangue, para detectar a presença do material genético dos vírus HIV, HBV e HCV em bolsas destinadas à doação. Este teste é mais sensível do que as técnicas sorológicas, por ser capaz de detectar a infecção na fase aguda antes do aparecimento de anticorpos, reduzindo o período de janela imunológica. Até o momento, nenhum teste NAT foi desenvolvido para a pesquisa de patógenos protozoários e a transmissão de doenças parasitárias via transfusão sanguínea e transplante de órgãos aumentou nos últimos anos. Neste trabalho, desenvolvemos um teste de diagnóstico NAT utilizando qPCR Sybr Green e TaqMan para a pesquisa do DNA de protozoários de alta relevância clínica, transmissíveis via transfusão sanguínea e endêmicos no Brasil, como o Trypanosoma cruzi, causador da doença de Chagas, Leishmania spp., causadoras das leishmanioses, Toxoplasma gondii, causador da Toxoplasmose, e Plasmodium spp., causadores da malária. Para tanto, foram utilizados pares de primers específicos para amplificação de genes conservados de cada um destes patógenos. Com relação aos testes de eficiência dos pares de primers utilizados, não houve perda de linearidade, pois os declives se mantiveram próximos de 100%. A sensibilidade para detecção de T. cruzi, Leishmania sp. e Plasmodium sp. foi semelhante na qPCR Sybr Green e TaqMan, para T. gondii, a qPCR TaqMan foi mais sensível, detectando um limite de 0,005 parasitas/µL. Constatamos que com relação à linearidade e sensibilidade ambas as metodologias são similares e com relação à especificidade, a TaqMan qPCR que utiliza sondas fluorogênicas gene-específicas marcadas com fluoróforos diferentes, apresentouse superior ao Sybr Green qPCR, possibilitando a definição do tipo de protozoário presente na amostra a ser analisada. Deste modo, propomos o sistema de qPCR Sybr Green utilizando primers com alvo no rRNA 28S de Trypanosomatidae para a amplificação dos genes de T. cruzi e Leishmania sp. e com alvo no rRNA 18S para os genes de Plasmodium sp. e T. gondii. para ser utilizado nos testes de triagem. Em uma segunda etapa, o sistema qPCR TaqMan deve ser então utilizado nos testes confirmatórios. Deste modo, o estabelecimento deste teste diagnóstico na rotina de bancos de sangue contribuirá fortemente para o aumento da segurança transfusional. / The nucleic acid amplification test (NAT) is based on real-time PCR (qPCR) and is currently used in blood donor screening to detect the presence of the genetic material of HIV, HBV and HCV viruses in donated pockets. This test is more sensitive than serologic techniques, because it is able to detect acute infection before the appearance of antibodies, reducing the period of immunological window. To date, no NAT test has been developed for protozoan pathogen research, and transmission of parasitic diseases via blood transfusion and organ transplantation has increased in recent years. In this work, we developed a NAT diagnostic test using qPCR Sybr Green and TaqMan to investigate the DNA of protozoa of high clinical relevance, transmissible through blood transfusion and endemic in Brazil, such as Trypanosoma cruzi, which causes Chagas disease, Leishmania spp. , causing the leishmaniasis, Toxoplasma gondii, causative of toxoplasmosis, and Plasmodium spp., causing malaria. For this, specific pairs of primers were used for the amplification of conserved genes of each of these pathogens. Regarding the efficiency tests of the pairs of primers used, there was no loss of linearity, since the slopes remained close to 100%. The sensitivity for detection of T. cruzi, Leishmania sp. and Plasmodium sp. was similar in qPCR Sybr Green and TaqMan, for T. gondii, qPCR TaqMan was more sensitive, detecting a limit of 0.005 parasites / μL. We found that with regard to linearity and sensitivity both methodologies are similar and with respect to specificity, TaqMan qPCR that uses gene-specific fluorogenic probes labeled with different fluorophores, was superior to Sybr Green qPCR, allowing the definition of protozoan type present in the sample to be analyzed. Thus, we propose the Sybr Green qPCR system using target primers in the Trypanosomatidae 28S rRNA for the amplification of the T. cruzi and Leishmania sp. and targeted at the 18S rRNA for the Plasmodium sp genes and T. gondii to be used in the screening tests. In a second step, the TaqMan qPCR system should be used in the confirmatory tests. In this way, the establishment of this diagnostic test in routine blood banks will contribute greatly to the increase of transfusion safety.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Medicina Tropical, 2015. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-03-03T17:43:05Z No. of bitstreams: 1 2015_ShirleyClaudinoPereiraCouto.pdf: 2005336 bytes, checksum: 109e6489df275decec29166652ec4123 (MD5) / Approved for entry into archive by Ruthléa Nascimento(ruthleanascimento@bce.unb.br) on 2017-03-31T16:30:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_ShirleyClaudinoPereiraCouto.pdf: 2005336 bytes, checksum: 109e6489df275decec29166652ec4123 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-31T16:30:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_ShirleyClaudinoPereiraCouto.pdf: 2005336 bytes, checksum: 109e6489df275decec29166652ec4123 (MD5) / A malária continua sendo um importante problema de saúde pública mundial acometendo milhões de pessoas principalmente nas regiões tropicais, e resulta em aproximadamente em 600 mil mortes por ano. As drogas antimaláricas influenciam indiretamente as respostas do sistema imunitário pela capacidade de diminuir a carga parasitária, diminuindo a quantidade de antígenos capazes de ativar o sistema imunitário. Entretanto, ainda está pouco esclarecida a ação das drogas antiplasmodiais sobre os mecanismos de defesa contra o plasmódio. A fagocitose encontra-se entre os principais mecanismos de eliminação do parasito, principalmente pela produção de radicais de oxigênio e nitrogênio pelos monócitos. A biogênese dos corpos lipídicos encontra-se aumentada na malária e pode estar envolvida na defesa e na fisiopatogenia da malária grave. O objetivo desse trabalho foi avaliar a influência do efeito imunomodulador do artemeter, lumefantrina e mefloquina na malária, pela avaliação da influência dessas drogas na fagocitose das formas eritrocitárias do plasmódio, na produção de óxido nítrico e peróxido de hidrogênio e na biogênese de corpos lipídicos. A influência do artemeter, da lumefantrina ou da mefloquina sobre a fagocitose por monócitos de indivíduos normais foia valiada in vitro utilizando 106 eritrócitos parasitados pelo Plasmodium falciparum, pelos receptores para padrões moleculares de patógenos (rPMP) e pelos receptores para opsoninas (rOps). Os monócitos e/ou os eritrócitos foram tratados previamente com as drogas por 60 min. O índice fagocitário foi determinado pela média de eritrócitos parasitados ingeridos por monócito multiplicado pela proporção de monócitos envolvidos na fagocitose. A produção de óxido nítrico foi avaliada pela reação de Griess e a produção de peróxido de hidrogênio foi avaliada pela oxidação do vermelho fenol na presença de peroxidase, sendo os monócitos estimulados pelos eritrócitos parasitados. Os corpúsculos lipídicos foram avaliados pela coloração com Oil Red O. As drogas foram utilizadas in vitro considerando os picos séricos observados quando do tratamento in vivo, sendo 360 ng/mL para o artemeter, 4,9g/mL para a lumefantrina e 687ng/mL para a mefloquina. Quando foi feito o tratamento dos monócitos e dos eritrócitos com o artemeter, observamos diminuição no IF quando avaliado pelos rOps (7,6x 5,2) (p= 0,02). A diminuição da fagocitose foi semelhante quando quantificada para hemozoína (p=0,036). Para a lumefantrina, houve diminuição do IF de 8,4 para 4,6 (p=0,02), quando apenas os monócitos foram tratados e a fagocitose avaliada pelos rPMP. Também houve diminuição do IF para esquizontes pelos rPMP, quando apenas os monócitos foram tratados (p=0,006). Quando os monócitos foram estimulados com os eritrócitos parasitados pelos rPMP, as três drogas diminuíram a expressão de corpúsculos lipídicos (p<0,05). Entretanto, quando os monócitos foram estimulados com os eritrócitos infectados sensibilizados, pelos receptores para opsoninas, houve aumento da expressão dos corpúsculos lipídicos pelo tratamento com a lumefantrina e a mefloquina (p<0,05). O estímulo dos monócitos com os eritrócitos parasitados aumentou a produção de peróxido de hidrogênio (p=0,009). E a mefloquina diminuiu a produção basal de H2O2 pelos monócitos (p<0,05). A diminuição da expressão de corpúsculos lipídicos nos monócitos estimulados com eritrócitos parasitados pelo P. falciparum pelos rPMP e seu aumento pelos rOps indica que a expressão dos corpúsculos lipídicos foi dependente da via pelo qual o monócito foi estimulado pelo eritrócito parasitado. A lumefantrina deprimiu a fagocitose dos eritrócitos parasitados pelos rPMP, enquanto a depressão da fagocitose ocasionada pelo artemeter foi dependente da ingestão do parasito pelos receptores para complemento. Nossos dados mostraram que o artemeter, a lumefantrina e a mefloquina modulam as respostas dos monócitos aos eritrócitos parasitados pelo P. falciparum em aspectos fundamentais relacionados com a defesa inata, nas interações iniciais do parasito com as células de defesa do hospedeiro. Mostrando, portanto, que a ação desses fármacos não depende exclusivamente de sua atividade antiparasitária, mas que o resultado final da ação desses medicamentos depende também da modulação de diversos mecanismos de defesa inato contra o parasito. / Malaria remains a worldwide public health issue, affecting millions of people, especially those living in tropical regions. Statistics confirm the magnitude of this disease, with, approximately, 600 thousand deaths each year. Antimalarial drugs indirectly influence immune response through its capacity to reduce parasite load, reducing the quantity of antigens that are capable of activating immune system. However, the role played by antiplasmodial drugs on defense against Plasmodium is still not well established. Phagocytosis remains one of the main mechanisms of eliminating parasites, especially through production of radical oxygen and nitrogen molecules by monocytes. The lipid body biogenesis is also enhanced in malaria e may be involved in defense and pathophysiology of severe disease. Therefore, the objective of the current study was to evaluate the immunomodulatory effect of arthemeter, lumefantrine and mefloquine drugs in malaria, based on the role of these drugs on phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes, on the production of nitric oxide and hydrogen peroxide and on the biogenesis of lipid bodies. The influence of arthemeter, lumefantrine and mefloquine on phagocytosis by monocytes in healthy individuals was evaluated in vitro using 106 Plasmodium falciparum-infected erythrocytes, through pathogen-associated molecular pattern receptors (PAMPr) or opsonin receptors. Monocytes and/or erythrocytes were previously treated with the drugs for 60 minutes. The phagocitic index was determined by the product of the mean number of parasitized erythrocytes ingested by monocyte and the proportion of monocytes involved in phagocytosis. The production of nitric oxide was evaluated through the Griess reaction, while de hydrogen peroxide production through the red phenol oxidation in presence of peroxidase. Lipid body formation was evaluated by oil red O staining. The drug concentrations used in vitro were obtained by the higher serum levels observed in vivo after ingestion of the drugs, which was 360 ng/mL for arthemeter 4,9 μg/mL for lumefantrine and 687ng/mL for mefloquine. When monocytes and erythrocytes were treated with arthemeter, it was observed a decrease in the phagocitic index when analyzed through opsonin receptors (7,5x5,2) (p=0,02). The reduction in phagocytosis was similar when quantified by hemozoine ingestion (p=0,02). Regarding the lumefantrine treatment, a reduction from 8,4 to 4,6 was observed in the phagocytic index when only monocytes were treated and phagocytosis was assessed through pathogen-associated molecular pattern receptors. An additional reduction was also observed in phagocytic index for esquizonts, through PAMPr when only monocytes were treated (p=0,006). When monocytes were stimulated with parasitized erythrocytes by PAMPr, all three drugs diminished the lipid body formation. However, when monocytes were stimulated with sensitized infected erythrocytes by the opsonin receptors, an increase in lipid body formation was observed when lumefantrine or mefloquine treatment were done (p>0,05). When monocytes were stimulated with Plasmodium falciparum-infected erythrocytes there was an increase in hydrogen peroxide production (p=0,009), whereas mefloquine treatment reduced the basal production of H2O2 by monocytes (p<0,05). Reduction observed in lipid body production after monocyte stimulation with Plasmodium falciparum-infected erythrocytes by PAMPr and its increase when monocyte stimulation occurred by opsonin receptors show that lipid body formation depended on the intracellular pathway by which monocytes were stimulated. Lumefantrine reduced phagocytosis of infected erithrocytes through PAMPr, while reduction caused by arthemeter was observed when phagocytosis occurred by complement receptors. Our dada show that arthemeter, lumefantrine and mefloquine modulate monocyte functions in defense against P. falciparum. Therefore, we conclude that beside the antiparasitic action of these drugs they also modulate the innate defense against parasite.

Submitted by MELINA AULINO CAMPOS DE LIMA null (mel_linaa@hotmail.com) on 2016-06-14T11:27:04Z No. of bitstreams: 1 Campos, versão final.pdf: 6619779 bytes, checksum: 1ced7c5593e51838fa6cdc10742bb1f2 (MD5) / Rejected by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: O arquivo submetido está sem a ficha catalográfica. A versão submetida por você é considerada a versão final da dissertação/tese, portanto não poderá ocorrer qualquer alteração em seu conteúdo após a aprovação. Corrija esta informação e realize uma nova submissão contendo o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2016-06-15T19:04:14Z (GMT) / Submitted by MELINA AULINO CAMPOS DE LIMA null (mel_linaa@hotmail.com) on 2016-07-28T09:31:04Z No. of bitstreams: 1 Campos, versão final.pdf: 6669108 bytes, checksum: bf58ca3048946ca88e3c4dd8fb99500a (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-07-28T14:10:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lima_mac_dr_bot.pdf: 6669108 bytes, checksum: bf58ca3048946ca88e3c4dd8fb99500a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-28T14:10:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lima_mac_dr_bot.pdf: 6669108 bytes, checksum: bf58ca3048946ca88e3c4dd8fb99500a (MD5) Previous issue date: 2016-05-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Degradação florestal, alterações ambientais antropogênicas e mudanças climáticas são fatores que podem modificar a dinâmica populacional de anofelinos. Anopheles (Nyssorhynchus) dar- lingi é o principal vetor de malária no Brasil e em outros países na América do Sul. Estudos observaram o aumento da abundância do vetor An. darlingi e número de casos de malária após desflorestação e demais modificações ambientais antropogênicas. Além de ter ampla distribuição geográfica, essa espécie possui plasticidade comportamental e diversidade morfo- lógica, biológica e genética. Tendo em vista essa heterogeneidade, o presente estudo avaliou a diversidade genética populacional em An. darlingi ligada a distribuição geográfica, dinâmica sazonal e comportamento hematofágico, através de marcadores microssatélites e SNPs. Espé- cimes de An. darlingi foram coletados em dois assentamentos rurais próximos e, em uma área urbana à aproximadamente 600 km de distância. Além disso, as coletas foram realizadas no primeiro e segundo semestre e, dentro e fora das casas, durante o período de atividade hema- tofágica do vetor, ou seja, das 18-6 horas. Os resultados apresentaram subpopulações de An. darlingi em aspecto geográfico, em escalas macro e microgeográficas, acessadas com mais pro- fundidade com os dados dos SNPs. Além disso, o estudo corroborou o prévio achado de duas subpopulações de An. darlingi relacionadas ao regime de chuvas. Por fim, pela primeira vez, a heterogeneidade genética em populações simpátricas desse vetor foi encontrada e relacionada com o fenótipo de comportamento hematofágico, endo e exofagia. Esses achados demonstram a importância do entendimento e vigilância entomológica, pois possuem potencial impacto na transmissão de malária. Dado que cada localidade possui características ambientais peculia- res e portanto, diferentes composições populacionais dos vetores, intervenções específicas em menor escala passam a ser abordagens interessantes no controle da malária. / Forest degradation, human environmental alteration and climate changes are all influence anopheline populations. Anopheles darlingi is the main vector of malaria parasite in Brazil and other countries of South America. Deforestation and others anthropogenic activities have been accompanied by sharp increases in both abundance of the primary malaria vector Anopheles darlingi and numbers of malaria cases. Besides it is widely distributed, this species display great behavioral plasticity and morphological, biological and genetic diversity. The aim of this study was to analyze population genetic diversity of An. darlingi related to geographical distribution, seasonal dynamics and hematophagic behavior, using microsatellites and SNPs markers. An. darlingi specimens were collected in two close rural settlements and in an urban area about 600 km away. In addition, collections were performed in both semesters of the year and, indoor and outdoor during the biting activity period of the vector, i.e., 6pm-6am. The results showed subpopulations of An. darlingi related to geographical aspect, in a macro and micro geographic scales, better accessed with SNPs dataset. Moreover, this study corroborated with a previous finding showing two subpopulations of An. darlingi related to rainfall. Finally, for the first time, genetic heterogeneity was found in sympatric populations of this vector, and it was associated with a phenotype of hematophagic behavior, endo and exophagy. These outcomes demonstrate that genetic heterogeneity may represent an important vector phenotypic variation with potentially highly significant consequences for malaria transmission. Since each site has unique environmental characteristics and therefore, different population compositions of vectors, specific interventions on a smaller scale become interesting approaches for optimal targeted malaria transmission interventions. / CAPES: BEX 9230/12-2 / FAPESP: 2014/09461-3 / FAPESP: 2012/04881-9

Orientador: Marina Politi Okoshi / Coorientador: Marcus Vinícius Guimarães de Lacerda / Coorientador: Katashi Okoshi / Banca: Roberto Jorge da Silva Franco / Banca: José Francisco Kerr Saraiva / Banca: Eros Antonio de Almeida / Banca: Alexandre Rodrigues / Resumo: Introdução: O envolvimento do sistema cardiovascular em pacientes com malária por Plasmodium vivax tem sido pouco estudado. Neste trabalho, avaliamos as estruturas cardíacas, a função ventricular e marcadores sistêmicos de lesão cardiovascular em pacientes com a forma não-grave da malária por P. vivax, em Manaus, estado do Amazonas, Brasil. Métodos: Foram avaliados, prospectivamente, 26 pacientes adultos com malária por P. vivax em tratamento ambulatorial, no período de janeiro de 2012 a março de 2013. Os resultados foram comparados com grupo controle de 25 indivíduos saudáveis, pareados por gênero e idade. Avaliação clínica, exames laboratoriais e ecocardiografia transtorácica foram realizados na primeira avaliação após o diagnóstico de malária (dia zero, D0) e sete dias após (D7) início do tratamento. Resultados: Os Casos apresentaram maiores valores do diâmetro sistólico do ventrículo esquerdo (VE; 28,8±2,82 vs 30,9±4,03 mm; p=0,037) e do volume diastólico do VE (82,4±12,3 vs 93,8±25,9 ml; p=0,05) e menor fração de ejeção do VE (método de Teicholz: 73,2±6,59 vs 68,4±4,87; p=0,004) que os Controles. A fração de variação da área do ventrículo direito (VD) foi menor (54,7±5,11 vs 50,5±6,71 %; p=0,014) e o índice de performance miocárdica do VD (0,21±0,71 vs 0,33±0,19; p=0,007), a área diastólica do VD (13,0±3,19 vs 15,3±2,96 cm2; p=0,009 ), a área de sistólica do VD (6,41±1,27 vs 7,45±1,46 cm2; p=0,009) e a resistência vascular pulmonar (1,13±0,25 vs 1,32±0,26 unidades Woods; p=0,012) foram maiores nos Casos que nos Controles. A fração de variação da área do VD foi também menor e a resistência vascular pulmonar maior nos Casos no D0 que no D7. No D0, os Casos apresentaram maior concentração sérica de bilirrubina indireta, da molécula de adesão celular vascular solúvel tipo 1, do fragmento N-terminal do pró-peptídeo natriurético cerebral e da troponina T, e menor ... / Abstract: Purpose: Malaria is an endemic disease in the Amazon Region. In Brazil it has been largely attributed to Plasmodium vivax infection since the 1990's. Cardiovascular system involvement in patients with P. vivax malaria has been poorly addressed. The aim of this study was to evaluate cardiac structures and function and serum markers of cardiovascular injury in patients with the nonsevere form of P. vivax malaria in Manaus, Amazonas state, Brazil. Methods: In an observational study, we prospectively evaluated 26 patients with P. vivax malaria in an outpatient referral hospital from January 2012 to March 2013 and compared results with a control group of 25 gender- and age-matched healthy individuals. Patients underwent clinical evaluation, laboratory tests, and transthoracic echocardiography at first evaluation after malaria diagnosis (day zero, D0) and seven days after starting malaria treatment (day seven, D7). Results: Echocardiography showed higher left ventricular (LV) systolic diameter (28.8±2.82 vs 30.9±4.03 mm; p=0.037) and LV diastolic volume (82.4±12.3 vs 93.8±25.9 ml; p=0.05), and lower LV ejection fraction (Teicholz method: 73.2±6.59 vs 68.4±4.87; p=0.004) values in patients than controls. Right ventricle (RV) fractional area change (54.7±5.11 vs 50.5±6.71%; p=0.014) was lower, and RV myocardial performance index (0.21±0.71 vs 0.33±0.19; p=0.007), RV diastolic area (13.0±3.19 vs 15.3±2.96 cm2; p=0.009) and systolic area (6.41±1.27 vs 7.45±1.46 cm2; p=0.009), and pulmonary vascular resistance (1.13±0.25 vs 1.32±0.26 Woods unit; p=0.012) were higher in patients than controls. RV fractional area change was lower and pulmonary vascular resistance higher in patients in D0 than D7. In D0, patients presented higher serum levels of indirect bilirubin, soluble vascular cell adhesion molecule-1 (sVCAM-1), Nterminal prohormone brain natriuretic peptide, and troponin T, and lower levels of nitric oxide than D7 and controls / Doutor

Orientador: Paulo Eduardo Martins Ribolla / Banca: Virgilio E. do Rosário / Banca: Alexandre Afrânio / Banca: Marcelo Urbano / Banca: Maria Anice Mured Sallum / Resumo: A malária é uma das principais parasitoses humanas do mundo, causando mais de um milhão de mortes, e quase 500 milhões de casos agudos da doença por ano. No Brasil, esta doença continua sendo uma das mais importantes do país, tendo sido registrados no ano de 2009 mais de 300 mil casos. O mosquito Anopheles darlingi é o principal vetor desta doença no Brasil e outros países da América do Sul. Devido à sua importância como vetor da malária humana, estudos sobre a estrutura populacional de An. darlingi tem sido objeto de vários estudos. A sua distribuição na Região Amazônica é ampla e dados recentes mostram alto grau de heterogeneidade, tanto genética como de comportamento. Grande parte desta variabilidade observada em An. darlingi pode estar relacionada com estratégias adaptativas para explorar nichos ecológicos distintos enquanto que a estrutura populacional e a diferenciação pode ser explicada por diferenças no tamanho efetivo da população, padrões de fluxo gênico e acontecimentos históricos e de colonização recente. De igual modo, alterações ambientais efetuadas pelo homem podem ter um impacto significativo na dinâmica de populações de vetores e, consequentemente, na transmissão da malária. Este projeto utilizou a genotipagem de 10 microssatélites para o estudo populacional de Anopheles darlingi coletados em sete localidades ao longo da extensão das Hidrelétricas de Jirau e Santo Antônio, às margens do Rio Madeira, em Porto Velho - RO. Estes métodos foram aplicados na caracterização de amostras coletadas nestas regiões no 1º e 2° semestres de 2007. O objetivo do trabalho foi analisar a estrutura populacional de An. darlingi ao longo do Rio Madeira, na área de influência das Hidrelétricas de Jirau e Santo Antônio. Os resultados mostraram alto fluxo gênico entre as populações, mesmo distando de 70 km. Foram encontradas diferenças... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Malaria is the major human parasitic diseases in the world, causing more than a million deaths and almost 500 million acute cases of disease per year. In Brazil, this disease remains one of the most important, having been recorded in the year of 2009 more than 300.000 cases. The mosquito Anopheles darlingi is the principal malaria vector in Brazil and other countries in South America. Due to its importance as a vector of human malaria, population structure of Anopheles darlingi has been the subject of several studies. Its distribution in the Amazon region is large and recent data show a high degree of heterogeneity, regarding genetic and behavioral aspects. Much of this observed variability may be related to adaptive strategies to exploit different ecological niches, while the population structure and differentiation can be explained by differences in effective population size, patterns of gene flow and historical events and recent colonization. Similarly, environmental changes made by man can take a significant impact on population dynamics of vectors and hence the transmission of malaria. This project genotyping 10 microsatellites for population-based study of Anopheles darlingi collected at seven locations along Rio Madeira at Porto Velho - RO. These methods were applied in the characterization of samples collected in these regions in the 1st and 2nd semesters of 2007. The objective was to analyze the population structure of Anopheles darlingi along the Madeira River, the area of influence of Hydroelectric of Jirau and San Antonio. The results showed high gene flow among populations, even at 70 km apart. We found significant genetic differences among populations when samples were compared seasonally. The samples collected in the first half of the year showed effective population size 10x greater than those collected in the second half. These differences may represent differences... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Paulo Eduardo Martins Ribolla / Resumo: Degradação florestal, alterações ambientais antropogênicas e mudanças climáticas são fatores que podem modificar a dinâmica populacional de anofelinos. Anopheles (Nyssorhynchus) dar- lingi é o principal vetor de malária no Brasil e em outros países na América do Sul. Estudos observaram o aumento da abundância do vetor An. darlingi e número de casos de malária após desflorestação e demais modificações ambientais antropogênicas. Além de ter ampla distribuição geográfica, essa espécie possui plasticidade comportamental e diversidade morfo- lógica, biológica e genética. Tendo em vista essa heterogeneidade, o presente estudo avaliou a diversidade genética populacional em An. darlingi ligada a distribuição geográfica, dinâmica sazonal e comportamento hematofágico, através de marcadores microssatélites e SNPs. Espé- cimes de An. darlingi foram coletados em dois assentamentos rurais próximos e, em uma área urbana à aproximadamente 600 km de distância. Além disso, as coletas foram realizadas no primeiro e segundo semestre e, dentro e fora das casas, durante o período de atividade hema- tofágica do vetor, ou seja, das 18-6 horas. Os resultados apresentaram subpopulações de An. darlingi em aspecto geográfico, em escalas macro e microgeográficas, acessadas com mais pro- fundidade com os dados dos SNPs. Além disso, o estudo corroborou o prévio achado de duas subpopulações de An. darlingi relacionadas ao regime de chuvas. Por fim, pela primeira vez, a heterogeneidade genética em populações... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Forest degradation, human environmental alteration and climate changes are all influence anopheline populations. Anopheles darlingi is the main vector of malaria parasite in Brazil and other countries of South America. Deforestation and others anthropogenic activities have been accompanied by sharp increases in both abundance of the primary malaria vector Anopheles darlingi and numbers of malaria cases. Besides it is widely distributed, this species display great behavioral plasticity and morphological, biological and genetic diversity. The aim of this study was to analyze population genetic diversity of An. darlingi related to geographical distribution, seasonal dynamics and hematophagic behavior, using microsatellites and SNPs markers. An. darlingi specimens were collected in two close rural settlements and in an urban area about 600 km away. In addition, collections were performed in both semesters of the year and, indoor and outdoor during the biting activity period of the vector, i.e., 6pm-6am. The results showed subpopulations of An. darlingi related to geographical aspect, in a macro and micro geographic scales, better accessed with SNPs dataset. Moreover, this study corroborated with a previous finding showing two subpopulations of An. darlingi related to rainfall. Finally, for the first time, genetic heterogeneity was found in sympatric populations of this vector, and it was associated with a phenotype of hematophagic behavior, endo and exophagy. These outcomes demon... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by Thaíza da Silva Santos (thaiza28@hotmail.com) on 2009-10-24T13:16:24Z No. of bitstreams: 1 2006_Paulo Cesar Rodrigues Tabanez.pdf: 2997772 bytes, checksum: c45f51b562196594cb16abea9281c014 (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2009-10-27T13:18:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Paulo Cesar Rodrigues Tabanez.pdf: 2997772 bytes, checksum: c45f51b562196594cb16abea9281c014 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-10-27T13:18:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Paulo Cesar Rodrigues Tabanez.pdf: 2997772 bytes, checksum: c45f51b562196594cb16abea9281c014 (MD5) Previous issue date: 2006-07-31 / A talidomida é uma droga imunomoduladora que tem sido utilizada experimentalmente em muitas condições clínicas, porém seu uso na malária ainda é insipiente. A malária é uma doença com alta morbi-mortalidade presente em todas as regiões tropicais do mundo. As manifestações severas da doença, possivelmente, estão ligadas à excessiva resposta imunitária, principalmente à produção de fator de necrose tumoral e radicais de oxigênio e nitrogênio. A talidomida diminui a produção de FNT por aumentar a degradação do seu ARNm e diminuir a ativação do NFκB. O presente trabalho avaliou a influência da talidomida sobre a evolução da malária e sobre as funções dos macrófagos em camundongos susceptíveis ou não à malária cerebral. Camundongos Balb/C e CBA foram infectados com 106 eritrócitos parasitados por Plasmodium berghei ANKA, tratados a partir do terceiro dia de infecção com 150 mg/Kg de talidomida diluída em solução a 0,8M de sacarose, por via oral, uma vez ao dia, em um volume de 100 μL. Outros dois grupos não foram infectados, mas foram tratados da mesma forma. No oitavo dia de infecção, o sangue foi obtido para a determinação do FNT e os macrófagos foram recuperados da cavidade abdominal para avaliação, in vitro, da capacidade fagocitária, produção de peróxido de hidrogênio, óxido nítrico e FNT. A capacidade fagocitária foi avaliada pelo teste de fagocitose, com ou sem opsoninas, em placa sendo determinado o índice fagocitário. A produção de peróxido de hidrogênio foi determinada pelo teste de oxidação do vermelho de fenol na presença de peroxidase. O óxido nítrico foi determinado pela reação de Griess. O FNT foi quantificado no soro e no sobrenadante das culturas dos macrófagos pelo teste imunoenzimático. A influência da talidomida, mas também da sacarose e da associação da talidomida com sacarose foi avaliada na evolução da malária por meio da curva de sobrevida, da parasitemia, anemia e peso dos camundongos Balb/C. Nos camundongos Balb/C, o tratamento com talidomida não modificou a sobrevida, diminuiu a perda de peso, retardou a elevação da parasitemia em nove dias, porém agravou a anemia a partir do vigésimo primeiro dia de infecção. O tratamento com solução a 0,8M de sacarose antecipou em um dia o início da morte e diminuiu em nove dias o tempo de vida, aumentou a perda de peso no início da infecção e posteriormente, a partir do décimo quarto dia, reduziu a perda de peso, agravou a parasitemia e a anemia. Porém, a associação da talidomida com a sacarose não modificou a curva de sobrevida e retardou a evolução da parasitemia a partir do vigésimo primeiro dia de infecção, por outro lado, agravou a evolução da anemia e aumentou a perda de peso a partir do vigésimo primeiro dia de infecção. Nos camundongos CBA, a associação da talidomida com sacarose não modificou a curva de sobrevida dos animais, a perda de peso, a parasitemia e a anemia. Em relação à função dos macrófagos, o tratamento dos camundongos Balb/C e CBA com talidomida diluída em solução 0,8M de sacarose não alterou a capacidade fagocitária e a produção de peróxido de hidrogênio, modulou negativamente a produção de óxido nítrico e diminuiu a produção de FNT tanto na cultura de macrófagos quanto no soro. Nossos dados sugerem que a talidomida, nos camundongos Balb/C, modulou a hiperativação do sistema imunitário de forma benéfica, uma vez que os aspectos gerais da evolução da malária não foram alterados, ao contrário, houve diminuição da perda de peso e retardo na evolução da parasitemia, porém, a administração isolada de sacarose deve ser avaliada pelos seus possíveis efeitos deletérios durante a infecção. Os dois modelos estudados não respondem da mesma forma à infecção provavelmente determinados por fatores genéticos. Sugerem, portanto, que a utilização da talidomida como terapia adjuvante aos anti-plasmodiais, antes das manifestações clínicas de gravidade, deve ser avaliada em seres humanos, exceto mulheres, com o objetivo de diminuir a grande morbidade e mortalidade da malária. ______________________________________________________________________ ABSTRACT / Thalidomide is an immunomodulatory drug that has been successfully evaluated in several clinical conditions, however it needs better evaluation in severe malaria. Malaria has high morbimortality in vast areas of the world. The excessive activation of the immune system, with increased production of tumor necrosis factor, oxygen and nitrogen reactive species, plays an important role in the pathogenesis of the disease. Thalidomide inhibits the production of TNF increasing the rate of mRNA degradation and depressing NFκB pathway. This work aimed to evaluate the influence of thalidomide on malaria outcome and on macrophage functions of susceptible (CBA) and not susceptible (Balb/C) mice to cerebral malaria. Balb/C and CBA mice were injected with 106 Plasmodium berghei ANKA infected-erythrocytes, and after three days mice were treated per os with 150 mg/Kg/day of thalidomide in 100 μL of 0,8M sucrose solution. The same treatment was administered to two other not infected groups. Another group was treated with only 0,8M sucrose solution. On the eightieth day after infection, blood was collected and macrophages were obtained from peritoneal cavity to assess, in vitro, immunological functions. Phagocytosis was evaluated by phagocytic index. Hydrogen peroxide was assessed by phenol red oxidation and nitric oxide production was assessed by Griess reaction. TNF production was evaluated in serum and supernatant of peritoneal macrophage cultures by immunoassay test. The influence of thalidomide on mortality, parasitemia, hematocrit and body weight was assessed in Balb/C and CBA-infected mice. Another Balb/c group treated with sucrose was added. Thalidomide did not influence the survival time, diminished body weight loss, delayed parasitemia in fortieth day, but worsened anemia twenty one days onward of infection in Balb/C mice compared to non-treated animals. The treatment with sucrose prompts one day the beginning of death and nine days the survival time. Firstly sucrose increased and after fortieth day of infection decreased body weight loss. It worsened parasitemia and anemia compared to that non-treated animals. However, association of thalidomide and sucrose did not alter survival time and body weight loss but increased parasitemia on fourth day onward of infection and worsened anemia after twenty one days of infection compared to that non-treated animals. The association of thalidomide and sucrose to treat CBA infected mice did not alter the survival time, body weight loss, parasitemia or anemia. The treatment with thalidomide of Balb/C and CBA infected mice did not influence the phagocytosis and hydrogen peroxide production, but it downregulated nitric oxide production, and decreased TNF production in serum (Balb/C) and supernatant of peritoneal macrophage cultures (Balb/C and CBA). Our findings suggest that thalidomide improved the outcome of disease, by decreasing body weight loss and delaying the parasitemia. Treatment with sucrose should be better evaluated because its possible deleterious effects. Our findings suggest that both experimental models show different immunopathological mechanisms, probably due to genetic factors. Moreover, thalidomide as adjuvant therapy in human malaria should be evaluated, except in women, to reduce morbidity and mortality of severe malaria.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 1993. / Submitted by Kelly Marques (pereira.kelly@gmail.com) on 2009-11-30T16:54:31Z No. of bitstreams: 1 1993_LeopoldoLuizdosSantosNeto.PDF: 968344 bytes, checksum: be85df14342692bf2dc82666e0164244 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2009-12-01T15:35:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 1993_LeopoldoLuizdosSantosNeto.PDF: 968344 bytes, checksum: be85df14342692bf2dc82666e0164244 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-01T15:35:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1993_LeopoldoLuizdosSantosNeto.PDF: 968344 bytes, checksum: be85df14342692bf2dc82666e0164244 (MD5) Previous issue date: 1993 / A malária representa atualmente um importante problema de saúde pública. A evolução clínica da infecção pelo P. falciparum é geralmente benigna, mas a mortalidade pode atingir até 50% dos casos. Citocinas como o fator de necrose tumoral-α (FNT-α) e o fenômeno de aderência associado as hemácias parasitadas são os principais mecanismos envolvidos na fisiopatogenia da forma grave de malária. Contudo, ainda existem muitos pontos na patogenia desta infecção, particularmente a contribuição da disfunção endotelial no desenvolvimento da síndrome de inflamação sistêmica da forma grave da malária. Com o objetivo de contribuir para o entedimento da disfunção do endotélio na malária grave foi realizado um estudo envolvendo 42 pacientes infectados pelo Plasmodium falciparum, 6 infectados por P. vivax e 13 indivíduos hígidos. A função endotelial foi avaliada, através da detecção da concentração plasmática da selectina-E e do fator de von Willebrand (FVW). Um total de 19 pacientes foram caracterizados como apresentando a forma grave e 23 a forma moderada, de acordo os critérios da OMS. Nos pacientes com malária houve aumento da concentração de selectina-E e do FVW, quando comparado com o grupo controle normal (P<0,05). No entanto, os pacientes com a forma grave apresentaram uma maior ativação endotelial do que os indivíduos do grupo moderado, respectivamente 52,1 ± 34,9 e 34,6 ± 16 ng/mL de selectina-E (P<0,05). Também os títulos do FVW estavam mais elevados na forma grave (P<0,05). Além da disfunção do endotélio, os pacientes com malária grave apresentaram maior elevação do nível do FNT-α, do que na forma Moderada (P<0,05). Por outro lado, a concentração de interleucina-lα não apresentou diferença entre os grupos grave, moderado e controle (P>0,05). A mortalidade da malária foi maior no grupo grave (4/19) do que no moderado (0/23) (P<0,05), e está associada com a maior elevação do FNT-α e maior disfunção endotelial. Contudo, não houve diferença nos níveis de selectina-E e FVW entre os indivíduos que foram a óbito e os que sobreviveram. A correlação entre o FNT-α e o FVW foi de 0,4736 (P=0,047), o que sugere que a disfunção endotelial possa estar estar associada ao aumento dos níveis plasmáticos do FNT-α. Os resultados do presente trabalho mostram, pela primeira vez, o envolvimento do endotélio na malária grave e sua relação com a elevação dos níveis do FNT-α. Tais dados permitem prever o desenvolvimento de novos métodos terapêuticos e profiláticos, através do aumento da proteção do endotélio, modulação na expressão das moléculas de aderência, ou na controle dos efeitos citotóxicos do FNT-α. _____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Malaria remains a major public health problem throughout the world. Although the clinicai manifestations of malaria are not usually severe, the mortality associated to Plasmodium falciparum infection can reach 50% according with the care disposable. Cytokines such as tumor necrosis factor-a (TNF-a) and the phenomena of adherence associated to parasited erythrocytes are considered to play important role in the phatophysiology of severe malaria. However several important questions about the pathology of malaria remain unsolved. This included the contribution of endothelial dysfunction of systemic inflammatory response syndrome associated to severe malaria. Aiming at contributing to the understanding of endothelial dysfunction in severe malaria we studied 42 individuais P. falciparum. The endothelial function was evaluated thought the detection of plasma leveis of E-selectin and von Willbrand Factor (VWF). Nineteen individuais were characterized as presenting severe malaria while in 23 individuais presented moderated manifestations according to WHO. An increase in plasma concentrations of E-Selectin and the titers of vWF was detected in individuais with P. falciparum infection, when compared to those infected with P. vivax and normal controls (P<0,05). However, the cases of severe malaria showed a more intense involvement of endothelial cells than those without malaria, as measured by the plasma leveis of E-Selectin, respectively 52,1 ± 34,9 and 34,6 ± 16 ng/mL. Comparable results were obtained with vWF. Plasma leveis of TNF-a were higher in individuais with severe malaria as compared with the moderate cases. On the other hand, plasma interleukin-lα showed comparable leveis in all the studied groups. Mortality was higher in the severe group (4/19) and was associated to higher increases of plasma TNF-a and endothelial dysfunction. However, no difference was found in the leveis of E-selectin and vWF among those individuais who survived and who died. The correlation between TNF-a and vWF was 0,4736 (P=0.047) suggesting that the endothelial dysfunction could be associated to the increased leveis of TNF-a. Our results show for the first time the involvement of endothelium in severe malaria and it relation with the increased plasma leveis of TNF-α These data open new avenues for the development of novel methods of prophilatics and therapy by means of modulation of expression of adherence molecules, the control of cytotoxic effects of TNF-α and the increasing the protection of the endothelial cells.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2011. / Submitted by Gabriela Ribeiro (gaby_ribeiro87@hotmail.com) on 2011-06-28T18:32:02Z No. of bitstreams: 1 2011_AlanFecchio.PDF: 1068161 bytes, checksum: 361c20f6d6683f24f194fadeb71ba488 (MD5) / Approved for entry into archive by Guilherme Lourenço Machado(gui.admin@gmail.com) on 2011-06-30T13:06:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_AlanFecchio.PDF: 1068161 bytes, checksum: 361c20f6d6683f24f194fadeb71ba488 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-30T13:06:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_AlanFecchio.PDF: 1068161 bytes, checksum: 361c20f6d6683f24f194fadeb71ba488 (MD5) / Hemoparasitos têm fundamental importância na ecologia e evolução de aves, uma vez que são capazes de afetar a sobrevivência e reprodução de seus hospedeiros. A prevalência (porcentagem de indivíduos infectados na população de hospedeiros) dos parasitos da malária aviária (Plasmodium e Haemoproteus) varia de zero a 100% entre diferentes espécies na comunidade de aves, embora as causas ecológicas e evolutivas dessa variação não sejam bem entendidas. Diante desse contexto, a proposta da presente tese foi determinar quais características reprodutivas (tipo de construção do ninho e altura do ninho) e da história de vida (peso, sistema social, tempo de incubação e status migratório) em aves poderiam explicar as taxas de parasitismo entre as diferentes espécies de hospedeiros em uma comunidade estudada durante cinco anos no Cerrado do Brasil Central. Adicionalmente, foi estudada a estrutura e organização da taxocenose dos parasitos da malária aviária através do sequenciamento de parte do gene mitocondrial (citocromo b) do parasito. Usando Modelo Linear Misto Generalizado (GLMM) e método tradicional para detecção dos hemoparasitos (microscopia), mostramos uma significante correlação positiva entre altura do ninho e prevalência de Haemoproteus, o que corrobora a hipótese que associa prevalência de hemoparasitos e estrato de nidificação em aves da América do Norte. Foram apresentadas novas evidências de que espécies sociais de aves neotropicais e com reprodução cooperativa são mais parasitadas por Haemoproteus. Ainda, espécies que nidificam em cavidades são mais parasitadas por Plasmodium. Através de métodos moleculares para diagnóstico (amplificação e sequenciamento do gene mitocondrial do parasito) e GLMM, a socialidade das espécies de aves estudadas foi a melhor variável para explicar os valores de prevalência de Haemoproteus (Parahaemoproteus) entre as espécies de hospedeiros da comunidade de aves, onde espécies 2 sociais foram significativamente mais parasitadas. Espécies migratórias foram mais parasitadas por Haemoproteus (Parahaemoproteus), embora a relação tenha sido margialmente significante. A prevalência geral (Plasmodium + Haemoproteus) não variou entre os cinco anos de estudo ou entre as estações seca e chuvosa. Entre os indivíduos nos quais foi possível determinar a idade, não houve diferença significativa na prevalência (Plasmodium + Haemoproteus) em aves com menos de um ano de idade e aves com mais de um ano de idade. Baseado na divergência de três ou mais substituições nucleotídicas em fragmentos de aproximadamente 600 pares de base do citocromo b dos parasitos, a taxocenose dos parasitos da malária aviária foi composta por 17 linhagens sendo oito pertencentes ao gênero Plasmodium, oito pertencentes a Haemoproteus (Parahaemoproteus) e apenas uma linhagem pertencente a Haemoproteus (Haemoproteus). O número de espécies de hospedeiros que uma linhagem infectou variou de um a sete, e como esperado, o número de linhagens se aproximou do número de espécies de hospedeiros, confirmando a elevada diversidade desses hemoparasitos. Os dados sugerem que a maioria das espécies de hospedeiros pode ser infectada por uma grande variedade de hemoparasitos, uma vez que, o número de linhagens que uma espécie de hospedeiro abriga variou de uma a sete e o número de linhagens de hemoparasitos aumentou com o número de indivíduos infectados em cada espécie de hospedeiro. Sugerimos que parâmetros comportamentais e reprodutivos das espécies de aves podem ser responsáveis por sua exposição diferencial aos vetores, explicando dessa forma, a variação na prevalência de hemoparasitos entre as espécies de hospedeiros dentro da comunidade de aves. A taxocenose de hemoparasitos estudada na comunidade de aves no Cerrado do Brasil Central confirma os padrões que estão surgindo em estudos envolvendo os parasitos da malária aviária utilizando marcadores moleculares: 1) elevada diversidade de 3 linhagens; 2) número de linhagens de hemoparasitos se aproximando do número local de espécies de hospedeiros e; 3) duas estratégias quanto ao uso das espécies de hospedeiros, desde extrema especialização à grande amplitude das espécies de hospedeiros utilizados. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Blood parasites play a fundamental role in the ecology and evolution of birds, because they are able to affect host fitness and survival. The prevalence of avian malaria parasites among different host species can vary from zero to 100%, nonetheless, the ecological and evolutionary reasons for this variation are still unclear. The goal of this thesis was to analyze if aspects of the host’s natural history (nest height, nest type, body mass, migratory status, incubation time and social system), which we believe are variables associated with hosts´ exposure to vectors, could explain the variation in blood parasite prevalence of a bird community from the Cerrado biome of central Brazil. Additionally, we studied the structure and organization of an assemblage of malaria parasites by sequencing part of the mitochondrial cytochrome b gene. By using Generalized Linear Mixed Models (GLMM) and traditional methods to detect blood parasite infections (microscopy) we found a significant positive correlation between nest height and Haemoproteus prevalence, which is in accordance with the hypothesis that associates blood parasite prevalence in North American birds with nesting stratum. Additionally, new evidence is presented that Neotropical bird species that live in groups and are cooperative breeders are more parasitized by Haemoproteus and that cavity/closed cup nesters are more parasitized by Plasmodium. Through molecular methods for diagnosis (by sequencing a part of the mitochondrial cytochrome b gene of parasite) and GLMM, the sociality of the bird species studied was the best variable to explain the high prevalence of Haemoproteus (Parahaemoproteus) between host species in this bird community. Migratory species were also more parasitized by Haemoproteus (Parahaemoproteus), although the relationship was only weakly significant. Malaria prevalence determined by PCR screening (pooled Plasmodium and Haemoproteus) 5 did not vary among the five years or between dry and rainy seasons. Among all individuals that could be aged, parasite prevalence did not differ between juveniles and adults. Based on divergence in 600 sequenced nucleotides of the parasite’s cytochrome b gene we differentiated 17 parasite lineages. The number of host species that a single lineage infected varied from one to seven, and as one would expect, the number of parasite lineages approached the number of host species, confirming the high diversity of these parasites. The data suggest that most host species can be infected by a wide variety of parasite lineages, since the number of lineages that infected single host species ranged from one to seven and this number increased with the number of individuals infected. We concluded that behavioural parameters of hosts may be responsible for their differential exposure to vectors. Therefore, these parameters may be able to describe interspecific variation of blood parasite prevalence in other bird communities. The assemblage of blood parasites studied in bird communities in the Cerrado of central Brazil confirms the patterns that are emerging in studies of avian malaria parasites using molecular markers: 1) high species diversity; 2) number of parasite lineages approaching the number of host species within a local area; and 3) two strategies regarding use of host species by parasites, extreme specialization and broad range of host species used.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2014. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-04-29T12:50:20Z No. of bitstreams: 1 2014_ThuanydeMouraCordeiro.pdf: 3960809 bytes, checksum: 4b394c3182d7b2be77db6f48e1225c6d (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-05-23T12:40:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_ThuanydeMouraCordeiro.pdf: 3960809 bytes, checksum: 4b394c3182d7b2be77db6f48e1225c6d (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-23T12:40:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_ThuanydeMouraCordeiro.pdf: 3960809 bytes, checksum: 4b394c3182d7b2be77db6f48e1225c6d (MD5) / A malária é uma doença infecciosa causada por protozoários Plasmodium spp. O P. falciparum é considerado o mais severo por ser o responsável pela maioria dos casos de morte causados pela doença. Devido ao rápido surgimento de cepas de P. falciparum resistentes às drogas antimalariais dá-se a importância de realizar um screening de compostos da biodiversidade, além de elucidar os mecanismos de ação de substâncias com comprovada ação antiplasmodial, como por exemplo, a rottlerin, um inibidor da proteína quinase C. As proteínas quinases desempenham um papel essencial em muitas funções celulares, o que as tornam alvos muito atraentes para o desenvolvimento de novas drogas. A metodologia considerada padrão ouro para avaliar a atividade antimalárica de drogas é o ensaio com incorporação de hipoxantina tritiada. No entanto, o alto custo, a adoção de medidas de segurança e a produção de lixo radioativo limitam a utilização desta técnica. Desta forma, os objetivos deste trabalho foram à implementação do teste de atividade antiplasmodial baseado em fluorescência com SYBR Green I®, avaliação da atividade antimalárica das subfrações cromatográficas de sílica-gel do extrato de acetato de etila de Qualea grandiflora, uma planta típica do Cerrado brasileiro, e avaliação dos efeitos da rottlerin no ciclo intra-eritrocitário do P. falciparum por métodos bioquímicos e citofluorimétricos. Três subfrações de Q. grandiflora apresentaram atividade antiplasmodial moderada, sem atividade citotóxica e hemolítica aparentes. Foi demonstrado o efeito da rottlerin, um potencial efetor da autofagia, sobre o ciclo eritrocitário de P. falciparum por citometria de fluxo. De fato, a análise da população enriquecida de esquizonte de P. falciparum em cultura tratada por rottlerin comparada com a não tratada revelou que houve inibição da diferenciação dos merozoítos, acarretando na morte rápida do parasito. A fim de entender quais eram os alvos proteicos de ação desta molécula, foi realizada uma análise proteômica comparativa preliminar por eletroforese bidimensional. Três proteínas, Heat Shock Protein 90 (HSP90), 3-fosfoglicerato quinase (3-PGK) e lactato desidrogenase (LDH), superexpressas na população de esquizontes não tratada com a rottlerin foram identificadas. Estas proteínas pertencem à classe de proteínas quinases ou possuem um domínio de interação com quinase. A HSP90 está envolvida no processo de enovelamento proteico com um papel fundamental no crescimento e desenvolvimento do parasito e, consequentemente, estudada como potencial alvo de droga antiplasmodial. A LDH e a 3-PGK são enzimas do metabolismo da glicose, e assim, potenciais alvos bem conhecidos para compostos antimaláricos devido à dependência deste parasito à glicólise para produção de energia. O estudo da biodiversidade do Cerrado pode contribuir para a descoberta de compostos antimalariais e a conservação deste bioma ameaçado. A não detecção das proteínas identificadas na presença de rottlerin pode estar relacionada à indução da autofagia na esquizogonia eritrocitária e constituem potenciais alvos de drogas antimaláricas. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Malaria is an infectious disease caused by Plasmodium spp protozoa. The P. falciparum is considered the most severe, since it is responsible for the majority of deaths related to this disease. Due to the rapid emergence of resistant strains of P. falciparum against antimalarial drugs, a great importance can be given to the screening of biodiversity compounds in addition to elucidate the mechanisms of action of substances with demonstrated antiplasmodial action such as rottlerin, an inhibitor of protein kinase C. Protein kinases play a pivotal role in many cellular functions, which make them very attractive targets for the development of new drugs. The methodology considered the gold standard for assessing antimalarial drug activity is the [3H]hypoxanthine incorporation assay. However, the high cost, adoption of safety regulations and the production of radioactive waste limit the application of this technique. Therefore, the objectives of this study were to implement the antiplasmodial activity test based on SYBR® Green I fluorescence, assessment of antimalarial activity of silica gel chromatographic subfractions of Qualea grandiflora ethyl acetate extract, a typical plant of the Brazilian Cerrado, and assessment of the rottlerin‟s effects in erythrocytic cycle of P. falciparum by biochemical and cytofluorimetric methods. Three subfractions of Q.grandiflora showed moderate antiplasmodial activity without apparent cytotoxic and hemolytic activities. It was demonstrated the effect of rottlerin, a potencial autophagy effector, on P. falciparum erythrocytic cycle by flow cytometry. In fact, analysis of the schizont enriched population of P. falciparum in rottlerin-treated culture compared to untreated ones revealed that there was an inhibition of merozoites differentiation, resulting in the rapid death of the parasite. In order to elucidate which proteins were the targets of rottlerin action, a preliminary comparative proteomic analysis by two-dimensional electrophoresis was performed. Three proteins, heat shock protein 90 (HSP90), 3- phosphoglycerate kinase (PGK-3) and lactate dehydrogenase (LDH), upregulated in schizont population non treated with rottlerin were identified. These proteins belong to the class of protein kinases or possess domains that interact with them. The HSP90 is involved in the protein folding process with a critic role in parasite growth and development, thus being studied as a potential target for antiplasmodial drugs. The 3- PGK and LDH are enzymes of glucose metabolism, hence well known potential targets for antimalarial compounds due to parasite dependence on glycolysis to produce energy. The study of Cerrado biodiversity can contribute to the discovery of antimalarial compounds and to the conservation of this threatened biome. The not detection of these proteins identified in the presence of rottlerin may be related to autophagy induction in erythrocytic schizogony and constitute potential targets for antimalarial drugs.