Orientador: Andrigo Barboza De Nardi / Coorientador: Mirela Tinucci Costa / Coorientador: Reneé Laufer Amorim / Banca: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Banca: Daniel Guimarães Gerardi / Resumo: A via PI3K/AKT/mTOR está relacionada com a proliferação, síntese proteica, sobrevivência e motilidade das células. Mutações nesta via tem sido associadas com o processo carcinogênico de diferentes tipos tumorais. Atualmente, inibidores específicos de proteínas como a PI3K, AKT, mTOR, vem sendo testados com o intuito de otimizar a terapia antitumoral em seres humanos e animais. Além de potenciais alvos terapêuticos, o aumento da expressão de algumas destas proteínas tem sido associado a tumores de pior prognóstico em seres humanos. Em cães, o mastocitoma (MCT) é um tumor cutâneo extremamente comum, de comportamento bastante variável e etiologia ainda não esclarecida. Diante disso, o objetivo deste estudo, foi avaliar a imunomarcação dos componentes proteicos da via PI3K/AKT/mTOR, por meio da técnica de imuno-histoquímica e em um segundo momento, associar esses resultados com os parâmetros clínicos dos pacientes, com as características morfológicas e biológicas dos tumores e com o tempo de sobrevida dos pacientes, visando determinar possíveis marcadores prognósticos para esta neoplasia. Para tal 46 MCTs caninos foram utilizados. Todos os tumores apresentaram positividade na avaliação imuno-histoquímica para as proteínas analisadas. As proteínas p-AKT Thr 308 e p-S6K1 apresentaram forte intensidade de imunomarcação, quando comparadas a parâmetros associados a piores prognósticos. Esses resultados indicam que a forte intensidade de imunomarcação de p- AKT Thr 308 e p-S6K1 está relacionada a um pior prognóstico para os cães acometidos pelo MCT cutâneo / Abstract: The PI3K/AKT/mTOR pathway is related to proliferation, protein synthesis, cell motility and survival. Mutations in this pathway have been associated with the carcinogenic process in diferent tumor types. Currently, specific inhibitors of some proteins such as PI3K, AKT, mTOR, are being tested in order to optimize antitumor therapy in humans and animals. Apart from potential therapeutic targets, increased in immunostaining of some of these proteins have been associated with poorer prognostic in humans tumors. In dogs, mast cell tumor (MCT) is an extremely common skin tumor, which presents a highly variable behavior and unclear etiology. Therefore, the aim of this study was to evaluate the immunostaining of the protein components of PI3K/AKT/mTOR pathway, through the technique of immunohistochemistry, and in a second stage, correlate this results with clinical parameters of patients, with morphological and biological tumor characteristics and the survival time of patients to determine possible prognostic markers for this disease. For this, 46 canine MCTs were used. All tumors were positive in immunohistochemical analysis for the proteins analyzed. Proteins p-AKT Thr 308 and p-S6K1 showed increases in the intensity of immunostaining compared to parameters associated with worse prognosis. These results suggest that the increase in the intensity of immunostaining of p-AKT Thr 308 and p-S6K1 are related to a worse prognosis for dogs affected by cutaneous MCT / Mestre

Mastocitomas são neoplasias muito prevalentes em cães, e podem ser classificados em graus 1, 2 ou 3 de acordo com características morfológicas. O objetivo deste projeto foi investigar a presença de metástases de mastocitomas caninos de graus 1, 2 ou 3 em linfonodos regionais, procurando correlaciona-las ao intervalo livre de doença e à sobrevida dos animais. Para isto, avaliamos os parâmetros clínicos dos animais e das neoplasias em 57 cães portadores de mastocitoma cutâneo, registrando-se a porcentagem dos casos que apresentaram metástases, o grau histológico da neoplasia e a sobrevida dos animais. Realizou-se análise citológica dos linfonodos regionais previamente ao procedimento cirúrgico e posteriormente estes linfonodos foram excisados junto com a neoplasia primária, independentemente do resultado da citologia. Os tumores foram graduados por histopatologia e submetidos à análise imunoistoquímica com c-kit e Ki-67. Os linfonodos foram avaliados por histopatologia, por análise histoquímica e por imunoistoquímica com c-kit. Foi realizada comparação entre o diagnóstico citológico e histopatológico dos linfonodos quanto à presença de metástases e entre fatores prognósticos associados à neoplasia e a presença de metástase em linfonodo. A citologia demonstrou ser um bom exame na detecção de metástase em linfonodo de cães portadores de mastocitoma cutâneo, e foram observadas células metastáticas em 36 casos (36/46). Na análise histológica dos linfonodos, observamos um maior índice de metástase nos animais diagnosticados com mastocitomas de grau 3, segundo a graduação de Patnaik, e com mastocitomas de alto grau, segundo a graduação de Kiupel. No entanto, não encontramos uma associação significativa entre a presença de metástase em linfonodo e o grau histológico da neoplasia. O grau histológico associou-se à sobrevida independentemente da presença de metástase em linfonodo. Não houve associação entre o padrão de expressão da proteína KIT na neoplasia com a presença de metástase em linfonodo, nem a sobrevida. A utilização da imunoistoquímica em linfonodos metastáticos com c-kit foi um método eficaz, com predomínio do mesmo padrão de marcação da proteína KIT na neoplasia primária e no linfonodo. A expressão de Ki-67 na neoplasia correlacionou-se à presença de metástase em linfonodo e à uma menor sobrevida e intervalo livre de doença nos animais que apresentavam mastocitomas com índice de Ki-67 acima de 23. Na análise da sobrevida, não observamos diferença na sobrevida, nem no intervalo livre de doença, comparando-se os animais que apresentavam metástase em linfonodo e aqueles que não apresentavam, entretanto o índice de óbito e de progressão da doença neste estudo foram baixos. O intervalo livre de doença e sobrevida média não foram alcançados ao final do estudo. Os resultados sugerem que a presença de metástase em linfonodo não deve ser considerada como um fator prognóstico independente em cães diagnosticados com mastocitoma cutâneo, uma vez que outros fatores prognósticos, bem como a utilização de tratamentos adjuvantes, podem interferir de forma significativa na evolução destes pacientes. / Mast cell tumors are very prevalent in dogs, and can be classified in grades 1, 2 or 3 according to morphological characteristics.The aim of this study was to investigate the presence of metastases in regional lymph nodes of grade 1, 2 or 3 canine mast cell tumors, and correlate its presence to the disease-free interval and survival of the animals. For this, we evaluated the clinical parameters of animals and tumors in 57 dogs with cutaneous mast cell tumor, registering the percentage of cases with metastasis, histological grade of the tumor and survival of the animals. Cytological analysis of regional lymph nodes were performed prior to surgery and then these lymph nodes were excised along with the primary tumor, regardless of the result of cytology. The tumors were graded by histopathology and submitted to immunohistochemical analysis with c-kit and Ki-67. The lymph nodes were evaluated by histopathology, histochemistry and immunohistochemistry with c-kit. We compared the cytological and histopathological diagnosis of lymph nodes for the presence of metastases and compared prognostic factors associated with the primary tumor and the presence of metastasis in lymph node. Cytology proved to be a good method in detecting lymph node metastasis in dogs with cutaneous mast cell tumors and metastatic cells were observed in 36 cases (36/46). In the histological analysis of the lymph nodes, we observed a higher rate of metastasis in animals diagnosed with grade 3 mast cell tumors, according to the Patnaik grading system, and with high-grade mast cell tumors, according to the Kiupel grading system. However, we have not found a significant association between the presence of metastasis in lymph nodes and the histological grade of the tumors. Histological grade associated with survival independent of the presence of lymph node metastasis. In addition, there was no association between the pattern of KIT protein expression in the primary tumor and lymph node metastasies or survival. The use of immunohistochemistry in metastatic lymph nodes with c-kit is an effective method, with prevalence of the same KIT pattern in primary tumor and lymph node. The expression of Ki-67 in the primary tumor correlated with lymph node metastasis, survival and disease-free-time, and it was observed in animals in which mast cell tumors had a Ki-67 index higher than 23. In survival analysis, we observed no difference in survival or in disease-free interval, comparing the animals with lymph node metastasis and those who did not had, though the death rate and disease progression in this study were low. The disease-free interval and median survival were not reached at the end of the study. The results suggest that the presence of lymph node metastasis should not be considered as an independent prognostic factor in dogs diagnosed with cutaneous mast cell tumors, since other prognostic factors, as well as the establishment of adjuvant treatment, can interfere significantly with the progression of these patients.

Mastocitomas são neoplasias muito prevalentes em cães, e podem ser classificados em graus 1, 2 ou 3 de acordo com características morfológicas. O objetivo deste projeto foi investigar a presença de metástases de mastocitomas caninos de graus 1, 2 ou 3 em linfonodos regionais, procurando correlaciona-las ao intervalo livre de doença e à sobrevida dos animais. Para isto, avaliamos os parâmetros clínicos dos animais e das neoplasias em 57 cães portadores de mastocitoma cutâneo, registrando-se a porcentagem dos casos que apresentaram metástases, o grau histológico da neoplasia e a sobrevida dos animais. Realizou-se análise citológica dos linfonodos regionais previamente ao procedimento cirúrgico e posteriormente estes linfonodos foram excisados junto com a neoplasia primária, independentemente do resultado da citologia. Os tumores foram graduados por histopatologia e submetidos à análise imunoistoquímica com c-kit e Ki-67. Os linfonodos foram avaliados por histopatologia, por análise histoquímica e por imunoistoquímica com c-kit. Foi realizada comparação entre o diagnóstico citológico e histopatológico dos linfonodos quanto à presença de metástases e entre fatores prognósticos associados à neoplasia e a presença de metástase em linfonodo. A citologia demonstrou ser um bom exame na detecção de metástase em linfonodo de cães portadores de mastocitoma cutâneo, e foram observadas células metastáticas em 36 casos (36/46). Na análise histológica dos linfonodos, observamos um maior índice de metástase nos animais diagnosticados com mastocitomas de grau 3, segundo a graduação de Patnaik, e com mastocitomas de alto grau, segundo a graduação de Kiupel. No entanto, não encontramos uma associação significativa entre a presença de metástase em linfonodo e o grau histológico da neoplasia. O grau histológico associou-se à sobrevida independentemente da presença de metástase em linfonodo. Não houve associação entre o padrão de expressão da proteína KIT na neoplasia com a presença de metástase em linfonodo, nem a sobrevida. A utilização da imunoistoquímica em linfonodos metastáticos com c-kit foi um método eficaz, com predomínio do mesmo padrão de marcação da proteína KIT na neoplasia primária e no linfonodo. A expressão de Ki-67 na neoplasia correlacionou-se à presença de metástase em linfonodo e à uma menor sobrevida e intervalo livre de doença nos animais que apresentavam mastocitomas com índice de Ki-67 acima de 23. Na análise da sobrevida, não observamos diferença na sobrevida, nem no intervalo livre de doença, comparando-se os animais que apresentavam metástase em linfonodo e aqueles que não apresentavam, entretanto o índice de óbito e de progressão da doença neste estudo foram baixos. O intervalo livre de doença e sobrevida média não foram alcançados ao final do estudo. Os resultados sugerem que a presença de metástase em linfonodo não deve ser considerada como um fator prognóstico independente em cães diagnosticados com mastocitoma cutâneo, uma vez que outros fatores prognósticos, bem como a utilização de tratamentos adjuvantes, podem interferir de forma significativa na evolução destes pacientes. / Mast cell tumors are very prevalent in dogs, and can be classified in grades 1, 2 or 3 according to morphological characteristics.The aim of this study was to investigate the presence of metastases in regional lymph nodes of grade 1, 2 or 3 canine mast cell tumors, and correlate its presence to the disease-free interval and survival of the animals. For this, we evaluated the clinical parameters of animals and tumors in 57 dogs with cutaneous mast cell tumor, registering the percentage of cases with metastasis, histological grade of the tumor and survival of the animals. Cytological analysis of regional lymph nodes were performed prior to surgery and then these lymph nodes were excised along with the primary tumor, regardless of the result of cytology. The tumors were graded by histopathology and submitted to immunohistochemical analysis with c-kit and Ki-67. The lymph nodes were evaluated by histopathology, histochemistry and immunohistochemistry with c-kit. We compared the cytological and histopathological diagnosis of lymph nodes for the presence of metastases and compared prognostic factors associated with the primary tumor and the presence of metastasis in lymph node. Cytology proved to be a good method in detecting lymph node metastasis in dogs with cutaneous mast cell tumors and metastatic cells were observed in 36 cases (36/46). In the histological analysis of the lymph nodes, we observed a higher rate of metastasis in animals diagnosed with grade 3 mast cell tumors, according to the Patnaik grading system, and with high-grade mast cell tumors, according to the Kiupel grading system. However, we have not found a significant association between the presence of metastasis in lymph nodes and the histological grade of the tumors. Histological grade associated with survival independent of the presence of lymph node metastasis. In addition, there was no association between the pattern of KIT protein expression in the primary tumor and lymph node metastasies or survival. The use of immunohistochemistry in metastatic lymph nodes with c-kit is an effective method, with prevalence of the same KIT pattern in primary tumor and lymph node. The expression of Ki-67 in the primary tumor correlated with lymph node metastasis, survival and disease-free-time, and it was observed in animals in which mast cell tumors had a Ki-67 index higher than 23. In survival analysis, we observed no difference in survival or in disease-free interval, comparing the animals with lymph node metastasis and those who did not had, though the death rate and disease progression in this study were low. The disease-free interval and median survival were not reached at the end of the study. The results suggest that the presence of lymph node metastasis should not be considered as an independent prognostic factor in dogs diagnosed with cutaneous mast cell tumors, since other prognostic factors, as well as the establishment of adjuvant treatment, can interfere significantly with the progression of these patients.

Atualmente muitas são as técnicas utilizadas na área de citogenética para que os desequilíbrios genéticos potencialmente hereditários sejam identificados ou evitados. Algumas das técnicas são utilizadas apenas para o diagnóstico de enfermidades em humanos, mas seria importante que fossem aplicadas também aos animais domésticos, com a finalidade de se associar uma causa genética ao aparecimento de algumas doenças, como por exemplo, os mastocitomas. Os mastocitomas são formações cutâneas neoplásicas originadas de mastócitos e se apresentam com frequência em cães. Algumas raças apresentam maior susceptibilidade ao aparecimento de mastocitoma, e o Boxer tem a maior incidência nesta espécie. Este trabalho objetivou avaliar comparativamente o cariótipo de cães da raça Boxer e buscar uma possível correlação com o desenvolvimento de mastocitoma. Foram utilizadas técnicas citogenéticas de bandamentos C, G e Ron além de análises em coloração convencional (Giemsa). Para tais análises utilizaram-se células cultivadas de linfócitos periféricos e de mastocitomas de Boxer. O material foi analisado e fotografado em microscópio de imersão da marca Zeiss®, em objetiva de 100x, com filtro verde, equipado com software de análise citogenética Ikaros®. Foram consideradas alterações numéricas e estruturais. Foram analisadas 828 metáfases mitóticas provenientes de linfócitos periféricos e células de mastocitomas. A análise das metáfases provenientes de cultura de células dos linfócitos periféricos não apresentou alterações estruturais e a análise numérica mostrou somente uma metáfase com 2n=77, dentre 476 metáfases analisadas. Na análise das metáfases de células tumorais, entre todas as colorações, observou-se que 70,9% apresentou 2n=78, 17,4% mostraram 2n=77; 9,8% 2n=76. Cinco metáfases (1,3%) apresentaram 2n=79 e duas células apresentaram 2n=75. Todas essas alterações numéricas estão relacionadas com alterações estruturais do tipo fusão cêntrica. Os resultados obtidos mostram que devido ao crescimento descontrolado, as células tumorais promovem rearranjos na tentativa de controlar a divisão celular. Ainda, o aprimoramento das técnicas diagnósticas em citogenética promove o conhecimento da biologia tumoral do mastocitoma canino, e consequentemente, possibilita o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. / Nowadays there are many techniques applyed in cytogenetics in order to identify or avoid potentially hereditary genetic imbalance. Some of the techniques are used only to diagnose human diseases, but it would be important to apply them also to domestic animals, with the purpose of associating a genetic cause with the appearance of some diseases like, for example, mastocytomas. The mastocytomas are neoplasics cutaneous formation originated from mastocitos and frequently appears in dogs. Some breeds show higher susceptibity to the appearance of mastocytoma, and the boxer breed has shown the highest incidence. The objective of this study is to comparatively evaluate the boxer breed chariotype and search for a possible correlation with the mastocytoma development. There has been utilized cytogenetics bandamentos C,G e Ron as well as conventional (Giemsa) coloring analysis. For those analysis there has been utilized cultivated cells from peripheral lynphocites and boxer´s mastocytomas. The material as been analyzed and photographed in a Zeiss immersion microscope, using a 100x objective with green filter, equipped with Ikaros cytogenetic analysis software. It has been considered numerical and structural alterations. There has been analyzed 828 mithotics metaphases from peripheral lynphocites and mastocytomas cells. The analysis of metaphases from the culture of peripheral lynphocites cells did not show structural alterations and the numerical analysis has shown only one metaphase 2n=77, among 476 analyzed metaphases. In the tumoral metaphase cells analysis, among all colorations, it has been observed that 70,9% presented 2n=78, 17,4% shown 2n=77 and 9,8% 2n=76. Five metaphases (1,3%) presented 2n=79 and two cell presented 2n=75. All these numerical alterations are related with structural alterations from the centric fusion type. The obtained results shows that due to the uncontrolled growth, the tumoral cells promote rearrangements in an attempt to control a cellular division. Yet, the improvement of diagnosis technique in cytogenetics promotes the knowledge of canine mastocytoma tumoral biology, and consequently allows the new therapeutic strategy development.

Os mastocitomas caninos são neoplasias originárias de mastócitos, sendo bastante prevalente entre os cães, por isso a importância de averiguar novas terapias para esta doença. O objetivo geral deste projeto foi investigar o efeito do DCA em mastocitomas caninos, por meio da realização de ensaios in vitro. Também foram investigados os efeitos do tratamento com DCA associado ao omeprazol ou merformina em linhagens de mastocitoma canino. As linhagens de mastocitoma canino utilizadas, grau 2 e 3, foram estabelecidas no Laboratório de Oncologia Experimental e Comparadas da FMVZ/USP e foram cultivadas em meio AIM-V. As células foram tratadas com diversas concentrações de DCA (de 0,31 a 100mM). O DCA 0,1; 0,5; 1,0; 5; 10 e 20mM foi também testado em associação com metformina (0,02; 0,2 e 2mM) ou com omeprazol (0,02; 0,1 e 0,2mM). Após os tratamentos, foi realizado ensaio para analisar a viabilidade celular utilizando o método do cristal violeta, com leituras em 3 e 5 dias. Ao contrário do que era esperado, o tratamento com dicloroacetato isolado ou com associações aumentou a população de células neoplásicas principalmente nas concentrações de 10 e 20mM. Num experimento realizado com três linhagens diferentes de mastocitomas caninos foram utilizadas concentrações de 10 a 100mM de DCA, e mostrou que a partir de 60mM há diminuição da viabilidade celular, sendo que o efeito se intensifica com o aumento das concentrações de DCA. Concluímos que o tratamento com DCA isoladamente, em concentrações de até 60mM, ou as associações com metformina e omeprazol não foram eficazes em diminuir a população de células de mastocitomas canino de graus 2 e 3 in vitro. Consideramos que a realização deste estudo foi importante para obter informações sobre os efeitos do DCA e associações em mastocitomas caninos. Os resultados deverão ser divulgados e evitarão o uso indiscriminado deste fármaco, cujas consequências poderiam ser adversas para os cães portadores de mastocitomas. / The Warburg effect or aerobic glycolysis is a phenomenon in which tumor cells convert glucose to lactic acid in the presence of oxygen, unlike normal cells in the body that perform the Krebs cycle and oxidative phosphorylation. Sodium dichloroacetate (DCA) activates pyruvate dehydrogenase (PDH), resulting in increased pyruvate within the mitochondria and in the reestablishment of normal metabolism of cellular respiration. Studies indicate that the association of DCA with metformin or omeprazole potentiate this effect. Canine mastocytomas are neoplasms originating from mast cells, being quite prevalent among dogs, so the importance of investigating new therapies for this disease. The general objective of this project was to investigate the effect of DCA on canine mast cell tumors, by performing in vitro tests. The treatment with dca DCA was then associated with omeprazole or merformin in canine mastocytoma cell lines. The canine mast cell tumor lines used, grade 2 and 3, were established in the Laboratory of Experimental and Comparative Oncology of FMVZ / USP and were cultured in AIM-V medium.. Treatment with DCA alone was performed with varying concentrations (0,31 mM to 100 mM). The associations were performed with 0,1; 0,5; 1,0; 5, 10 and 20 mM of DCA with 0,02; 0,2 and 2mM of metformin or with 0,02; 0,1 and 0,2 mM of omeprazole. After the treatments, an assay was performed to analyze cell viability using the crystal violet method, with readings at 3 and 5 days. Contrary to our expectations, treatment with dichloroacetate alone or with combinations increased the population of neoplastic cells mainly in the concentrations of 10 and 20mM. In an experiment with three different canine mastocytomas cell lines treated with DCA (10 to 100mM of DCA.), it was found that from 60mM the cell viability was decreased. This effect was intensified with increasing DCA concentrations. We conclude that treatment with DCA alone, at concentrations up to 60mM, or associated with metformin and omeprazole were not effective to decrease the population of canine mast cell tumors of grades 2 and 3 in vitro. The results should be disclosed and will avoid the indiscriminate use of this drug, the consequences of which could be adverse for dogs with mastocytomas.

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-28Bitstream added on 2015-04-09T12:47:46Z : No. of bitstreams: 1 000813877.pdf: 1968360 bytes, checksum: ba893fb51a41ad4d26fafd388f7a43d2 (MD5) / A via PI3K/AKT/mTOR está relacionada com a proliferação, síntese proteica, sobrevivência e motilidade das células. Mutações nesta via tem sido associadas com o processo carcinogênico de diferentes tipos tumorais. Atualmente, inibidores específicos de proteínas como a PI3K, AKT, mTOR, vem sendo testados com o intuito de otimizar a terapia antitumoral em seres humanos e animais. Além de potenciais alvos terapêuticos, o aumento da expressão de algumas destas proteínas tem sido associado a tumores de pior prognóstico em seres humanos. Em cães, o mastocitoma (MCT) é um tumor cutâneo extremamente comum, de comportamento bastante variável e etiologia ainda não esclarecida. Diante disso, o objetivo deste estudo, foi avaliar a imunomarcação dos componentes proteicos da via PI3K/AKT/mTOR, por meio da técnica de imuno-histoquímica e em um segundo momento, associar esses resultados com os parâmetros clínicos dos pacientes, com as características morfológicas e biológicas dos tumores e com o tempo de sobrevida dos pacientes, visando determinar possíveis marcadores prognósticos para esta neoplasia. Para tal 46 MCTs caninos foram utilizados. Todos os tumores apresentaram positividade na avaliação imuno-histoquímica para as proteínas analisadas. As proteínas p-AKT Thr 308 e p-S6K1 apresentaram forte intensidade de imunomarcação, quando comparadas a parâmetros associados a piores prognósticos. Esses resultados indicam que a forte intensidade de imunomarcação de p- AKT Thr 308 e p-S6K1 está relacionada a um pior prognóstico para os cães acometidos pelo MCT cutâneo / The PI3K/AKT/mTOR pathway is related to proliferation, protein synthesis, cell motility and survival. Mutations in this pathway have been associated with the carcinogenic process in diferent tumor types. Currently, specific inhibitors of some proteins such as PI3K, AKT, mTOR, are being tested in order to optimize antitumor therapy in humans and animals. Apart from potential therapeutic targets, increased in immunostaining of some of these proteins have been associated with poorer prognostic in humans tumors. In dogs, mast cell tumor (MCT) is an extremely common skin tumor, which presents a highly variable behavior and unclear etiology. Therefore, the aim of this study was to evaluate the immunostaining of the protein components of PI3K/AKT/mTOR pathway, through the technique of immunohistochemistry, and in a second stage, correlate this results with clinical parameters of patients, with morphological and biological tumor characteristics and the survival time of patients to determine possible prognostic markers for this disease. For this, 46 canine MCTs were used. All tumors were positive in immunohistochemical analysis for the proteins analyzed. Proteins p-AKT Thr 308 and p-S6K1 showed increases in the intensity of immunostaining compared to parameters associated with worse prognosis. These results suggest that the increase in the intensity of immunostaining of p-AKT Thr 308 and p-S6K1 are related to a worse prognosis for dogs affected by cutaneous MCT

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-11Bitstream added on 2014-06-13T20:11:27Z : No. of bitstreams: 1 cesar_jrf_me_jabo.pdf: 550352 bytes, checksum: 1d6db13e1ea88e0f7e6d7733821abce1 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Tendo em vista a relação da cicloxigenase-2 com a progressão do câncer, objetivou-se neste trabalho avaliar a expressão da atividade desta enzima com a imunorreatividade de macrófagos no diagnóstico e prognóstico de mastocitoma canino. Para a realização deste estudo foram selecionadas 24 amostras de mastocitomas e 5 amostras de tecido cutâneo sem alterações patológicas (grupo controle). Os espécimes foram divididos em grupos: GO ¬ grupo controle (n=5), G1 -mastocitomas grau I (n=8) , G2 - mastocitomas grau 11 (n=8), G3 - mastocitomas grau 11I (n=8). A avaliação da expressão da COX-2 e macrófagos foi conduzida por imunoistoquímica, utilizando-se o complexo avidina-biotina (ABC). Os resultados mostraram que os dois anticorpos imunorreagiram com tecidos caninos normais ou neoplásicos. A expressão da COX-2 mostrou marcação crescente, conforme a agressividade do tumor e houve significância (P<O,05) entre os grupos GO e G1; GO e G2; GO e G3; G1 e G3. A imunomarcação de macrófagos foi decrescente em relação à gradação histológica e-houve significância (P<O,05) entre os grupos GO e G1; GO e G2; GO e G3; G1 e G3; G2 e G3. Assim como a expressão de macrófagos, a sobrevida dos animais foi decrescente em relação ao grau de malignidade do tumor e inversamente proporcional a marcação de COX-2. / Considering the relationship between cyclooxygenase-2 (COX-2) with the cancer evolution, this study aimed to assessment the expression of this enzyme with the immunoreactive of macrophage in the diagnosis and prognostic of canine mast cell tumor. Twenty four mast cell tumors samples were selected for the accomplishment of this study and tive samples of normal skin tissue (control group - GO). The samples were divided in groups: GO ¬ control group (n=5), G1 - mastocytoma grade I (n=8), G2 - mastocytoma grade 11 (n=8), G3 - mastocytoma grade 11I (n=8). The evaluation of the COX-2 and macrophage expression was achieved by immunohistochemistry, by means of complex avidine-biotine (ABC). The COX-2 expression increased, as the tumor grade progression; moreover. it had relevancy (P<O,05) among the groups: GO and G1, GO and G2, GO and G3, G1 and G3. The macrophage immunoreactive was decreased in relation of histological grade and it had a relevancy (P<O,05) among the groups: GO and G1, GO and G2. GO and G3. G1 and G3, G2 and G3. As macrophage expression, animal survival was decreased in relation of the histological grade of tumor and proportional reversed COX-2 expression.

Orientadores: Konradin Metze, Randall Luis Adam / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T05:29:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Elston_LilianBarreto_D.pdf: 2689434 bytes, checksum: 2eeb1a5a1e47810949c3286be8cd9633 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O sistema de graduação histológica desenvolvido por Patnaik et al. (1984), provou ser de relevância prognóstica nos Mastocitomas Cutâneos Caninos (MCC). Os parâmetros subjetivos utilizados em sua graduação têm levado patologistas veterinários a conferir diferentes graus a uma mesma amostra. Este fato pode refletir negativamente no estabelecimento do protocolo terapêutico baseado em tal método. A ampliação das possibilidades de ferramentas prognósticas objetivas pode auxiliar a diminuir o problema da concordância da graduação. Este estudo tem por objetivo calcular a concordância entre observadores no processo de graduação, estabelecer quais os parâmetros são de relevância prognóstica, desenvolver nova técnica simplificada de graduação baseada em parâmetros histológicos de concordância adequada, e estabelecer a relevância prognóstica das variáveis de sociologia celular como ferramenta prognóstica objetiva e confiável. Grau de Patnaik, parâmetros histológicos e o coeficiente kappa livre de margens foram calculados para cada uma das amostras dos 81 cães de diferentes raças, sexo, e idade. De 56 destas amostras foram obtidos dados quanto à sobrevida e, de suas lâminas histológicas, foram adquiridas imagens digitalizadas para fins de análise sintática estrutural (ASE). ASE das amostras, mediante construção de grafos como Mosaico Voronoi (MV), Triangulação Delaunay (TD) e Árvore Geradora Mínima (AGM), foi automaticamente realizada pelo programa "Sociology" desenvolvido pelo Dr. Randall Luiz Adam. Nossos resultados confirmaram a fraca concordância do método de Patnaik para graduação dos MCCs por três experimentados patologistas veterinários (Kfree=0,28). A avaliação mitótica (quanto maior o seu número pior o prognóstico) e a granulação intracitoplasmática (quanto mais granulação melhor o prognóstico) revelaram-se como variáveis independentes de relevância prognóstica (B=0.760 e -0,989; p=0,045 e 0,014 respectivamente) e com razoável concordância (Kfree?0,35), quando todas as variáveis relevantes (p?0,05) quanto à sobrevida e de razoável concordância foram submetidas à análise multivariada pela Regressão de Cox. Deste modo, desenvolveu-se um método simples, sob a forma de escore o qual variava de -2 a +2 (porquanto a granulação tem caráter protetor sendo B = - 0,989) e se mostrava estatisticamente significativo para sobrevida (p?0,004). Por outro lado, o estudo da sociologia celular revelou que, os coeficientes de variação (CV) do perímetro, da esfericidade e da área dos polígonos do MV (p=0.029, p=0,028 e p= 0,031 respectivamente), o CV dos ângulos máximos dos triângulos da TD (p=0,026), provaram ser variáveis objetivas significativas, indicando a relação entre desordem arquitetural e malignidade. Desta forma o estudo matemático da arquitetura tissular de MCCs revelou-se como uma nova e promissora ferramenta na avaliação prognóstica de MCCs. / Abstract: Histological based grading system developed by Patnaik et al. (1984) has proved to be of prognostic relevance in Cutaneous Mast cell tumors (CMC). The subjective histological parameters used in grading may lead different veterinary pathologists to access different grade for the same MCC, this fact may negatively reflect in the treatment protocol based on this grading system. Disclosing new objective prognostic tools may help to minimize the problem of grading. The aim of this study is to calculate interobserver agreement in the grading process, to establish which histological parameters are of prognostic relevance, to reveal a novel simplified prognostic technique based on these parameters and to establish the prognostic relevance of cellular sociology parameters as an objective prognostic tool. Patnaik's grade, histological parameters and the Kappa free coefficient were calculate for each one of eighty-one dogs from different breeds, sex, and ages. From 56 with defined survival time we achieved digitalized images with cellular sociology purposes. The "Sociology" software then performed syntactic Structural Analysis (SSA) with Voronoi Tessellation (VT), Delaunay Triangulation (DT) and Minimum Spanning Tree (MST). Our results statistically confirmed the poor interobserver agreement in the MCC grading (Kfree= 0,28). When all agreement and prognostic relevant parameters were submitted to multivariate analyses with Cox regression, mitotic evaluation and intracitoplasmatic granulation showed to be independents parameters with prognostic relevance (B= 0,760 e -0,989; p= 0,045 and p=0,014) and with reasonable agreement (Kfree<0,35). We performed a score that varies from -2 to +2 (since granulation is a protective one) with these two relevant parameters. This new simple score system significantly correlated to survival (p ? 0,004). In the other hand, the prognostic relevance of cellular sociology, reveals that coefficient of variation (CV) of perimeter, area and roundness from Voronoi polygons (p=0,029; 0,031; 0,028 respectively) and CV of maximum angle of DTs (p=0,026) are significant objective parameters. These findings indicated the relationship between structural disorder and malignancy of MCTs and pointed out SSA as a new reliable tool to prognosticate MCTs. / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

O mastocitoma é o tumor cutâneo mais comum dos cães, representando 7% a 21% dos tumores da pele e tecidos moles, 11% a 27% dos tumores malignos cutâneos nessa espécie. Eles possuem uma grande variedade de aparência e comportamento, o qual o torna um desafio seu tratamento. Os retinóides são uma promessa na luta contra o câncer. Entretanto, há poucos estudos sobre os efeitos dos retinóides em neoplasias caninas. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar a cultura primária de mastocitomas caninos assim como investigar a quimiosensibilidade deste tumor ao ácido retinóico todo-trans (ATRA). A cultura primária de mastocitomas caninos foi realizada em co-cultivo com fibroblastos, que demonstrou uma interação favorável entre mastócitos e fibroblastos, com uma sobrevida média de 30 dias. A quimiosensibilidade dos mastocitomas caninos ao ATRA não mostrou diferenças entre os graus de mastocitomas, ou seja, tanto um mastocitoma grau II ou III respondem igualmente ao ATRA nas doses estudadas. Foi constatado também que o mastocitoma é mais sensível na concentração 10-4M de ATRA (p < 0,002). Existe também um efeito já nas primeiras 24h, mas esse não se altera em 48h, entretanto se intensifica após 72h. Podemos inferir, então, que a maior quimiosensibilidade de mastocitomas caninos ao ATRA se dá após 72h de exposição na dose de 10-4M. Podemos concluir que o ATRA apresenta efeitos sobre as células de mastocitomas caninos e pode ser usado como potencial adjuvante no tratamento desta neoplasia. / Mast cell tumor (MCT) is one of the most frequent neoplasms that affect the skin and soft tissue of the dog, representing about 7% a 21% of all skin tumors and 11% a 27% of malignant skin tumors in this specie. They present a great variety of appearance and behavior, which becomes a challenge to the treatment. The retinoids are well recognized as promising antitumor agents. However, there have only been a few reports about the effect of retinoids in canine cancers. The aim of this study was to characterize the primary mast cell tumor culture and to investigate the chemosensitivity of this tumor to all trans retinoic acid (ATRA). The primary cell culture of MCT was performed as co-cultive with fibroblasts, showing a positive interaction between mast cells and fibroblasts, with a lifetime of 30 days. The chemosensitivity of MCT to ATRA showed no difference between grade II or III, thus either a MCT grade II or grade III has the same response with ATRA at the doses studied. It has been shown that the MCT is more sensible at the dose 10-4M (p < 0,002). There is also an effect on first 24h untill 48h, changing after 72h. According to these results, it is possible to state that the great chemosensitivity of MCT to ATRA is after 72h of exposition at 10-4M. We can conclude that ATRA may be a potential adjunctive chemotherapeutic agent for the treatment of canine mast cell tumor.

O mastocitoma é o tumor cutâneo mais comum dos cães, representando 7% a 21% dos tumores da pele e tecidos moles, 11% a 27% dos tumores malignos cutâneos nessa espécie. Eles possuem uma grande variedade de aparência e comportamento, o qual o torna um desafio seu tratamento. Os retinóides são uma promessa na luta contra o câncer. Entretanto, há poucos estudos sobre os efeitos dos retinóides em neoplasias caninas. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar a cultura primária de mastocitomas caninos assim como investigar a quimiosensibilidade deste tumor ao ácido retinóico todo-trans (ATRA). A cultura primária de mastocitomas caninos foi realizada em co-cultivo com fibroblastos, que demonstrou uma interação favorável entre mastócitos e fibroblastos, com uma sobrevida média de 30 dias. A quimiosensibilidade dos mastocitomas caninos ao ATRA não mostrou diferenças entre os graus de mastocitomas, ou seja, tanto um mastocitoma grau II ou III respondem igualmente ao ATRA nas doses estudadas. Foi constatado também que o mastocitoma é mais sensível na concentração 10-4M de ATRA (p < 0,002). Existe também um efeito já nas primeiras 24h, mas esse não se altera em 48h, entretanto se intensifica após 72h. Podemos inferir, então, que a maior quimiosensibilidade de mastocitomas caninos ao ATRA se dá após 72h de exposição na dose de 10-4M. Podemos concluir que o ATRA apresenta efeitos sobre as células de mastocitomas caninos e pode ser usado como potencial adjuvante no tratamento desta neoplasia. / Mast cell tumor (MCT) is one of the most frequent neoplasms that affect the skin and soft tissue of the dog, representing about 7% a 21% of all skin tumors and 11% a 27% of malignant skin tumors in this specie. They present a great variety of appearance and behavior, which becomes a challenge to the treatment. The retinoids are well recognized as promising antitumor agents. However, there have only been a few reports about the effect of retinoids in canine cancers. The aim of this study was to characterize the primary mast cell tumor culture and to investigate the chemosensitivity of this tumor to all trans retinoic acid (ATRA). The primary cell culture of MCT was performed as co-cultive with fibroblasts, showing a positive interaction between mast cells and fibroblasts, with a lifetime of 30 days. The chemosensitivity of MCT to ATRA showed no difference between grade II or III, thus either a MCT grade II or grade III has the same response with ATRA at the doses studied. It has been shown that the MCT is more sensible at the dose 10-4M (p < 0,002). There is also an effect on first 24h untill 48h, changing after 72h. According to these results, it is possible to state that the great chemosensitivity of MCT to ATRA is after 72h of exposition at 10-4M. We can conclude that ATRA may be a potential adjunctive chemotherapeutic agent for the treatment of canine mast cell tumor.