La spectrométrie de masse est une technique utilisée en protéomique pour identifier des protéines inconnues dans un échantillon. Le spectromètre mesure la masse de fragments de la protéine et fournit ainsi des spectres expérimentaux qui sont des représentations, sous forme de séries de pics, de la présence de ces différents fragments. En étudiant ces spectres, nous espérons pouvoir identifier la protéine d'origine en la retrouvant dans une banque. L'objectif de cette thèse est de proposer de nouvelles méthodes permettant d'étudier ces spectres. Cependant, ces méthodes doivent fonctionner sur des organismes non séquencés. Dans ce cas particulier, nous ne retrouverons pas exactement ces protéines dans la banque, mais uniquement des protéines qui y ressemblent. Nous proposons tout d'abord un nouvel algorithme dit de comparaison de spectres : PacketSpectralAlignment. Cet algorithme permet de comparer des spectres expérimentaux à des spectres créés à partir des données contenues dans la banque, et ce, même en présence de modifications. Cette comparaison permet l'association de chacun des spectres à un peptide de cette banque. Ensuite, nous détaillerons différents prétraitements et filtrages permettant d'améliorer l'exploitation de notre nouvel algorithme. Tous ces éléments sont intégrés dans une plate-forme intitulé SIFpackets. Enfin, nous validons les résultats de PacketSpectralAlignment ainsi que de SIFpackets sur différents jeux de données réelles.

La protéine p76 (« hypothetical protein LOC196463 ») a été identifiée au laboratoire lors d'une analyse protéomique ciblant les protéines mannose-6-phosphate de lignées cellulaires humaines U937 et MCF7. Ce rapport de thèse présente l'étude de cette protéine concernant certaines de ses caractéristiques biochimiques, sa localisation intracellulaire et l'approche de sa fonction. Ainsi, nous avons mis en évidence la présence de 6 N-glycosylations, ainsi que la présence effective de sucres mannose-6-phosphate. Une maturation protéolytique des précurseurs de la forme humaine et murine de p76 a été observée ; les chaînes issues de ces clivages ont été en partie caractérisées à l'aide des anticorps développés au laboratoire. L'étude de sa localisation intracellulaire par immunofluorescence et par fractionnements subcellulaires réalisés sur du foie de souris indique clairement que p76 est localisée dans les lysosomes. Enfin, p76 ayant une homologie de séquence avec une phospholipase B nouvellement caractérisée de Dictyostelium discoideum, des tests fonctionnels ont été mis en œuvre pour détecter une telle activité pour la protéine recombinante hp76-myc, mais sans succès. En revanche, une expérience de fat blot a montré que hp76-myc se lie à la cardiolipine, un phospholipide particulier des membranes mitochondriales et bactériennes.

Les cils sont des organites très conservés au cours de l'évolution des eucaryotes et présents à la surface de presque tous les types cellulaires. Ils sont constitués d'une structure microtubulaire, l'axonème, entourée d'une membrane en continuité avec la membrane plasmique. Ils sont nucléés par un corps basal, centriole ancré à la surface cellulaire. Grâce aux nombreux récepteurs qu'ils concentrent à leur membrane, tous les cils sont des senseurs de leur environnement. Ils peuvent aussi être motiles et assurer, par leur battement coordonné, le déplacement relatif de la cellule et du fluide environnant. Tandis que cil et structure centriolaire, hérités du premier eucaryote, ont été perdus par certains champignons et par les plantes supérieures, certains gènes codant des protéines ciliaires et centriolaires sont pourtant retrouvés dans le génome de ces espèces. Cette conservation de protéines sans l'organite suggère soit que ces protéines interviennent dans un même processus moléculaire utilisé dans plusieurs organites, soit qu'elles jouent des rôles dans des processus moléculaires distincts via leur interaction avec différents types de partenaires.J'ai choisi d'étudier l'une de ces protéines ciliaires et centriolaires, Bug22p, hautement conservée en séquence protéique entre l'homme et la paramécie, mais également présente chez les plantes supérieures. J'ai mené cette étude principalement sur la paramécie, système modèle pour la biogénèse des corps basaux et des cils, mais aussi sur des cellules de mammifère et de végétaux supérieurs. Si Bug22p est impliquée dans la détermination du battement ciliaire chez la paramécie, elle se localise également dans des cils immotiles de cellules de mammifère suggérant que son activité ciliaire n'est pas réduite à cette seule fonction. Des expériences d'inactivation génique suggèrent par ailleurs un lien entre l'activité de Bug22p et la polyglycylation. Sa surexpression dans les cellules de mammifère en culture entraîne l'apparition d'extensions cellulaires et une augmentation des réseaux de tubulines acétylées probablement associées à une stabilisation des microtubules. L'ensemble de mes résultats suggère donc un rôle de Bug22p dans la régulation de modifications post-traductionnelles. En plus d'être présente dans les structures ciliaires, Bug22p se localise aussi bien dans les noyaux de la paramécie que dans ceux des cellules humaines et des plantes supérieures Arabidopsis et Nicotiana. Ces observations ouvrent un nouveau champ d'études. En effet, si l'on sait que les tubulines ciliaires sont soumises à différentes modifications post-traductionnelles telles que polyglycylation ou acétylation, ce type de modifications touchent également des protéines nucléaires régulant ainsi le trafic de protéines nucléaires ou l'expression génique. Nous pouvons donc avancer l'hypothèse selon laquelle Bug22p agirait sur la régulation de ces modifications dans le cil et dans le noyau. Il serait donc intéressant de caractériser les modifications post-traductionnelles chez les plantes supérieures afin de vérifier une possible implication de Bug22p dans leur régulation et donc comprendre les raisons de sa conservation chez les végétaux.

Les virus infectant les archées présentent des morphotypes inhabituels et des génomes extrêmement divers. Leur isolation a permis de développer nos connaissances sur la diversité de la virosphère et demeure une piste de recherche primordiale. Durant ma thèse, j’ai isolé et caractérisé de nouveaux virus d'archées et étudié les interactions virus-hôte dans un système modèle bien établi. Des cultures d'enrichissement et des analyses bioinformatiques nous ont permis de décrire de nouveaux virus de crénarchées hyperthermophiles infectant les espèces du genre Pyrobaculum et ainsi de mieux comprendre la diversité architecturale des virus filamenteux. De plus, un provirus a été identifié chez P. oguniense et l’étude de sa réplication a révélé par microscopie électronique des nanostructures pyramidales à la surface des cellules ressemblant à des structures connues de sortie des virions chez des virus de crénarchées. Deux études de protéomique nous ont fourni un aperçu de la dynamique du protéome de Sulfolobus islandicus : l’analyse du protéome de cellules de S. islandicus non infectées a révélé de nombreuses modifications post-traductionnelles, et l’analyse de la régulation des protéines dans des cellules de S. islandicus infectées par le virus SIRV2 a révélé 136 protéines de l'hôte présentant une régulation temporelle significative. L’analyse structurale de SIRV2 a permis d'étudier la résistance des virus crénarchées à des conditions extrêmes et a révélé pour la première fois que la forme A de l'ADN est biologiquement pertinente. Ces résultats ont contribué au développement des connaissances sur la diversité de la virosphère et sur l'évolution des virus d'archées. / Viruses infecting Archaea display unusual morphotypes and highly diverse genomes. Several virus-host systems have emerged enabling the detailed characterization of virus-host interplay in archaea. However, isolation of new archaeal viruses proved to be instrumental for expanding the knowledge on the diversity of the Earth’s virosphere. Therefore, I have focused on two major lines of research: isolation of new archaeal viruses and characterization of the virus-host interactions in a well-established model system. A new Pyrobaculum virus with a unique architecture among DNA viruses was described, expanding our knowledge on the diversity of architectural solutions explored by filamentous viruses. Furthermore, attempts to trigger the replication of a provirus in P. oguninese led to the development of six-fold pyramidal nanostructures on the cell surface, resembling known virion egress structures of archeal viruses. Finally, I focused on the interplay between Sulfolobus islandicus and the rod-shaped virus SIRV2. Two proteomic studies yielded insights into the dynamics and posttranslational modifications (PTMs) of the Sulfolobus proteome. Sulfolobus proteins were found to carry a high degree of PTMs on functionally diverse proteins. The global analysis of the regulation of viral and host proteins in SIRV2-infected S. islandicus cells yielded insights the temporal regulation of host and virus proteins. Structural studies on SIRV2 virion have resulted in the first ever description of A-form DNA being a biologically relevant form of DNA. Together, these results contribute to the knowledge on the diversity of the extant virosphere, and the biology and evolution of archaeal viruses.

Pseudomonas aeruginosa PA14 est une bactérie pathogène très résistante aux antibiotiques et impliquée dans de nombreuses infections nosocomiales. Toutefois, la disponibilité d'agents antibactériens efficaces contre cette bactérie manque cruellement à ce jour. Explorer la physiologie de P. aeruginosa au niveau des modifications post-traductionnelles (PTMs) pourrait fortement contribuer au développement de nouveaux agents thérapeutiques. En effet, il a été montré certaines corrélations entre les PTMs et la virulence, l’adaptation et la résistance bactérienne. De plus, les progrès récents en protéomique ont permis d’accéder à un nombre croissant des protéines modifiées. Pourtant, leur description reste un véritable challenge.Dans une première partie, nous avons étudié l'impact des kinases et des phosphatases sur la physiologie de P. aeruginosa PA14. Cependant, aucune différence de phénotype n'a été observée entre les 8 mutants de ces enzymes et la souche sauvage.Dans une deuxième partie, nous avons caractérisé le succinylome et l'acétylome de la lysine chez P. aeruginosa PA14 dans quatre sources de carbone (glucose, citrate, succinate et glutamate) par enrichissement par anticorps couplé à la spectrométrie de masse. Ainsi, 1 530 sites succinylés (617 protéines) et 1 109 sites acétylés (526 protéines) ont été identifiés. De façon intéressante, 622 sites (312 protéines) ont été observés acétylés ou succinylés sur la même lysine, révélant ainsi l'existence de protéoformes pour une même protéine. Les protéines modifiées sont impliquées dans tous les processus biologiques. Toutefois, certaines d'entre elles ont des fonctions dans la résistance aux antibiotiques, le chimiotactisme et la virulence.Nous avons également quantifié les peptides succinylés et/ou acétylés dans les 4 sources de carbone. Les peptides succinylés étaient principalement sur-exprimés en citrate, mais aucune différence significative n’a été observée pour les peptides acétylées.Dans une troisième partie, nous avons étudié par immunoprécipitation le succinylome et l’acétylome de la lysine des protéines extracellulaire de P. aeruginosa. Nous avons montré que certaines lysines des protéines LasB et CbpD, deux facteurs de virulence, sont modifiées par 9 PTMs différentes. Une approche d’électrophorèse bi-dimensionnelle (2D) a permis de révéler et de quantifier les protéoformes des protéines extracellulaires et plus spécifiquement de ces facteurs de virulence.Dans une quatrième partie, une approche quantitative « label-free » a permis de mettre en avant 581 protéines qui varient différemment selon la source de carbone. Parmi ces protéines, 67 biomarqueurs ont été identifiés par approche statistique.Ces travaux constituent un point de départ prometteur pour de futures études sur le rôle de la succinylation de la lysine et d'autres PTMs chez P. aeruginosa. / Pseudomonas aeruginosa PA14 is a multi-drug resistant human pathogen largely involved in nosocomial infections. Unfortunately, today, effective antibacterial agents lacked. Explore its physiology at the post-translational modification (PTMs) level may contribute to the renewal of combat tactics. Indeed, some correlations between PTMs and the bacterial virulence, adaptation and resistance have been shown. The recent improvements in proteomics have increased the number of modified proteins. However, their characterization believes a real challenge.In the first part, we focused on the impact of kinases and phosphatases on bacterial physiology of P. aeruginosa PA14. For this purpose, we compared different phenotypes of 8 mutants of kinase and phosphatase with the WT strain. Unfortunately, no difference was observed.In the second part, we characterized the lysine succinylome and acetylome in P. aeruginosa PA14 in 4 carbon sources (glucose, citrate, succinate and glutamate) by mass spectrometry. Overall, a total of 1 530 succinylated sites (617 proteins) and 1 109 acetylated sites (526 proteins) were identified. Interestingly, we noticed that 622 sites (312 proteins) can be either acetylated or succinylated on the same lysine. This reveals the existence of proteoforms for a same protein. As expected, many modified proteins are involved in a wide range of biological processes but some of these proteins have interesting functions like antibiotic resistance, chemotaxis and virulence.We also tried to quantify succinylated and/or acetylated peptides in the 4 carbon sources. Succinylated peptides were mainly over-represented in the citrate condition whereas no significant difference was observed for the acetylated forms.In the third part, we investigated the lysine succinylome and acetylome of P. aeruginosa in extracellular compartment by immunoprecipitation. We showed that some lysines of two virulence factors, LasB and CbpD, were modified by 9 different PTMs. We also used a 2-dimensional gel approach to reveal and quantify proteoforms of extracellular proteins and more specifically virulence factors. In the fourth part, we did a label-free quantitative approach to obtain protein abundance in each carbon source. In total, 581 proteins vary differently depending on the carbon source. Among these proteins, 67 biomarkers were identified by statistical approach.This work is a promising starting point for further investigations on the biological role of lysine succinylation, and others PTMs, in P. aeruginosa.

Nous montrons dans cette étude que dans les cellules déplétées pour la nucléoline, une plus faible accumulation de pré-ARNr est associée à une augmentation de marques d’hétérochromatine (H3K9me2) et une diminution de marques d’euchromatine (H4K12ac et H3K4me3) sur la chromatine des gènes ribosomiques. Des expériences de ChIP-seq montrent que la nucléoline est enrichie dans la région codante et promotrice de l’ADNr et est préférentiellement associée avec les gènes non méthylés des ARNr. La déplétion de la nucléoline entraîne une accumulation de l’ARN Pol I au début de l’ADNr et une diminution de UBF sur la région codante et promotrice. La nucléoline interfère avec la liaison de TTF-1 sur le promoteur-proximal T0, inhibant ainsi le recrutement de TIP5 du complexe NoRC, et établissant un état d’hétérochromatine répressive. Ces résultats révèlent l’importance de la nucléoline dans le maintien d’un état euchromatinien des ADNr et dans l’élongation de la transcription. Nous montrons aussi dans cette thèse que l’acétylation est une nouvelle modification post-traductionnelle de la nucléoline. Des études d’immunofluorescence utilisant l’anticorps anti nucléoline acétylée montrent que la nucléoline acétylée est exclue des nucléoles. De plus, par ChIP-seq nous n’avons jamais pu détecter d’association significative de la nucléoline acétylée sur la chromatine des ADNr. Aussi, nous n’avons détecté aucune activation de la transcription de Pol II sur des matrices de chromatine avec la nucléoline acétylée. Nous trouvons une distribution de la nucléoline acétylée majoritairement dans le nucléoplasme où elle co-localise parfaitement avec le facteur d’épissage SC35, et partiellement avec les structures marquées avec un anticorps dirigé contre Y12, mais ne co-localise pas avec des structures contenant la coïline, ce qui suggère que cette fraction de la nucléoline pourrait être impliquée dans la synthèse ou le métabolisme des pré-ARNm. / Here we have shown that, in nucleolin depleted cells, lower accumulation of pre-rRNA is associated with the increase in heterochromatin marks (H3K9me2) and decrease of the euchromatin histone marks (H4K12Ac and H3K4me3) in rDNA chromatin. ChIP-seq experiments show that nucleolin is enriched in the coding and promoter region of the rDNA and is preferentially associated with the unmethylated rRNA genes. Nucleolin knockdown results in the accumulation of RNAPI at the beginning of the rDNA and a decrease of UBF in the coding and promoter regions. Nucleolin is able to interfere with the binding of TTF-1 on the promoter-proximal terminator T0 thus inhibiting the recruitment of the NoRC subunit TIP5 and HDAC1 and establishing a repressive heterochromatin state. These results reveal the importance of nucleolin in the maintenance of the euchromatin state of rDNA and transcription elongation.In this thesis we have also shown that acetylation is a novel post-translational modification of nucleolin. Immuno-fluorescence studies using anti-acetylated nucleolin antibody illustrated that acetylated nucleolin is excluded from nucleoli and interestingly, neither could we detect any significant binding of ac-nucleolin on rDNA chromatin by doing ChIP-Seq, nor did we detect any activation of Pol II transcription with ac-nucleolin from DNA and chromatin templates. Moreover, we found acetylated nucleolin had a predominant nucleoplasmic distribution where it associates with the splicing factor SC35 and partially with the structures labeled with Y12 antibody, but not with coilin containing structures.

Les activités de recherche présentées dans ce document s'articulent en deux parties distinctes. La première partie concerne des travaux réalisés au sein de l'équipe du Pr Guy Serre, à la faculté de Médecine Purpan et portant sur la caractérisation des antigènes cibles d'auto-anticorps associés à une maladie auto-immune, la polyarthrite rhumatoïde. La seconde partie, réalisée au sein de l'Unité Mixte CNRS-Pierre Fabre dirigée par le Pr Jean-Edouard Gairin, est centrée sur l'étude d'un système biologique impliqué dans la dégradation des protéines intracellulaires, le système ubiquitine-protéasome et pouvant générer des cibles d'intérêt thérapeutique dans le domaine du cancer.<br /> <br />1. La polyarthrite rhumatoïde et les auto-anticorps anti-protéines citrullinées :<br /><br />La polyarthrite rhumatoïde est une maladie auto-immune d'étiologie inconnue, caractérisée par une inflammation chronique et destructive des articulations synoviales. Le processus auto-immun rhumatoïde fait l'objet d'intenses recherches et bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension de certains mécanismes immuno-pathologiques mis en jeu, il n'a pas été possible d'identifier un élément unique comme responsable du processus inflammatoire auto-immun. Il est donc communément admis aujourd'hui que c'est la combinaison de divers facteurs qui détermine l'apparition et l'entretien de la maladie. <br />La présence dans le sérum des patients, d'anticorps décrits pour leur marquage du Stratum Corneum (ou couche cornée) de l'épithélium d'œsophage de rat et de l'épiderme humain, s'est avérée comme une caractéristique suffisamment fréquente et spécifique de la maladie rhumatoïde pour qu'on puisse les suspecter de jouer un rôle significatif dans les processus responsables de l'inflammation articulaire chronique. Afin de mieux comprendre le rôle joué par ces auto-anticorps qualifiés alors d'anticorps « anti-kératines » dans la pathogénie rhumatoïde, il était essentiel d'identifier leur cible antigénique. L'analyse par immunotransfert, à l'aide de sérums rhumatoïdes, d'extraits d'épithélium d'œsophage de rat a permis de détecter, comme cibles murines des auto-anticorps, trois antigènes solubles dans des tampons de faible force ionique. Ces trois protéines ne correspondent pas à des cytokératines mais à de nouvelles protéines spécifiques des étapes tardives du programme de différenciation de l'épithélium d'œsophage de rat. D'autre part, l'antigène ciblé dans l'épiderme humain a été identifié à un variant acide de la filaggrine, protéine jouant un rôle physiologique dans l'agrégation des filaments de kératines de l'épiderme. Ces formes acides sont générées in situ par modification post-traductionnelle des résidus arginine basiques en résidus citrulline par une enzyme, la peptidyl arginine déiminase, exprimée dans l'épiderme. Cette modification a pu être reproduite in vitro après action de la peptidyl-arginine déiminase (PAD) sur divers polypeptides dérivés de la séquence de la filaggrine et il a été ainsi montré que les épitopes reconnus par les auto-anticorps pouvaient être générés par la déimination post-traductionnelle des filaggrines.<br /> Toutefois, la filaggrine n'étant pas exprimée dans les tissus osseux et synoviaux, nous avons recherché une cible articulaire de ces anticorps portant des épitopes déiminés et immunologiquement apparentée à la filaggrine. Ayant à disposition des tissus synoviaux provenant d'une série de patients, deux protéines, p55-61 et p64-78, portant toutes deux des résidus citrullines ont été extraites des membranes synoviales et reconnues spécifiquement par les sérums rhumatoïdes; ces protéines ont été identifiées aux chaînes a et b de la fibrine. Le fait que ces deux protéines ne soient ciblées par les sérums rhumatoïdes qu'après déimination par une PAD, soulignait soulignait le rôle émergent d'une « immunité anti-citrulline » reconnue aujourd'hui comme pouvant être à la base de certains dérèglements impliqués dans diverses maladies auto-immunes.<br /><br />2- Le système ubiquitine-protéasome et ses implications dans le cancer :<br /><br />Le protéasome est un complexe multicatalytique présent dans le cytoplasme et le noyau de toutes les cellules eucaryotes. Il constitue la machinerie protéolytique de la voie ubiquitine-protéasome, voie majeure responsable de la dégradation des protéines intracellulaires. Cette voie détermine la durée de vie et la concentration de nombreuses enzymes et protéines régulatrices dont beaucoup jouent un rôle dans les processus de cancérisation.<br /> Afin de mieux connaître le fonctionnement de cette machinerie protéolytique, nous avons étudié les mécanismes moléculaires intervenant dans la régulation du protéasome 20S qui constitue le cœur catalytique du système. L'analyse protéomique du protéasome 20S préparé à partir de cellules humaines non pathologiques a permis l'identification de l'ensemble des sous-unités constitutives du protéasome 20S et a révélé l'existence de modifications post-traductionnelles de type phosphorylation. Deux nouvelles sous-unités phosphorylées , les sous-unités b2 et b7, ont pu être identifiées posant ainsi la question du rôle joué par ces phosphorylations dans la régulation fonctionnelle du protéasome 20S. <br /> L'analyse similaire des protéasomes exprimés dans diverses lignées tumorales a révélé une complexité structurale importante avec en particulier la co-expression de deux formes de protéasomes : le protéasome dit standard et l'immunoprotéasome. L'étude fonctionnelle de ces protéasomes a montré une sensibilité différente de ces deux formes à certaines molécules de la chimiothèque de substances naturelles purifiées dans l'UMS de Chimie CNRS-Pierre Fabre. En accord avec ceci, l'analyse comparative des protéasomes présents dans les cellules normales comparées à ceux présents dans les cellules tumorales d'un même patient a confirmé la surexpression de l'immunoprotéasome dans les cellules cancéreuses. Le système ubiquitine-protéasome est un système cellulaire particulièrement sensible aux facteurs micro-environnementaux et l'induction de l'immunoprotéasome témoigne de ce processus. Dans ce contexte, nos résultats font émerger la question de l'impact de l'immunoprotéasome sur la dérégulation du système ubiquitine-protéasome dans la cellule tumorale. Afin de répondre à cette question, des lignées de lymphomes surexprimant l'immunoprotéasome ont été développées ainsi que des substrats peptidiques fluorescents spécifiques de l'immunoprotéasome ou du protéasome.<br />Outre une meilleure connaissance de cette machinerie protéolytique, la continuité de ce travail devrait aboutir à l'identification de nouveaux agents pharmacologiques anti-tumoraux. Enfin, il s'intègre pleinement dans la logique de l'UMR 2587 CNRS-Pierre Fabre en témoignant d'un effort de recherche focalisé sur des systèmes biologiques pouvant générer des cibles d'intérêt thérapeutique dans le domaine du cancer.

Les éléments transposables sont des séquences génomiques capables de se répliquer et de se déplacer dans les génomes. Leur capacité à s'insérer près des gènes et à produire des réarrangements chromosomiques par recombinaison entre copies, font des éléments transposables des agents mutagènes. Les éléments transposables sont de plus capables de modifier l'expression des gènes voisins grâce aux régions promotrices qu'ils possèdent. Les éléments transposables ont été trouvés dans la plupart des génomes dans lesquels ils ont été recherchés. Ils forment ainsi 45 % du génome de l'homme et peuvent représenter jusqu'à 90 % du génome de certaines plantes. Dans la première partie de ma thèse, je me suis penché sur les facteurs qui déterminent la distribution de ces éléments. Je me suis intéressé à un facteur particulier, qui est la fonction des gènes dans le voisinage des insertions d'éléments transposables. Dans la deuxième partie, j'ai essayé de déterminer l'impact de l'altération des modifications épigénétiques (modifications d'histones plus précisément) associées aux différents composants géniques, dont les éléments transposables, sur la variation de l'expression des gènes en condition tumorale.

Dans ce travail de thèse, nous avons développé et optimisé une stratégie originale pour la caractérisation des extrémités N-terminales des protéines et des sites de clivages protéolytiques. Elle s'appuie sur la dérivation chimique spécifique des amines N-terminales et nous l'avons adapté à différents types d'échantillons biologiques. L'application de cette stratégie dans des études en biologie nous a permis d'apporter plusieurs éléments de réponse à différentes problématiques. Nous avons ainsi caractérisé les peptides de transit des protéines mitochondriales humaines et ainsi validé/corrigé expérimentalement leurs prédictions dans les banques de données. Nous avons aussi appliqué cette stratégie à l'étude du protéome du parasite P. falciparum. La mise au point de la dérivation N-terminale de protéines immobilisées dans un gel SDS PAGE nous a permis d'étudier le mécanisme d'export des protéines de ce parasite vers sa cellule hôte et de déterminer le rôle des acides aminés impliqués dans cet export. Un réactif de dérivation marqué aux isotopes stables permet d'effectuer des études différentielles des processus protéolytiques que subissent les protéines. Cette stratégie quantitative a été appliquée à l'étude du protéome hépatique du rat soumis au jeûne expérimental. D'autres applications de l'analyse protéomique en biologie sont aussi présentées dans ce manuscrit.

Le principal intérêt de nos études présentées dans ce manuscrit, correspond à la compréhension des évènements, reliés aux acylations d’histones au niveau des lysines (Ks) dans les cellules germinales post méiotiques, qui régulent spécifiquement l’expression des gènes à l’échelle du génome entier.Dans la première partie de mon travail, nous avons élaboré une stratégie afin d’analyser le rôle des « histones acetyl transférases » (HATs), Cbp et p300, dans les cellules germinales post méiotiques. Pour ce faire, nous avons généré une lignée de souris conditionnellement et partiellement invalidée pour les gènes Cbp et p300 dans les cellules post méiotiques. Bien que les souris mâles sont fertiles et que la spermatogénèse semble se dérouler normalement, une analyse transcriptomique des cellules germinales haploïdes post méiotiques précoces et tardives nous a permis d’identifier une série de gènes dont l’expression est augmentée dans les cellules spermatogéniques tardives et qui sont sensibles à la diminution des niveaux de Cbp et p300. Ces résultats ont permis de révéler un programme spécifique d’expression de gènes dans les cellules germinales post méiotiques dépendant des HATs correspondantes.Prenant en compte qu’il existe une variété d’acylations des histones au niveau des lysines, nous avons étendu nos études à une modification à « quatre-carbone », la butyrylation. Nous avons alors initié une analyse comparative de l’acétylation et de la butyrylation de l’histone H₄ en positions K5 et K8 dans les cellules germinales mâles en différentiation. Nous avons cartographié à l’échelle du génome les marques H4K5ac, H4K5bu, H4K8ac, et H4K8bu au niveau de deux étapes développementales critiques avec les cellules méiotiques et les cellules post méiotiques haploïdes. Cette cartographie montre que la majorité des gènes exprimés fortement, à la fois dans les cellules méiotiques et les spermatides précoces rondes haploïdes, qu’au niveau des sites d’initiation de la transcription (TSSs) l’acétylation et la butyrylation sont interchangeables. De façon intéressante, beaucoup de ces promoteurs correspondants sont aussi reconnus par un régulateur essentiel de l’expression des gènes lors de la spermatogénèse, le factor à bromodomaine, Brdt. Une étude détaillée, des capacités de liaison du facteur Brdt sur les parties N-terminales de l’histone H4 portant des combinaisons variées d’acétylation et/ou de butyrylation en position K5 et K8, montre que la marque H4K5bu inhibe fortement la liaison du facteur Brdt. Nos résultats suggèrent qu’en addition à la fonction activatrice de Brdt vis-à-vis du programme d’expression de gènes méiotiques et post méiotiques, l’échange (« turnover ») induit par la butyrylation d’H4K5 est également important. Ce travail montre comment une interconnexion entre deux différentes acylations d’une même lysine peut jouer un rôle régulateur essentiel en augmentant la dynamique de liaison de la chromatine par un lecteur de lysine acétylé, Brdt.Enfin, au cours d’un travail collaboratif portant sur des approches structurales, nous avons montré, malgré le fait que p300 soit répertoriée comme une acétylase robuste, que son activité est réduite lorsque la longueur des chaines acyl augmente. Ces résultats suggèrent qu’in vivo, p300 puisse utiliser un co-facteur spécifique pour assurer des acylations d’histones autre qu’une acétylation.Ces investigations mettent en lumière comment la programmation du génome mâle est guidée par diverses acylations d’histone et révèlent pour la première fois l’existence d’un réseau moléculaire qui régule ces acylations et transmet un impact fonctionnel. / The main focus of the investigations reported in this manuscript is the understanding of the regulatory events that are based on histone lysine modifications in post-meiotic male germ cells, where specific and chromosome-wide regulations of gene expression occur. In the first part of my work we designed a strategy to specifically investigate the role of the histone acetyl-transferases (HATs), Cbp and p300, in post-meiotic male germ cells.Accordingly, we generated double Cbp and p300 conditional knock-out mice resulting in a partial depletion of Cbp and p300 in post-meiotic cells. Although the mice were fertile and spermatogenesis seemed to take place normally, a transcriptomic analysis of early and late post-meiotic germ cells led to the identification of a specific subset of genes with an increased expression in late spermatogenic cells that is highly sensitive to the decreased amounts of Cbp and p300. In conclusion, these results have revealed an interesting new gene expression program specific to post-meiotic male germ cells that are specifically regulated by the considered HATs.Taking into account the occurrence of a variety of histone lysine acylations, we extended these investigations to a four-carbon histone lysine modification, butyrylation. Accordingly, we have undertaken a comprehensive comparative analysis of histone H4 acetylation and butyrylation on its K5 and K8 positions in differentiating male germ cells. Genome-wide mapping of H4K5ac, H4K5bu, H4K8ac and H4K8bu at two critical developmental stages, meiotic and post-meiotic haploid cells, shows an interchangeable use of acetylation and butyrylation in the Transcriptional Start Sites (TSSs) of the most highly expressed genes in both meiotic and haploid round spermatids. Interestingly, many of these promoters are also bound by the essential regulator of spermatogenic gene expression, the BET bromodomain-containing factor, Brdt. A detailed analysis of Brdt binding capacity of H4 tails bearing various combinations of K5 and K8 acetylation and butyrylation showed that H4K5 butyrylation severely interferes with Brdt-binding. Our results therefore indicate that not only Brdt is required for the activation of a meiotic and post-meiotic gene expression program, but also its turnover induced by H4K5 butyrylation is equally important. This work hence highlights how an interplay between two different acylations occurring on the same lysines can play an essential regulatory role by increasing the chromatin binding dynamics of a critical lysine acetyl-reader, Brdt.Finally, in a collaborative work with structural biologists we showed that while p300 is a robust acetylase, its activity gets weaker with increasing acyl chain length. These results suggest that in vivo, p300 would use a specific co-factor to ensure non-acetyl histone acylations.Overall, these investigations shed an important light on how the male genome programming is guided by histone acylations and revealed for the first time a molecular network that regulates histone acylations and mediates its functional impact.