Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2209.pdf: 3433970 bytes, checksum: f1696bf3d4dba44ef3cb8eb1b129cdf5 (MD5) Previous issue date: 2008-10-11 / Financiadora de Estudos e Projetos / This work describes the investigation of part of the secondary metabolism of actinomicete Streptomyces clavuligerus and endophytic filamentous fungus Penicillium sp isolated from Murraya paniculata; Penicillium brasilianum and Aspergillus aculeatus isolated from Melia azedarach and Penicillium griseoroseum isolated from the grains of Coffea arabica. Preliminary tests were realized to define the best composition of medium culture and the best condition of cultivation Streptomyces clavuligerus. On the other hand, the endophytic fungus were cultivated in rice and Czapec´k (medium liquid). The anthranilic acid and the 7-hydroxy-2- methyl-chromone were identified from the extracts of S. clavuligerus by spectroscopic methods 1D e 2D NMR and mass spectrometry. Methodologies of analysis for detection of β-lactam antibiotics were developed by liquid chromatography combined with mass spectrometry. The identification was based on studies of standard compounds and comparison with literature data. These methodologies were efficient in the analysis of this type of substances and they allowed the detection and identification of β-lactam antibiotics such as the penicillin N, the cephamycin C, deacetoxy-cephalosporin C and the clavulanic acid in small amounts in S. clavuligerus the extracts. In the endophytic fungus extracts were possible to identify the 6-aminopenicillanic acid, precursor of the penicillin G and metabolites no β-lactams as nucleotides thymine and adenine. / Este trabalho descreve a investigação química de uma parte do metabolismo secundário do actinomiceto Streptomyces clavuligerus e dos fungos endofíticos filamentosos Penicillium s.p isolado de Murraya paniculata; Penicillium brasilianum e Aspergillus aculeatus isolados de Melia azedarach e Penicillium griseoroseum isolado dos grãos de Coffea arabica. Inicialmente, foram realizados testes preliminares para definir a melhor composição do meio de cultura e as melhores condições de cultivo para Streptomyces clavuligerus, já os fungos endofíticos foram cultivados em arroz e em meio líquido Czapec k. Dos extratos de S. clavuligerus foram identificados, por métodos espectroscópicos de RMN 1D e 2D e espectrometria de massas, o ácido antranílico e a 7-hidroxi-2-metilcromona. Com o objetivo de determinar a presença de antibióticos β-lactâmicos e outros metabólitos nos extratos foram desenvolvidas metodologias de detecção por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas. A identificação das substâncias foi feita com base no estudo de padrões comerciais e levantamento bibliográfico. Estas metodologias se mostraram eficientes na análise deste tipo de substâncias e permitiu a detecção de antibióticos β-lactâmicos como a penicilina N, a cefamicina C, a deacetoxicefalosporina C e o ácido clavulânico nos extratos de S. clavuligerus. Estas metodologias foram aplicadas nas análises dos extratos fúngicos onde foi identificado o ácido 6-aminopenicilânico, precursor da penicilina G e metabólitos não β-lactâmicos como os nucleotídeos timina e adenosina.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-08-17Bitstream added on 2014-06-13T20:26:07Z : No. of bitstreams: 1 cafeu_mc_dr_araiq.pdf: 2687839 bytes, checksum: 6f78bffb8a9f427b48e9b75f8cda9db6 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Este trabalho descreve a triagem de 21 fungos endofíticos associados a espécies vegetais de Cerrado e Mata Atlântica. Os extratos brutos fornecidos por estes fungos foram avaliados quimicamente (CLAE e RMN1H) e submetidos a bioensaios para avaliação da potencialidade antifúngica, antioxidante e anticolinesterásica, onde se mostraram promissores. Após esta triagem, os fungos Xylaria sp. E Colletotrichum crassipes, associados a Casearia sylvestris, foram selecionados para o estudo químico/biológico. Estes fungos foram cultivados nos meios líquido (MDB) e sólido (milho) para obtenção dos extratos brutos. O extrato bruto de Xylaria sp. em milho foi submetido a fracionamento cromatográfico e levou ao isolamento da griseofulvina, 7-desclorogriseofulvina e citocalasina B, enquanto que o extrato obtido do meio líquido conduziu ao isolamento da citocalasina D, citocalasina C e 5-carbóxi-6-hidroxi-3-metil-3,4- diidroisocumarina. Após fracionamento do extrato bruto do endófito C. crassipes no meio líquido MDB foram isoladas 8 substâncias da classe de dicetopiperazinas, N-(2-feniletil)acetamida, tirosol e as substâncias inéditas 1-hidroxi-1-feniletil-tirosol e (6-metil-3- (feniletóxi)-1,4-dioxan-2-il)metanol. Algumas substâncias puras foram submetidas à bioensaios e apresentaram potencial bioatividade frente aos fungos fitopatogênicos Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum e nos ensaios antioxidante e anticolinesterásico. As citocalasinas D e B isoladas durante este trabalho e outras 5 citocalasinas isoladas anteriormente foram submetidas à avaliação da citotoxicidade utilizando linhagens de células de adenocarcinoma murino e se mostraram muito ativas. Os fungos endofíticos Xylaria sp. e C. crassipes foram utilizados em biotransformação do substrato 4-etilciclohexanona. Este experimento foi realizado através do cultivo... / This work describes the screening of 21 endophytic fungi from plant species from Cerrado and Atlantic Forest. The crude extracts produced by these fungi after fermentation in potato dextrose broth (PDB) were evaluated by HPLC, 1HNMR and potential biological activities: antifungal, antioxidant and anticholinesterasic. After screening, the extracts of Xylaria sp. and Colletotrichum crassipes, isolated from Casearia sylvestris, were selected, based on the chemical/biological results. These endophytic fungi were cultivated in PDB and corn for crude extract preparation. The crude corn extract of Xylaria sp. led to isolation of griseofulvin, 7- dechlorogriseofulvin and cytochalasin B while the crude PDB extract led to isolation of cytochalasin C, cytochalasin D and 5-carboxy-6- hidroxy-3-methyl-3,4-dihydroisocoumarin. The crude PDB extract of Colletotrichum crassipes led to isolation of eight diketopiperazines, N-(2-phenylethyl)acetamide, tyrosol, 1-hidroxy-1- phenylethyl-tyrosol and (6-methyl-3-(phenethyloxy)-1,4-dioxan-2- yl)methanol. The some of them pure compounds showed potential antifungal activity against Cladosporium cladosporioides and C. sphaeropermum, antioxidant and anticholinesterasic activities. The Cytochalasins D and B, isolated in this work, and other five cytochalasins produced by Xylaria sp.1 showed potential activity for cytotoxic activity against adenocarcinomatous murine cells. The fungi Xylaria sp. and C. crassipes were evaluated as biocatalysts for biotransformation of 4-ethylcyclohexanone. Four biotransformation products were isolated. Their structures were established by spectroscopic methods, including the application of bidimensional NMR techniques and comparison with published data.

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-13. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:46:54Z : No. of bitstreams: 1 000830316.pdf: 480896 bytes, checksum: a5e41f1e33eaed9c3e07df80b06f7e3a (MD5) / Este trabalho está dividido em três artigos no formato para a submissão e publicação. No primeiro, testamos níveis de carboidratos (CHO) associados ao jejum e realimentação como estratégia de induzir as vias catabólicas e anabólicas dos diferentes nutrientes e auxiliar no entendimento da intolerância dos peixes aos CHOs; no segundo, avaliamos o uso da amônia sérica como indicador de dietas desbalanceadas; e, ainda, no terceiro artigo avaliamos como o jejum afeta a imunidade e a estratégia metabólica adotada pelos peixes para sustentar a resposta imune em condições de déficit energético. Os resultados indicam que o pacu pode tolerar altos níveis de CHO, uma vez que os valores de glicemia e glicogênio hepático foram semelhantes entre os peixes que ingeriram 25 e 45% CHO, além de suportar longos períodos de jejum (30 dias), sem comprometer a capacidade de resposta de ganho em peso. Entretanto, 25% CHO resultou em menor acúmulo de lipídeo visceral, associado com maior lipólise (mais ácidos graxos livres circulantes) e menores níveis de triglicerídeo e colesterol circulantes após 30 dias de alimentação. Após 30 dias de jejum, os peixes consumiram as reservas energéticas avaliadas, mas após um dia de re-alimentação, apenas as reservas de glicogênio e os níveis circulantes de triglicerídeo e colesterol normalizaram, enquanto as reservas lipídicas teciduais foram restauradas ao final dos 30 dias de realimentação. As atividades da hexoquinase (HK), glicoquinase (GK), glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH) e aspartato aminotransferase (AST) acompanharam o perfil das variáveis metabólicas, reforçando que o pacu é capaz de usar altos níveis de CHO e ajustar seu metabolismo para suportar longos períodos de jejum. Como foram utilizadas duas dietas, uma balanceada em proteína e energia (45% CHO), e outra desbalanceada (25% CHO), testamos a determinação da concentração da amônia plasmática para validar ... / This study is divided in three papers formatted to be submitted and publishing. In the first one, we tested carbohydrate (CHO) levels associated to fasting and refeeding as strategy to induce catabolic and anabolic pathways of different nutrients and assist in understanding of CHO intolerance in fish; in the second, we evaluated the serum ammonia as indicator of unbalanced diets utilization; and also, in a third paper, we evaluated how fasting affect the fish immunity and the metabolic strategies adopted by fish to sustain the immune response under energy deficit conditions. The results indicate pacu use efficiently high CHO levels, once values of blood glucose and liver glycogen were similar between fish fed with 25 and 45% CHO, besides this, pacu tolerates long-term fasting (30 days), without compromise the ability of weight gain response. However, 25% CHO resulted in lower mesenteric fat accumulation and higher lipolysis (more current non-esterified fatty acids) and lower levels of triglycerides and cholesterol after 30 days feeding. After 30 days fasting, fish consumed the evaluated energy reserves, but after one day re-feeding, only reserves of liver glycogen, triglycerides and cholesterol normalized, while the tissue lipid reserves were reestablished at the end of 30 days re-feeding. The hexokinase (HK), glucokinase (GK), glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) and aspartate aminotransferase (AST) follow the metabolic variables profile, reinforcing that pacu is able to use high CHO levels and adjust their metabolism to tolerate long-term fasting. As we used two diets with different protein/energy ratio, we tested the serum ammonia determination to validate the use of this parameter as indicator of unbalanced diets utilization in pacu. The AST activity was used to prove the occurrence of protein catabolism after feeding fish during 30 days with both diets. At the end of period, we observed increasing in serum ammonia and AST ...

Made available in DSpace on 2015-07-13T12:10:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-01-16. Added 1 bitstream(s) on 2015-07-13T12:25:36Z : No. of bitstreams: 1 000825405_20160116.pdf: 75183 bytes, checksum: 1620844b396df598ded4ccaf7402128d (MD5) Bitstreams deleted on 2016-01-18T10:44:03Z: 000825405_20160116.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-01-18T10:44:40Z : No. of bitstreams: 1 000825405.pdf: 1100346 bytes, checksum: 4c2e45a0432afa746a7d8719d85f12ac (MD5) / Streptomyces clavuligerus é uma espécie produtora de múltiplos metabólitos secundários de interesse terapêutico: ácido clavulânico, um potente inibidor de beta-lactamases, e outras vinte clavamas, várias delas com atividade antifúngica; cefamicina C, um antibiótico beta-lactâmico usado para produzir vários antibióticos semissintéticos com ação contra bactérias anaeróbias; tunicamicina, uma mistura de homólogos de nucleosídeos inibidores da glicosilação de proteínas em procariotos e eucariotos; holomicina, uma ditiolopirrolona com atividades bacteriostática e citotóxica em mamíferos. Neste projeto foram estudadas as linhagens de S. clavuligerus ATCC 27064 (selvagem) e Hol.80 (mutante) em cultivos submersos. Os dados experimentais dos cultivos foram utilizados para análise cinética, na qual foram determinados parâmetros cinéticos e coeficientes de rendimento, e para simulação de distribuição de fluxos metabólicos, empregando-se modelo metabólico previamente construído em Tese de Doutorado e com o auxílio de programa computacional designado para esta finalidade. Cultivos da linhagem selvagem em biorreator convencional operado em batelada utilizando-se a combinação de maltose e lisina resultaram em produções de cefamicina C e ácido clavulânico de, respectivamente, 90 e 100 mgL-1, sem produção de holomicina. Sob mesmas condições, a linhagem mutante produziu 50 e 60 mgL-1 de cefamicina C e holomicina, respectivamente. Por outro lado, a combinação maltose, lisina e glutamato estimulou a produção de holomicina pela linhagem selvagem (95 a 110 mgL-1) e reduziu a produção tanto de cefamicina C como de ácido clavulânico em cerca de 65%. O mutante cultivado neste mesmo meio produziu cerca de 120 mgL-1 de cefamicina C e 75 mgL-1 de holomicina, com produção desprezível de ácido clavulânico. Estes resultados mostraram que diferentes fontes de... / Streptomyces clavuligerus is a species that produces multiple secondary metabolites of therapeutic interest: clavulanic acid, a potent inhibitor of beta-lactamases, and other twenty clavams, several of them with antifungal activity; cephamycin C, a beta-lactam antibiotic used to produce various semi synthetic antibiotics with activity against anaerobic bacteria; tunicamycin, a mixture of homologues nucleoside that inhibits protein glycosylation in prokaryotes and eukaryotes; holomycin, a dithiolopyrrolone with bacteriostatic and cytotoxic activities in mammals. In this project we compared the behavior of strains ATCC 27064 of S. clavuligerus and Hol.80 mutant, non producer of clavulanic acid in submerged cultures. Kinetic parameters and yield coefficients were determined. The experimental data of the cultures were used to simulate the metabolic fluxes distribution for each strain. It was employed a metabolic model previously built up in a Doctoral Thesis and the simulation was carried on with the aid of a computer program designed for this purpose. Batch cultivations with the wild strain in conventional bioreactor using a combination of maltose and lysine resulted in a production of 90 mgL-1 of cephamycin C and 100 mgL-1 of clavulanic acid, without holomycin production. At same conditions, the mutant produced 50 and 60 mgL-1 of cephamycin C and holomycin, respectively. The same combination (maltose and lysine) supplemented with glutamate stimulated the production of holomycin by the wild strain (95 to 110 mgL-1), with a production of cephamycin C and clavulanic acid 65% lower. The mutant produced in the same medium approximately 120 mgL-1 of cephamycin C and 75 mgL-1 of holomycin. These results showed that different nitrogen sources promote the production of various bioactives. The most significant data obtained from the model simulations indicated that the holomycin biosynthesis...

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-03Bitstream added on 2014-11-10T11:57:26Z : No. of bitstreams: 1 000791226.pdf: 1902973 bytes, checksum: 9927a38cc35b88c72a4837a5f9faedd4 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A utilização do praguicida Diuron na agricultura e a sua metabolização no ambiente em compostos potencialmente tóxicos pode comprometer a saúde dos ecossistemas aquáticos e de organismos não alvo ali presentes. O objetivo principal deste estudo avaliou se os metabólitos 3-(3,4-diclorofenil)-3-metilureia (DCPMU), o 3,4-diclorofenilureia (DCPU) e o 3,4- dicloroanilina (DCA) gerados a partir da biotransformação do diuron, geram mais ou menos efeitos que o próprio diuron em parâmetros genotóxicos e bioquímicos em peixes Astyanax sp. Foram realizados testes de toxicidade com o diuron e os metabólitos a fim de obter a CL50 de cada composto. Foi visto que o diuron e o DCA possuem semelhante toxicidade a lambaris, uma vez que seus valores de CL50 foram muito próximos (0,75 e 0,89 mg/L, respectivamente). O valor de CL50 para o DCPMU foi duas vezes maior (1,42 mg/L) e para o DCPU foi de três vezes maior que a do diuron (>3,0 mg/L), o que indica ser o metabólito de menor potencial tóxico. A partir do valor de CL50, realizou-se a exposição dos lambaris a concentrações subletais (CL1= 0,015 mg/L e CL10=0,15 mg/L do diuron) por dois e sete dias para avaliar os parâmetros bioquímicos e genotóxicos desses compostos. A genotoxicidade foi avaliada pelo método do cometa e foi visto que a metabolização do diuron não minimiza os efeitos genotóxicos em lambaris uma vez que os metabólitos DCA, DCPMU e DCPU são capazes de causar lesões no DNA dos peixes. Parâmetros bioquímicos foram avaliados pela medida da atividade de enzimas de biotransformação (EROD e GST), de defesa antioxidante (SOD, GPx e CAT) e ocorrência de peroxidação lipídica (MDA). A atividade da EROD aumentou pela exposição dos lambaris aos três metabólitos em brânquias e fígados. A GST foi inibida pela exposição ao DCA, nas brânquias e pela exposição ao DCPMU e DCPU em brânquias e fígado. A atividade da GST aumentou no fígado de lambaris expostos ao ... / Diuron is a pesticide used in the agriculture and its transformation in potential toxic compounds can be harmful to aquatic ecosystem and animals. This work had as main objective discover if the metabolites 3-(3,4-dichlorophenyl)-3-methylurea (DCPMU), 3,4- dichlorofhenylurea (DCPU) and 3,4-dichloroaniline (DCA) produced in the diuron degradation may cause more or less effects than the pesticide in genotoxic and biochemistry parameters in fish. Toxicity tests were performed with the diuron and its metabolites to obtain the LC50. We observed that the diuron and the DCA have similar toxicity to fish observed by the low values of LC50. The DCPMU LC50 is twice higher and DCPU is three times higher than diuron and DCA. It indicating that these metabolites can be less toxic than the others compounds. From LC50 values, fish exposures were performed at LC1 (0.015 mg/L) and LC10 (0.15 mg/L) of diuron concentration by two and seven days. The genotoxicity was measured by comet assay and we observed that the degradation of diuron increase the genotoxic effects, whereas the DCA, DCPMU and DCPU are able to promote DNA damage. Biochemistry parameters were measured by analysis of biotransformation enzymes (EROD and GST), antioxidant defenses (SOD, GPx and CAT) and lipid peroxidation (MDA). EROD activity is increased after all metabolites exposure in both tissues. GST activity is inhibited after DCA gill exposure and DCPMU and DCPU gill and liver exposures. GST activity also is increased after DCA exposure in liver. SOD is induced in all metabolites treatment and GPx to DCPMU and DCPU exposure. CAT activity is increased after DCA exposure and it is inhibited after DCPMU and DCPU exposures in both tissues. CAT is also inhibited after diuron exposure in the liver. The exposure of diuron and its three main metabolites can change biochemistry parameters indicators of oxidative stress in Astyanax sp. in the conditions tested in this study. In general, the ...

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-03-13T19:56:49Z No. of bitstreams: 1 2016_RodrigoTheodoroRocha.pdf: 3894776 bytes, checksum: 1c81a5970509cf6762b3a7714e52434c (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-03-28T16:39:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_RodrigoTheodoroRocha.pdf: 3894776 bytes, checksum: 1c81a5970509cf6762b3a7714e52434c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-28T16:39:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_RodrigoTheodoroRocha.pdf: 3894776 bytes, checksum: 1c81a5970509cf6762b3a7714e52434c (MD5) / Metabólitos secundários (MS) são moléculas heterogêneas de baixo peso molecular e, alternativamente aos metabólitos primários, não estão diretamente envolvidas no crescimento do organismo que as produz. Entre os microrganismos produtores de MS destacam-se os fungos filamentosos do gênero Aspergillus, abrangendo diversas espécies com estilos de vida variados e produzindo inúmeros compostos de importância para os homens, animais e plantas. A espécie A. terreus é produtora de diversos MS, entre eles destaca-se a lovastatina, fármaco da classe das estatinas, que são mundialmente utilizadas para a redução dos níveis de colesterol. Visando a bioprospecção de cepas de A. terreus produtoras de lovastatina utilizamos a genômica comparativa para detalhar a estrutura e variabilidade dos genes responsáveis por sua biossíntese. Oito cepas de A. terreus isoladas no Brasil foram submetidas a sequenciamento de segunda geração utilizando a plataforma Illumina. Os dados resultantes foram mapeamentos contra o genoma de referência da espécie (cepa NIH 2624) e observou-se uma conservação de 86% de todo genoma entre as cepas. No entanto, grandes regiões com tamanho maior que 10 kb apresentaram cobertura anômala, e posteriormente verificou-se que se tratava de variantes estruturais (grandes indels) nos genomas das cepas, inclusive no agrupamento gênico de biossíntese (BCG) de lovastatina. As variantes estruturais dentro deste loco foram validadas experimentalmente via ensaios de PCR e a ausência de genes essenciais à biossíntese da lovastatina explica o fenótipo não produtor em algumas cepas. A observação variabilidade genômica entre as cepas motivou o desenvolvimento de uma nova metodologia para detecção de BCGs em geral. Esta baseia-se na estrutura de grafos de Bruijn coloridos e pode ser aplicada diretamente nos dados brutos de sequenciamento, sem necessitar montagens genômicas de alta qualidade. Com esta abordagem foi possível identificar os limites gênicos dos agrupamentos de biossíntese dos metabólitos acetilaranotina, terretonina e outros. As análises de genômica comparativa neste estudo apontam as relevantes diferenças na composição gênica de indivíduos da mesma espécie, as quais podem ser correlacionadas com fenótipos de interesse biotecnológico. Ademais, ressaltam a complexa história evolutiva dos fungos e a plasticidade de seus genomas. Assim como acontece em muitos procariotos, os genomas dos fungos filamentosos devem ser representados por um pan-genoma. / Secondary metabolites (SM) are a heterogeneous class of low molecular weight compounds not directly involved in the growth of the producing organism. Among the SM producing microorganisms stands out the genus Aspergillus, a diverse group of filamentous fungi of medical and biotechnological relevance. The species A. terreus is known to produce several metabolites, noticeably lovastatin, belonging to the statins class with worldwide application as cholesterol lowering drugs. Aiming at the bioprospection of lovastatin producing strains we employed a comparative genomics study to pinpoint the structure and variability of the genes involved in its biosynthesis. Eight A. terreus strains, isolated in different locations, were sequenced by second generation genome sequencing platform Illumina. The resulting reads were mapped against the reference genome of A. terreus (strain NIH 2624) unveiling a 86% genome-wide conservation between the strains. However, large blocks spanning over 10 kb showed anomalous mapping coverage depth, and further analyses showed that these were structural variants (large indels) occurring in the genome of the strains. Strikingly, some strains exhibited structural variations in the lovastatin biosynthetic gene cluster (BCG), further validated by PCR assays, which offers a plausible explanation for the non-producing phenotype observed in some strains. The observation of strain-specific genome variation prompted the development of a new BCG detection methodology based on colored de Bruijn graphs and directly applied to raw sequencing data without the necessity of a high quality reference genome. This approach uncovered the presence and the gene boundaries of several BCGs in our study, such as the biosynthetic clusters for the metabolites acetilranotin, terretonin and others. The comparative genomic analyses in this study highlight the gene composition differences among individuals of the same species and the correlation with biotechnological relevant phenotypes. Moreover, underlies the complex fungal evolutive pathways and the plasticity of microbial genomes.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa De Pós-Graduação Em Ciências Médicas, Université Des Antilles Et de La Guyane, École Doctorale Santé, Environnement Et Sociétés Dans Les Amériques, 2014. / Orientador em co-tutela: Dr. Didier Stien. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-06-24T17:07:12Z No. of bitstreams: 1 2014_ThiagoMeirellesCasella.pdf: 5683604 bytes, checksum: 8180115a6e697860a1f952637c723f3c (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-06-26T13:00:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_ThiagoMeirellesCasella.pdf: 5683604 bytes, checksum: 8180115a6e697860a1f952637c723f3c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-26T13:00:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_ThiagoMeirellesCasella.pdf: 5683604 bytes, checksum: 8180115a6e697860a1f952637c723f3c (MD5) / Devido à natureza simbiótica dos micro-organismos endofíticos, este estudo teve como objetivo investigar a atividade antibacteriana, antifúngica e citotóxica em metabólitos secundários de extratos de fungos endofíticos foliares de plantas do bioma Amazônia e Cerrado. Neste trabalho de tese foram isolados 147 micro-organismos cultiváveis (130 fungos, 3 bactérias e 14 fungos não-identificados ou desconhecidos) a partir de 28 plantas (4 espécies coletadas no Brasil e 24 na Guiana Francesa). Todos os micro-organismos foram identificados por análise molecular de regiões específicas de DNAr, com uso de técnicas de sequenciamento genômico. Fungos endofíticos da ordem Xylariales foram os de maior frequência de isolamento neste estudo, representados por 25 isolados. Extratos brutos em AcOEt foram produzidos a partir de culturas de cada micro-organismo isolado. Uma proporção relativa significante (23,1%) dos extratos demonstrou atividade em Candida albicans ATCC 10213, enquanto 4% foram ativos em Staphylococcus aureus ATCC 29213. O potencial citotóxico dos extratos foi avaliado para as linhagens celulares humanas KB (carcinoma cervical uterino), MDA-MB-435 (melanoma), e MRC-5 (fibroblastos de pulmão normal), resultando em proporção significante com atividade de inibição da proliferação celular (24,4%, 23,1% e 16,3%, respectivamente). Dezoito metabólitos secundários foram isolados a partir do fracionamento de oito extratos brutos endofíticos. Dezessete destas substâncias já tinham sido descritas anteriormente na literatura: ácido pilifórmico (24) e griseofulvina (25) isoladas de Xylaria cubensis SNB-GCI02; phomopirona A (26), pyrenocina A (27), alterperilenol (28) e novae-zelandina A (29) isoladas de Lewia infectoria SNB-GTC2402; 5-metilmelleina (31) e Dihidrosporothriolida (32) isoladas de Xylaria sp. SNB-GTC2501; mycoleptodiscina A (34) e mycoleptodiscina B (35) isoladas de Mycoleptodiscus sp. SNB-GTC2304; mycoepoxidieno (36) e altiloxina A (37) isoladas de Diaporthe pseudomangiferae SNB-GSS10; acremonisol A (40), semicochliodinol A (41) e cochliodinol (42) isoladas de Chaetomium globosum SNB-GTC2114; colletofragarona A2 (43) isolada de Colletotrichum sp. SNB-GTC0201; flavoglaucina (44) isolada de Eurotium rubrum BBS01. Dentre estas substâncias, a flavoglaucina (44) isolada de E. rubrum BBS01, demonstrou atividade comparável ao controle fluconazol em C. albicans (CIM de 4 μg.mL-1). Esta substância (44) apresentou IC50 >10 μM em células normais MRC-5, tornando-se candidata para estudos posteriores. Neste trabalho foi identificado pela primeira vez a atividade citotóxica da colletofragarona A2 (43), isolada de Colletotrichum sp. SNB-GTC0201. A substância inédita nomeada pyrrocidina C (30) foi isolada a partir de L. infectoria SNB-GTC2402 e identificada através de análises espectroscópicas (Casella et al., 2013). A pyrrocidina C (30) foi ativa em S. aureus ATCC 10213 (CIM de 2 μg.mL-1), e não foi considerada citotóxica para as células normais MRC-5 (IC50 >10 μM), demonstrando seletividade na ação antimicrobiana. Estes resultados demonstram a grande diversidade fúngica endofítica em plantas do bioma Amazônia e Cerrado, e a quimiodiversidade associada aos metabólitos secundários destes micro-organismos. Fungos endofíticos tropicais, como os vistos neste trabalho, podem emergir como uma nova fonte de substâncias antimicrobianas e citotóxicas. ____________________________________________________________________________________ RÉSUMÉ / En raison de la nature symbiotique des micro-organismes endophytes, cette étude visait à étudier l'activité antibactérienne, antifongique et cytotoxique chez les métabolites secondaires des extraits endophytes foliaires de plantes de l'Amazonie brésilienne et du Cerrado. Dans ce travail de thèse 147 micro-organismes cultivables ont été isolés (130 champignons, 3 bactéries e 14 champignons non-identifiés ou inconnus) à partir de 28 plantes (4 espèces collectées au Brésil et 24 en Guyane Française). Tous les micro-organismes furent identifiés par analyse moléculaire des régions spécifiques de l'ADNr en utilisant des techniques de séquençage génomique. Des champignons endophytes de l’ordre des Xylariales furent ceux de plus importante fréquence d’isolation dans cette étude, représentés par 25 isolats. Des extraits bruts à l’AcOEt furent produits à partir de cultures de chaque micro-organisme isolé. Une proportion relative signifiante (23,1%) des extraits démontra une activité sur Candida albicans ATCC 10213, pendant que 4% furent actifs sur Staphylococcus aureus ATCC 29213. Le potentiel cytotoxique des extraits fut évalué pour des lignées cellulaires humaines KB (carcinome cervical utérin), MDA-MB-435 (mélanome), et MRC-5 (fibroblastes de poumon normal), résultant en proportion signifiante avec activité d’inhibition de la prolifération cellulaire (24,4%, 23,1% e 16,3%, respectivement). Dix-huit métabolites secondaires furent isolés et identifiés à partir du fractionnement des extraits bruts de huit endophytes. Dix-sept de ces substances furent déjà décrites précédemment dans la littérature: l’acide piliformique (24) et la griséofulvine (25) isolés à partir de Xylaria cubensis SNB-GCI02; La phomopirone (26), la pyrenocine (27), l’alterpérilenol (28) et la novae-zelandine (29), isolés de Lewia infectoria SNB-GTC2402; 5-métilmelleina (31) et la dihidrosporothrioride (32) isolées à partir de Xylaria sp. SNB-GTC2501; La mycoleptodiscine (34) et la mycoleptodiscine B (35) isolées à partir de Mycoleptodiscus sp. SNB-GTC2304; le mycoepoxidiène (36) et la altiloxina A (37) isolés à partir de Diaporthe pseudomangiferae SNB-GSS10; L’acremonisol (40), le semicochliodinol (41) et le cochliodinol (42) isolés à partir de Chaetomium globosum SNB-GTC2114; la colletofragarone A2 (43) isolée à partir de Colletotrichum sp. SNB-GTC0201; la flavoglaucine (44) isolée à partir de Eurotium rubrum BBS01. Parmi ces substances, la flavoglaucine (44) isolée à partir de E. rubrum BBS01 démontra une activité comparable au contrôle fluconazol en C. albicans (CIM de 4 μg.mL-1). La substance (44) présenta IC50 >10 μM sur cellules normales MRC-5, ce qui en fait un candidat pour des études ultérieures. Dans ce travail, fut identifié pour la première fois l’activité de la colletofragarone A2 (43) isolée à partir de Colletotrichum sp. SNB-GTC0201. La substance inédite nommée pyrrocidine C (30) fut isolée à partir de L. infectoria SNB-GTC2402 et identifiée par des analyses spectroscopiques (Casella et al., 2013). La pyrrocidine C (30) fut active en S. aureus ATCC 10213 (CIM de 2 μg.mL-1) et ne fut pas considérées cytotoxique pour les cellules normales MRC-5 (IC50 >10 μM), démontrant une sélectivité dans l’action antimicrobienne. Ces résultats démontrent la grande diversité des endophytes fongiques chez les plantes de l'Amazonie brésilienne et du Cerrado et la grande chimiodiversité associée aux métabolites secondaires de ces micro-organismes. Des champignons endophytes tropicaux, comme ceux présentés dans cette étude, peuvent apparaître comme une nouvelle source de substances antimicrobiennes et cytotoxiques. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Because of the symbiotic nature of endophytes, this survey aims to investigate the probality of discovering antibacterial, antifungal and cytotoxic activities in secondary metabolites of leaf endophytes isolated from plants of Amazon and Cerrado biomes. In this study, 147 cultivable microorganisms were isolated (130 fungi, 3 bacteria and 14 unidentified or unknown microbes) from 28 plant species (4 species collected in Brazil and 24 in French Guyana). All endophytes were identified by molecular analyses of specific rDNA regions, with genomic sequencing techniques. Fungal endophytes belonging to Xylariales order were the most frequently isolated in this study, represented by 25 isolates. Crude AcOEt extracts were produced from cultures of each isolated endophyte. A significant relative proportion (23,1%) of extracts showed activity in Candida albicans ATCC 10213, while 4% were active in Staphylococcus aureus ATCC 29213. The cytotoxic potencial of the extracts was evaluated for human cell lines KB (uterin cervical carcinome), MDA-MB-435 (melanoma) and MRC-5 (normal lung fibroblasts), and a significant proportion of them showed cellular proliferation inhibition (24,4%, 23,1% e 16,3%, respectively). Eighteen secondary metabolites were isolated by the fractionation of eight endophytic extracts. Seventeen of these substances had already been previously described in the literature: piliformic acid (24) and griseofulvin (25) isolated from Xylaria cubensis SNB-GCI02; phomopiron A (26), pyrenocin A (27), alterperilenol (28) and novae-zelandin A (29) isolated from Lewia infectoria SNB-GTC2402; 5-metilmellein (31) and dihidrosporothriorid (32) isolated from Xylaria sp. SNB-GTC2501; mycoleptodiscin A (34) and mycoleptodiscin B (35) isolated from Mycoleptodiscus sp. SNB-GTC2304; mycoepoxidien (36) and altiloxin A (37) isolated from Diaporthe pseudomangiferae SNB-GSS10; acremonisol A (40), semicochliodinol A (41) and cochliodinol (42) isolated from Chaetomium globosum SNB-GTC2114; colletofragaron A2 (43) isolated from Colletotrichum sp. SNB-GTC0201; flavoglaucin (44) isolated from Eurotium rubrum BBS01. Among these substances, flavoglaucin (44), isolated from E. rubrum BBS01, showed comparable antifungal activity with the positive control fluconazol in C. albicans (MIC of 4 μg.mL-1). Flavoglaucin (44) also showed IC50 >10 μM in normal MRC-5 cells, becoming a good candidate for further studies. In this work, the cytotoxic activity of colletofragaron A2 (43), isolated from Colletotrichum sp. SNB-GTC0201 was described for the first time. The unpublished substance named pyrrocidin C (30) isolated from L. infectoria SNB-GTC2402 was identified by spectroscopic analyses (Casella et al., 2013). The pyrrocidin C (30) was active in S. aureus ATCC 10213 (MIC of 2 μg.mL-1), and was not considered cytotoxic for normal MRC-5 cells (IC50 >10 μM), showing selectivity in antimicrobial activity. These results demonstrate the great endophytic fungal diversity in plants of Amazon and Cerrado biomes, along with the chemodiversity associated to the secondary metabolites of these endophytes. Tropical fungal endophytes, like those seen in this work, may emerge as a new source of antimicrobial and cytotoxic substances.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Medicina Tropical, 2017. / Texto parcialmente liberado pelo autor. Conteúdo restrito: Capítulos 5,6,7 e 8. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-07-24T17:06:17Z No. of bitstreams: 1 2017_TatianeSilvadosSantos_PARCIAL.pdf: 449028 bytes, checksum: 8c8cb73576e3120a9c5059ea29c736a2 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-09-20T13:42:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_TatianeSilvadosSantos_PARCIAL.pdf: 449028 bytes, checksum: 8c8cb73576e3120a9c5059ea29c736a2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-20T13:42:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_TatianeSilvadosSantos_PARCIAL.pdf: 449028 bytes, checksum: 8c8cb73576e3120a9c5059ea29c736a2 (MD5) Previous issue date: 2017-09-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). / O fungo Cryptococcus neoformans é um agente causador da micose sistêmica criptococose, que tem levado a óbito cerca de 181 mil pessoas por ano ao redor do mundo. A doença atinge principalmente pessoas imunodeprimidas e adquiriu maior importância clínica a partir da década de 1980, com o aparecimento da AIDS. Como em outras doenças fúngicas, o diagnóstico e o tratamento dessa doença ainda não são ideais, reforçando a necessidade de estudar-se melhor a relação parasito-hospedeiro na busca por melhores estratégias para reverter esses problemas. Nos últimos anos tem se mostrado que pequenos metabólitos podem ter um importante papel na interação parasita-hospedeiro. Demonstrou-se previamente, que moléculas de baixo peso molecular (menor que 1 KDa) presentes no meio condicionado (CM) de culturas estacionários de C. neoformans da linhagem H99, afetavam o crescimento planctônico e em biofilmes desse fungo, bem como a produção de melanina e a secreção de polissacarídeos capsulares por esse fungo. Em continuidade a esses estudos, no presente trabalho analisou-se a influência dessas mesmas moléculas secretadas pelo fungo na sua interação com macrófagos murinos primários. Fungos e macrófagos foram co-incubados por períodos de 2h ou 24h em uma razão de infecção de 2:1 na presença ou não do CM e foram analisados os possíveis efeitos na fagocitose dos fungos, na sobrevivência fúngica pós-interação e na produção de citocinas por esses macrófagos (TNF-α, IL-12, IL-1β, IL-6 e MCP-1, e IL-10). Observou-se uma potencial atividade antifagocítica de metabólitos presentes no CM, uma vez que na presença do CM houve um menor percentual de fagocitose dos fungos. Além disso, o CM produziu um aumento significativo no número de unidades formadoras de colônia do fungo após a interação com os macrófagos por 24h, sugerindo, portanto, a possibilidade de existir nessas amostras, moléculas capazes de estimular o crescimento extra e/ou intracelular do fungo. Interessantemente, após 24 h de fagocitose, observa-se um número bem menor de fungos intracelulares nos macrófagos contendo fungo, do que nas amostras controle sem CM. A produção de citocinas só foi avaliada no período de 2h de interação e não foram observadas diferenças significativas na produção de TNF-α, IL-1β, IL-6, apenas uma diminuição da produção de MCP-1 na presença de CM indicando um potencial papel anti-inflamatório de moléculas presentes nessa amostra. Em resumo, foi possível constatar que os pequenos metabólitos presentes no CM podem afetar a viabilidade e/ou crescimento fúngico na sua interação com macrófagos, possivelmente inibindo a sua internalização por fagócitos e inibindo a produção de citocinas pró-inflamatórias. Dessa maneira, um maior conhecimento das moléculas presentes no CM bem com o melhor detalhamento de suas atividades podem ajudar no melhor entendimento das interações fungo-hospedeiro na criptococcose. / The fungus Cryptococcus neoformans is a causative agent of the systemic mycosis cryptococcosis, a disease leading to about 181 thousand deaths per year worldwide. The disease affects mainly immunocompromised individuals and gained greater clinical importance from the 1980s, with the onset of AIDS. As in other fungal diseases, the diagnosis and treatment of this pathology is still far from ideal, reinforcing the need to better study the host-parasite interaction in the seek for best strategies to revert these problems. In the recent years, small metabolites were shown to play important roles in host-parasite interactions. It was previously demonstrated that low molecular weight molecules (lower than 1 KDa), present in conditioned medium (CM) from stationary cultures of C. neoformans strain H99, affected the planktonic and biofilm growth of this fungus, as well the production of melanin and secretion of capsular polysaccharides by this fungus. To further study the role of those molecules, in the present work we analyzed the influence of these secreted molecules, during fungal interaction with primary murine macrophages. Fungal cells and macrophages were co-incubated for periods of 2h or 24h in an infection ratio of 2:1, in the presence or absence of CM. Then we analyzed the possible effects of these molecules on fungal phagocytosis by macrophages, fungal survival, and macrophage cytokine production (TNF-α, IL-12, IL-1β, IL-6, MCP-1, and IL-10). We observed a potential anti-phagocytic activity of metabolites present in CM, which samples showed a lower percentage of fungal internalization. In addition, the CM produced a significant increase in the number of colony forming units of the fungus, obtained after 24h interaction with macrophages. This suggests that molecules capable to stimulate the extra and/or intracellular growth of the fungus might exist in these samples. Interestingly, after 24h phagocytosis, a significantly lower number of intracellular fungi were observed in fungus-containing macrophages when compared to control samples without CM. The production of cytokines was evaluated only within a period of 2h interaction and no significant differences were observed in the production of TNF-α, IL-1β, IL-6. Only a decrease in the production of MCP-1 in the presence of CM was detected, suggesting a potential anti-inflammatory role of the molecules present in this sample. In summary, it was possible to confirm that small metabolites present in CM might affect fungal viability and/or growth while interacting with macrophages, possibly inhibiting their internalization by these phagocytes and the production of pro-inflammatory cytokines. Thus, a better characterization of the molecules present in CM and of their activities could improve the understanding of fungus-host interactions in cryptococcosis.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Botânica, Programa de Pós-Graduação em Botânica, 2016. / Submitted by Nayara Silva (nayarasilva@bce.unb.br) on 2016-06-23T19:35:47Z No. of bitstreams: 1 2016_DéboraAlmeidaAlcantaradaSilva.pdf: 1806060 bytes, checksum: b0722b82676b47c15af2547143ca743a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-06-23T21:09:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_DéboraAlmeidaAlcantaradaSilva.pdf: 1806060 bytes, checksum: b0722b82676b47c15af2547143ca743a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-23T21:09:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_DéboraAlmeidaAlcantaradaSilva.pdf: 1806060 bytes, checksum: b0722b82676b47c15af2547143ca743a (MD5) / A planta modelo, Arabidopsis thaliana, produz uma diversidade de metabólitos secundários. Dentre os metabólitos secundários, os terpenos formam a maior e mais diversa classe. Os terpenos estão envolvidos em várias funções fisiológicas importantes nos vegetais, entre as quais têm sido associados a compostos alelopáticos O geranil geranil difosfato (GGPP) é o precursor para a biossíntese de terpenos. Estudos anteriores estabeleceram uma associação entre plantas transgênica que supostamente superexpressavam os genes GGR, GGPPS2 e GGPPS6, envolvidos na síntese de terpenos, com efeitos alelopáticos. Para contribuir na elucidação desta associação, o primeiro capítulo deste estudo teve como objetivo estudar o efeito do silenciamento dos genes GGR, GGPS2 e GGPPS6 em A. thaliana e resposta alelopática de Arabidopsis. Assim, vetores de RNAi para GGR, GGPS2 e GGPPS6 foram sintetizados e transferidos para Agrobacterium tumefaciens e em seguida as plantas de Arabidopsis foram transformadas para o silenciamento desses genes. As plântulas transformadas foram selecionadas em meio MS contendo glufosinato de amônio como composto seletivo. Foi possível selecionar três plantas da geração T1 e duas plantas da geração T2, transformadas com o vetor de silenciamento para o gene GGPPS2. Entretanto, as plantas transformadas não sobreviveram. Além disso, não foi possível selecionar plantas com vetores de silenciamento para os genes GGR e GGPPS6. No segundo capítulo, o objetivo foi avaliar a expressão relativa do gene GGR em plantas selvagens e transgênicas de Arabidopsis thaliana que que supostamente superexpressam esse gene. Adicionalmente, objetivou-se verificar a associação entre os níveis de expressão de GGR e respostas alelopáticas em A. thaliana. Assim, uma serie de PCR em Tempo Real, utilizando sondas TaqMan® para GGR tendo como genes de referência: ACT2 e RAD23C. Ao contrário do esperado, as plantas selvagens expressaram mais o gene GGR que todas as linhagens que supostamente superexpressavam esse gene. Esse dado pode indicar que um processo de cossupressão de GGR pode ter ocorrido nas plantas transgênicas. Estudos prévios sobre as respostas alelopáticas mostram que extratos foliares de plantas transgênicas de Arabidopsis com GGR têm efeito alelopático mais acentuados que os extratos de plantas selvagens. Assim, pelo menos para o gene GGR, quanto menor o seu nível de expressão maior a resposta alelopática da planta. Uma possível explicação para isso se baseia no fato de que a menor expressão de GGR disponibilizaria mais substrato para a enzima GGPP sintase e consequentemente, maior produção de terpenos. Outra possibilidade é que a redução da expressão de GGR poderia induzir outras vias metabólicas que aumentam a produção de compostos alelopáticos. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The model plant, Arabidopsis thaliana, produces a variety of secondary metabolites. Among the secondary metabolites, terpenes are the largest and most diverse class. Terpenes are involved in several important physiological functions in plants, among which they have been associated with allelopathic compounds. Geranyl geranyl diphosphate (GGPP) is the precursor for the biosynthesis of terpenes. Previous studies established a positive association between transgenic plants that supposedly overexpressed GGR, GGPPS2 and GGPPS6 genes, which are involved in terpene synthesis, and allelopathic response. Therefore, the first part of this research focused on investigating the effect GGR, GGPS2 and GGPPS6 silencing on A. thaliana allelopathic response. Furthermore, GGR, GGPS2 and GGPPS6 RNAi vectors were transferred to Agrobacterium tumefaciens and then used to transform Arabidopsis plants with the purpose of silencing these genes. Transformed Arabidopsis seedlings were selected on MS medium containing glufosinate-ammonium as selective compound. It was possible to select three T1 generation plants and two T2 generation plants containing the silencing vector for GGPPS2 silencing. However, the transformed plants did not survive. Moreover, it was not possible to select plants containing GGR and GGPPS6 silencing vectors. In the second chapter, the objective was to evaluate the expression of GGR gene in wild type and transgenic A. thaliana transgenic plants that supposedly overexpressed this gene. In addition, the association between GGR expression levels and allelopathic responses in A. thaliana was investigated. Thus, a series of RT-PCR using TaqMan probes for GGR and the following reference genes: RAD23C and ACT2 were performed. Contrary to expectations, wild plants expressed the GGR gene at higher level than all lineages of GGR transformed plants. This data indicates that a cosuppression of GGR may have taken place in the transgenic plants. Previous studies on allelopathic responses of Arabidopsis showed that leaf extracts of GGR transformed Arabidopsis plants have stronger allelopathic effect than those from wild type plants. Thus, at least with respect to GGR gene, the lower the level of GGR expression the higher the allelopathic response of Arabidopsis plant. One possible explanation for this phenomenon is based on the fact that a low expression of GGR would provide more substrate for GGPP synthase, which consequently would increase terpene production. Another possibility links the reduction of GGR expression with the induction of other metabolic pathways associated with an increase of allelopathic compound production.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, 2015. / Submitted by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-11-11T14:55:25Z No. of bitstreams: 1 2015_ChristianeGoncalvesCamposCavalcanti.pdf: 3510961 bytes, checksum: d524e70ab5294981db6303c5f8d98f3e (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2015-12-04T13:59:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_ChristianeGoncalvesCamposCavalcanti.pdf: 3510961 bytes, checksum: d524e70ab5294981db6303c5f8d98f3e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-04T13:59:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_ChristianeGoncalvesCamposCavalcanti.pdf: 3510961 bytes, checksum: d524e70ab5294981db6303c5f8d98f3e (MD5) / O aumento na demanda por fontes de energia alternativa e as preocupações com os impactos ambientais tem incentivado o desenvolvimento de tecnologias para a produção de combustíveis a partir de biomassa lignocelulósica, como o etanol de segunda geração (2G). No entanto um dos açúcares mais abundante nas biomassas lignocelulósicas, a xilose, não pode ser convertida a etanol devido à incapacidade da levedura Saccharomyces cerevisiae, microrganismo mundialmente utilizado na indústria para produção de etanol, de converter eficientemente esse substrato em xilulose. A tecnologia baseada em metabolômica mostra-se eficiente, como uma ferramenta para auxiliar na determinação das etapas limitantes na via metabólica de fermentação da xilose. Neste trabalho, foram desenvolvidos e otimizados dois protocolos para análise de metabolômica targeted, utilizando como plataforma analítica a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas tandem (LC-MS/MS) com experimentos de MRM. Os métodos de separação foram baseados na cromatografia por pareamento iônico utilizando uma coluna de fase reversa (HSS-T3) e na cromatografia de interação hidrofílica (HILIC), utilizando uma coluna quimicamente modificada com o grupo amida. Catorze padrões de metabólitos presentes na via de fermentação da xilose puderam ser identificados através de dois métodos complementares. Estes protocolos foram aplicados qualitativamente durante a avaliação de duas leveduras, Scheffersomyces stipitis e Spathaspora passalidarum. O preparo de amostra foi realizado em duas etapas: quenching e extração dos metabólitos. Os métodos de separação e detecção se mostraram promissores para a análise de rotina em processos de fermentação de xilose. / The increase in demand for alternative energy sources and concerns about the environmental impacts has encouraged the development of technologies for the production of fuels from lignocellulosic biomass, such as ethanol from second generation (2G). However one of the most abundant sugars in lignocellulosic biomass, xylose, can not be converted into ethanol due to the inability of yeast Saccharomyces cerevisiae, which is a microorganism used worldwide in the industry for the production of ethanol, to convert this substrate into xylulose efficiently. The technology based on metabolomics proves to be efficient as a tool to identify the crucial steps in the metabolic pathway of xylose fermentation. In this work, we developed and optimized two protocols for targeted metabolomics analysis, using as an analytical platform liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) with MRM experiments. Separation methods were based on the ion pairing chromatography using a reverse phase column (HSS-T3) and hydrophilic interaction chromatography (HILIC) with a chemically modified column with amide group. Fourteen patterns of metabolites present in the xylose fermentation pathway could be identified using two complementary methods. These protocols were applied qualitatively during the evaluation of two yeast, Scheffersomyces stipitis and Spathaspora passalidarum. The sample preparation was performed in two stages: quenching and extraction of metabolites. The methods of separation and detection were promising for routine analysis in the xylose fermentation processes.