Orientadora : Profª. Drª. Guilhermina Rodrigues Noleto / Coorientadora : Profª. Drª. Carmen Lúcia de Oliveira Petkowicz / Coorientadora : Profª. Drª. Silvia Maria Suter Correia Cadena / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 07/07/2017 / Inclui referências: fls. 138-159 / Resumo: Nesse estudo, foi avaliada a toxicidade de preparações de galactomananas isoladas de sementes de Schizolobium amazonicum e de seus complexos com oxovanádio em células HepG2, com enfoque nos efeitos sobre o metabolismo energético. A galactomanana nativa (SAGM) foi obtida do endosperma das sementes de S. amazonicum por extração aquosa a 25 ºC. O polímero nativo foi submetido à hidrólise ácida parcial resultando na fração MSAGM. A comparação dos perfis de eluição por HPSEC/MALLS/RI das galactomananas nativa e modificada confirmou a hidrólise parcial. A massa molecular de MSAGM obtida por MALLS foi de 1,56 x 104 g/mol. A razão Man:Gal de 3,2:1, determidada por GC, não foi alterada em relação a galactomanana nativa. SAGM e MSAGM foram complexadas com oxovanádio, sendo denominadas SAGM:VO e MSAGM:VO, respectivamente. A complexação dos biopolímeros com oxovanádio (IV/V) foi caracterizada por titulação potenciométrica, FT-IR, RMN 51V e 13C. A técnica de absorção atômica foi utilizada para determinar a presença do metal nos complexos. Os valores das constantes de complexação para os equilíbrios químicos foram similares para ambas as preparações, exceto para o equilíbrio [L2(OH)2(VO)2]/[L]2.[OH]2.[VO]2 que foi detectado apenas para MSAGM:VO. Para o complexo SAGM:VO o conteúdo de vanádio foi 3,8 vezes maior ao do complexo MSAGM:VO. Dentre os polímeros, SAGM e MSAGM:VO promoveram maior redução (~ 50%) na viabilidade das células HepG2 na concentração de 250 ?g/mL durante 72h de incubação. Nas mesmas condições somente MSAGM:VO (250 ?g/mL) promoveu inibição de ~50% na proliferação destas células. Ambos os polímeros também inibiram todos os estados da respiração (basal: ~70%; desacoplado: ~80%, e leak: ~40%). Este efeito se repetiu também em células permeabilizadas, nas quais foi observada a inibição da respiração em ~50%, que se manteve após a adição de ADP, glutamato/malato e succinato, estes últimos substratos para os complexos I e II, respectivamente. A concentração de lactato das células HepG2 incubadas com SAGM (250 ?g/mL) por 72h aumentou em ~25%, porém para SAGM:VO, MSAGM e MSAGM:VO (250 ?g/mL) houve redução de ~20%. Nas mesmas condições, a presença dos biopolímeros não alterou significativamente a concentração de piruvato. Os níveis de ATP foram reduzidos em ~30% após o tratamento de 72h com 250 ?g/mL com todas as preparações. MSAGM:VO aumentou os níveis de ROS em ~149%, enquanto o potencial transmembrana mitocondrial (??m) foi reduzido em ~47%. A análise da morte celular em condição de normóxia, após 72 h, mostrou que MSAGM:VO (250 ?g/mL) promoveu o aumento da atividade de caspases (3 e 7) envolvidas na morte celular por apoptose e, em menor intensidade, a proteína pro-apoptótica BAX. Porém, em condições de hipóxia, o biopolímero aumentou a expressão das proteínas anti-apoptóticas MCL-1 e BCL-XL. Também nesta condição (hipóxia), o tratamento com MSAGM:VO promoveu aumento das proteínas LC3-II e redução de p62, sugerindo o processo de autofagia. Os níveis de expressão de HIF-1? em condições de hipóxia foram reduzidos após o tratamento com MSAGM:VO (250 ?g/mL e 72h). Esses resultados demonstram que as preparações das galactomananas de S. amazonicum, especialmente, SAGM e MSAGM:VO, tornam as células HepG2 suscetíveis a morte e sugerem que estes polímeros tem potencial atividade antitumoral, motivando estudos futuros que viabilizem sua aplicação terapêutica. Além do estudo realizado com as galactomananas de S. amazonicum, o outro objetivo desse estudo foi avaliar o impacto do silenciamento da enzima glucose - 6 - fosfato isomerase (GPI) em células LS174T. GPI é uma enzima citosólica que realiza a interconversão de glucose - 6 - fosfato em frutose - 6 - fosfato. A interrupção genética desta enzima em células LS174T (GPIKO) foi realizada de forma a desviar o metabolismo dessas células para a via das pentoses fosfato. Após o silenciamento de GPI, em condições de normóxia, foi observado uma redução de glucose e lactato, reprogramando as células GPIKO para a fosforilação oxidativa de forma a elevar os níveis de ATP mitocondrial, mantendo assim a viabilidade. A incubação com fenformina nas células GPIKO, levaram as células a morte, indicando sensibilidade ao inibidor do complexo I da cadeia de transporte de elétrons. Em condições de hipóxia, GPIKO teve seu crescimento celular reduzido, caracterizado pela diminuição da proliferação e respiração celular. Apesar da restrição do crescimento in vitro sob hipóxia, o crescimento tumoral in vivo reduziu moderamente em comparação ao tipo selvagem, o qual não apresentava a mutação. Esses resultados indicam que a utilização exclusiva do metabolismo oxidativo tem a capacidade de fornecer precursores metabólicos para o crescimento tumoral, apontando a plasticidade do metabolismo das células tumorais apresentarem uma forte limitação para estratégias antitumorais. Palavras - chave: galactomananas; oxovanadio (IV/V); células HepG2; células LS174T; GPI; metabolismo; efeitos citotóxicos; antitumoral; hipóxia. / Abstract: The aim of this study, was evaluated the toxicity of galactomannan preparations isolated from seeds of S. amazonicum and its complexes with oxovanadium in HepG2 cells, focusing on effects of energy metabolism. Native galactomannan (SAGM) was obtained from endosperm of S. amazonicum seeds by aqueous extraction at 25 ºC. SAGM was subjected to partial acid hydrolysis resulting in the MSAGM fraction. HPSEC/MALLS/RI elution profiles of native and modified galactomannans confirmed partial hydrolysis. Molecular mass of MSAGM obtained by MALLS was 1.56 × 104 g/mol. The Man: Gal ratio of 3.2:1 determined by GC, was not modified in relation to SAGM. SAGM and its partially hydrolyzed form (MSAGM) were complexed with oxovanadium, and was called SAGM:VO and MSAGM:VO, respectively. The complexation of biopolymers with oxovanadium (IV/ V) was characterized by potentiometric titration, FT-IR, NMR 51V, 13C. Atomic absorption technique was used to determine the presence of the metal in the complexes. The values of the complexation constants for the chemical equilibria were similar for both preparations, except for the equilibrium [L2(OH)2(VO)2]/[L]2.[OH]2.[VO]2 that was detected only for MSAGM:VO. For SAGM:VO complex the vanadium content was 3.8 fold greater than MSAGM:VO complex. Among the polymers, SAGM and MSAGM:VO promoted a greater reduction (~ 50%) in the viability of HepG2 cells at concentration of 250 ?g/mL during 72h of incubation. Under the same conditions only MSAGM:VO promoted ~ 50% of inhibition in the proliferation of these cells. Both polymers also inhibited all states of respiration (basal: ~ 70%, decoupled: ~ 80%, and leak: ~ 40%). This effect was also repeated in permeabilized cells, in which respiration inhibition was observed in ~ 50%, which was maintained after the addition of ADP, glutamate/malate and succinate (substrates for complexes I and II, respectively). Lactate concentration of HepG2 cells incubated with SAGM (250 ?g/mL) for 72h increased by ~ 25%, but for SAGM:VO, MSAGM and MSAGM:VO, there was a ~ 20% reduction. Under the same conditions, the presence of the biopolymers did not significantly alter the concentration of pyruvate. ATP levels were reduced by ~ 30% after treatment of 72 h at 250 ?g/ml with all preparations. MSAGM:VO increased ROS levels by ~ 149%, while mitochondrial transmembrane potential (??m) was reduced by ~ 47%. The analysis of cell death in normoxic condition, after 72h, showed that MSAGM:VO (250 ?g / mL) promoted an increase of caspase activity (3 and 7) and, to a lesser extent, protein BAX. However, under hypoxia conditions, the biopolymer increased expression of the anti-apoptotic proteins MCL- 1 and BCL-XL. Also in this condition, treatment with MSAGM:VO promoted increase of LC3-II proteins and reduction of p62, suggesting the autophagy process. Expression levels of HIF-1? under hypoxia conditions were reduced after treatment with MSAGM:VO (250 ?g/mL and 72 h). These results demonstrate that the preparations of galactomannans from S. amazonicum, especially SAGM and MSAGM:VO, render HepG2 cells susceptible to death and suggest that these polymers have a potential antitumor activity, motivating future studies that allow their therapeutic application. In addition to the study carried out with galactomannans from S. amazonicum, the other aim of this study was to evaluate the impact of disruption glucose - 6 - phosphate isomerase (GPI) on LS174T cells. GPI is a cytosolic enzyme that performs glucose - 6 - phosphate interconversion to fructose - 6 - phosphate. Genetic disruption of this enzyme in LS174T cells (GPIKO) was performed in a way to divert the metabolism of these cells to the phosphate pentose pathway. After GPI silencing under conditions of normoxia, a reduction of glucose and lactate was observed, reprogramming GPIKO cells for oxidative phosphorylation in order to raise mitochondrial ATP levels, thus maintaining viability. Incubation with phenformin in GPIKO cells led the cells to death, indicating sensitivity to the inhibitor of the complex I of the electron transport chain. Under hypoxia conditions, GPIKO had a reduced cell growth, characterized by decreased proliferation and cellular respiration. Despite in vitro growth restriction under hypoxia, tumor growth in vivo moderately reduced compared to wild type, which did not show the mutation. These results indicate that the exclusive use of oxidative metabolism has the ability to provide metabolic precursors for tumor growth, pointing out that the plasticity of tumor cell metabolism has a strong limitation for antitumor strategies. Key - words: galactomannan; Oxovanadium (IV/V); HepG2 cells; LS174T cells; metabolism; GPI; Cytotoxic effects; Antitumor; Hypoxia.

Submitted by CAROLINA VASCONCELOS TAVARES DE FARIAS null (carolzoouem@gmail.com) on 2017-04-18T19:34:52Z No. of bitstreams: 1 CAROLINA - FCAT Dracena.doc: 989696 bytes, checksum: e2b8a7e03a0532f512626d77d6f32014 (MD5) / Rejected by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: O arquivo submetido não contém o certificado de aprovação. A versão final da dissertação/tese deve ser submetida no formato PDF (Portable Document Format). O arquivo PDF não deve estar protegido e a dissertação/tese deve estar em um único arquivo, inclusive os apêndices e anexos, se houver. Por favor, corrija o formato do arquivo e realize uma nova submissão. Agradecemos a compreensão. on 2017-04-18T20:37:17Z (GMT) / Submitted by CAROLINA VASCONCELOS TAVARES DE FARIAS (carolzoouem@gmail.com) on 2017-04-18T20:39:29Z No. of bitstreams: 2 CAROLINA - FCAT Dracena.doc: 989696 bytes, checksum: e2b8a7e03a0532f512626d77d6f32014 (MD5) CAROLINA - FCAT Dracena.PDF: 1801848 bytes, checksum: acf0e35768b2c64f1d316dd482376f8b (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-04-18T20:42:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 farias_cv_me_ilha.pdf: 1801848 bytes, checksum: acf0e35768b2c64f1d316dd482376f8b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-18T20:42:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 farias_cv_me_ilha.pdf: 1801848 bytes, checksum: acf0e35768b2c64f1d316dd482376f8b (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / Em peixes, a utilização dos carboidratos da dieta pode variar em função da fonte e características estruturais do amido. O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito de dietas com diferentes quantidades de amilose e amilopectina no metabolismo de carboidratos e desempenho produtivo de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus). Os animais foram alojados (n = 216) em 24 caixas de polietileno (100-L) e alimentados três vezes por dia até a saciedade aparente durante 90 dias. O experimento foi conduzido em um delineamento em blocos casualizados com seis tratamentos (dietas experimentais): T1 - 0,5/38,7; T2 - 6,9/32,6; T3 - 10,3/29,5; T4 - 20,4/18,6; T5 - 27,3/11,0 e T6 - 28,4/9,8 (% de amilose e % de amilopectina, respectivamente) e quatro blocos (faixa de peso), sendo cada bloco considerado como uma repetição. Os resultados obtidos foram submetidos a ANOVA e as médias comparadas pelo teste de Tukey (5%). Melhor peso final, ganho de peso, taxa de crescimento especifico, conversão alimentar, taxa de eficiência proteica e atividade da amilase foram observadas nos peixes que receberam as dietas com menor quantidade de amilose (até 6,9%). As reservas de lipídio muscular, lipídeo hepático e índice hepatossomático foram mais elevadas nos peixes que receberam a dieta com a 38,7% de amilopectina. Dentre os indicadores das vias metabólicas, a atividade hepática da glicoquinase foi maior nos peixes que receberam essas dietas com maior percentagem de amilopectina. Na composição corporal o extrato etéreo foi maior nos animais da dieta com mais amilopectina. De forma geral, dietas com mais de 74% de amilopectina resultaram em melhores índices zootécnicos e maior estoque energético, sugerindo melhor aproveitamento do carboidrato amiláceo da dieta. / In fish, the use of dietary carbohydrates may vary depending on the source and structural characteristics of the starch. The objective of this work was to evaluate the effect of diets with different levels of amylose and amylopectin, in carbohydrate metabolism and productive performance of juveniles of pacu (Piaractus mesopotamicus). The animals were stocked (n = 216) in 24 polyethylene (100-L) boxes and fed three times daily to apparent satiety for 90 days. The experiment was conducted in a randomized block design with six treatments (experimental diets): T1 - 0,5/38,7; T2 - 6.9/32.6; T3 - 10.3/29.5; T4 - 20.4/18.6; T5 - 27.3/11.0 and T6 - 28.4/9.8 (% amylose and% amylopectin, respectively) and four blocks (weight range), each block being considered as a replicate. The results were submitted to ANOVA and Tukey's test (5%) for means comparisons. Better final weight, weight gain, specific growth rate, feed conversion, protein efficiency rate and amylase activity were observed in fish fed diets with less amylose (up to 6.9%). Muscle lipid, hepatic lipid and hepatosomatic index were higher in fish that received a diet of 38.7% amylopectin. Among the indicators of the metabolic pathways, a hepatic glycokinase activity was higher in the fish that received diets with more than 47% of amylopectin. In the body composition, ether extract percentage was higher in the animals of the diet with more amylopectin. In general, diets with more than 74% of amylopectin resulted in better zootechnical indexes and higher energy supply, suggesting a better use of the dietary starch.

Orientador: Denis Otavio Vieira de Andrade / Banca: José Eduardo de Carvalho / Banca: Fernando Ribeiro Gomes / Resumo: O grupo das serpentes é formado por animais estritamente carnívoros que ingerem suas presas inteiras, sem mastigação. Algumas espécies podem tolerar períodos prolongados de jejum intercalados com ingestão ocasional de presas muito grandes em relação à sua massa corpórea. Tais serpentes apresentam, dentre todos os vertebrados, algumas das mais dramáticas especializações morfológicas, comportamentais e fisiológicas associadas à alimentação. Uma das consequências da ingestão de grandes massas de alimento é o excepcional aumento da taxa metabólica pós-prandial, referido como Ação Dinâmica Específica (ADE). A magnitude dessa resposta metabólica pós-prandial depende essencialmente do tamanho e da natureza do alimento, associado a fatores como o tamanho corpóreo e a temperatura do ambiente. No entanto, raros são os trabalhos que caracterizaram a ADE de espécies de serpentes neotropicais e examinaram os fatores que potencialmente poderiam afetar esta resposta. Deste modo, ao longo dos dois capítulos que compõem a presente dissertação, investiguei alguns dos determinantes proximais do aumento metabólico pós-prandial da urutu-cruzeiro, Bothrops alternatus (Serpentes, Viperidae). O capítulo I foi dedicado à investigação dos efeitos da temperatura e do termoperíodo sobre a ADE de Bothrops alternatus (Serpentes, Viperidae). O capítulo II foi dedicado ao estudo dos efeitos do tamanho da presa sobre a ADE de Bothrops alternatus (Serpentes, Viperidae). Nossos resultados mostraram que o aumento da temperatura corpórea é acompanhado por uma aceleração do processo digestivo às custas de um maior incremento metabólico. A variação destes parâmetros ocorre de maneira inteiramente proporcional de forma que a energética da ADE não foi afetada pela variação da temperatura... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Not available / Mestre

Orientador: João Carlos Pinheiro Ferreira / Banca: Maria Denise Lopes / Banca: José Mauricio Barbanti Duarte / Resumo: A validação da técnica de enzimoimunoensaio (EIA) para dosagem de metabólitos de cortisol fecal e de radioimunoensaio (RIA) para dosagem de metabólitos de corticosterona fecal em papagaio-verdadeiro (Amazona aestiva) foi considerada eficiente em predizer os valores hormonais, comprovada pelas curvas de paralelismo, dose resposta e coeficientes de variação intra e interensaio. A estimulação da adrenal com 25UI/animal de ACTH resultou na elevação das concentrações de metabólitos de cortisol e corticosterona fecal. Embora não tenha sido observada uma padronização nos picos de excreção fecal, nos animais analisados, houve duas concentrações de picos de excreção, uma entre duas e quatro horas e outra entre oito e dez horas. Não foram detectados efeitos de Grupos (Tratamento x Controle), momento (horas de coleta) ou sexo (macho x fêmea) nos resultados observados nos níveis de cortisol, exceto quando comparados fêmeas e machos de grupos distintos. / Abstract: Validation of enzyme immunoassay (EIA) to measure metabolite of cortisol and radioimmunoassay (RIA) to measure metabolites of corticosteroid in Amazon parrots (Amazona aestiva) feces showed that this techniques can be used to measure feces hormones in this specie. These techniques were considered efficient to measure hormones values, proved by parallelism, standart curve and intra-assay and inter-assay coefficient of variation. Adrenal stimulation was showed by increase metabolic levels of cortisol and corticosterone in feces after ACTH administration (25UI/animal). In spite of didn't have standards in picks of excretion, this study show concentration of picks in 2-4 hour and 8-10h for hormones metabolites. For cortisol measure, there aren't significantly differences between Control Group and Treatment Group, moments and sex, but there are significantly differences between female and male in different groups. / Mestre

Orientador:Maria Lucia Gonsales da Costa Araujo / Banca: José Roberto Ernandes / Banca: Ruy de Souza Junior / Banca: Alberto Colli Badino Junior / Banca: José Gregório Cabrera Gomez / Resumo: Cefamicina C é um antibiótico produzido por Streptomyces clavuligerus de grande interesse, em virtude de seu maior grau de resistência a enzimas do tipo β-lactamases comparativamente a outros antibióticos beta-lactâmicos. Cefamcina C é produzida em pequenas concentrações na natureza assim como acontece com todos os metabólitos secundários. Assim, investimentos em programas de melhoria de linhagens e de otimização de meios de cultura e operação de biorreatores são aspectos-chave para o aumento da produção industrial. Porém, a eficácia de tais estratégias pode ser limitada, o que requer o uso de novas abordagens. Neste sentido, a engenharia metabólica é uma área importante que alia ferramentas de quantificação de fluxos metabólicos e de técnicas de biologia molecular para melhoria de linhagens. O estudo dos fluxos metabólicos permite, por meio de análise criteriosa do metabolismo do micro-organismo, identificar gargalos metabólicos na rota biossintética de um produto de interesse para, posteriormente, propor possíveis soluções para o aumento da produção. No presente projeto realizou-se o estudo dos fluxos metabólicos de S. clavuligerus com vistas a encontrar formas de operação do metabolismo que conduzam a aumentos da produção de cefamicina C. Para isto, primeiramente foi desenvolvido um meio de cultivo quimicamente definido contendo maltose como fonte de carbono e lisina como fonte de nitrogênio, para que análises do caldo fermentado não tivessem interferência de componentes desconhecidos. Tal meio possibilitou a obtenção de biomassa em torno de 9 g.L-1 e cefamicina C ao redor de 200 mg.L-1 em processo contínuo. Este modo de operação foi possível somente em biorreator devido ao controle de pH, pois em shaker as variações deste parâmetro inviabilizaram o processo. Paralelamente, foi construído um modelo metabólico com 78 reações e 81 metabólitos, sendo 10 externos e 71 internos, que ... / Abstract: Cephamycin C is an antibiotic produced by Streptomyces clavuligerus of great interest due to its higher degree of resistance to β-lactamases as compared to other beta- lactam antibiotics. Cephamycin C is produced in small concentrations in nature as with all secondary metabolites. Therefore, investments in improvement of strains and optimization, of culture media and operation of bioreactors are key aspects to increase the production. However, the effectiveness of such strategies may be limited, requiring the use of new approaches. In this aspect, the metabolic engineering is an important field that combines quantification of metabolic fluxes and molecular techniques for improving strains. The study of metabolic fluxes enables one to identify metabolic bottlenecks through careful analysis of metabolism of the microorganism, and to suggest ways to increase production. In this project we carried out the study of metabolic fluxes in S. clavuligerus aiming to find ways to increase the production of cephamycin C. For this, first we developed a chemically defined culture medium because this kind of media does not cause interference in the analyses. The developed medium contained maltose as carbon source and lysine as nitrogen source and resulted in 9 g.L-1 of biomass and 200 mg.L-1 of cephamycin C in the continuous process. This mode of operation was only possible in the bioreactor due to its pH control. Due to variations in the pH, the continuous process in shaken-flasks became unviable. The metabolic model was constructed with 78 reactions and 81 metabolites (10 external and 71 internal) which suitably described the metabolism of S. clavuligerus. This model was simulated with the aid of Optflux, a multi-task software developed for this purpose. The profiles of maltose, lysine, biomass, cephamycin C, clavulanic acid, external protein and CO2 evolution were monitored. These data were used for the model simulations. The results allowed... / Doutor

Resumo: Muitas das questões relacionadas a como Xylella fastidiosa vive num ambiente cuja concentração de nutrientes é baixa, e como e porquê ela forma agregados nos vasos do xilema, devem estar relacionados com seu metabolismo. O seqüenciamento deste organismo forneceu informações para serem aplicadas em estudos genéticos funcionais, visando à elucidação da funcionalidade de vias metabólicas que possam estar intimamente ligadas à etiologia do amarelinho. O presente estudo foi conduzido com o objetivo de verificar a funcionalidade da via Glicolítica de X. fastidiosa através de estudo das isoenzimas fosfoglicose isomerase, aldolase ou gliceraldeído-3-fosfato liase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase e piruvato quinase presentes na via Glicolítica e a glicose 6-fosfato desidrogenase presente na Entner-Doudoroff, bem como a clonagem, expressão e a determinação da atividade da enolase. O gene da enolase é uma das 35 ORFs anotadas no cosmídeo 02F10, denominada XF1291. Estes estudos sugerem que a bactéria X. fastidiosa não utiliza a via Glicolítica no metabolismo de carboidratos, inferindo assim no elevado tempo de duplicação deste fitopatógeno. As atividades enzimáticas da enolase recombinante, da enolase nativa e das isoenzimas aldolase e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase não foram detectadas, sugerindo que a X. fastidiosa utiliza a via Entner-Doudoroff para a formação de piruvato. São apresentadas evidências de que a regulação gênica e a presença de isoformas, com propriedades regulatórias diferentes, podem dificultar a compreensão do metabolismo de carboidratos em X. fastidiosa. / Abstract: Many of the questions related to how Xylella fastidiosa lives in an environmental with low concentration of nutrients, and the reason why she forms aggregates in xylem vessels should be related with its metabolism. However, the sequencing this organism provided information to be applied in functional genetic studies. These studies focus on elucidating the functionality of metabolic pathways that might be intimately involved in "amarelinho" etiology. The objective of this study was to verify the functionality of the Glycolytic pathways by studying the isozymes phosphoglucose isomerase, aldolase or glyceraldehyde-3-phosphato-lyase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and pyruvate kinase in the Glycolytic pathway and glucose-6-phosphate dehydrogenase in Entner-Doudoroff pathway, as well as the cloning and expression of enolase and determination of its activity. The enolase gene is one of 35 ORFs annoted in 02F10 cosmid and denominated XF 1291. These studies suggested that X. fastidiosa bacterium does not use the Glycolitic pathway in the metabolism of carbohydrates, which might explain the long time of duplication presented by this phytopathogen. The enzymatic activities of recombinant enolase, native enolase and isozymes aldolase and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase have not been detected, suggesting that X. fastidiosa uses the Entner-Doudoroff pathway to produce pyruvate. Evidences are presented that the regulation of genes and the presence of isoforms with different properties of regulation can make it difficult to understand the metabolism of carbohydrates in X. fastidiosa. / Orientadora: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Coorientador: João Martins Pizauro Junior / Banca: Julio Cezar Franco de Oliveira / Banca: Luiz Roberto Furlan / Mestre

Orientador: Ana Angélica Henrique Fernandes / Banca: Regina Coeli Vasques de Miranda / Banca: José Maurício Sforcin / Resumo: O Diabetes mellitus é uma síndrome metabólica caracterizada pela deficiência relativa ou absoluta da ação da insulina em órgãos alvo, expondo os tecidos à hiperglicemia crônica. Além disso, a deficiência insulínica ocasiona anormalidades no metabolismo de lipídios, proteínas e carboidratos. Durante a gestação, o diabetes cursa o pior prognóstico materno e fetal, com elevadas taxas de abortamento espontâneo, malformações congênitas, óbito intra-útero, macrossomia, prematuridade, distúrbios metabólicos e funcionais. Atualmente observa-se forte tendência na valorização de substâncias naturais para fins terapêuticos na medicina humana. Neste panorama, os flavonóides têm especial destaque, pois sendo produto de origem natural vem conquistando numerosos adeptos de sua utilização. Diante do exposto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da quercetina sobre parâmetros bioquímicos séricos, hepáticos e cardíacos, além do estresse oxidativo em ratas prenhez com diabetes mellitus tipo 1 induzido experimentalmente. Foram utilizadas 32 ratas prenhez Wistar, distribuídas em 4 grupos experimentais (n=8): G1 (normais, controle); G2 (normais, tratadas com quercetina); G3 (diabéticas não tratadas); G4 (diabéticas, tratadas com quercetina). O diabetes mellitus foi induzido com estreptozotocina (60mg/kg, i.p., dose única). Após 48 horas, as ratas que apresentaram concentração glicêmica acima de 220 mg/dl foram consideradas diabéticas e submetidas ao acasalamento. A prenhez foi verificada através de lavados vaginais, levando em consideração fatores indicativos de prenhez, como cabeças de espermatozóides e diagnóstico da fase estral. Com a confirmação da prenhez a quercetina foi administrada por gavagem, na concentração de 50 mg/kg de peso corporal... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Diabetes mellitus is a metabolic syndrome characterized by relative or absolute insulin deficiency in target organs, exposing tissues to chronic hyperglycemia. In addition, insulin deficiency leads to abnormal metabolism of lipids, proteins and carbohydrates. During gestation, diabetes shows the worst maternal and fetal prognosis, including high rates of spontaneous abortion, congenital malformation, intrauterine death, macrosomia, prematurity, and metabolic and functional disorders. There is a strong tendency toward the appreciation of natural substances for therapeutic purposes in human medicine. In this context, flavonoids are worthy of note since, as products of natural origin, they have been gaining a large number of consumers. Thus, the present study aimed to assess the effect of quercetin on biochemical parameters of serum, liver and heart, addition to stress oxidative in pregnant rats with experimentally induced diabetes. The study included 32 pregnancy Wistar rats allocated to 4 experimental groups (n=8): G1 (normal, control); G2 (normal, treated with quercetin); G3 (diabetic, non-treated); G4 (diabetic, treated with quercetin). Diabetes mellitus was induced by using esterptozotocin (60mg/kg, i.p., single dose). After 48 hours, animals showing glucose level above 220 mg/dl were considered diabetic and were subjected to breeding. Pregnancy was verified by means of vaginal lavage, considering the predictors of pregnancy such as sperm heads and the estrous phase. Once pregnancy was established, quercetin was administered through gavage at the concentration of 50 mg/kg body weight at 7-day intervals, during pregnancy. After the experimental period, serum and tissue samples from the liver and the heart were obtained and used in the biochemical assays. Statistical design... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-08-18Bitstream added on 2014-06-13T20:00:13Z : No. of bitstreams: 1 otani_l_dr_rcla.pdf: 342288 bytes, checksum: 617b9a7fa593d0e15872392da6ee55a7 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Apesar das inúmeras vantagens da endotermia, os animais endotérmicos necessitam do constante aporte de energia. As variações na qualidade da dieta são tidas como um dos principais agentes seletivos envolvidos na evolução de padrões comportamentais, morfológicos e fisiológicos de endotérmicos. O presente trabalho procurou analisar os mecanismos ingestórios e digestórios utilizados por Artibeus lituratus quando deparado com a queda na qualidade da dieta, e seus efeitos sobre o metabolismo basal (TMB) e a capacidade termogênica (CT). Após 7, 30 e 90 dias de aclimatação a dietas artificiais com diferentes teores de fibras, foram quantificadas a eficiência digestória, a TMB, a CT, a condição corpórea e massa dos órgãos viscerais. A. lituratus sob dieta de baixa qualidade apresentaram maiores digestibilidade de matéria seca e energia, com um maior aporte de energia metabolizável ingerida. No entanto, nenhuma alteração foi observada nos órgãos viscerais, com exceção dos rins. A hipertrofia desse órgão pode ter sido conseqüência da maior ingestão de proteínas. A ausência de flexibilidade fenotípica na massa dos órgãos pode ser devida a uma combinação de fatores, incluindo o uso de ajustes comportamentais (produção de ejetas) e/ou a utilização de reservas energéticas. A TMB e a CT apresentaram-se maiores para os morcegos sob dieta de baixa qualidade. Como não houve alteração na massa dos órgãos em função da qualidade da dieta, e tampouco correlação entre massa dos órgãos e TMB, os mecanismos responsáveis pelo maior gasto energético basal de morcegos expostos à dieta de baixa qualidade são incertos, mas podem estar relacionados a uma maior atividade enzimática dos órgãos viscerais. A maior CT de morcegos expostos à dieta de baixa qualidade não pode ser explicada pelo modelo clássico da capacidade aeróbica. A CT foi influenciada... / Although endothermy has innumerous advantages, endothermic animals need constant energy ingestion. Variations on diet composition are among the most important selective determinant factors of behavior, morphologic and physiologic aspects of evolution of endothermic animals. In spite of the numerous advantages of endothermy, such animals require constant energy income. This study aims to analyze ingestion and digestion mechanisms employed by Artibeus lituratus when facing a decrease in food quality, and the influence of this on its basal metabolism (BMR) and thermogenic capacity (TC). Past 7, 30 and 90 days of acclimation to diets containing different fiber concentrations, we quantified the digestive efficiency, BMR and TC of the bats, and also recorded their body condition and visceral organs masses. The species presented higher dry matter and energy digestibility, and also high metabolizable energy intake under low quality diet condition, but there were no observed morphological alterations on their internal organs, with the exception of their kidneys, which were unusually increased. This could have been due to higher protein ingestion. The lack of phenotypic variation in the visceral mass could have been caused by a myriad of factors, including behavioral adjustments (i.e. ejecta production), or utilization of energetic reserves. There was an increase of the BMR and TC of bats under low quality food conditions. As there were no alterations on the internal organs mass neither any detected correlation between this mass and the BMR of the bats, perhaps the greater energy expenses responsible mechanisms could be involved with a greater enzymatic activity of the internal organs. The observed greater TC of the bats fed on low quality food is not explainable through the classical aerobic capacity model. TC was influenced by fat mass, independently of diet quality and acclimation time. However... (Complete abstract click electronic access below)

O mecanismo de ação dos esteróides sexuais sobre a proliferação e diferenciação do endométrio envolve a participação de fatores de crescimento e protooncogenes, cuja regulação é pouco conhecida. O objetivo deste trabalho foi investigar a influência do ciclo menstrual e os efeitos do acetado de medroxiprogesterona (MP A) sobre a expressão de prolactina (PRL), do protooncogene c-los e do fator de crescimento TGF~ no endométrio humano in vivo. Quarenta e seis mulheres com ciclos regulares receberam, de forma randomizada, placebo ou MP A (10mg/ dia, 10 dias). Em seguida foram submetidas a biópsia do endométrio e as amostras foram classificadas em 3 grupos de acordo com a fase do ciclo/tratamento: Proliferativo/Placebo (grupo 1, N=ll), Secretor/Placebo (grupo 2, N=18) e Secretor/MPA (grupo 3, N=8). Parte do material foi fixada em formol e incluída em parafina, sendo posteriormente submetida a coloração por imuno-histoquímica. O restante foi congelado a -70°C para posterior análise do RNA mensageiro (mRNA) pela técnica de RT-PCR. Encontrou-se PRL imunorreativa no epitélio glandular de 9,1% das amostras do grupo 1, em 55,6% das amostras do grupo 2 e em 100% das amostras do grupo 3 (p<0,05; teste de Fisher). No estroma endometriat observou-se imunocoloração para PRL em 9)% , 66,7% e 87,5% das biópsias dos grupos 1, 2 e 3, respectivamente (p<0,01). Os níveis médios de mRNA da PRL foram maiores na fase secretora (grupo 2) e significativamente maiores no grupo 3 em relação ao grupo 1 (p<0,05). Observou-se imunocoloração para c-los (predominando no núcleo das células estremais) em 54,5% das biópsias do grupo 1, em 7,1% das do grupo 2 e em nenhuma do grupo 3 (p<0,05, grupo 1 vs 2 e 3). Os níveis de mRNA do c-los foram substancialmente menores nos grupos 2 e 3 comparados ao grupo 1 (p<0,05) e apresentaram correlação direta com os níveis séricos de estradiol (r= 0,56; p<0,02). Não houve diferença entre os grupos quanto à expressão de TGF~l. Entretanto, a freqüência de amostras com imunocoloração positiva para TGFB3 e os níveis de mRNA do TGFB3 foram sucessivamente maiores nos grupos 2 e 3 em comparação com o grupo 1. Os dados demonstram aumento da expressão de PRL e TGF~3 e inibição da expressão de c-los no endométrio durante a fase secretora do ciclo menstrual, bem como no endométrio estimulado por MPA. A inibição de c-los e o aumento na expressão de TGFB3 poderiam participar do mecanismo antiproliferativo da progesterona e dos progestogênios sobre o endométrio humano in vivo. / Growth factors anci protooncogenes are involveci in the mechanism of sex steroicistirnulateci growth anci ciifferentiation of the enciometriurn, but their precise regulation remains unclear. The aim of the present stuciy was to evaluate the influence of menstrual cycle anci the effects of meciroxyprogesterone acetate (MP A) on the expression of prolactin (PRL), c-los anci transforrning growth factor beta (TGFI3) in the hurnan enciometriurn in vivo. Forty-six cycling women were ranciomizeci to receive either 10 mg MPA or placebo, once a ciay ciuring 10 ciays. Enciometrial specirnens were obtaineci about 8-12 hours following the last tablet intake anci patients were classifieci into three groups accorciing to biopsy ciating anci treatment: Proliferative/Placebo (group 1, N=ll), Secretory /Piacebo (group 2, N=18) anci Secretory /MP A (group 3, N=8). Enciometrial sampies were partially snap-frozen in liquici nitrogen anci partially fixeci in formalin, embecicieci in paraffin anci staineci by irnrnunohistochemistry. Messenger ribonucleic acici (rnRNA) leveis were assessed by reverse transcriptidase polymerase chain reaction (RT-PCR). Irnmunoreactive PRL was found in the epithelium of 9.1% of the specirnens from group 1, in 55.6% of group 2, anci in 100% of group 3 (p<0.05, Fisher's exact test). In the enciometrial stroma, immunopositive PRL was present in 9.1%, 66.7% anci 87.5% of the specirnens from groups 1, 2 anci 3, respectively (p<0.01). The average leveis of PRL mRNA were slightiy increaseci in group 2 anci markecily increaseci in group 3 compareci to group 1 (p<0.05). Irnrnunoreactive c-los was concentrateci in the nucleus of stromal cells in 54.5% of the biopsies from group 1, in 7.1% of group 2, and in 0% of group 3 (p<0.05, group 1 vs 2 and 3). The leveis of c-los mRNA were greatly reciuceci in groups 2 anci 3 compareci to group 1 (p<0.05) anci correlateci positiveiy with serum estraciiollevels (r=0.56, p<0.02). There were no ciifferences between groups conceming to the enciometrial expression of TGFI31. However, the frequency of immunopositive samples for TGFB3 anci the leveis of TGFB3 rnRNA were higher in groups 2 anci 3 compareci to group 1. 1t is conclucieci that MP A induces PRL anci TGFB3 and inhibits c-los expression in endometrial cells in vivo, resembling what occurs ciuring the secretory phase of spontaneous ovulatory cycles. The inhibition of c-los and the increase of TGFB3 expression may contribute to the antiproliferative effect of progestins on the endometriurn.

Este experimento foi conduzido para avaliar o efeito do sistema de incubação - estágio múltiplo (EM) e estágio único (EU) - sobre as características de pintos Cobb-500, machos e fêmeas, ao nascimento, bem como a morfologia intestinal, metabolismo e desempenho no período de 1 a 40 d. Um total de 1.968 ovos férteis, foram incubados em duas incubadoras sob condições comerciais. Na avaliação dos pintos no nascimento, observou-se uma influência do sistema de incubação no comprimento do pinto, sendo que as aves nascidas em sistemas EU foram mais longas do que as nascidas em sistemas EM, assim como as fêmeas apresentaram maior peso relativo do intestino em comparação aos machos. No entanto, ao nascimento não foram observadas diferenças no peso vivo e peso corporal livre de gema devido ao sistema de incubação e devido ao sexo. No período de 1 a 40 d, aves nascidas em EU foram as mais pesadas, e tiveram maior ganho de peso, bem como melhor conversão alimentar, do que as nascidas em EM, sem diferenças para consumo de ração e conversão alimentar. Salienta-se que este resultado deve-se, sobretudo às fêmeas de EM que sempre mostraram, ainda que só numericamente em alguns períodos, piores respostas do que os outros tratamentos, colocando a média de desempenho das aves de EM num nível inferior. Observou-se que o sexo influenciou a altura dos vilos do duodeno em pintos de corte de 0 d, sendo que as fêmeas mostraram vilos maiores do que os machos. Além disso, aves nascidas em sistemas de EU tiveram criptas mais profundas do que as nascidas em EM. Já aos 7 dias de idade, devido ao fato que os machos apresentaram un consumo de alimento significativamente maior, as diferenças na altura do vilo do duodeno encontradas ao nascimento desapareceram, sendo observado só um efeito do sexo na profundidade da cripta do jejuno, onde as fêmeas exibiram criptas mais profundas do que os machos. No que diz respeito aos coeficientes de metabolizabilidade de nutrientes, dos 5 aos 7 d, fêmeas foram mais eficientes em metabolizar a energia e apresentaram maiores valores de EMAn do que machos, sem diferenças para o sistema de incubação. A diferença devida ao sexo pode ser sustentada pelo maior peso relativo do intestino e vilos duodenais mais longos que as fêmeas exibiram no nascimento. As melhores condições de incubação observadas no sistema de estágio único melhoraram o desempenho das aves (2,98%), especialmente das fêmeas (5.04%). / This experiment was conducted to evaluate the effect of incubation system – multiple-stage (MS) and single-stage (SS) – on the Cobb-500 chickens characteristics at hatch, as well as intestinal morphology, metabolism and performance in the period from 1 to 40 d of age. A total of 1,968 fertile eggs were incubated in two incubators under commercial conditions. In hatchlings evaluation, it was observed an influence of incubation system on chick length, being that the birds hatched in SS were longer than those hatched in MS, as well as the females had higher relative intestine weight compared to males. However, at hach there were no differences in BW and yolk-free body mass due to incubation system and sex. In the period from 1-40 d, the birds hatched in SS were heaviest and had higher weight gain, as well as better AFCR, compared to the ones from MS, without differences for feed intake and feed conversion ratio. This result is due mainly to MS females which always, although in some periods only numerically, worse responses than the other treatments, placing the average MS performance at a lower level. I was observed that the sex influenced the height villi of duodenum in chickens at 0 d-age, being that females showed larger villis than males. Moreover, the birds hatched in SS system had deeper crypts than those hatched in MS. Already at 7 d-age, due to fact that males had higher feed intake, the differences in villi height of duodenum found at hatch disappeared, being observed only a gender effect on the crypt depth of the jejunum, where the females showed deeper crypts than males. As regards the metabolism coefficients of nutrients, from 5 to 7 d, females were more efficient in metabolizing energy and showed higher AMEn values than males, with no differences caused by the incubation system. The difference since to sex can be sustained by greater relative intestine weight and longer duodenal villis that females exhibited at hatch. The best incubation conditions observed in the single-stage system improved broiler performance (2.98%), especially in the females (5.04%).