Orientador: Renée Laufer Amorim / Banca: Noeme Sousa Rocha / Banca: Antonio Carlos Alessi / Resumo: Os mastócitos são células provenientes do precursor CD34 da medula óssea, o mastocitoma (MCT) pertence ao grupo das neoplasias de células redondas e possui etiologia desconhecida, é a neoplasia cutânea mais comum em cães, sem predileção por raça, sexo ou idade. Seu comportamento biológico é bastante agressivo e de alta frequência. A graduação histopatológia proposta Patnaik et al., (1984), é o critério mais utilizado para a graduação histopatológica da neoplasia sendo o grau 1 uma neoplasia bem diferenciada, o grau 2 moderadamente diferenciada e o grau 3 pouco diferenciada ou anaplásica. O presente trabalho teve como objetivos a avaliação do ínidice proliferativo e apoptotico dos MCT em lâmina de Microarranjo de tecido (TMA) utilizando a técnica de imunoistoquiímica e TUNEL. Para tal utilizou-se 166 casos de MCT compondo um arranjo em matriz de amostra tecidual, ou tissue microarray (TMA) com 190 amostras, sendo avaliado o padrão de marcação da proteína Kit, a proliferação celular com o anticorpo primário Ki67 e apoptose com o anticorpo primário caspase-3 clivada e pela técnica da Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Mediated dUTP Nick end Labeling Assey (TUNEL). Quando os casos foram avaliados quanto à imunoexpressão de c-KIT, os tumores (únicos e múltiplos) com expressão citoplasmática da proteína KIT tiveram uma taxa proliferativa maior e uma menor taxa apoptótica quando comparados aos com expressão membranosa. Os MCTs grau 3 tiveram um maior índice proliferativo (imunoexpressão de Ki67) quando comparados aos tumores de graus 1 e 2. Não foi observada correlação entre a imunomarcação do anticorpo primário caspase-3 clivada e a técnica de TUNEL, sendo que a técnica de TUNEL se mostrou mais eficaz na avaliação da apoptose que a imunomarcação para caspase-3 clivada / Abstract: Mast cells are from precursor CD34 cells bone marrow, the mast cell tumor (MCT) belongs to the group of round cell malignancies and has unknown etiology, is the most common skin cancer in dogs without distinction of race, sex or age. Its biological behavior is very aggressive and high frequency. The histopathological grading proposal from Patnaik et al., (1984), is the most commonly used criterion for the histopathological grade of the tumor is a tumor grade 1 are well-differentiated, grade 2 are moderately differentiated and grade 3 are poorly differentiated or anaplastic. This study aimed to evaluate the proliferative and apoptotic index of MCT in blade tissue microarray (TMA) using the TUNEL technique and immunohistochemistry. To this end we used 166 cases of MCT composing an tissue microarray (TMA) with 190 samples, and evaluated the pattern of protein labeling kit, cell proliferation, with the primary antibody Ki67 and apoptosis with primary antibody and cleaved caspase-3 by the technique of terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling Mediated Assey (TUNEL). When the cases were evaluated for immunoexpression of c-KIT, tumors (single and multiple) with cytoplasmic KIT protein expression had a higher proliferative rate and a lower apoptotic rate when compared to those with membranous expression. Grade 3 MCTs had a greater proliferative index (Ki67 immunostaining) when compared with tumor grades 1 and 2. No correlation was observed between the immunostaining of primary antibody caspase-3 cleavage and TUNEL technique, and TUNEL technique was more effective in assessing apoptosis that immunostaining for cleaved caspase-3 / Mestre

A galectina-1 (Gal-1) pertence à uma família de proteínas ligantes de ?-galactosídeos e participa de vários processos biológicos, tais como a modulação da resposta inflamatória. Os mastócitos desempenham um importante papel em eventos inflamatórios e alérgicos. Entretanto, o impacto da Gal-1 na biologia dos mastócitos é pouco conhecido. Neste trabalho, foram analisados os aspectos morfológicos e funcionais de células RBL-2H3 tratadas com Gal-1. Além disso, foi investigado o efeito da ausência de Gal-1 endógena sobre a desgranulação in vivo. A avaliação da interação de Gal-1Texas-Red com células RBL-2H3, por citometria de fluxo, indicou que esta lectina ligou-se às superfícies dessas células de modo dose-dependente. A Gal-1 foi capaz de promover a exposição de fosfatidilserina (FS, um marcador de apoptose) nas superfícies dessas células por meio de reconhecimento de carboidratos. Entretanto, as células RBL-2H3 tratadas com Gal-1 não apresentaram apoptose e/ou necrose, como indicado pelos resultados obtidos dos ensaios de TUNEL, DNA laddering, hipodiploidia, citotoxicidade e microscopia eletrônica de transmissão. As análises de microscopia eletrônica de varredura e Differential Interference Contrast (DIC) de células tratadas com Gal-1 (10 µM-1 hora) indicaram que essa lectina induziu ondulações apenas nas porções apicais das membranas plasmáticas de células RBL-2H3. Além disso, a Gal-1 modulou negativamente a formação de ondulações nas superfícies de células RBL-2H3 estimuladas via Fc?RI. A distribuição de componentes de Lipid Rafts relacionados ao processo de ativação celular via Fc?RI (Lyn, LAT e GD1b) foi modificada pelo tratamento dessas células com Gal-1 (10 µM), por 1 hora. As células RBL-2H3 tratadas com Gal-1(10µM-45 minutos) apresentaram níveis de liberação da enzima ?-hexosaminidase (?-HEX) semelhantes ao do controle negativo, sugerindo que essa lectina não promove a desgranulação de células RBL-2H3. Por outro lado, a Gal-1 inibiu a desgranulação de células RBL-2H3 ativadas via Fc?RI. O valor máximo de inibição (80%) da liberação de ?-HEX foi atingido quando as células foram tratadas com 10 µM de Gal-1 por 24 horas. Este efeito inibitório não foi detectado quando as células foram tratadas com Gal-1 na presença de ?-D-Tiogalactopiranosídeo (TDG), quando estimuladas com ionóforo de cálcio ou tratadas com a forma monomérica da Gal-1. Os dados de microscopia confocal mostraram que os grânulos secretórios de células submetidas ao procedimento de estimulação via Fc?RI, foram fracamente marcados com o anticorpo AD1 e apresentaram uma distribuição citoplasmática difusa. Entretanto, células tratadas com Gal-1 (10 µM - 24 horas) e estimuladas via Fc?RI foram intensamente marcadas com anticorpo AD1 e mostraram um padrão perinuclear, como detectado em células não estimuladas. De modo interessante, camundongos deficientes para o gene de Gal-1 quando submetidos ao ensaio de anafilaxia passiva cutânea (PCA) apresentaram uma reação significativamente maior que os animais selvagens. Com base no conjunto de resultados obtidos sugere-se que a Gal-1 pode participar da homeostase de mastóctios sem provocar apoptose e/ou necrose dessas células. Além disso, a Gal-1 pode modular o processo de exocitose de mastócitos por meio das propriedades lectínica e de dimerização dessa proteína e esse efeito modulatório parece estar associado a eventos de sinalização celular anteriores ao influxo de cálcio. / Galectin-1 (Gal-1) belongs to a family of ?-galactoside-binding proteins and is involved in several biological processes, including modulation of the inflammatory response. Mast cells play a critical role in allergic and inflammatory events, however, little is known about the impact of Gal-1 on mast cell biology. In this study, we examined the role of Gal-1 in mast cell function using RBL-2H3 (Rat Basophilic Leukemia) and galectin-1 deficient mice. We report that Gal-1 recognized glycoconjugates on mast cells and this interaction promotes phosphatidylserine (PS) exposure in the absence of cell death or apoptosis. Morphological analysis of Gal-1-treated RBL-2H3 cells, by scanning electron microscopy and Differential Interference Contrast (DIC), indicated that Gal-1 induces modifications on cell membranes and modulation of ruffles formation on cell surface of stimulated RBL-2H3 cells. Interesting, Gal-1 treatment of RBL-2H3 cells, with or without stimulation, promotes alterations in the distribution of the components (Lyn, LAT and GD1b) of Lipid Rafts. Gal-1 did not promote degranulation on RBL-2H3 with or without prior sensitization with IgE. However, Gal-1 treatment inhibits the cell degranulation mediated by via Fc?RI and this effect was time and dose-dependent. Also, this inhibition was related to carbohydrate recognition domain and required Gal-1 dimerization. Importantly, confocal microscopy analysis showed that Gal-1 was distributed in cytoplasm close to secretory granules stained AD-1 antibody on RBL-2H3 with or without prior stimulation with Fc?RI. In addition, we found significantly increased passive cutaneous anaphylaxis reaction in Gal-1 deficient mice. The results demonstrated that Gal-1 may participate of homeostasis and exocytose in mast cells suggesting that Gal-1 can have important role in allergic and inflammatory process.

A quimioterapia metronômica é uma modalidade terapêutica onde o agente quimioterápico é administrado em baixas doses, em curtos intervalos e continuamente, diferente da quimioterapia em dose máxima tolerada. Dirigida contra células tumorais e outros tipos de células, como as endoteliais e do sistema imunológico, a metronômica altera o microambiente tumoral e suprime características inatas que apoiam o crescimento dos tumores. O objetivo deste trabalho foi analisar prospectivamente o uso da quimioterapia metronômica com lomustina em pacientes com mastocitoma cutâneo, seus efeitos adversos e comparar com o protocolo de vimblastina e prednisona. Para tanto foram incluídos neste estudo 40 neoplasias obtidas de 32 cães de ambos os sexos e idades variadas, com o diagnóstico citológico e histopatológico de mastocitoma cutâneo, os mesmos foram divididos em dois grupos de forma randomizada. O grupo VP foi tratado com vimblastina na dose de 2mg/m² e prednisona por 12 sessões e o grupo LP foi tratado a metronômica com lomustina na dose de 2,84mg/m²/VO por 4 meses. Quanto à classificação histopatológica dos tumores estudados 67,5% (27/40) das formações mostrou graduação intermediária, correspondendo a grau II/baixo grau. Os efeitos adversos foram avaliados de acordo com os critérios do VCOG. Dos pacientes pertencentes ao grupo VP 62,5% (5/16) apresentaram algum tipo de efeito adverso, sendo os mais frequente os efeitos sob o trato gastrointestinal como: disorexia, anorexia, êmese e diarreia ocorrendo em cinco pacientes (5/16), seguido de leucopenia em três animais (3/16). No grupo LP 50% (8/16) dos pacientes tiveram algum tipo de efeito adverso, o mais comum foi êmese, sendo que apenas um cão apresentou efeito adverso classificado em grau III. Os dois protocolos foram bem tolerados pelos pacientes e não houve significância estatística sobre os efeitos adversos de ambos os grupos (p=0,715). A trombocitose foi a síndrome paraneoplásica mais observada, acometendo 25% de todos os animais (8/32), apresentando significância estatística em relação ao temo de sobrevida global (p=0,000049). A média de sobrevida do grupo VP foi de 404,25 dias (104-815dias) enquanto que do grupo LP foi de 320,25 dias (83-669). Não houve diferença estatística entre os grupos de acordo com o tempo de sobrevida (p=0,662) e o tempo livre de recorrência (p=1). A quimioterapia metronômica com lomustina teve boa aceitação junto aos proprietários dos animais, já que é administrada por via oral e os efeitos adversos foram toleráveis e pouco frequentes. / Metronomic chemotherapy is a therapeutic modality where the chemotherapeutic agent is administered in low doses, continuously for short and regular periods, as opposed to the chemotherapy in maximum tolerated dose. Directed against tumor cells and other cell types, such as endothelial cells and immune system cells, the metronomic chemotherapy alters the tumor microenvironment and suppresses innate features that support the growth of tumors. The aim of this study is to prospectively analyze the use of metronomic chemotherapy with lomustine in patients with mast cell tumors, evaluate the therapeutic action and adverse effects and compare with the chemotherapy protocol with vinblastine and prednisone. For this, 40 neoplasms obtained from 32 dogs of both sexes and varied ages, with cytological and histopathological diagnosis of mast cell tumor, were divided into two groups in a randomized fashion. The VP group was treated with vinblastine at a dose of 2mg/m² and prednisone for 12 sessions and the LP group was treated with metronomic chemotherapy with lomustine at a dose of 2.84mg/m²/ VO for 4 months. Regarding the histopathological classification of the studied tumors, 67.5% (27/40) of the formations showed an intermediate degree, corresponding to grade II / low grade. Adverse effects were assessed according to the VCOG criteria. Of the patients belonging to the VP group 62.5% (5/16) presented some type of adverse effect, being the most frequent the effects under the gastrointestinal tract as: dysorexia, anorexia, emesis and diarrhea occurring in five patients (5/16), Followed by leukopenia in three animals (3/16). In the LP group 50% (8/16) of the patients had some type of adverse effect, the most common was emesis, and only one dog presented grade III adverse effect. The two chemotherapeutic protocols were well tolerated by the patients and there was no statistical significance regarding the adverse effects of both groups (p = 0.715). Thrombocytosis was the most observed paraneoplastic syndrome, affecting 25% of all animals (8/32), presenting statistical significance in relation to the overall survival rate (p = 0.000049). The mean survival time of the PV group was 404.25 days (104-815 days) while the LP group was 320.25 days (83-669). There was no statistical difference between the groups according to the survival time (p = 0.662) and the free time of recurrence (p = 1). Metronomic chemotherapy with lomustine was well accepted by animal owners, since it is administered orally and the adverse effects were tolerable and infrequent.

Os mastocitomas caninos são neoplasias originárias de mastócitos, sendo bastante prevalente entre os cães, por isso a importância de averiguar novas terapias para esta doença. O objetivo geral deste projeto foi investigar o efeito do DCA em mastocitomas caninos, por meio da realização de ensaios in vitro. Também foram investigados os efeitos do tratamento com DCA associado ao omeprazol ou merformina em linhagens de mastocitoma canino. As linhagens de mastocitoma canino utilizadas, grau 2 e 3, foram estabelecidas no Laboratório de Oncologia Experimental e Comparadas da FMVZ/USP e foram cultivadas em meio AIM-V. As células foram tratadas com diversas concentrações de DCA (de 0,31 a 100mM). O DCA 0,1; 0,5; 1,0; 5; 10 e 20mM foi também testado em associação com metformina (0,02; 0,2 e 2mM) ou com omeprazol (0,02; 0,1 e 0,2mM). Após os tratamentos, foi realizado ensaio para analisar a viabilidade celular utilizando o método do cristal violeta, com leituras em 3 e 5 dias. Ao contrário do que era esperado, o tratamento com dicloroacetato isolado ou com associações aumentou a população de células neoplásicas principalmente nas concentrações de 10 e 20mM. Num experimento realizado com três linhagens diferentes de mastocitomas caninos foram utilizadas concentrações de 10 a 100mM de DCA, e mostrou que a partir de 60mM há diminuição da viabilidade celular, sendo que o efeito se intensifica com o aumento das concentrações de DCA. Concluímos que o tratamento com DCA isoladamente, em concentrações de até 60mM, ou as associações com metformina e omeprazol não foram eficazes em diminuir a população de células de mastocitomas canino de graus 2 e 3 in vitro. Consideramos que a realização deste estudo foi importante para obter informações sobre os efeitos do DCA e associações em mastocitomas caninos. Os resultados deverão ser divulgados e evitarão o uso indiscriminado deste fármaco, cujas consequências poderiam ser adversas para os cães portadores de mastocitomas. / The Warburg effect or aerobic glycolysis is a phenomenon in which tumor cells convert glucose to lactic acid in the presence of oxygen, unlike normal cells in the body that perform the Krebs cycle and oxidative phosphorylation. Sodium dichloroacetate (DCA) activates pyruvate dehydrogenase (PDH), resulting in increased pyruvate within the mitochondria and in the reestablishment of normal metabolism of cellular respiration. Studies indicate that the association of DCA with metformin or omeprazole potentiate this effect. Canine mastocytomas are neoplasms originating from mast cells, being quite prevalent among dogs, so the importance of investigating new therapies for this disease. The general objective of this project was to investigate the effect of DCA on canine mast cell tumors, by performing in vitro tests. The treatment with dca DCA was then associated with omeprazole or merformin in canine mastocytoma cell lines. The canine mast cell tumor lines used, grade 2 and 3, were established in the Laboratory of Experimental and Comparative Oncology of FMVZ / USP and were cultured in AIM-V medium.. Treatment with DCA alone was performed with varying concentrations (0,31 mM to 100 mM). The associations were performed with 0,1; 0,5; 1,0; 5, 10 and 20 mM of DCA with 0,02; 0,2 and 2mM of metformin or with 0,02; 0,1 and 0,2 mM of omeprazole. After the treatments, an assay was performed to analyze cell viability using the crystal violet method, with readings at 3 and 5 days. Contrary to our expectations, treatment with dichloroacetate alone or with combinations increased the population of neoplastic cells mainly in the concentrations of 10 and 20mM. In an experiment with three different canine mastocytomas cell lines treated with DCA (10 to 100mM of DCA.), it was found that from 60mM the cell viability was decreased. This effect was intensified with increasing DCA concentrations. We conclude that treatment with DCA alone, at concentrations up to 60mM, or associated with metformin and omeprazole were not effective to decrease the population of canine mast cell tumors of grades 2 and 3 in vitro. The results should be disclosed and will avoid the indiscriminate use of this drug, the consequences of which could be adverse for dogs with mastocytomas.

O mastocitoma é a neoplasia cutânea mais comum em cães. Acredita-se que as células inflamatórias associadas ao tumor desempenham papéis importantes no comportamento biológico do mastocitoma. Este estudo teve como objetivo verificar a presença de macrófagos associados ao tumor (TAMs) e eosinófilos na região intratumoral e comparar à graduação histopatológica e à evolução clínica dos casos para avaliar se são marcadores prognósticos para MCTs cutâneos caninos. Foram avaliados 38 MCTs provenientes de 30 animais submetidos à cirurgia, sem nenhuma outra terapia complementar. Os tumores foram submetidos à análise imuno-histoquímica para detecção de CD68 e à contagem de eosinófilos em lâminas coradas por hematoxilina e eosina. Os resultados foram comparados à classificação histopatológica segundo os critérios de Patnaik et a. (1984) e Kiupel et al. (2011) e à sobrevida e mortalidade em função do tumor. O número de TAM detectado pela imunomarcação de CD68 não apresentou diferenças significativas entre os graus histopatológicos, assim como não foi um indicador de mortalidade em função do tumor, nem para sobrevida, o mesmo sendo observado para a contagem de eosinófilos. Os números de TAMs e eosinófilos não apresentaram correlação. Nossos resultados sugerem que a presença de TAM e eosinófilos em MCTs cutâneos caninos não são bons indicadores prognósticos para esta doença. / Mast cell tumors are the most common skin cancer in dogs. It is believed that tumor-associated inflammatory cells play important roles in biological behavior of this neoplasm. This study aimed to verify the presence of the tumor associated macrophages (TAMs) and eosinophils in the intratumoral region in comparison with the histopathologic grading and clinical evolution of cases in order to assess their prognostic value for canine cutaneous MCTs. Thirty-eight MCTs from 30 dogs treated by surgery with no complementary therapy were investigated. The tumors were submitted to immunohistochemical analysis for CD68 detection and eosinophil count on HE-stained slides. The results were compared with histopathological classification, according to the criteria of Patnaik et al. (1984) and Kiupel et al. (2011), and with survival and mortality due to the disease. The number of TAMs and eosinophils showed no significant differences between the histopathologic grades, as well as it was not a predictor of disease-related mortality or survival. The number of TAMs and eosinophil count showed no correlation. Our results suggest that the presence of TAMs and eosinophils in cutaneous canine MCTs are not good prognostic indicators for this disease.

Os problemas decorrentes de doenças alérgicas é tema em destaque atualmente devido ao aumento de pessoas que vêm apresentando sintomas e sofrendo as consequências de mudanças aceleradas nos costumes da nossa sociedade. Apesar das diversas terapias oferecidas, pacientes alérgicos ainda sofrem com efeitos colaterais decorrentes do uso de medicamentos anti-alérgicos. Assim, a busca por novas alternativas que possam amenizar os sintomas alérgicos torna-se relevante. As substâncias naturais tem sido alvo de intensa investigação devido às propriedades farmacológicas no tratamento de diversas doenças incluindo as alérgicas. Neste contexto, este trabalho foi focado no extrato Vimang e seu componente majoritário, a mangiferina (Mgf), que tem apresentado atividades biológicas diversas. Sabendo-se que a atividade biológica de um extrato pode ser potencializada pelo sinergismo entre seus componentes, foi avaliado o efeito sinérgico de substâncias isoladas do Vimang, tais como mangiferina, quercetina, catequina, ácido gálico e benzóico. Esses componentes foram combinados e as misturas avaliadas quanto à capacidade em inibir a desgranulação mastocitária. O Vimang, a quercetina e mangiferina inibem a desgranulação mastócitária enquanto catequina, ácido gálico e benzóico não são ativos; e porisso, não foram incluídos na determinação do isobolograma de aditividade, adotado no estudo de sinergismo. O isobolograma de aditividade mostra sinergismo para as concentrações de mangiferina iguais a 5, 10, 20 e 40 ?M e quercetina iguais a 0,2, 1 e 1,6 ?M; e mostra antagonismo para mangiferina 80 ?M e quercetina 0,4 e 0,8 ?M. Tais resultados sugerem que altas concentrações de mangiferina atrapalham a interação sinérgica entre estas substâncias e altas concentrações de quercetina exercem um efeito contrário, ou seja, favorecem o sinergismo entre quercetina e mangiferina. A baixa solubilidade de flavonóides em meio fisiológico levou ao estudo da interação da Mgf com lipossomos de Dimiristoil-L-?-Fosfatidilcolina (DMPC) para aplicação nos ensaios biológicos. A Interação da Mgf com lipossomos de DMPC, bem como a estabilidade lipossomal, foram avaliadas quanto aos efeitos de pH, força iônica e presença de colesterol. O pH influencia a eficiência de incorporação (EI) da Mgf que é maior em pHs ácidos. Em soluções de pH ácido ou fisiológico há aumento de tamanho do lipossomo na presença de Mgf, o que reforça a hipótese de interação desta com a bicamada lipídica. O aumento da força iônica, na ausência de Mgf, diminui a estabilidade do lipossomo. Na ausência de sal, a Mgf favorece a formação de agregados e diminui a estabilidade dos lipossomos e na presença de sal, a Mgf previne a agregação e estabiliza os agregados lipossomais. A EI da Mgf nos lipossomos de DMPC preparados pelo método da injeção etanólica, em pH fisiológico, foram ao redor de 13%. A tentativa de otimizar a EI foi realizada pela adição de colesterol em diferentes proporções lipídio:colesterol. Um aumento de 13% para 17% foi observado para a proporção DMPC:colesterol (9:1). A Mgf livre inibe a desgranulação dos mastócitos de forma concentração-dependente; mas a presença de lipossomos, preparados pelo método da injeção etanólica não altera significativamente esse perfil. A EI da mangiferina em lipossomos de DMPC:colesterol (9:1), preparados pelo método do filme lipídico, foi igual a 45%. Os resultados de potencial antialérgico, para este caso, mostraram que os lipossomos de DMPC favorecem o potencial antialérgico da Mgf em concentrações acima de 25 ?M. Esses resultados abrem perspectivas na busca de sistemas lipossomais mais estáveis e que possam ser aplicados em ensaios biológicos in vitro e in vivo. / The problems due to allergic diseases are currently a highlighted topic due to the increase of people who are showing symptoms and suffering the consequences of rapid changes in the habits of our society. Despite various therapies offered, allergic patients still suffer side effects from the use of anti-allergic drugs. Thus, the search for new alternatives that can alleviate the allergic symptoms becomes relevant. Natural substances have been the subject of intense research due to the pharmacological properties in the treatment of several diseases, including allergic ones. In this context, this work was focused on Vimang extract and its major component, the mangiferin (Mgf), which has shown several biological activities. Given that the biological activity of an extract can be enhanced by the synergism between its components, the synergistic effect of compounds isolated from Vimang such as mangiferin, quercetin, catechin, gallic acid and benzoic acid was evaluated. These components were combined and the mixtures tested for their ability to inhibit mast cell degranulation. The Vimang, quercetin and mangiferin inhibit mast cell degranulation while catechin, gallic acid and benzoic acid are not active and for that reason they were not included in the determination of the isobologram adopted in the synergism study. The isobologram of additivity shows synergism for the concentration of mangiferin equal to 5, 10, 20 and 40 ?M and quercetin equal 0.2, 1 and 1.6 ?M, and shows antagonism for mangiferin 80 ?M and quercetin 0.4 and 0.8 ?M. The low solubility of flavonoids in physiological medium led to the study of the interaction of Mgf with liposomes of L-?-dimyristoyl-phosphatidylcholine (DMPC) for application in biological assays. The interaction of Mgf with DMPC liposomes as well as the liposomal stability was evaluated considering the effects of pH, ionic strength and cholesterol presence. The pH influences the incorporation efficiency (IE) of mangiferin, which is higher in acidic pHs. In solutions of acidic or physiological pH, the liposome size increases in the presence of Mgf, which reinforces the hypothesis of interaction of Mgf with the lipid bilayer. The increased ionic strength in the absence of Mgf decreases the stability of the liposome. In the absence of salt, Mgf favors the formation of aggregates and decreases the stability of the liposomes. When in presence of salt, Mgf prevents the aggregation and stabilizes the liposomal aggregates. The IE of mangiferin in DMPC prepared by the ethanol injection method, at physiological pH, were around 13%. The attempt to optimize the IE was performed by the addition of cholesterol in different proportions lipid:cholesterol. An increase from 13% to 17% was observed for the proportion of DMPC:cholesterol (9:1). Free mangiferin inhibits mast cells degranulation in a dose-dependent manner, but the presence of liposomes prepared by the ethanol injection method does not significantly change this profile. The IE of mangiferin in liposomes of DMPC:cholesterol (9:1), prepared by the method of lipidic film was equal to 45%.The results of antiallergic potential in this case show that DMPC liposomes favor the mangiferin antiallergic potential at concentrations above 25 mM. These results open perspectives in the search for more stable liposomal systems and can be applied to biological assays in vitro and in vivo.

Mastocitomas são neoplasias muito prevalentes em cães, e podem ser classificados em graus 1, 2 ou 3 de acordo com características morfológicas. O objetivo deste projeto foi investigar a presença de metástases de mastocitomas caninos de graus 1, 2 ou 3 em linfonodos regionais, procurando correlaciona-las ao intervalo livre de doença e à sobrevida dos animais. Para isto, avaliamos os parâmetros clínicos dos animais e das neoplasias em 57 cães portadores de mastocitoma cutâneo, registrando-se a porcentagem dos casos que apresentaram metástases, o grau histológico da neoplasia e a sobrevida dos animais. Realizou-se análise citológica dos linfonodos regionais previamente ao procedimento cirúrgico e posteriormente estes linfonodos foram excisados junto com a neoplasia primária, independentemente do resultado da citologia. Os tumores foram graduados por histopatologia e submetidos à análise imunoistoquímica com c-kit e Ki-67. Os linfonodos foram avaliados por histopatologia, por análise histoquímica e por imunoistoquímica com c-kit. Foi realizada comparação entre o diagnóstico citológico e histopatológico dos linfonodos quanto à presença de metástases e entre fatores prognósticos associados à neoplasia e a presença de metástase em linfonodo. A citologia demonstrou ser um bom exame na detecção de metástase em linfonodo de cães portadores de mastocitoma cutâneo, e foram observadas células metastáticas em 36 casos (36/46). Na análise histológica dos linfonodos, observamos um maior índice de metástase nos animais diagnosticados com mastocitomas de grau 3, segundo a graduação de Patnaik, e com mastocitomas de alto grau, segundo a graduação de Kiupel. No entanto, não encontramos uma associação significativa entre a presença de metástase em linfonodo e o grau histológico da neoplasia. O grau histológico associou-se à sobrevida independentemente da presença de metástase em linfonodo. Não houve associação entre o padrão de expressão da proteína KIT na neoplasia com a presença de metástase em linfonodo, nem a sobrevida. A utilização da imunoistoquímica em linfonodos metastáticos com c-kit foi um método eficaz, com predomínio do mesmo padrão de marcação da proteína KIT na neoplasia primária e no linfonodo. A expressão de Ki-67 na neoplasia correlacionou-se à presença de metástase em linfonodo e à uma menor sobrevida e intervalo livre de doença nos animais que apresentavam mastocitomas com índice de Ki-67 acima de 23. Na análise da sobrevida, não observamos diferença na sobrevida, nem no intervalo livre de doença, comparando-se os animais que apresentavam metástase em linfonodo e aqueles que não apresentavam, entretanto o índice de óbito e de progressão da doença neste estudo foram baixos. O intervalo livre de doença e sobrevida média não foram alcançados ao final do estudo. Os resultados sugerem que a presença de metástase em linfonodo não deve ser considerada como um fator prognóstico independente em cães diagnosticados com mastocitoma cutâneo, uma vez que outros fatores prognósticos, bem como a utilização de tratamentos adjuvantes, podem interferir de forma significativa na evolução destes pacientes. / Mast cell tumors are very prevalent in dogs, and can be classified in grades 1, 2 or 3 according to morphological characteristics.The aim of this study was to investigate the presence of metastases in regional lymph nodes of grade 1, 2 or 3 canine mast cell tumors, and correlate its presence to the disease-free interval and survival of the animals. For this, we evaluated the clinical parameters of animals and tumors in 57 dogs with cutaneous mast cell tumor, registering the percentage of cases with metastasis, histological grade of the tumor and survival of the animals. Cytological analysis of regional lymph nodes were performed prior to surgery and then these lymph nodes were excised along with the primary tumor, regardless of the result of cytology. The tumors were graded by histopathology and submitted to immunohistochemical analysis with c-kit and Ki-67. The lymph nodes were evaluated by histopathology, histochemistry and immunohistochemistry with c-kit. We compared the cytological and histopathological diagnosis of lymph nodes for the presence of metastases and compared prognostic factors associated with the primary tumor and the presence of metastasis in lymph node. Cytology proved to be a good method in detecting lymph node metastasis in dogs with cutaneous mast cell tumors and metastatic cells were observed in 36 cases (36/46). In the histological analysis of the lymph nodes, we observed a higher rate of metastasis in animals diagnosed with grade 3 mast cell tumors, according to the Patnaik grading system, and with high-grade mast cell tumors, according to the Kiupel grading system. However, we have not found a significant association between the presence of metastasis in lymph nodes and the histological grade of the tumors. Histological grade associated with survival independent of the presence of lymph node metastasis. In addition, there was no association between the pattern of KIT protein expression in the primary tumor and lymph node metastasies or survival. The use of immunohistochemistry in metastatic lymph nodes with c-kit is an effective method, with prevalence of the same KIT pattern in primary tumor and lymph node. The expression of Ki-67 in the primary tumor correlated with lymph node metastasis, survival and disease-free-time, and it was observed in animals in which mast cell tumors had a Ki-67 index higher than 23. In survival analysis, we observed no difference in survival or in disease-free interval, comparing the animals with lymph node metastasis and those who did not had, though the death rate and disease progression in this study were low. The disease-free interval and median survival were not reached at the end of the study. The results suggest that the presence of lymph node metastasis should not be considered as an independent prognostic factor in dogs diagnosed with cutaneous mast cell tumors, since other prognostic factors, as well as the establishment of adjuvant treatment, can interfere significantly with the progression of these patients.

As doenças alérgicas alcançaram proporções mundialmente epidêmicas. A ativação de receptores para IgE, Fc RI, em mastócitos, é o mecanismo chave para a iniciação e propagação das respostas patofisiológicas dos processos alérgicos. Após a interação destas células com um alérgeno, há a ativação de uma cascata de eventos de sinalização, a qual resulta na secreção de mediadores alérgicos pré-formados, através de um processo regulado de exocitose, além da síntese e secreção de mediadores lipídicos e citocinas. Desta forma, a inibição da responsividade dos mastócitos, quando ativados por um alérgeno, representa uma via importante para o desenvolvimento de novos candidatos a fármacos com indicação antialérgica. Neste sentido, este trabalho buscou, num primeiro momento, contribuir com a compreensão dos papéis desempenhados por um glicerofosfolipídeo de membrana, fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PtdIns(4,5)P2), em eventos de sinalização em mastócitos, mediados por IgE. Este trabalho permitiu destacar a importância de PtdIns(4,5)P2 como um regulador chave das respostas de Ca2+ e das alterações de morfologia de mastócitos estimulados por um alérgeno. Foi observado ainda que níveis reduzidos de PtdIns(4,5)P2 determinaram a inibição do processo de endocitose de receptores Fc RI ativados, um evento crucial para a redução da transdução de sinais. Estes resultados não somente trazem um ganho de conhecimento acerca dos detalhes que orquestram os eventos de sinalização em mastócitos estimulados por um alérgeno, como também apontam que a regulação dos níveis de PtdIns(4,5)P2 pode certamente ser apontada como alvo para o desenvolvimento de novas moléculas inibidoras da ativação mastocitária. A segunda etapa deste trabalho teve como objetivo avaliar o potencial inibitório de alguns compostos de origem natural e sintética sobre a degranulação de mastócitos, evento em que mediadores alérgicos, como a histamina, são secretados, em resposta ao estímulo celular. Inicialmente, avaliou-se o efeito inibitório de um conjunto de arilcumarinas sintéticas, estruturalmente relacionadas, sobre a degranulação. Um número significativo de moléculas foram ativas e, dentre elas, algumas substituições junto à estrutura do anel 3-fenilcumarínico, como as hidroxilações das posições 6, 2\'e 5\', puderam ser identificadas como importantes para o potencial bioativo. Finalmente, o trabalho apresentou uma molécula de origem natural, como um potente inibidor da degranulação de mastócitos e da secreção de citocinas. Trata-se da piridovericina, um metabólito secundário, isolado do fungo entomopatogênico Beauveria bassiana. Dessa forma, tanto as cumarinas, como a piridovericina podem ser apontadas como compostos de partida de grande potencial para o desenvolvimento de novos fármacos anti-alérgicos. / Allergic diseases have approached epidemic proportions worldwide. The activation of IgE receptors, Fc RI, from mast cells, is the key event for the initiation and propagation of pathophysiological responses involved in the allergic processes. The interaction between mast cells and allergens triggers a signaling cascade, which results in secretion of pre-formed allergic mediators, through regulated exocytosis, in addition to the synthesis and secretion of lipid mediators and cytokines. In this way, the inhibition of mast cell responsiveness, upon allergen stimulation, represents an important pathway for the development of new antiallergic drug candidates. Thus, the present work tried, firstly, to gain better insight of the roles played by phosphatidylinositol 4,5-biphosphate (PtdIns(4,5)P2) during IgE-mediated mast cell signaling. This work highlighted the importance of PtdIns(4,5)P2 as a key regulator of Ca2+ responses and mast cell morphological alteration, when activated by an allergen. It was observed that reduced levels of PtdIns(4,5)P2 determined the inhibition of activated Fc RI endocytosis, a crucial event for signal transduction termination. Those results not only improve the actual knowledge in mast cell signaling but also point out the regulation of PtsIns(4,5)P2 levels as a target to be pursued during the development of new inhibitors of mast cell activation. The second part of this work aimed to evaluate the capacity of both synthetic and natural compounds to inhibit mast cell degranulation, characterized by the release of granule-contained allergic mediators, such as histamine, upon cell stimulation. Initially, the inhibitory effect of a set of structurally related synthetic arylcoumarins was evaluated. A significant number of molecules were active, and a few substitutions within such molecules could be pointed as important for the biological activity, such as the hydroxylation of carbons 6, 2\' e 5\' of the 3-phenylcoumarin ring. Lastly, this work presents a natural compound as a potent inhibitor of mast cell degranulation and cytokine secretion. The refered compound is pyridovericin, a secondary metabolite isolated from the entomophatogenic fungus Beauveria bassiana. Therefore, both the coumarin derivatives and pyridovericin can be regarded as lead compounds for the development of new anti-allergic drugs.

Mastocitomas são neoplasias muito prevalentes em cães, e podem ser classificados em graus 1, 2 ou 3 de acordo com características morfológicas. O objetivo deste projeto foi investigar a presença de metástases de mastocitomas caninos de graus 1, 2 ou 3 em linfonodos regionais, procurando correlaciona-las ao intervalo livre de doença e à sobrevida dos animais. Para isto, avaliamos os parâmetros clínicos dos animais e das neoplasias em 57 cães portadores de mastocitoma cutâneo, registrando-se a porcentagem dos casos que apresentaram metástases, o grau histológico da neoplasia e a sobrevida dos animais. Realizou-se análise citológica dos linfonodos regionais previamente ao procedimento cirúrgico e posteriormente estes linfonodos foram excisados junto com a neoplasia primária, independentemente do resultado da citologia. Os tumores foram graduados por histopatologia e submetidos à análise imunoistoquímica com c-kit e Ki-67. Os linfonodos foram avaliados por histopatologia, por análise histoquímica e por imunoistoquímica com c-kit. Foi realizada comparação entre o diagnóstico citológico e histopatológico dos linfonodos quanto à presença de metástases e entre fatores prognósticos associados à neoplasia e a presença de metástase em linfonodo. A citologia demonstrou ser um bom exame na detecção de metástase em linfonodo de cães portadores de mastocitoma cutâneo, e foram observadas células metastáticas em 36 casos (36/46). Na análise histológica dos linfonodos, observamos um maior índice de metástase nos animais diagnosticados com mastocitomas de grau 3, segundo a graduação de Patnaik, e com mastocitomas de alto grau, segundo a graduação de Kiupel. No entanto, não encontramos uma associação significativa entre a presença de metástase em linfonodo e o grau histológico da neoplasia. O grau histológico associou-se à sobrevida independentemente da presença de metástase em linfonodo. Não houve associação entre o padrão de expressão da proteína KIT na neoplasia com a presença de metástase em linfonodo, nem a sobrevida. A utilização da imunoistoquímica em linfonodos metastáticos com c-kit foi um método eficaz, com predomínio do mesmo padrão de marcação da proteína KIT na neoplasia primária e no linfonodo. A expressão de Ki-67 na neoplasia correlacionou-se à presença de metástase em linfonodo e à uma menor sobrevida e intervalo livre de doença nos animais que apresentavam mastocitomas com índice de Ki-67 acima de 23. Na análise da sobrevida, não observamos diferença na sobrevida, nem no intervalo livre de doença, comparando-se os animais que apresentavam metástase em linfonodo e aqueles que não apresentavam, entretanto o índice de óbito e de progressão da doença neste estudo foram baixos. O intervalo livre de doença e sobrevida média não foram alcançados ao final do estudo. Os resultados sugerem que a presença de metástase em linfonodo não deve ser considerada como um fator prognóstico independente em cães diagnosticados com mastocitoma cutâneo, uma vez que outros fatores prognósticos, bem como a utilização de tratamentos adjuvantes, podem interferir de forma significativa na evolução destes pacientes. / Mast cell tumors are very prevalent in dogs, and can be classified in grades 1, 2 or 3 according to morphological characteristics.The aim of this study was to investigate the presence of metastases in regional lymph nodes of grade 1, 2 or 3 canine mast cell tumors, and correlate its presence to the disease-free interval and survival of the animals. For this, we evaluated the clinical parameters of animals and tumors in 57 dogs with cutaneous mast cell tumor, registering the percentage of cases with metastasis, histological grade of the tumor and survival of the animals. Cytological analysis of regional lymph nodes were performed prior to surgery and then these lymph nodes were excised along with the primary tumor, regardless of the result of cytology. The tumors were graded by histopathology and submitted to immunohistochemical analysis with c-kit and Ki-67. The lymph nodes were evaluated by histopathology, histochemistry and immunohistochemistry with c-kit. We compared the cytological and histopathological diagnosis of lymph nodes for the presence of metastases and compared prognostic factors associated with the primary tumor and the presence of metastasis in lymph node. Cytology proved to be a good method in detecting lymph node metastasis in dogs with cutaneous mast cell tumors and metastatic cells were observed in 36 cases (36/46). In the histological analysis of the lymph nodes, we observed a higher rate of metastasis in animals diagnosed with grade 3 mast cell tumors, according to the Patnaik grading system, and with high-grade mast cell tumors, according to the Kiupel grading system. However, we have not found a significant association between the presence of metastasis in lymph nodes and the histological grade of the tumors. Histological grade associated with survival independent of the presence of lymph node metastasis. In addition, there was no association between the pattern of KIT protein expression in the primary tumor and lymph node metastasies or survival. The use of immunohistochemistry in metastatic lymph nodes with c-kit is an effective method, with prevalence of the same KIT pattern in primary tumor and lymph node. The expression of Ki-67 in the primary tumor correlated with lymph node metastasis, survival and disease-free-time, and it was observed in animals in which mast cell tumors had a Ki-67 index higher than 23. In survival analysis, we observed no difference in survival or in disease-free interval, comparing the animals with lymph node metastasis and those who did not had, though the death rate and disease progression in this study were low. The disease-free interval and median survival were not reached at the end of the study. The results suggest that the presence of lymph node metastasis should not be considered as an independent prognostic factor in dogs diagnosed with cutaneous mast cell tumors, since other prognostic factors, as well as the establishment of adjuvant treatment, can interfere significantly with the progression of these patients.

Os mastocitomas caninos são neoplasias originárias de mastócitos, sendo bastante prevalente entre os cães, por isso a importância de averiguar novas terapias para esta doença. O objetivo geral deste projeto foi investigar o efeito do DCA em mastocitomas caninos, por meio da realização de ensaios in vitro. Também foram investigados os efeitos do tratamento com DCA associado ao omeprazol ou merformina em linhagens de mastocitoma canino. As linhagens de mastocitoma canino utilizadas, grau 2 e 3, foram estabelecidas no Laboratório de Oncologia Experimental e Comparadas da FMVZ/USP e foram cultivadas em meio AIM-V. As células foram tratadas com diversas concentrações de DCA (de 0,31 a 100mM). O DCA 0,1; 0,5; 1,0; 5; 10 e 20mM foi também testado em associação com metformina (0,02; 0,2 e 2mM) ou com omeprazol (0,02; 0,1 e 0,2mM). Após os tratamentos, foi realizado ensaio para analisar a viabilidade celular utilizando o método do cristal violeta, com leituras em 3 e 5 dias. Ao contrário do que era esperado, o tratamento com dicloroacetato isolado ou com associações aumentou a população de células neoplásicas principalmente nas concentrações de 10 e 20mM. Num experimento realizado com três linhagens diferentes de mastocitomas caninos foram utilizadas concentrações de 10 a 100mM de DCA, e mostrou que a partir de 60mM há diminuição da viabilidade celular, sendo que o efeito se intensifica com o aumento das concentrações de DCA. Concluímos que o tratamento com DCA isoladamente, em concentrações de até 60mM, ou as associações com metformina e omeprazol não foram eficazes em diminuir a população de células de mastocitomas canino de graus 2 e 3 in vitro. Consideramos que a realização deste estudo foi importante para obter informações sobre os efeitos do DCA e associações em mastocitomas caninos. Os resultados deverão ser divulgados e evitarão o uso indiscriminado deste fármaco, cujas consequências poderiam ser adversas para os cães portadores de mastocitomas. / The Warburg effect or aerobic glycolysis is a phenomenon in which tumor cells convert glucose to lactic acid in the presence of oxygen, unlike normal cells in the body that perform the Krebs cycle and oxidative phosphorylation. Sodium dichloroacetate (DCA) activates pyruvate dehydrogenase (PDH), resulting in increased pyruvate within the mitochondria and in the reestablishment of normal metabolism of cellular respiration. Studies indicate that the association of DCA with metformin or omeprazole potentiate this effect. Canine mastocytomas are neoplasms originating from mast cells, being quite prevalent among dogs, so the importance of investigating new therapies for this disease. The general objective of this project was to investigate the effect of DCA on canine mast cell tumors, by performing in vitro tests. The treatment with dca DCA was then associated with omeprazole or merformin in canine mastocytoma cell lines. The canine mast cell tumor lines used, grade 2 and 3, were established in the Laboratory of Experimental and Comparative Oncology of FMVZ / USP and were cultured in AIM-V medium.. Treatment with DCA alone was performed with varying concentrations (0,31 mM to 100 mM). The associations were performed with 0,1; 0,5; 1,0; 5, 10 and 20 mM of DCA with 0,02; 0,2 and 2mM of metformin or with 0,02; 0,1 and 0,2 mM of omeprazole. After the treatments, an assay was performed to analyze cell viability using the crystal violet method, with readings at 3 and 5 days. Contrary to our expectations, treatment with dichloroacetate alone or with combinations increased the population of neoplastic cells mainly in the concentrations of 10 and 20mM. In an experiment with three different canine mastocytomas cell lines treated with DCA (10 to 100mM of DCA.), it was found that from 60mM the cell viability was decreased. This effect was intensified with increasing DCA concentrations. We conclude that treatment with DCA alone, at concentrations up to 60mM, or associated with metformin and omeprazole were not effective to decrease the population of canine mast cell tumors of grades 2 and 3 in vitro. The results should be disclosed and will avoid the indiscriminate use of this drug, the consequences of which could be adverse for dogs with mastocytomas.