O Brasil é o maior produtor e exportador de suco de laranja, sendo esta uma das mais importantes atividades econômicas para o país. Os frutos são afetados pela mancha preta dos citros, causada por Guignardia citricarpa, que deprecia comercialmente os frutos, provoca queda prematura e eleva o custo de produção. Medidas alternativas ao controle químico clássico vêm sendo estudadas e, neste contexto, insere-se a indução de resistência. O presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos in vitro da quitosana e radiação UV-C sobre o crescimento micelial, germinação e formação de apressórios por G. citricarpa e a ação destes agentes abióticos no controle da doença em laranjas pós-colheita, sob armazenamento ambiente e refrigerado, estudando-se também mecanismos de resistência ativados no tecido vegetal em resposta ao tratamento de melhor eficiência. Para tanto, foram utilizadas as concentrações de 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 3,0% de quitosana e as doses de 0,52; 1,04; 3,13; 10,44 e 15,66 kJ.m-2 da radiação UV-C. A quitosana inibiu o crescimento micelial do fungo e estimulou a germinação e formação de apressórios, os quais se mostraram morfologicamente alterados. A UV-C não inibiu o crescimento micelial, porém a maior dose ocasionou o menor crescimento. Para os experimentos in vivo, laranjas foram coletadas, lavadas, sanitizadas com hipoclorito e posteriormente tratadas. As concentrações de 0,5, 1,0 e 2,0% de quitosana e a dose de 7 kJ m-2 da UV-C apresentaram melhor resultado em laranjas ?Valência? na redução dos sintomas. Análise da cor da casca dos frutos irradiados revelou que houve leve escurecimento. Os fungicidas tiabendazol e imazalil não controlaram a doença em laranjas ?Pêra Rio?, porém, obteve-se menos lesões nos frutos tratados com os fungicidas em combinação com quitosana, tanto em temperatura ambiente quanto em refrigeração. Análises da cor da casca indicaram amarelecimento e não houve alterações significativas nos teores de sólidos solúveis, acidez titulável, pH, vitamina C e ratio. Nos ensaios com quitosana, tiabendazol e UV-C, a quitosana apresentou melhor controle da doença, aplicada isoladamente ou em conjunto com o fungicida e UV-C, em temperatura ambiente ou refrigeração. A quitosana e a proteína harpina apresentaram controle semelhante e, em comparação com o ácido cítrico, a quitosana ocasionou melhor controle em laranjas ?Valência?. Para análises bioquímicas, amostras de flavedo foram homogeneizadas em de tampão acetato, com posterior centrifugação, coletando-se o sobrenadante. Para as reações enzimáticas, foram utilizados os reagentes CM-chitin-RBV, CMCurdlan- RBB, guaiacol, catecol e L-fenilalanina para quitinase, glucanase, peroxidase, polifenoloxidase e fenilalanina amônia-liase, respectivamente. Para a determinação de fenóis, amostras do flavedo foram homogeneizadas em metanol acidificado e a dosagem feita com o reagente Folin-Ciocalteau. A quitosana induziu o aumento da atividade das enzimas nas primeiras 24 h após o tratamento, sendo neste tempo detectada a maior atividade. Não houve atividade de fenilalanina amônia-liase, bem como acúmulo de fenóis. Finalmente, fica evidenciado que quitosana e a UV-C apresentaram efeito in vitro sobre G. citricarpa, porém somente a quitosana exibiu potencial no controle da mancha preta em laranja pós colheita. / Brazil is the biggest producer and exporter of orange juice, and this is one of the most important economical activities for the country. The fruits can be affected by the citrus black spot, disease caused by the fungus Guignardia citricarpa, which depreciates then commercially, causes premature fall and increases the production cost. Alternative measures to the chemical control are being studied and, in this context, resistance induction can be considered. The present work had as objective evaluate the in vitro effects of chitosan and UV-C radiation on mycelial growth, germination and apressorium formation by G. citricarpa and the action of the abiotic agents on controlling the disease on postharvest oranges, under room temperature and refrigeration storage, also studying the mechanisms of resistance in the plant tissue in response to the better treatment. The chitosan concentrations were 0, 0.5, 1.0, 1.5; 2.0 and 3.0% and the UVC doses were 0.52, 1.04, 3.13, 10.44 and 15.66 kJ.m-2. Chitosan inhibited mycelial growth and stimulated the germination and the apressorium formation that were morphologically abnormal. UV-C did not inhibited mycelial growth, but reduced it at the highest dose used. For the in vivo experiments, oranges were collected, sanitized with hypochlorite and treated. Chitosan concentrations of 0.5, 1.0 and 2.0% and the UV-C dose of 7 kJ m-2 exhibited better results in ?Valência ? oranges. Analyses of peel color of irradiated fruits revealed a light browning. The fungicides thiabendazole and imazalil did not control the disease in ?Pêra Rio ? oranges, but fewer lesions appeared on fruits treated with the fungicides in association with chitosan, under room temperature and refrigeration. Color analysis of peel indicated yellowing and no significant differences among soluble solids, titratable acidity, pH vitamin C and ratio. In the chitosan, thiabendazole and UV-C assays, there was a better control of lesion appearing by treatment with chitosan, applied alone or in association with fungicide and UV-C, at room temperature or refrigeration. Chitosan and the harpin protein were similar on the controlling of the disease and, in comparison to the citric acid, chitosan presented better control on ?Valência? oranges. For biochemical analysis, flavedo samples were homogenized in acetate buffer, centrifuged, and the supernatant collected. The reagents used were CM-chitin-RBV, CM-Curdlan-RBB, guaiacol, cathecol and L-phenylalanine for chitinase, glucanase, peroxidase, polyphenoloxidase and phenylalanine ammonia-lyase, respectively. For phenol determination, flavedo was homogenized in acidified methanol and the evaluation was made with Folin-Ciocalteau. Chitosan increased enzyme activities in the first 24 h after treatment, with the highest activity in that time. Activity of phenylalanine ammonia-lyase was not detected, well as absent of phenolic compounds accumulation. Chitosan and UV-C exhibited in vitro effect on G. citricarpa, however, only chitosan showed potential on the control of black spot in postharvest oranges.

A mancha preta dos citros (MPC), incitada pelo fungo Guignardia citricarpa, causa lesões em frutos depreciando-os para a comercialização no mercado interno de fruta fresca, restringindo-os para a exportação e pode causar queda prematura. Para auxiliar nos estudos epidemiológicos, foi desenvolvida uma escala diagramática para a severidade da MPC que contempla os dois tipos de sintomas usualmente observados no campo, “mancha dura”, cujos valores variam entre 0,5 e 49,0%, e “falsa melanose”, cujos valores variam entre 1,1 e 68%. O grau de suscetibilidade das variedades cítricas ‘Hamlin’, ‘Pera’ e ‘Valência’ à MPC foi avaliado em pomar comercial, sob infecção natural. O modelo monomolecular ajustou-se às curvas de progresso da incidência e da severidade da doença para as três variedades. Não houve diferença estatística significativa entre as taxas de progresso da MPC, concluindo-se que as três variedades possuem o mesmo grau de suscetibilidade à doença. O agente causal da MPC em sua fase epidêmica forma ascósporos e conídios. Os ascósporos, formados em folhas em decomposição no solo, são disseminados a curtas e longas distâncias pela ação do vento. Os conídios, formados em ramos e frutos fixados à planta, são disseminados a curtas distâncias pela ação da água. O padrão de distribuição espacial de plantas com MPC foi avaliado pelo índice de dispersão e pela função K de Ripley. As plantas doentes mostraram-se agregadas independentemente da incidência da doença, indicando elevada importância da dispersão do inóculo a curtas distâncias. Avaliou-se, também, o padrão de distribuição de frutos sintomáticos dentro da planta, pelo índice de dispersão e pela forma binária da lei de Taylor. Pelo índice de dispersão 84% das plantas avaliadas mostraram agregação de frutos sintomáticos. Pela lei de Taylor concluiu-se que a agregação de frutos sintomáticos independe da incidência da doença na planta, sugerindo a participação dos conídios no incremento da doença em condições de campo. Estudou-se o efeito da supressão de ascósporos, pela retirada periódica de folhas cítricas em decomposição do campo e o de conídios, pela colheita antecipada de frutos de maturação tardia, na intensidade da MPC, por dois anos, em área com alta pressão de inóculo. Esses tratamentos reduziram a severidade da doença, no segundo ano de avaliação, entretanto não foram suficientes para controlá-la adequadamente. Estas medidas de sanitização são importantes no controle da MPC, devendo ser adotadas em conjunto com o controle químico. Danos causados pela redução na produtividade e perdas medidas pelo retorno financeiro foram avaliados em dois experimentos. Tratamentos cujo incremento na produção por hectare que, em comparação com a isenção de tratamento, excederam 100 caixas de 40,8 kg, foram rentáveis. A amostragem de áreas para diagnosticar a presença da MPC depende da finalidade da produção. Em áreas para exportação e mercado interno de fruta fresca deve-se avaliar todas as plant as do talhão, uma vez que esta doença é quarentenária e causa danos qualitativos. Em áreas para a indústria de suco cítrico concentrado, 285 plantas são suficientes para amostrar incidências superiores a 15% de MPC, em pomares médios de 2200 plantas. / The fungus Guignardia citricarpa is the causal agent of citrus black spot (CBS), which is a disease that become the fruits unsightly and unsuitable for the fresh fruit market. Besides, premature fruit drop may occur, reducing the productivity. A diagrammatic scale for the two symptoms of CBS (hard spot and false melanose) was developed to evaluate the severity and help in epidemiological studies of this disease. The susceptibility level of ‘Hamlin’, ‘Pera’ and ‘Valência’ sweet orange to CBS was evaluated in commercial orchard, under natural infection. The monomolecular model was fitted to the incidence and severity progress curves of the disease for the three sweet oranges. According to the progress curves, there was not significant difference among cultivars, showing that ‘Hamlin’, ‘Pera’ and ‘Valência’ sweet orange have similar susceptibility level to CBS. G. citricarpa in the epidemic phase produce ascospores and conidia. The ascospores, produced in leaves on soil, are disseminated by wind, while conidia, produced in plant twigs and fruits, are disseminated by water. The pattern of spatial distribution of CBS plants was evaluated by dispersion index and Ripley K function. The groups of symptomatic plants were distributed independently of disease incidence, suggesting that short distance dispersion of the inocullum could be the most important factor in distribution of the disease. The binary form of Taylor´s power law and dispersion index were used to evaluate the distribution of symptomatic fruits in the plant. According to dispersion index 84% o f the evaluated plants showed aggregation of symptomatic fruits, while by the Taylor´s power law the symptomatic fruits aggregation occurred independently of the incidence of plant disease, suggesting that the increase of disease in field conditions is related to conidia production. The effect of ascospore suppression on intensity of CBS was evaluated by removing citrus leaves from the orchard soil surface, while the conidia suppression was evaluated by early harvesting of late maturation fruits. These treatments, carried out during two years in a high inocullum incidence area, reduced the disease severity in the second year, but the satisfactory control was not observed. However, these treatments could be important in CBS control whether used in association with chemical control. Damages caused by yield reduction and losses of financial return were evaluated in two experiments. In relation to non-treated orchards, those treated orchards where the production/ha increased more than hundred boxes (40.8 kg each box) were considered profitable. The destination of the orange production (juice of fresh fruit market) are important for determine the size of samples to assess the CBS incidence. Since the G. citricarpa fungus is considered a quarentine organism that causes qualitative losses, in areas used for production of fresh fruit market whole orchard has to be evaluated. However, in areas used for production of fruits to concentrated orange juice, 285 plants sampled are enough to determinate the CBS incidence superior to 15%, in average orchards containing 2200 plants.

A mancha preta dos citros é uma doença que limita a exportação de laranja brasileira para os países da Europa. Exceto para Citrus aurantium e seus híbridos, todas as outras variedades são susceptíveis ao patógeno. Com isso existe um grande interesse para que esta doença não ocorra, uma vez que é considerada uma doença quarentenária A1. Problemas associados à aquisição de resistência e a percepção do público em geral sobre o impacto potencial das práticas tradicionais de controle sobre a saúde e meio ambiente levaram a uma crescente demanda por produtos livres de resíduos químicos. Em vista disso, este trabalho verificou o efeito dos extratos aquosos do albedo de C. sinensis, L. edodes, A. blazei e da suspensão de S. cerevisiae no controle da mancha preta dos citros quando associados a refrigeração. Os frutos de C. sinensis var. Valência, após serem tratados pelos extratos, permaneceram durante 21 dias a 3 ºC e posteriormente 4 dias a 25 ºC, foram realizadas cinco avaliações ao longo do experimento. Neste trabalho, também verificou-se a eficiência dos compostos orgânicos voláteis produzidos por S. cerevisiae no controle da mancha preta dos citros quando aplicados em pós-colheita. A linhagem CR-1 da levedura S. cerevisiae foi colocada para crescer em placas de poliestireno contendo meio de batata-dextroseágar e colocada em recipientes de vidro de 3 L fechados, junto com frutos de C. sinensis var. Valência apresentando sintomas de mancha preta dos citros. E por fim, verificou-se a eficiência de diferentes compostos orgânicos identificados a partir da S. cerevisiae, obtidos a partir de produtos disponíveis comercialmente, que foram utilizados para verificar o crescimento micelial a germinação e a formação de apressório por G. citricarpa, e o controle da mancha preta dos citros em pós-colheita. Como resultado, os extratos aquosos do albedo de C. sinensis, L. edodes e A. blazei apresentaram potencial como agentes de controle sobre a mancha preta dos citros em frutos de laranja (C. sinensis var. Valência) associados a refrigeração, pois apresentaram inibição no aparecimento de novas lesões. Os compostos voláteis produzidos por S. cerevisiae inibiram a expressão de sintomas em frutos de C. sinensis var. Valência, quando tratados em pós-colheita, sendo que os compostos orgânicos voláteis, 2-metil-1-butanol e 3-metil-1-butanol apresentaram inibição sobre Guignardia citricarpa in vitro e atuaram como agentes de controle, inibindo o aparecimento de novas lesões em frutos de laranja Valência, apresentando sintomas de mancha preta, quando aplicados em pós-colheita. / The citrus black spot is a disease that restricts the export of Brazilian oranges to the countries in Europe. Except for Citrus aurantium and its hybrids, all other varieties are susceptible to the pathogen. Thus, there is great interest that this disease does not occur, since it is considered a quarantine A1 disease. Problems associated with the acquisition of fungal resistance and the perception of the general public about the potential impact of traditional control measures over the health and the environment led to a growing demand for products free of chemical residues. Thus, this study was carried out to investigate the effect of aqueous extracts of the albedo of C. sinensis, L. edodes, A. blazei and the suspension of S. cerevisiae cells in the control of citrus black spot when associated with cooling. The fruits of C. sinensis var. Valencia, after being treated with the extracts, were stored for 21 days at 3 º C and then 4 days at 25 ° C (there were five evaluations during the experiment). This work also verified the efficiency of volatile organic compounds produced by S. cerevisiae in the control of citrus black spot when applied in post-harvest. The CR-1 strain of yeast S. cerevisiae was put to grow inside polystyrene plates containing potato-dextrose-agar medium. The plates were placed in closed glass containers of 3 L, along with fruits of C. sinensis var. Valencia showing symptoms of citrus black spot. Finally, it was verified the effect of different organic compounds, identified from the S. cerevisiae and obtained from commercially available products, on in vitro mycelial growth, germination and appressorium formation by G. citricarpa and on the in vivo control of citrus black spot under post-harvest conditions. The results showed that the aqueous extracts of the albedo of C. sinensis, L. edodes and A. blazei exhibit potential to control the black spot in orange (C. sinensis var. Valencia) associated with cooling, since they inhibited the appearance of new lesions. The volatile compounds produced by S. cerevisiae inhibited the expression of symptoms in fruits of C. sinensis var. Valencia, when treated in postharvest. On the other hand, the microbial volatile organic compounds, 2-methyl-1- butanol and 3-methyl-1-butanol inhibited the growth of Guignardia citricarpa in vitro and acted as control agents by inhibiting the appearance of new lesions of black spot in fruits of Valencia orange when applied in post-harvest.

Os cogumelos comestíveis contêm substâncias funcionais de interesse, tais como proteínas e glucanas, as quais apresentam potencial antimicrobiano contra bactérias, fungos e até mesmo propriedades antivirais. O objetivo deste trabalho foi identificar extratos do cultivo in vitro do micélio de Lentinula edodes com propriedades contra fitopatógenos. Duas linhagens de L. edodes foram cultivadas em pequena escala em três diferentes meios de cultivo e após 0, 20, 40 e 60 dias, o micélio e o filtrado foram extraídos com solventes de diferentes polaridades. Os extratos foram testados contra Xanthomonas axonopodis pv passiflorae e Guignardia citricarpa, para verificar as melhores condições de cultivo para a produção de compostos bioativos. Com isso, foram selecionados os meios GPL (glicose, peptona e extrato de levedura) e SML (sacarose, extrato de malte e extrato de levedura) para o cultivo em grande escala de L. edodes. Após 60 dias, o micélio foi extraído com etanol, etanol 70% e água. O filtrado foi extraído com acetato de etila através de partição líquido-líquido. Os extratos foram testados contra G. citricarpa, Colletotrichum sublineolum e o Vírus do mosaico do fumo (TMV). Os extratos etanol e etanol 70% do meio SML foram ativos in vitro contra os fungos, constatando-se através de RMNH1, a presença, nestes extratos, de possíveis açúcares ausentes no meio de cultivo. As suspensões de TMV foram inoculadas mecanicamente em Nicotiana tabacum var. TNN (hospedeira de lesão local) cultivadas em casa de vegetação, através do método da meia-folha. Somente o extrato aquoso do micélio da linhagem LE 96/17 inibiu a expressão de sintomas de lesão local pelo TMV e a taxa de inibição foi de 82% na concentração de 0,5 mg/mL. Este extrato ativo foi purificado por coluna de Sephadex, rendendo 16 frações, sendo que as frações ativas 6/7 e 8/9 reduziram a infectividade do TMV em 95,5 % e 79%, respectivamente. Os espectros de RMNH1 sugeriram que estas frações são constituídas possivelmente por peptídeos e composto aromático. Os resultados de espectrometria de massas revelaram a provável presença de compostos já descritos na literatura e que apresentam conhecida atividade antimicrobiana. Experimentos comprovaram que o extrato bruto ativo não apresentou efeito viricida e, este mesmo extrato e a subfração resultante, não induziram resistência nas plantas de fumo. / Edible mushrooms contain functional compounds, such as proteins and glucans, which exhibit antimicrobial potential against bacteria, fungi and antiviral activity. The aim of this work was to identify extracts from submerged mycelium of Lentinula edodes with antimicrobial properties against phytopathogens. Two strains of L. edodes were grown in small scale in three different culture media and after 0, 20, 40 and 60 days, the mycelium and the filtrate were extracted with solvents of different polarities. Extracts were bioassayed against Xanthomonas axonopodis pv passiflorae and Guignardia citricarpa to verify the best condition for growth to produce bioactive compounds. After this, L. edodes was grown in large scale in the selected media, GPL (glucose, peptone and yeast extract) and SML (sucrose, malt extract and yeast extract). After 60 days, the mycelium was extracted with ethanol, ethanol 70% and water. The filtrate was extracted through liquid-liquid partition with ethyl acetate. The extracts were bioassayed against G. citricarpa, Colletotrichum sublineolum and Tobacco Mosaic Virus (TMV). The ethanol and ethanol 70% extracts from medium SML were active in vitro against the fungi and it was verified through H1NMR, the possible presence of sugars in these extracts, which were absent in the culture medium. The TMV suspensions were mechanically inoculated in Nicotiana tabacum TNN (local lesion host) grown in greenhouse, through the half-leaf method. Only the mycelium aqueous extract of strain LE 96/17 inhibited the expression of symptoms of local lesions by TMV and the inhibition ratio was around 82% at 0.5 mg/mL. This active extract was purified by Sephadex column, yielding 16 fractions. Active fractions 6/7 and 8/9 reduced infectivity by 95.5 and 79%, respectively. The H1NMR spectra suggested that fractions 6/7 and 8/9 possibly have peptides and aromatic compound. The results of mass spectrometry revealed the possible presence of compounds already described in the literature and exhibiting antimicrobial activity. The experiments showed that the active crude extract did not exhibit viricidal effect and that such extract and its resulting subfraction inhibited the infectivity of TMV and did not induce resistance in tobacco plants.

A produção brasileira de laranjas destina-se à indústria de suco concentrado, principal produto citrícola, sendo o estado de São Paulo o maior produtor e exportador do país. Devido à diminuição da variabilidade genética causada pela multiplicação de plantas cítricas por enxertia, esta cultura se tornou alvo constante de inúmeras pragas e doenças. Dentre estas doenças que vem causando crescentes prejuízos para a citricultura brasileira destaca-se a pinta preta causada pelo fungo Guignardia citricarpa Kiely. O combate desta doença é feito por inúmeras pulverizações de fungicidas que aumenta significativamente o custo para os produtores. Uma possível alternativa para o combate a este patógeno seria a produção de plantas cítricas resistentes a doença, através de transformação gênica. Mas para isto, é necessário conhecer os mecanismos de respostas de defesa da planta e identificar quais genes podem estar relacionados com a defesa. Na tentativa de elucidar as respostas de defesa deste hospedeiro foram feitas análises anatômicas de frutos de laranja doce (Citrus sinensis Osbeck cv. Pêra) inoculados com o patógeno e análise transcricional de duas bibliotecas de cDNA, uma de albedo de frutos sadios(BAFS) e outra de albedo de frutos inoculados com o patógeno (BAFC). As análises anatômicas mostraram que os danos causados pelo patógeno na planta iniciam-se 24 horas após a inoculação com as lesões das células do epicarpo, e continuam gradativamente até 72 horas apresentando a diminuição na quantidade de amido e acúmulo de compostos fenólicos. Foi obtido 184 ESTs válidas da BAFS e 370 da BAF. A anotação e categorização destas sequencias apresentaram que o perfil transcricional encontrado nas duas bibliotecas foi semelhante, porém, na BAFC, foram encontrados transcritos pertencentes à defesa da planta como a catalase, a glutationa e monooxygenases. Está analise mostrou que a resposta de defesa da planta inicia-se com lesões nas células, que a interação é custo-intensiva (redução da reserva de amido) para o hospedeiro, e que a defesa da planta está relacionada a muitos genes de defesa. / The Brazilian production of oranges is mainly for the industry of concentrated juice, it is the most important citrus product, and the state of São Paulo is the largest producer and exporter of the country. Due to the low genetic variability caused by the multiplication of citrus plants by grafting, this culture became constant target of many pests and diseases. Among all the diseases that lead to elevated damage to the Brazilian citrus plantation, one is very relevant, the Black Spot disease caused by the fungus Guignardia citricarpa Kiely. The control of this disease is done by many sprays of fungicides that significantly increase the production cost to the producers. A possible alternative to control this pathogen is the development of resistant citrus plants to disease through genetic transformation. To that, it is necessary to understand the mechanisms of plant defense response and identify the genes related to the defense. In an attempt to elucidate the responses of this host both,anatomical analysis of sweet orange fruits (Citrus sinensis Osbeck cv. Pêra) inoculated with the pathogen and transcriptional analysis of two cDNA libraries of albedo section were done. One was from health fruits (BAFS) and another from albedo of fruits inoculated with the pathogen (BAFC). The analysis showed that the anatomical damage caused by the pathogen in the plant shall begin 24 hours after inoculation showing lesions on epicarp cells, and continue gradually until 72 hours also showing a decrease in the amount of starch and accumulation of phenolic compounds. It was obtained 184 valid ESTs of the BAFS and 370 from BAFC. The annotation and categorization of these sequences showed that the transcriptional profile in the two libraries were similar, however, in BAFC, were found transcripts belonging to plant defense such as catalase, the glutathione and monooxygenases. These analyses showed that the plant defense response begins with lesions in the cells, being it cost-intensive interaction for the host, (with reduction of starch reserves) and the plant defense to resistance is related to many genes.

A produção brasileira de laranjas destina-se à indústria de suco concentrado, principal produto citrícola, sendo o estado de São Paulo o maior produtor e exportador do país. Devido à diminuição da variabilidade genética causada pela multiplicação de plantas cítricas por enxertia, esta cultura se tornou alvo constante de inúmeras pragas e doenças. Dentre estas doenças que vem causando crescentes prejuízos para a citricultura brasileira destaca-se a pinta preta causada pelo fungo Guignardia citricarpa Kiely. O combate desta doença é feito por inúmeras pulverizações de fungicidas que aumenta significativamente o custo para os produtores. Uma possível alternativa para o combate a este patógeno seria a produção de plantas cítricas resistentes a doença, através de transformação gênica. Mas para isto, é necessário conhecer os mecanismos de respostas de defesa da planta e identificar quais genes podem estar relacionados com a defesa. Na tentativa de elucidar as respostas de defesa deste hospedeiro foram feitas análises anatômicas de frutos de laranja doce (Citrus sinensis Osbeck cv. Pêra) inoculados com o patógeno e análise transcricional de duas bibliotecas de cDNA, uma de albedo de frutos sadios(BAFS) e outra de albedo de frutos inoculados com o patógeno (BAFC). As análises anatômicas mostraram que os danos causados pelo patógeno na planta iniciam-se 24 horas após a inoculação com as lesões das células do epicarpo, e continuam gradativamente até 72 horas apresentando a diminuição na quantidade de amido e acúmulo de compostos fenólicos. Foi obtido 184 ESTs válidas da BAFS e 370 da BAF. A anotação e categorização destas sequencias apresentaram que o perfil transcricional encontrado nas duas bibliotecas foi semelhante, porém, na BAFC, foram encontrados transcritos pertencentes à defesa da planta como a catalase, a glutationa e monooxygenases. Está analise mostrou que a resposta de defesa da planta inicia-se com lesões nas células, que a interação é custo-intensiva (redução da reserva de amido) para o hospedeiro, e que a defesa da planta está relacionada a muitos genes de defesa. / The Brazilian production of oranges is mainly for the industry of concentrated juice, it is the most important citrus product, and the state of São Paulo is the largest producer and exporter of the country. Due to the low genetic variability caused by the multiplication of citrus plants by grafting, this culture became constant target of many pests and diseases. Among all the diseases that lead to elevated damage to the Brazilian citrus plantation, one is very relevant, the Black Spot disease caused by the fungus Guignardia citricarpa Kiely. The control of this disease is done by many sprays of fungicides that significantly increase the production cost to the producers. A possible alternative to control this pathogen is the development of resistant citrus plants to disease through genetic transformation. To that, it is necessary to understand the mechanisms of plant defense response and identify the genes related to the defense. In an attempt to elucidate the responses of this host both,anatomical analysis of sweet orange fruits (Citrus sinensis Osbeck cv. Pêra) inoculated with the pathogen and transcriptional analysis of two cDNA libraries of albedo section were done. One was from health fruits (BAFS) and another from albedo of fruits inoculated with the pathogen (BAFC). The analysis showed that the anatomical damage caused by the pathogen in the plant shall begin 24 hours after inoculation showing lesions on epicarp cells, and continue gradually until 72 hours also showing a decrease in the amount of starch and accumulation of phenolic compounds. It was obtained 184 valid ESTs of the BAFS and 370 from BAFC. The annotation and categorization of these sequences showed that the transcriptional profile in the two libraries were similar, however, in BAFC, were found transcripts belonging to plant defense such as catalase, the glutathione and monooxygenases. These analyses showed that the plant defense response begins with lesions in the cells, being it cost-intensive interaction for the host, (with reduction of starch reserves) and the plant defense to resistance is related to many genes.

Os cogumelos comestíveis contêm substâncias funcionais de interesse, tais como proteínas e glucanas, as quais apresentam potencial antimicrobiano contra bactérias, fungos e até mesmo propriedades antivirais. O objetivo deste trabalho foi identificar extratos do cultivo in vitro do micélio de Lentinula edodes com propriedades contra fitopatógenos. Duas linhagens de L. edodes foram cultivadas em pequena escala em três diferentes meios de cultivo e após 0, 20, 40 e 60 dias, o micélio e o filtrado foram extraídos com solventes de diferentes polaridades. Os extratos foram testados contra Xanthomonas axonopodis pv passiflorae e Guignardia citricarpa, para verificar as melhores condições de cultivo para a produção de compostos bioativos. Com isso, foram selecionados os meios GPL (glicose, peptona e extrato de levedura) e SML (sacarose, extrato de malte e extrato de levedura) para o cultivo em grande escala de L. edodes. Após 60 dias, o micélio foi extraído com etanol, etanol 70% e água. O filtrado foi extraído com acetato de etila através de partição líquido-líquido. Os extratos foram testados contra G. citricarpa, Colletotrichum sublineolum e o Vírus do mosaico do fumo (TMV). Os extratos etanol e etanol 70% do meio SML foram ativos in vitro contra os fungos, constatando-se através de RMNH1, a presença, nestes extratos, de possíveis açúcares ausentes no meio de cultivo. As suspensões de TMV foram inoculadas mecanicamente em Nicotiana tabacum var. TNN (hospedeira de lesão local) cultivadas em casa de vegetação, através do método da meia-folha. Somente o extrato aquoso do micélio da linhagem LE 96/17 inibiu a expressão de sintomas de lesão local pelo TMV e a taxa de inibição foi de 82% na concentração de 0,5 mg/mL. Este extrato ativo foi purificado por coluna de Sephadex, rendendo 16 frações, sendo que as frações ativas 6/7 e 8/9 reduziram a infectividade do TMV em 95,5 % e 79%, respectivamente. Os espectros de RMNH1 sugeriram que estas frações são constituídas possivelmente por peptídeos e composto aromático. Os resultados de espectrometria de massas revelaram a provável presença de compostos já descritos na literatura e que apresentam conhecida atividade antimicrobiana. Experimentos comprovaram que o extrato bruto ativo não apresentou efeito viricida e, este mesmo extrato e a subfração resultante, não induziram resistência nas plantas de fumo. / Edible mushrooms contain functional compounds, such as proteins and glucans, which exhibit antimicrobial potential against bacteria, fungi and antiviral activity. The aim of this work was to identify extracts from submerged mycelium of Lentinula edodes with antimicrobial properties against phytopathogens. Two strains of L. edodes were grown in small scale in three different culture media and after 0, 20, 40 and 60 days, the mycelium and the filtrate were extracted with solvents of different polarities. Extracts were bioassayed against Xanthomonas axonopodis pv passiflorae and Guignardia citricarpa to verify the best condition for growth to produce bioactive compounds. After this, L. edodes was grown in large scale in the selected media, GPL (glucose, peptone and yeast extract) and SML (sucrose, malt extract and yeast extract). After 60 days, the mycelium was extracted with ethanol, ethanol 70% and water. The filtrate was extracted through liquid-liquid partition with ethyl acetate. The extracts were bioassayed against G. citricarpa, Colletotrichum sublineolum and Tobacco Mosaic Virus (TMV). The ethanol and ethanol 70% extracts from medium SML were active in vitro against the fungi and it was verified through H1NMR, the possible presence of sugars in these extracts, which were absent in the culture medium. The TMV suspensions were mechanically inoculated in Nicotiana tabacum TNN (local lesion host) grown in greenhouse, through the half-leaf method. Only the mycelium aqueous extract of strain LE 96/17 inhibited the expression of symptoms of local lesions by TMV and the inhibition ratio was around 82% at 0.5 mg/mL. This active extract was purified by Sephadex column, yielding 16 fractions. Active fractions 6/7 and 8/9 reduced infectivity by 95.5 and 79%, respectively. The H1NMR spectra suggested that fractions 6/7 and 8/9 possibly have peptides and aromatic compound. The results of mass spectrometry revealed the possible presence of compounds already described in the literature and exhibiting antimicrobial activity. The experiments showed that the active crude extract did not exhibit viricidal effect and that such extract and its resulting subfraction inhibited the infectivity of TMV and did not induce resistance in tobacco plants.

A mancha preta dos citros é uma doença que limita a exportação de laranja brasileira para os países da Europa. Exceto para Citrus aurantium e seus híbridos, todas as outras variedades são susceptíveis ao patógeno. Com isso existe um grande interesse para que esta doença não ocorra, uma vez que é considerada uma doença quarentenária A1. Problemas associados à aquisição de resistência e a percepção do público em geral sobre o impacto potencial das práticas tradicionais de controle sobre a saúde e meio ambiente levaram a uma crescente demanda por produtos livres de resíduos químicos. Em vista disso, este trabalho verificou o efeito dos extratos aquosos do albedo de C. sinensis, L. edodes, A. blazei e da suspensão de S. cerevisiae no controle da mancha preta dos citros quando associados a refrigeração. Os frutos de C. sinensis var. Valência, após serem tratados pelos extratos, permaneceram durante 21 dias a 3 ºC e posteriormente 4 dias a 25 ºC, foram realizadas cinco avaliações ao longo do experimento. Neste trabalho, também verificou-se a eficiência dos compostos orgânicos voláteis produzidos por S. cerevisiae no controle da mancha preta dos citros quando aplicados em pós-colheita. A linhagem CR-1 da levedura S. cerevisiae foi colocada para crescer em placas de poliestireno contendo meio de batata-dextroseágar e colocada em recipientes de vidro de 3 L fechados, junto com frutos de C. sinensis var. Valência apresentando sintomas de mancha preta dos citros. E por fim, verificou-se a eficiência de diferentes compostos orgânicos identificados a partir da S. cerevisiae, obtidos a partir de produtos disponíveis comercialmente, que foram utilizados para verificar o crescimento micelial a germinação e a formação de apressório por G. citricarpa, e o controle da mancha preta dos citros em pós-colheita. Como resultado, os extratos aquosos do albedo de C. sinensis, L. edodes e A. blazei apresentaram potencial como agentes de controle sobre a mancha preta dos citros em frutos de laranja (C. sinensis var. Valência) associados a refrigeração, pois apresentaram inibição no aparecimento de novas lesões. Os compostos voláteis produzidos por S. cerevisiae inibiram a expressão de sintomas em frutos de C. sinensis var. Valência, quando tratados em pós-colheita, sendo que os compostos orgânicos voláteis, 2-metil-1-butanol e 3-metil-1-butanol apresentaram inibição sobre Guignardia citricarpa in vitro e atuaram como agentes de controle, inibindo o aparecimento de novas lesões em frutos de laranja Valência, apresentando sintomas de mancha preta, quando aplicados em pós-colheita. / The citrus black spot is a disease that restricts the export of Brazilian oranges to the countries in Europe. Except for Citrus aurantium and its hybrids, all other varieties are susceptible to the pathogen. Thus, there is great interest that this disease does not occur, since it is considered a quarantine A1 disease. Problems associated with the acquisition of fungal resistance and the perception of the general public about the potential impact of traditional control measures over the health and the environment led to a growing demand for products free of chemical residues. Thus, this study was carried out to investigate the effect of aqueous extracts of the albedo of C. sinensis, L. edodes, A. blazei and the suspension of S. cerevisiae cells in the control of citrus black spot when associated with cooling. The fruits of C. sinensis var. Valencia, after being treated with the extracts, were stored for 21 days at 3 º C and then 4 days at 25 ° C (there were five evaluations during the experiment). This work also verified the efficiency of volatile organic compounds produced by S. cerevisiae in the control of citrus black spot when applied in post-harvest. The CR-1 strain of yeast S. cerevisiae was put to grow inside polystyrene plates containing potato-dextrose-agar medium. The plates were placed in closed glass containers of 3 L, along with fruits of C. sinensis var. Valencia showing symptoms of citrus black spot. Finally, it was verified the effect of different organic compounds, identified from the S. cerevisiae and obtained from commercially available products, on in vitro mycelial growth, germination and appressorium formation by G. citricarpa and on the in vivo control of citrus black spot under post-harvest conditions. The results showed that the aqueous extracts of the albedo of C. sinensis, L. edodes and A. blazei exhibit potential to control the black spot in orange (C. sinensis var. Valencia) associated with cooling, since they inhibited the appearance of new lesions. The volatile compounds produced by S. cerevisiae inhibited the expression of symptoms in fruits of C. sinensis var. Valencia, when treated in postharvest. On the other hand, the microbial volatile organic compounds, 2-methyl-1- butanol and 3-methyl-1-butanol inhibited the growth of Guignardia citricarpa in vitro and acted as control agents by inhibiting the appearance of new lesions of black spot in fruits of Valencia orange when applied in post-harvest.

Devido à percepção dos consumidores sobre o impacto da utilização de pesticidas sobre o ambiente e saúde humana, além da aquisição de resistência por parte dos fitopatógenos, a sociedade tem exercido pressões que levaram ao estabelecimento de políticas governamentais que restringem a utilização de fungicidas levando agricultores e pesquisadores a considerar a aplicação de técnicas de controle biológico de fitopatógenos fúngicos. Guignardia citricarpa é o agente causal da pinta preta dos citros, que é de grande importância econômica, pois interfere na produção e causa depreciação estética dos frutos, acarretando em prejuízos principalmente na comercialização de frutos in natura para o mercado externo. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi a avaliação in vitro do potencial de linhagens de Saccharomyces cerevisiae, utilizadas em processos fermentativos, como agentes de biocontrole contra G. citricarpa. Através de ensaio em placa, foi evidenciado que entre as linhagens de S. cerevisiae testadas (BG-1, CR-1, CAT-1, KD-1, K-1 e PE-2), a CR-1 demonstrou a maior atividade antagônica contra o fitopatógeno, causando 73% de inibição do crescimento micelial. Também foi demonstrado que as linhagens são capazes de produzir voláteis de ação fungistática inibindo em até 83% o desenvolvimento do patógeno. O filtrado de cultura autoclavado e não autoclavado, bem como as células inativadas termicamente, obtidas a partir do crescimento da linhagem CR-1 por 24 h em meio YEPD, não causaram redução do crescimento vegetativo do fungo. A produção de enzimas hidrolíticas extracelulares (quitinases, β-1,3-glucanases e proteases) pela levedura não foi detectada em meio YEPD contendo glicose ou preparação de parede celular de G. citricarpa, nos tempos de cultivo avaliados. Baseado nas informações obtidas, foi possível constatar que as linhagens de S. cerevisiae, em especial a linhagem CR-1, são potenciais antagonistas para o controle de G. citricarpa. O possível mecanismo utilizado para inibição pela levedura é a produção de voláteis, no entanto, outros mecanismos não podem ser descartados. Desta forma, o presente trabalho mostra o potencial de S. cerevisiae no controle de G. citricarpa em frutos de laranja na pós-colheita. / Due to the consumers perception about the impact caused by pesticides utilization over the environment and human health, besides the acquisition of resistance for part of the phytopathogens, the society has exercised pressures that had led to the establishment of governmental politics that restrict the use of fungicides leading agriculturists and researchers to consider the application of techniques of biological control of plant pathogenic fungi. Guignardia citricarpa is the causal agent of citrus black spot that has a great economic importance, therefore interfering in production and causing aesthetic depreciation of the fruits that can interfere with commercialization of fresh-fruit in the external market. In this context, the aim of this work was to evaluate in vitro the potential of Saccharomyces cerevisiae strains, used in fermentative process, as biocontrol agents against G. citricarpa. Through plate assay it was evidenced that among the tested strains of S. cerevisiae (BG-1, CR-1, CAT-1, KD-1, K-1 and PE-2), the strain CR-1 was the one that demonstrated the greatest antagonic activity against the phytopathogen, causing 73% of micelial growth inhibition. It was also demonstrated that the strains were able to produce volatile compounds with fungistatic action inhibiting up to 83% the development of the pathogen. The autoclaved and not autoclaved culture filtrate, as well as the termical inactivated cell obtained from the growth of strain CR-1 in YEPD medium for 24 h, did not cause reduction in the fungal vegetative growth. The production of extracellular hydrolytic enzymes (chitinases, β-1,3-glucanases and proteases) by the yeast was not detected in YEPD medium with glucose or cell wall preparation of G. citricarpa at the evaluated times. Based upon the obtained information it was possible to evidence that the strains of S. cerevisiae, specially the strain CR-1, are potentials antagonists for the control of G. citricarpa. The possible mechanism used for inhibition by yeast is the volatile production, however other mechanisms cannot be discarded. Thus, the present work shows the potential of S. cerevisiae to control G. citricarpa in orange fruits in postharvest.

O Brasil é líder absoluto no comércio internacional de suco de laranja concentrado congelado participando com 82% do volume comercializado no mundo. Guignardia citricarpa é um fungo Ascomiceto agente causal da Mancha Preta dos Citros (MPC), uma doença importante no contexto da Citricultura, causando lesões negras em frutos tornando-os impróprios para a exportação, já que não são aceitos na União Européia pois o patógeno é classificado como quarentenário. O presente trabalho teve como objetivo principal estabeler a metodologia de transformação genética de G. citricarpa para futuramente auxiliar no entendimento dos mecanismos de patogenicidade desta espécie, visando diminuir perdas na citricultura brasileira devido à MPC. Além disso, foi realizada uma análise do gene da enzima endopoligalacturonase, a qual está associada à capacidade de patógenos em colonizar plantas. Para elucidar esse fenômeno, foi realizada a busca de genes relacionados à patogenicidade em outros fungos fitopatogênicos previamente descritos e confirmados participarem no processo de doenças em diversas plantas. Considerando que esses genes possuem uma região conservada para esse fim, após o alinhamento dessas sequências foram construídos primers e o gene de endopoligalacturonase foi identificado no gênero Guignardia sp. Outra espécie pertencente a esse gênero é G. mangiferae, conhecida como endófito de citros, ou seja, coloniza os tecidos internos da planta hospedeira sem causar dano. Em análises enzimáticas foi observado que a quantidade de endopoligalacturonase produzida pela espécie patogênica é superior à da espécie endofítica, mostrando que essa enzima pode participar do processo de patogenicidade de G. citricarpa. Estudos para comprovar a participação de genes nos mecanismos de patogenicidade em diversas espécies utilizando reconhecimento de genes e genômica funcional, expressão e knockout de genes estão sendo realizados, permitindo uma visão geral da organização genômica do sistema patogênico. Pensando nisso, esse trabalho descreve pela primeira vez a metodologia de transformação genética de G. citricarpa via micélio e a obtenção de transformantes expressando a proteína verde fluorescente (GFP). Micélios do fungo foram transformados pelo sistema via Agrobacterium tumefaciens com o plasmídeo pFAT-gfp, contendo os genes de resistência à higromicina B (hgr) e da GFP. A otimização do protocolo de agrotransformação foi realizada a partir do teste de diferentes condições como: tipo de membrana, concentração de agente indutor e tempo de cocultivo. A melhor condição incluiu a utilização de membrana de éster de celulose; 200 PM de AS e 96 horas de co-cultivo. Os transformantes apresentaram alta estabilidade mitótica (82%) e tiveram a inserção do gene hgr confirmada por PCR e do gfp observada em microscopia óptica de epifluorescência. Além disso, foi acompanhado o desenvolvimento do fungo inoculado em frutos, mostrando a interação planta-patógeno. O estabelecimento do sistema de transformação por Agrobacterium para G. citricarpa possibilita o uso dessa ferramenta para estudos de mutagênese insercional e interrupção gênica visando a identificação de genes importantes, como os envolvidos com os mecanismos de patogenicidade utilizados por esse fungo. / Brazil is the world leader in the international trade of frozen orange juice concentrate, taking part with around 82% of the traded volume. Guignardia citricarpa (anamorph Phyllosticta citricarpa) is a fungal pathogen of citrus plants, being described as the causal agent of citrus black spot (CBS), one of the most important fungal diseases of citrus worldwide. Its symptoms are black lesions on fruit, making them unsuitable for the international fresh market, since they are included in the quarantine list of the European Plant Protection Organization (EPPO). Moreover, when the disease is severe it may cause extensive premature fruit drop that reduces yields of fruit for processing. Taking this into consideration, the current work aimed to improve the understanding on the pathogenic mechanisms of this fungus. Firstly, in an attempt to elucidate this phenomenon, it was performed a search for pathogenicity genes previously reported to some pathogenic fungi and confirmed to participate in the process of infection in many plants , especially endopolygalacturonase. Primers were designed using the conserved regions of the genes and allowed the identification of the Guignardia spp. endopolygalacturonase gene for the first time. This enzyme has been described as playing important role in the process of fungal diseases in plants. In the present work, enzymatic analysis showed that the pathogen G. citricarpa produced significantly greater amounts of endopolygalacturonase when compared to G. mangiferae, a closely related fungus described as a citrus endophyte. This result suggests that this enzyme may participate in the process of pathogenicity, characteristic of the pathogenic species. Genetic transformation methods have been used to prove the involvement of genes in pathogenic mechanisms, however, a suitable methodology for G. citricarpa has not been described yet. In this way, this study describes for the first time a methodology for genetic transformation of G. citricarpa via mycelia and the successful generation of transformants expressing the green fluorescent protein (GFP) and resistant to the hygromycin B antibiotic. Mycelia of the fungus were genetically transformed via Agrobacterium tumefaciens hosting the plasmid pFAT-gfp, which carries the genes for resistance to hygromycin B (hph) and for GFP (gfp). The protocol was optimized through different test conditions (type of membrane, concentration of the inducing agent acetosyringone and duration of the co-cultivation period). The higher transformation efficiencies were observed using cellulose ester membrane, 200 PM of acetosyringone and 96 hours of cocultivation. The transformants showed high mitotic stability (82%) and the insertion of the T-DNA was confirmed by PCR and GFP expression through epifluorescence microscopy observation. Moreover, it was observed the development of the fungus in inoculated oranges, showing the plant-pathogen interaction observed by epifluorescense microscopy. The establishment of the Agrobacterium-mediated transformation system for G. citricarpa represents an important step on the search for unveiling important genes of this fungus, such as those involved in the pathogenic mechanisms.