Made available in DSpace on 2013-08-07T19:12:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000401361-Texto+Completo-0.pdf: 1361469 bytes, checksum: 329fa0580621e6b8b6156c8d6e01f764 (MD5) Previous issue date: 2001 / The genus Phyllocaulis Colosi, 1922 has being differenciated into five species based on anatomical and morphological analysis: P. variegatus (Semper, 1885), P. tuberculosus (Martens, 1868), P. boraceiensis Thomé 1976, P. soleiformis (Orbigny, 1835) and P. gayi (Fischer, 1872). Using classification emphasis is given to the form of the penis, spathe and the penal and pedal glands. However such criteria have been proved to be insufficient for identification of more complex groups, where the differentiating characteristics are not evident. There are five forms of Phyllocaulis soleiformis, A, B, C, D and E, representing populations from distinct geographical regions. In this investigation the entire genus was studied using scanning electron microscope (SEM) to examine the mandible, lateral and rachidian teeth and the radula. This examination together with the application of statistical analysis permitted the reclassification of form C of P. soleiformis as a new species. A complementary study based on the compilation of enzyme standards obtained from fragments of fourteen restriction enzymes which were applied in the regions ITS1 of 18S rDNA. The resulting gene distance tree showed form C of P. soleiformis to be a link between the two principal groups. Therefore, the application of these different methodologies led to the discrimination of the species P. variegatus, P. tuberculosus, P. boraceiensis, and P. gayi, forms A, B, D, and E and the differentiation of form C. As a result of these findings we propose that, P. soleiformis form C be renamed Phyllocaulis renschi Thomé, 1965. / O gênero Phyllocaulis Colosi, 1922 vem sendo diferenciado em cinco espécies, segundo análises morfológicas: P. variegatus, P. tuberculosus, P. boraceiensis, P. soleiformis e P. gayi. A ênfase é dada à forma do pênis, espata, glândula peniana e glândula pediosa. Esse critério vem se mostrando insuficiente para a resolução de grupos mais complexos, onde os caracteres diferenciais não são evidentes. Em P. soleiformis adotou-se formas A, B, C, D e E para populações que apresentam variabilidade morfológica e são oriundas de regiões geográficas distintas. Nesta investigação, abrangeu-se todas as espécies do gênero Phyllocaulis analisandose as ripas da mandíbula e os dentes laterais e raquidianos da rádula, a partir de microscopia eletrônica de varredura (MEV). Esta análise juntamente com tratamentos estatísticos permitiu reclassificar a forma C de P. soleiformis como uma nova espécie. Em outra investigação determinou-se o mapa físico empregando 14 enzimas de restrição de P. variegatus, P. tuberculosus, P. boraceiensis, P. soleiformis e, para fins comparativos, Belocaulus angustipes e Sarasinula linguaeformis. Esse mapa foi obtido através dos fragmentos da região ITS1 do 18S rDNA. A árvore de distâncias gênicas apresenta a forma C de P. soleiformis como um elo de ligação entre os dois principais agrupamentos por possuir um grande número de caracteres comuns com todo os outros táxons. Isto demonstra que a forma C sofreu poucas alterações ao longo de seu processo evolutivo. As diferentes técnicas levaram à caracterização das espécies P. variegatus, P. tuberculosus, P. boraceiensis, P. soleiformis com a diferenciação da forma C. Os resultados permitem propor a revalidação do nome Phyllocaulis renschi para a forma C de P. soleiformis.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:12:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000427622-Texto+Completo-0.pdf: 4680280 bytes, checksum: 75e54492eea58e6d4b33bd97da9115de (MD5) Previous issue date: 2010 / Among the angiostrongylid worms there are two extensively studied species because of their importance as causes of human health problems, Angiostrongylus costaricensis and A. cantonensis. While there are numerous in vitro studies on maintenance and evolution of trematodes, the literature is short of reports on similar trials with nematodes. Through cultivation and cocultivation with Biomphalaria glabrata embryonic cells, the best conditions were searched for the production of intra-mollusk larval stages from both parasites under study. A previous reported protocol for axenization of first stage larvae was adjusted especially concerning the concentration of sodium hypochlorite and a 0,25 % preparation was found effective. It was demonstrated that cultivation enriched with crude body proteic extract of B. glabrata resulted in a higher recovery of second stage larvae. In order to investigate the possibility of a differential expression of proteins after infection, bidimensional electrophoresis was performed. A 37 kDa protein with isoeletric point 4,2 was expressed exclusively at tissues of the infected snails. In order to guarantee the supply of first stage larvae for a future in vitro production of L3, several conditions for cryopreservation were assayed and the best larvae yield was achieved with a 1% dimethil-sulphoxide and 5% bovine fetal serum, and incubation time of 60 minutes before quick introduction into liquid nitrogen. In conclusion, although the unsuccessful trial to produce in vitro large amounts of L3, several aspects were assayed and the resulting knowledge may pave the way for the ongoing effort to establish an in vitro system that enables regular large production of parasitic forms.The results now reported have contributed to a better understanding of the complex task of in vitro manipulation of nematodes and the challenges standing ahead for the better understanding of their biology. / Dentre os angiostrongilídeos, há duas espécies que têm sido extensamente estudadas por constituírem problemas de saúde humana: Angiostrongylus costaricensis e A. cantonensis. Enquanto existem numerosos estudos sobre a manutenção e desenvolvimento in vitro de trematódeos, são poucas as tentativas registradas na literatura do mesmo esforço em relação aos nematódeos. Através do desenvolvimento de cultivos e co-cultivos com células embrionárias de B. glabrata buscou-se encontrar a forma mais adequada para a produção de larvas nas fases intramolusco dos dois parasitos em estudo. Em um trabalho anterior foi utilizada a axenização das larvas de primeiro estágio, este método foi adaptado especialmente quanto à concentração de hipoclorito de sódio que foi utilizado a 0,25% de modo eficiente. Verificou-se que nos cultivos enriquecidos com extrato protéico do corpo de B. glabrata, houve uma maior recuperação de larvas de segundo estágio. A fim de se investigar a possibilidade de uma diferença quanto à expressão de proteínas entre caramujos infectados e não infectados, foi realizada a eletroforese bidimensional. Uma proteína de 37 kDa no ponto isoelétrico de 4,2 foi expressa apenas nos tecidos dos caramujos infectados. Para se ter um estoque de larvas de primeiro estágio, testou-se formas de criopreservá-las com diferentes concentrações de dimetil-sulfóxido (DMSO) e de soro fetal bovino (SFB). Para ambos nematódeos, o uso de 1% de DMSO em meio enriquecido com 5% de SFB, incubação prévia de 60 minutos com o criopreservante em temperatura ambiente, seguido pelo congelamento rápido em nitrogênio líquido, apresentou os melhores índices de larvas ativas recuperadas.Embora os experimentos não tenham tido êxito para produzir in vitro larvas de terceiro estágio (L3), vários aspectos foram analisados e todo o conhecimento resultante representa o início do caminho para, com esforço contínuo, se estabelecer um sistema in vitro capaz de produzir em grande quantidade e regularmente essas formas parasitárias. Os resultados apresentados contribuem para uma melhor compreensão da complexa tarefa de manipulação in vitro desses nemátodeos e dos desafios para o melhor entendimento de sua biologia.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:12:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000432092-Texto+Completo-0.pdf: 4321589 bytes, checksum: 51aa9d7b8303d7b480f97239ba486b89 (MD5) Previous issue date: 2011 / The genus Omalonyx d’Orbigny, 1837 (from the Greek omal: flattened and onyx: nail, claw) is composed by hermaphrodite slugs which have, as their standard tegument coloring, two blackish longitudinal lines and dispersal spots over the body. The mantle covers the visceral mass and variable extensions of the shell. This genus is also characterized by an aulacopod foot. The shell is reduced, fragile, flattened and nail-shaped, having a whorl on its extremity. The shell aperture corresponds to around 90% of the shell’s height and the animal is unable shelter inside it. The genus’ specimens live in ecotone environments, on adjacent vegetations along floodlands, lakes and swamps. They are distributed throughout the Neotropical area, occurring in the West Indies and South America. Historically, Omalonyx taxonomic studies were based on the shell, radula, jaw and, more recently, on reproductive system characters. This thesis incorporated the greatest possible number of Omalonyx lots from widespread distribution areas, obtained through fleld collections and loans. Shell morphology, reproductive system anatomy and ovariotestis and hermaphrodite duct histology studies were conducted in order to identify characters for generic and specific diagnoses. Radulae and jaw relevance was discussed based on the genus’ bibliography and additional studies on those structures. After the taxonomic and systematic review, six species were considered valid; four new species were proposed as well as the creation of the subgenus Supertholus. The valid Omalonyx species are Omalonyx (Omalonyx) unguis (d’Orbigny, 1837), O. (O. ) matheronii (Potiez & Michaud, 1835), O. (S. ) convexus (Heynemann, 1868), O. (O. ) brasiliensis (Simroth, 1896), O. (O. ) geayi Tillier, 1980 e O. (O. )pattersonae Tillier, 1981, Omalonyx (O. ) elguru n. sp., Omalonyx (O. ) malabarbai n. sp., Omalonyx (O. ) carioca n. sp. and Omalonyx (S. ) saoborjensis n. sp. The cladistic analysis, based on the Parsimony Principle and on 26 morpho-anatomic characters, resulted in two most parsimonious cladograms with 69 steps, consistency index of 0. 76 and retention index of 0. 77. In both hypotheses, all phylogenetic relationships were completely resolved for the Omalonyx species. The phylogenetic relationship hypothesis for Omalonyx species is [[O. (C. ) convexus + Omalonyx (S. ) saoborjensis n. sp. ] [Omalonyx (O. ) elguru n. sp. [[O. (O. ) geayi + O. (O. ) pattersonae] [Omalonyx (C. ) malabarbai n. sp. [O. (O. ) matheronii [Omalonyx (C. ) carioca n. sp. [O. (O. ) unguis + O. (O. ) brasiliensis]]]]]]]. / O gênero Omalonyx d'Orbigny, 1837 (do grego omal: plano, achatado e onyx: unha, garra) compreende lesmas hermafroditas com um padrão de coloração do tegumento com duas linhas longitudinais escuras, manchas dispersas sobre o corpo, manto encobrindo a massa visceral e a concha em diferentes extensões e pé aulacópode. A concha é reduzida, frágil, achatada, unguiforme, possui aproximadamente uma volta, a abertura corresponde a aproximadamente 90% da altura da concha e não abriga o animal dentro dela. São animais que ocorrem em ambientes de ecótone, em vegetações adjacentes de planície de inundação de rios, em lagos e brejos. Têm distribuição restrita à região Neotropical, com ocorrência nas ilhas das pequenas Antilhas no mar do Caribe e na América do Sul. Historicamente, os estudos taxonômicos em Omalonyx foram baseados nas características da concha, dos dentes da rádula, na mandíbula e mais recentemente na anatomia do sistema reprodutório. Esta tese utilizou o maior número possível de lotes de Omalonyx de uma ampla área de distribuição do gênero, obtidas através de coletas e empréstimos de coleções científicas. A morfologia da concha, anatomia do sistema reprodutório e histologia do ovariotestis e dueto hermafrodita foram estudados objetivando identificar as estruturas que têm valor para a diagnose das espécies do gênero. A relevância dos dentes da rádula e mandíbula na diagnose específica são discutidas baseadas no estudo da bibliografia do grupo e em estudos relacionados. Após a revisão taxonômica e sistemática, foram consideradas válidas seis espécies previamente descritas e são propostas quatro espécies novas, bem como a criação do subgênero Supertholus. As espécies válidas do gênero são Omalonyx (Omalonyx) unguis (d'Orbigny, 1837), O. (O. ) matheronü (Potiez & Michaud, 1835), O. (S. ) convexus (Heynemann, 1868), O. (O. ) brasiliensis (Simroth, 1896), O. (O. ) geayi Tillier, 1980 e O. (O. ) pattersonae Tillier, 1981, Omalonyx (O. ) elguru n. sp., Omalonyx (O. ) malabarbai n. sp., Omalonyx (O. ) carioca n. sp. e Omalonyx (S. ) saoborjensis nsp. A análise cladística baseada no Princípio da Parcimônia e utilizando 26 caracteres morfo-anatômicos resultou em dois cladogramas igualmente parcimoniosos de 69 passos, índice de consistência 0,76 e índice de retenção 0,77. Em ambas as hipóteses, as relações filogenéticas das espécies de Omalonyx encontram-se totalmente resolvidas. As relações entre as espécies do gênero são [[O. (C. ) convexus + Omalonyx (S. ) saoborjensis n. sp. ] [Omalonyx (O. ) elguru n. sp. [[O. (O. ) geayi + O. (O. ) pattersonae] [Omalonyx (C. ) malabarbai n. sp. [O. (O. ) matheronü [Omalonyx (C. ) carioca n. sp. [O. (O. ) unguis + O. (O. ) brasiliensis]]]]]]].

Made available in DSpace on 2014-06-12T22:59:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo391_1.pdf: 843195 bytes, checksum: a04f290d66cb03649abb67894d253958 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Os despejos industriais e urbanos lançados nos ecossistemas aquáticos têm sido objetos de discussão em todo mundo, pois provocam modificações ambientais, aumentando também a pressão sobre as áreas costeiras. Como a maioria das cidades localizadas ao longo da costa brasileira, a cidade do Recife tem seu processo de urbanização determinado pela presença dos rios. A ocupação e a expansão urbana da planície do Recife vêm ocorrendo através de aterros, principalmente das áreas alagadas, que eram os espaços naturais das águas. O Parque dos Manguezais está localizado na cidade do Recife-Pernambuco, Brasil, entre os bairros do Pina e Boa Viagem, possuindo uma área total de 316 ha, sendo 225,82 ha (71,26%) de cobertura vegetal (mangue). O objetivo deste trabalho foi avaliar as concentrações de metais-traço (Cromo, Manganês, Ferro, Cobalto, Níquel, Cobre, Zinco, Cádmio, Chumbo) no compartimento sedimento, nos moluscos bivalves e árvores de mangue da área, determinando suas variações sazonais, interações com os compartimentos estudados, de modo a fornecer subsídios para estabelecer um sistema de monitoramento ambiental da área. As amostras superficiais de sedimento foram coletadas durante os períodos seco e chuvoso de 2006 a 2008 em 12 pontos ao longo dos rios que cortam a área, em suas margens direita e esquerda, em profundidades compreendidas entre 0-10 cm, durante as baixa-mares. Para a coleta do material sedimentado nas 24 horas, foram utilizadas 08 armadilhas, distribuídas entre 04 estações. Após transcorridas 24 horas, as amostras foram recolhidas (na baixa-mar) e levadas para posterior filtração em laboratório. Os parâmetros oxigênio dissolvido, pH, salinidade, temperatura, transparência da água e taxa de saturação de oxigênio foram determinados in situ segundo métodos reconhecidos internacionalmente. As amostras de moluscos Mytella charruana e Anomalocardia brasiliana foram coletas em um banco natural, localizado entre as estações 01 e 02 e as raízes de árvores de mangue, coletadas próximas às estações destinadas às análises dos sedimentos. Para quantificação da concentração de metais traço nas amostras foi utilizado um Espectrômetro de Emissão Ótica em Plasma Indutivamente Acoplado (ICP-OES). Os resultados obtidos indicaram que os sedimentos apresentaram níveis de metais acima dos valores obtidos do background , indicando uma contaminação da área por cromo, manganês e zinco. Quanto aos moluscos bivalves, os resultados apresentaram-se dentro dos valores máximos permissíveis para legislação brasileira, exceto para os elementos ferro e manganês que se encontraram acima dos valores máximos de consumo recomendados pela literatura internacional. Para as raízes de árvores de mangue, as concentrações situaram-se dentro da normalidade. Os resultados obtidos nos diferentes compartimentos demonstraram que o ecossistema em pauta, é capaz de atuar como uma barreira geoquímica, acumulando metais, contribuindo desta maneira para um perfeito gerenciamento ambiental dos ecossistemas de manguezais na região nordeste do Brasil

Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las hemocianinas son glicoproteínas transportadoras de oxígeno presentes en algunos moluscos y artrópodos. Son conocidas por su poderosa inmunogenicidad en mamíferos, siendo utilizadas como proteínas transportadoras de haptenos para obtener anticuerpos contra haptenos, en vacunas y como inmunoestimulante no específico en el tratamiento de algunos tipos de cáncer. Para estas aplicaciones la hemocianina más utilizada proviene de la lapa Californiana M. crenulata (KLH). Hemos demostrado que la hemocianina del gastrópodo Chileno C. concholepas (CCH), si bien difiere de KLH en su origen y estructura, posee cualidades inmunomoduladoras equivalentes, incrementando la actividad de células NK, e induciendo respuestas inmunes de tipo Th1. En este trabajo, se estudió el efecto de CCH sobre células dendríticas (DCs) murinas, consideradas las células presentadoras de antígeno por excelencia, y por tanto, las células moduladoras de la respuesta inmune. Postulamos que CCH induce la maduración de DCs, activando la inmunidad innata y adaptativa, vía procesamiento y presentación de CCH a células T naive, generando un ambiente de interleuquinas inmunoestimulante en los tejidos linfoides. En primer lugar, se estudió la cinética de incorporación de CCH in vitro, en DCs aisladas por selección magnética a partir de precursores de médula ósea de ratones de la cepa C57BL/6. Para el análisis, se emplearon diversas técnicas microscópicas de luz y electrónica, y de citometría de flujo; así como CCH marcada con fluorocromos o anticuerpos específicos contra ella. Se encontró que CCH fue incorporada rápidamente por DCs (CD11c+) vía endocitosis mediada por vesículas con clatrina, localizándose posteriormente en lisosomas secundarios. Se determinó el efecto de CCH sobre la maduración de DCs cultivadas in vitro, mediante la expresión de los marcadores de superficie MHCI, MHCII y CD86, y también mediante la secreción de IL12 y la pérdida de la capacidad fagocítica. Como control positivo se utilizó LPS, el cual produjo un aumento significativo de todos los marcadores a las 24 h. Las DCs tratadas con CCH no mostraron diferencias con las DCs control hasta las 72h de cultivo. Sin embargo, a este tiempo, se encontró que por efecto de CCH, las DCs aumentaron la expresión del marcador lisosomal Lamp, sugiriendo que dicha proteína se procesa lentamente. Evidencia adicional mediante Western blot, mostró fragmentos de hemocianina en torno a 50 kDa hasta las 54 h de incubación, no siendo detectados a las 72 h. Resultados diferentes se encontraron cuando las DCs fueron cocultivadas con células NK purificadas, aumentó la expresión de MHCII y CD86 como asimismo, la secreción de IL12 e INFγ por efecto de CCH en asociación al contacto entre las células, confirmando una modulación positiva de la hemocianina en la interacción NK/DC. Al estudiar la importancia del tamaño de CCH y la presencia de azúcares en su estructura sobre su inmunogenicidad, evaluando la respuesta inmune humoral de ratones de dos cepas diferentes (C57BL/6 y C3H/HeJ), se encontró que, ni la pérdida de su estructura cuaternaria ni de sus azúcares disminuyeron la inmunogenicidad de la proteína, por el contrario, se observó que el título de anticuerpos se mantuvo similar o aumentó al inmunizar los ratones con las proteínas desglicosiladas en comparación a las nativas. Sin embargo, estas moléculas no aumentaron la secreción de IL12 en DCs cultivadas in vitro, señalando nuevamente la importancia de las células del sistema inmune innato, como las células NK, en la vía de acción de las hemocianinas. Finalmente, este es el primer trabajo donde se aborda experimentalmente el mecanismo de inmunoestimulación de hemocianinas, estableciéndose que la proteína es procesada lentamente por parte de las DCs, y que en la respuesta de tipo Th1 que ellas modulan, la comunicación NK/DC es fundamental / Hemocyanins are glycoproteins that function as oxygen transporters in some mollusks and arthropods. They are known by their powerful immunogenicity in mammals, and therefore are widely used as hapten-carrier to produce antibodies, in vaccine development, and as non specific inmunoestimulant for the treatment of some types of cancer. The hemocyanin known as KLH obtained from the Californian limpet M. crenulata has been exclusively used for the above purposes. We demonstrated that CCH, the hemocyanin from the Chilean gastropod C. concholepas, although differ in origin and structure; have similar immunomodulatory properties, increasing the activity of NK cells, and inducing a type Th1 immune response. Considering the pivotal role of dendritic cells (DCs) in the modulation of immunity, it is of interest to determine the relationship among the structural features of hemocyanins and their effect on DCs maturation and how they specifically modulate their functions. We postulated that CCH induce DC maturation by activating the innate and adaptive immunity, trough CCH processing and presentation, to specific naïve T lymphocyte, leading to an immunostimulant interleukin environment in lymphoid tissues. First, we analyzed the kinetics of CCH uptake by DCs obtained from bone marrow precursors of C57BL mice, isolated by magnetic sorting and cultured in vitro. The uptake of CCH was studied using diverse microscopic techniques and flow cytometry. To track the protein, we used fluorescent conjugates of CCH and specific anti CCH antibodies. We found that CCH is quickly internalized by clathrin-mediated endocytosis vesicles, and after that, it was localized in secondary lysosomes. The effect of CCH on DC maturation, was investigated by the analyses of the expression of surface molecules as MHCI, MHCII and CD86, as well as by IL12 secretion and the lost of fagocitic activity. As a positive control we used DCs treated with LPS, which modify these parameters after 24h of culture. DCs treated with CCH did not show differences up to 72 h with respect to the control DCs. At this time, an increased of the expression of the lysosome membrane glycoprotein Lamp was observed, suggesting that CCH is gradually processed. We found additional evidence for a slow processing by DCs, since, fragments of size around 50 kDa, were detected by Western blot up to 54 h, and disappears at the 72h. In contrast to these results, when DCs were cocultured with purified NK cells in the presence of CCH, an increase in the expression of MHCII and CD86 surface molecules and secretion of IL12 and INFγ was observed. The above effects of CCH were boosted when both cellular types were put in contact, indicating that the NK and DCs contact is necessary for the modulation of DCs by CCH. Next, we studied the influence of the size and the sugar moieties of CCH in their immunostimulatory effect, trough the study of the humoral immune response against deglicosilated subunits of CCH, and native subunits as control. The results showed that the inmunoestimulant capacity was not decreased; on the contrary, the titers of antibodies were higher against the deglicosilated proteins than the native ones. However, the increased immunogenicity of the deglicosilated CCH did not correlate with the secretion of IL12 in isolated DCs cultured in vitro, suggesting again, the importance of cells of the innate immune cells, as NK, in the mechanisms of action of the hemocyanins. In conclusion, this work is the first experimental approached to get inside the fine immunomodulatory mechanism of mollusk hemocyanins, using CCH as model. The main conclusions that can be drawn from this work are that CCH is slowly processed by the DCs, and that the NK/DC interaction is required for the effect on DCs in vitro and in vivo

El modelo de biomasa dinámica de Schaefer fue usado para evaluar el estado de la pesquería del recurso “concha negra” (Anadara tuberculosa y Anadara similis), usando los datos de captura, esfuerzo y CPUE procedentes de los registros del IMARPE de los manglares de Puerto Pizarro, durante el periodo 1996 - 2010. El modelo aplicado es resuelto por error de proceso, que es uno de los más utilizados para estimar los parámetros de los modelos cuantitativos, el proceso de ajuste se hizo mediante la suma de la máxima verosimilitud, el cual presentó un buen ajuste del modelo en función a las características del recurso. La incertidumbre de los parámetros del modelo y las variables derivadas fueron obtenidas mediante el bootstrap no-paramétrico. Los parámetros poblacionales estimados fueron: K: 66036 kg, r: 0.23 kg*año-1 y q: 0.000125, con esta base se calcularon los principales puntos de referencia RMS: 3806 kg ERMS: 1489 viajes y FRMS: 0.12. Así como, la relación entre la biomasa actual y la biomasa prístina B2010/K: 0.2, B2010/B1996: 0.41 y la relación entre la mortalidad por pesca actual y la mortalidad por pesca al RMS F/FRMS: 2. De acuerdo con el análisis de estos resultados el recurso se encuentra sobreexplotado, encontrándose el 74% de la biomasa por debajo de aquella del máximo rendimiento sostenible. Las proyecciones de la biomasa sugieren que el nivel de explotación no debe sobrepasar los 1000 kg para evitar el colapso de la pesquería. Palabras claves: Concha negra, Evaluación, Modelo de biomasa dinámica, Manglar, Tumbes. / --- The model of Schaefer biomass dynamics was used to assessement the status of the fishery for Anadara tuberculosa y Anadara similis as a single resource black shell. Catch, effort and CPUE data from IMARPE registered in Port Pizarro for the period 1996-2010. The model is solved by process error, which is one of the most used for estimating the parameters of quantitative models; the adjustment was made by maximum likelihood, which presents a good fit of the model according to the biology of the resource. The uncertainty of the model parameters and derived variables were obtained by nonparametric bootstrap. The parameter of the biomass dynamics model were: K: 66036 kg, r: 0.23 kg*year-1 and q: 0.000125, the estimation of the point reference were: RMS: 3806 kg, ERMS: 1489 tasks y FRMS: 0.12. Also the relationship between B2010/K: 0.2, B2010/B1996:0.41 and F2010/FRMS: 2 to make a diagnosis of the resource status. The results of the analysis indicate that the resource is overexploited, found 74% of the biomass at maximum sustainable yield, the biomass projections suggest that the exploitation rate should not exceed 1000 kg to avoid collapse of the fishery. Keywords: black shell, Assessment, Biomass dynamics model, Mangrove, Tumbes.

A educação em ciências é uma prática social que vem sendo cada vez mais ampliada e desenvolvida e, nesse aspecto, os museus ganham destaque como locais de divulgação e de educação não formal. Neste sentido, é evidente a atual e gradual mudança que a natureza e o papel educacional dos museus vêm sofrendo, o que leva a questionar os pressupostos teóricos e práticos que fundamentaram e fundamentam as ações em educação não formal nesses locais. Assim, tendo em vista a fundamentação do trabalho de divulgação que o Laboratório de Malacologia do Instituto de Biociências da USP inicia, pretendia-se verificar como os moluscos são abordados nas exposições de dois museus universitários de ciências, discutindo algumas abordagens científicas, comunicacionais e museológicas que norteiam a práxis expositiva desses locais. Para tanto, optou-se por uma abordagem metodológica qualitativa por meio de dois instrumentos de pesquisa: observação com registros escritos e fotográficos e análise documental. A análise das abordagens científicas indicou que as duas instituições apresentam temáticas expositivas condizentes com os objetivos a que se propõem, ou seja, divulgar a pesquisa que ali é feita e, no caso do Museu de Zoologia, discutir também as idéias dominantes na Zoologia. Os textos, por sua vez, aparecem predominantemente na forma de impressos, cada instituição apresentando padrões de diagramação diferentes e conseqüentemente levantando questões diferentes. Com relação ao discurso empregado, fica evidente que o texto apresentado é um híbrido de diversas categorias de discurso. Por fim, as exposições revelaram corresponder preponderantemente ao tipo Educativas descrito por DEAN (2003), fazendo amplo uso de objetos reais embora estes estivessem sempre distantes do visitante e com função geralmente de ilustração. Quanto aos níveis de interatividade descritos por WAGENSBERG (2000), chama atenção o fato de nenhum dos museus trabalharem os três níveis, e a interatividade mental, única trabalhada pelos dois museus, sendo timidamente explorada. / Science Education is a growing and developing social practice and, in this respect, museums have gained prominence as places for doing public communication of science and non-formal education. In this sense, the nature and educational role of museums are clearly suffering gradual changes, what leads to questions about the theoretical and practical pre-assumptions that formed and still form the basis for actions in non-formal education occurring in these places. Thus, having in mind the fundamentals of the science communication work that the Malacology Lab (Institute of Biosciences-USP) has begun, the intention was to verify how mollusks are approached in the exhibitions of two universitary science museums, discussing some of the scientific, communicative and museological approaches that guide the expositive praxis of these places. For doing so, a qualitative methodological approach by means of two research instruments was chosen: observation, producing written and photographic records, and documental analysis. The analyses of scientific approaches indicated that both institutions have expositive subjects that meet their objectives of divulging the research they do and, in the case of the Zoology Museum, of discussing the dominant ideas in Zoology. The texts, in turn, appear predominantly as printouts, with each institution presenting different diagramming patterns and, consequently, bringing up different questions. As for the discourse used, it is clear that the text presented is a hybrid of several discourse categories. Finally, the exhibitions showed to be predominantly of the Educative type as described by Dean (2003), making wide use of real objects even though these were always far from the visitors and used for illustrative purposes. As for the levels of interactivity described by Wagensberg (2000), what calls the attention is the fact that none of the museums works all three existing levels and the only one worked by both museums, mental interactivity, is timidly explored.

Tesis Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las hemocianinas, glicoproteínas de alto peso molecular cuya función más conocida es transportar el oxígeno en algunos moluscos, son ampliamente utilizadas en aplicaciones biomédicas y biotecnológicas. La hemocianina más empleada para estos propósitos, conocida como KLH, proviene de la Lapa californiana Keyhole limpet (Megathura crenulata), y en Chile se han descubierto dos hemocianinas sustitutas que provienen de las especies litorales Concholepas concholepas (CCH) y Fissurella latimarginata (FLH). Las hemocianinas se utilizan como carriers de moléculas de haptenos y péptidos, como adyuvantes en vacunas y como inmunoestimulantes no específicos en la terapia contra ciertos tipos de cáncer, pues al ser inoculadas en mamíferos inducen una respuesta inmune adaptativa del tipo Th1, caracterizada por la síntesis de IFN-γ, fundamental en la destrucción de células tumorales e infectadas con patógenos. Los efectos inmunogénicos y antitumorales de las hemocianinas se han atribuido a su tamaño (4-8 MDa), a su estructura cuaternaria didecamérica con múltiples epítopos repetidos, a su xenogenicidad, y a sus azúcares, mayoritariamente N-glicosilaciones heterogéneas y complejas ricas en manosa, que alcanzan un 3-4% (p/p). Se ha demostrado que las N-glicosilaciones tienen funciones estructurales en la hemocianina de Tadorodes pacificus, sin embargo, este aspecto está escasamente estudiado en CCH, FLH y KLH, así como también el rol de los azúcares en sus efectos inmunológicos. Al respecto, se ha descrito que las hemocianinas son endocitadas por células presentadoras de antígenos (APCs) vía receptores de reconocimiento de patógenos de la familia lectina tipo C (CLRs), los cuales reconocen azúcares ricos en manosa, tales como el receptor de manosa (MR), Dectina-1 y Dectina-2, estimulando la secreción de citoquinas que generan un ambiente proinflamatorio benéfico. Sin embargo, no se ha estudiado experimentalmente la contribución de los azúcares sobre la estructura y la respuesta inmunomoduladora y antitumoral de dichas hemocianinas, por lo cual, en base a los antecedentes, se sustenta la siguiente hipótesis: “La eliminación enzimática de N-glicosilaciones en hemocianinas de gastrópodos, tales como KLH, CCH y FLH, disminuye la formación de estructuras didecaméricas y sus propiedades inmunogénicas y antitumorales en mamíferos”. CCH, FLH y KLH fueron N-desglicosiladas enzimáticamente utilizando PNGasa F y también, químicamente con peryodato de sodio como control. Posteriormente fueron analizadas según parámetros bioquímicos que incluyeron dot blot con lectinas, tinción de PAS y Lectin array blot para determinar la presencia de azúcares remanentes, y además, se realizaron análisis mediante SDS-PAGE, microscopía electrónica de transmisión y dicroísmo circular para determinar las modificaciones estructurales. Los resultados principales indicaron que la N-desglicosilación enzimática es parcial, selectiva, y que los azúcares remanentes corresponden principalmente a fucosilaciones. Además, la N-desglicosilación no afectó la estructura secundaria ni el desplegamiento, pero sí la estructura cuaternaria y el replegamiento de estas glicoproteínas. Los estudios inmunoquímicos mediante ELISA demostraron que la unión de hemocianinas desglicosiladas a CLRs quiméricos (MR-Fc, Dectina-1-Fc y Dectina-2-Fc) disminuye, en comparación con la unión de las hemocianinas nativas. Además, se demostró que la unión de hemocianinas al MR y Dectina-2 es específica para manosa, no así la unión a Dectina-1. Estudios mediante citometría de flujo y ELISA, en los que se evaluó el efecto funcional de la N-desglicosilación de las hemocianinas, sobre la unión/incorporación y secreción de citoquinas proinflamatorias en la línea de macrófagos murinos J774.2, demostraron que los N-glúcidos de estas glicoproteínas contribuyen a su unión/incorporación en dichas células, así como a la producción de las citoquinas proinflamatorias TNF-α IL-6 e IL-12p40. Finalmente, se realizaron estudios inmunológicos en los que se evaluó el efecto de la N-desglicosilación de hemocianinas sobre la respuesta humoral específica y antitumoral en un modelo murino de melanoma B16F10. Los resultados demostraron que la N-desglicosilación disminuyó el título de anticuerpos anti-hemocianinas, indicando una respuesta humoral desfavorecida. Respecto al potencial antitumoral, el volumen tumoral y porcentaje de animales con tumor no mostraron diferencias entre hemocianinas nativas y N-desglicosiladas con CCH y FLH, pero sí con KLH, donde se observó un mayor volumen tumoral en el grupo tratado con hemocianina N-desglicosilada. El conjunto de los resultados obtenidos, confirman el rol de los N-glúcidos de CCH, FLH y KLH a nivel de su estructura cuaternaria, y además, sugieren fuertemente que las N-glicosilaciones participan en su reconocimiento por algunos receptores lectina tipo C, así como en su efecto proinflamatorio en células presentadoras de antígenos. Finalmente, la N-desglicosilación disminuye la respuesta humoral anti-hemocianinas, sin embargo, se requieren experimentos adicionales para confirmar su rol en el efecto antitumoral / Hemocyanins are huge glycoproteins with several applications in biomedicine and biotechnology, whose better-known function is to carry oxygen in the hemolymph of some mollusks. The most used hemocyanin is named as KLH, from the keyhole limpet (Megathura crenulata), and two substitute hemocyanins have been described in Chile, from the species Concholepas concholepas (CCH) and Fissurella latimarginata (FLH). Hemocyanins act as non-specific immunostimulants when inoculated in mammals, inducing an adaptative Th1 immune response, characterized by the secretion of IFN-γ, essential in the destruction of tumoral and infected cells. By this property, hemocyanins are widely used in biomedicine as carriers of haptens/peptides, as adjuvants in vaccines, and as immunostimulants in therapies against certain types of cancer. Their immunomodulatory properties have been attributed to their high molecular weight (4-8 MDa), their complex quaternary structure, their xenogenicity and their high and heterogeneous glycan content, mainly mannose-rich N-glycans that reach up to 3-4% (w/w). Studies in the hemocyanin of Todarodes pacificus and other glycoproteins suggest a structural role of N-glycans, however, this role has been scarcely studied in CCH, FLH, KLH, as well as the role of N-glycans on their immunostimulant properties. Hemocyanins are incorporated by antigen presenting cells (APCs) through mannose-recognizing C-type lectin receptors (CLRs), such as mannose receptor (MR), Dectin-1 and Dectin-2, promoting the secretion of beneficial proinflammatory cytokines. Nevertheless, the contribution of glycans to the structure and the immunomodulatory and antitumor properties of CCH, FLH and KLH has not been experimentally demonstrated. Based on the bibliographic background, the proposed hypothesis is that: “The enzymatic N-deglycosylation of gastropods hemocyanins, such as KLH, CCH and FLH, disfavors the quaternary didecameric structure, and their immunogenic and antitumor properties in mammals”. Hemocyanins were enzymatically N-deglycosylated by PNGase F, and as a control, they were chemically deglycosylated by oxidation with sodium periodate. Analyses by dot blot and lectin array blot suggest that N-deglycosylation is selective and partial, leaving fucose-rich residual glycans. Also, analyses by SDS-PAGE, transmission electron microscopy and circular dichroism showed that N-deglycosylation did not affect the secondary structure or unfolding of hemocyanins, but it disfavored the association of subunits to form quaternary structures and their refolding. Moreover, ELISA binding assays showed that the binding of deglycosylated hemocyanins to chimeric CLRs (MR-Fc, Dectin-1-Fc and Dectin-2-Fc) decreased, compared with native hemocyanins. Besides, the binding of hemocyanins to MR and Dectin-2, but not to Dectin-1, was specific for mannose-rich glycans. Experiments by flow cytometry and ELISA, performed in J774.2 macrophage cells, showed a decreased binding and incorporation of N-deglycosylated hemocyanins in these cells, and also showed a decrease in the secretion of proinflammatory cytokines, such as TNF-α, IL-6 and IL-12p40, by N-deglycosylated proteins. Moreover, studies in a B16F10 murine model of melanoma were performed, to study the contribution of N-glycans to the humoral and antitumor responses induced by hemocyanins. ELISA assays showed a decreased antibody titer in mice immunized with N-deglycosylated hemocyanins, compared with their native forms. Nevertheless, no clear effects of N-deglycosylation on antitumor properties were observed, as mice immunized with native and N-deglycosylated CCH and FLH did not showed differences in tumor volume and tumor incidence. In contrast, mice immunized with N-deglycosylated KLH showed an increased tumor volume, compared with the native KLH group. Altogether, these results confirm that the N-glycans of CCH, FLH and KLH are essential for their didecameric structure. Similarly, N-glycans of hemocyanins contribute to their incorporation through CLRs, to the activation of the proinflammatory response by APCs, and to the humoral anti-hemocyanin response. However, further analyses are required to confirm the participation of N-glycans on their antitumor properties / FONDECYT; BIOSONDA; FUCITED

Tesis para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las hemocianinas provenientes de los gastrópodos Megathura crenulata, conocida como KLH, Concholepas concholepas (CCH) y Fissurella latimarginata (FLH), presentan propiedades inmunomoduladoras en mamíferos, las cuales han permitido su uso en biomedicina como proteína carrier de antígenos tumorales y como inmunoestimulantes no específicos en el tratamiento de ciertos cáncer. Para explicar esta propiedad se han invocado características tales como su tamaño, xenogenicidad, estructura compleja y contenido de azúcares, siendo este último uno de los rasgos estructurales de importancia en esta Tesis, ya que podrían ser reconocidos por receptores de inmunidad innata de tipo lectinas tipo C (CLRs), presentes en células presentadoras de antígeno (APCs). La endocitocis mediada por CLRs, tales como el receptor de manosa (MR), DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin) o MGL (macrophage galactose lectine), tiene diversas consecuencias en la respuesta inmune y una de ellas es la presentación cruzada de antígenos por APCs, un mecanismo por el cual los péptidos antigénicos de proteínas exógenas, que se presentan normalmente en el contexto de antígenos de Histocompatibilidad de Clase II (MHC II) a linfocitos T CD4+, son cargados en MHC de clase I y presentados a linfocitos T CD8+, células fundamentales en la respuesta inmune celular antitumoral. Siendo las hemocianinas antígenos exógenos, la hipótesis ha sido que: la endocitosis de las hemocianinas mediada por receptores lectinas tipo C en APCs, conduce a su presentación cruzada. Para estudiar la unión de las hemocianinas y los CLRs, se realizaron ensayos de unión in vitro mediante ELISA, entre quimeras recombinantes del MR y DC-SIGN con hemocianinas nativas y desglicosiladas; además de ensayos de inhibición con sus ligandos naturales, en presencia y ausencia de EDTA. Se caracterizó la interacción receptor/ligando utilizando SPR (surface plasmon resonance), permitiendo determinar las constantes de afinidad aparente entre las hemocianinas y dichos receptores. Además, mediante citometría de flujo se realizaron estudios en un modelo artificial de células. CHO que sobre-expresan el MR y, con APCs humanas y murinas. Usando microscopia confocal de fluorescencia y marcadores específicos, se estudió en APCs murinas a qué compartimento intracelular se destinan las hemocianinas. Finalmente, se iniciaron los estudios para determinar si APCs murinas y líneas tumorales internalizan y presentar las hemocianinas en MHC-I. Los principales resultados muestran que las hemocianinas interactúan con más de un receptor, así CCH, FLH y KLH interactúan con MR y DC-SIGN, pero solo FLH y KLH lo hacen con MGL. Además, se demostró en APCs murinas, que la incorporación de hemocianina es inhibida parcialmente por EDTA y D-Manosa. Por otro lado, se observó que el MR participa en la captura de las hemocianinas en células CHO que sobreexpresan el MR; además, que APCs humanas y murinas, que expresan CLRs, internalizan las hemocianinas. También se encontró, que las tres hemocianinas se destinan a compartimentos lisosomales (Lamp-1+) y endosomas tardíos (Rab7+). Sin embargo, no se encontró CCH en endosomas tempranos (Rab5+), a diferencia de FLH y KLH, sugiriendo diferencias en la ruta endocítica que siguen las hemocianinas una vez internalizadas por las APCs. Así, FLH y KLH podrían estar siguiendo una ruta de procesamiento alternativa, que las conduzca a ser presentadas a linfocitos T CD8+. La vía de procesamiento alternativa de las hemocianinas, podría explicar en parte su efecto antitumoral no específico, ya que sumada a la vía de presentación en MHC II, al activar linfocitos T CD8+ vía MHC I, se liberarían citoquinas y factores humorales que indirectamente, activarían la destrucción de células tumorales u otras respuestas específicas latentes, efecto conocido como bystander / Hemocyanins from the gastropod Megathura crenulata (KLH), Concholepas concholepas (CCH) and Fissurella latimarginata (FLH) have mainly been used as non-specific immunostimulants with beneficial clinical outcomes, to prevent the progression of recurrent superficial bladder cancer or as carriers/adjuvants for producing antibodies against tumor-associated antigens in therapeutic vaccines against cancer. However, the mechanism involved in the positive immunomodulatory effects of these proteins has been scarcely studied. An important feature of these hemocyanins is its carbohydrate content, which can reach up to 3% (w/w), being mannose as the most abundant sugar. These oligosaccharides can be recognized by C-type lectin receptors (CLRs) of innate immunity, such as Mannose Receptor (MR), DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin) or MGL (macrophage galactose lectine), present on antigen presenting cells (APCs). Furthermore, these innate receptors have been involved in classical and alternative antigen presentation by MHC I and MHC II to CD8+ and CD4+ lymphocytes, respectively. Hence, we proposed that CLRs-mediated endocytosis of hemocyanins in antigen presenting cells triggers the cross-presentation of these proteins. In this work, we studied the interaction between CLRs and hemocyanins using indirect ELISA and SPR (surface plasmon resonance). We found that CCH, FLH, and KLH bind to MR and DC-SIGN with high affinity constants; additionally FLH and KLH also bind to MGL. Our results demonstrate that the interaction between MR and hemocyanins trigger their endocytosis, analysed by an artificial CHO-MR system. Furthermore, human and murine APCs-expressing CLRs can uptake hemocyanins and ovalbumin. We also found that hemocyanins uptake by murine macrophages and dendritic cells can be partially inhibited by EDTA and D-Mannose. These results suggest an important role of CLRs in endocytosis and signalling transduction of hemocyanins. On the other hand, we studied the cellular destination of hemocyanins in bone marrow derived dendritic cells (BMDCs) using confocal microscopy. FLH and KLH showed a similar localization in Rab5+, Rab7+ and Lamp-1+ compartments. However, CCH was not found in Rab5+ early endosomes, suggesting differential compartmentalization between the hemocyanins. Thus, FLH and KLH could be involved in an alternative processing pathway such as cross-presentation. Finally, we determined if murine APCs could present hemocyanins on MHC I context. Our results showed that in vitro stimulation of macrophages with FLH, but not with CCH or KLH, increased MHC I and MHC II expression, supporting our hypothesis. Hemocyanins cross-presentation could explain one of the mechanisms involved in the antitumoral effect of these proteins, in addition to the classic presentation by MHC II. Moreover, CD8+ lymphocytes activation could promote cytokines and humoral factors release that indirectly trigger other latent immune responses against the tumoral cells, effect known as bystander effect / FONDECYT; CONICYT; BIOSONDA; FUCITED

El presente trabajo de tesis tiene como objetivo identificar y cuantificar las diferentes alteraciones morfológicas de espermatozoides de Argopecten purpuratus, ocasionadas por el proceso de criopreservación, y relacionarlas con su motilidad y capacidad de fecundación post-descongelamiento. Se utilizaron conchas de abanico maduras obtenidas de cultivos suspendidos de la Bahía la Herradura de Guayacán, Coquimbo-Chile. Se disectó la gónada y la porción masculina se cortó en trozos para liberar los espermatozoides en AMFE. Estos, fueron incubados en una solución crioprotectora compuesta por ME2SO al 10%, 125 mM de sacarosa y 10% de vitelo del huevo de gallina. Se congeló los espermatozoides a una tasa de 8,8 ºC/min. El descongelamiento se realizó 24 horas después mediante inmersión en un recipiente con agua a 50º C durante 20 seg y luego en otro a temperatura ambiente. Posteriormente se cuantificó el número de espermatozoides móviles en un microscopio de luz; también se cuantificó la cantidad de espermatozoides lesionados en la cabeza, acrosoma, pieza media y flagelo en un microscopio electrónico de barrido. Finalmente, se determinó la capacidad fecundante de los espermatozoides inseminando ovocitos frescos. La motilidad varió significativamente entre los tratamientos (C, PRE y POST) en cuanto a porcentaje de espermatozoides móviles y tiempo de actividad. Se observó distintas alteraciones en la morfología del espermatozoide congelado-descongelado. Algunas tuvieron la cabeza deforme, hinchada o lisada y la membrana celular plegada o rota. También fue observada, reacción acrosómica y mitocondrias fuera de su posición normal o ausentes. Pero las alteraciones más comunes se encontraron en el flagelo, el cual sufrió ruptura, rigidez y pérdida de su estructura lineal. En C y PRE el porcentaje de espermatozoides ilesos fue mayor (87,7 ± 3,4 % y 79,0 ± 3,0 % respectivamente), mientras que en POST fue 14,2 ± 2,8 %. La estructura lesionada en la mayor cantidad de espermatozoides POST, fue el flagelo (77,0 ± 3,0 %); el porcentaje de espermatozoides con lesión en la cabeza fue 55,1 ± 7,4 % y los que tuvieron el acrosoma reaccionado fueron 28,7 ± 3,3 %. La pieza media fue afectada en el 23,9 ± 4,1 % de espermatozoides. Los porcentajes de fecundación fueron 68,3 ± 6,6 %, 67,9 ± 4,2 % y 58,2 ± 7,3 % para C, PRE y POST respectivamente, no encontrándose diferencias significativas entre ellos. Se correlacionó la motilidad total cuantificada a los 5 y a los 30 minutos, las lesiones ocurridas en las diferentes estructuras espermáticas y los porcentajes de fecundación; encontrándose mayor correlación entre las alteraciones y la motilidad que entre las alteraciones y los porcentajes de fecundación. La correlación entre la motilidad y fecundación fue baja (0,650 y 0,668 con la motilidad a los 5 y 30 min respectivamente). La incubación durante el tiempo de equilibrio en la solución crioprotectora utilizada, no tiene un efecto tóxico que altere la motilidad o la morfología de los espermatozoides, sino más bien, tiene un efecto activador de la motilidad. Esta propiedad de la solución crioprotectora, se suma a la de protección, que les daría a los espermatozoides durante el congelamiento-descongelamiento, que es la etapa del proceso de criopreservación durante la cual los espermatozoide son afectado negativamente.. Las cabezas destrozadas de los espermatozoides sería consecuencia de la lisis celular o del crecimiento de cristales de hielo, todo esto como consecuencia de desórdenes osmóticos. La rigidez de los flagelos podría ser por alteraciones en la estructura del axonema. Posiblemente, la reacción acrosomal sería ocasionada por los cambios de polaridad ocurridos por el congelamiento-descongelamiento. En general, las lesiones en cualquiera de las estructuras espermáticas están relacionadas finalmente con la membrana celular. / The present work identifies and quantifies the morphological external alterations of spermatozoa of the scallop A. purpuratus due to long-term cryopreservation. Moreover, it relates the injuries to motility and fertilization capacity. Sexually mature scallops were collected from scallops farmed in La Herradura Bay, Coquimbo - Chile. The male portion of the gonad was cut in pieces (5 mm), which were after placed in a petri dish containing filtered sea water. Liberation of sperm was induced, which made it possible to obtain a spermatic solution. The sperm was equilibrated for 5 min in a crioprotective solution containing 10% ME2SO, 125 mM sucrose and 10% yolk of hen eggs diluted in sea water. Subsequently, the amples were frozen at a rate of 8,8 ºC/min. After 24 hours, the samples were firstly thawed while immersed for 20 seconds in water of 50º C, finally they were thawed while immersed in water at room temperature. The percentage of motility, fertilization of fresh oocytes and injured spermatozoa (in head, acrosome, middle piece and tail) were quantified with a light microscopy, stereoscopy and scanned electron microscopy, respectively. Both the freeze-thawing treatment and the post dilution time had significant effects on the spermatic motility. Moreover, it was observed a significant interaction between the post-dilution time and the freeze-thaw treatment (C, PRE o POST). Spermatozoa exposed to the pre-freezing treatment (PRE) remained motile for a longer while than the ones exposed to the control treatment (C). The motility in the spermatozoa in the post-thaw treatment was always much lower than in the PRE and C treatments. The morphology of the spermatozoids was affected in several ways by the freeze-thawing treatment. Some had their head deformed or swollen, others had their cell membrane folded or broken. Acrosome reaction, anomalous positions or absence of mitochondria were also observed. Broken or stiff or lineal structure loosed of tail were the most frequent injuries. The C and PRE had higher percentage of unhurt sperm (87,7 ± 3,4 % and 79,0 ± 3,0 % respectively), while the PRE samples had 14,2 ± 2,8 % of unhurt sperm. The tail was the spermatic structure that most commonly injured during the freezing-thawing process (77,0 ± 3,0 %). The percentage of sperm with head injury was 55,1 ± 7,4 % and with acrosome reaction was 28,7 ± 3,3 %. The middle piece was affected in 23,9 ± 4,1 % of the spermatozoa. The percentage of fertilization was 68,3 ± 6,6 %, 67,9 ± 4,2 % and 58,2 ± 7,3 % for C, PRE and POST respectively, which were not significantly different. The injuries were correlated with motility (at 5 and 30 min) and with fertilization success. There was a better correlation between injuries and motility than between injuries and fertilization success. The correlation between motility and fertilization was low (0,605 and 0,668 with motility at 5 min and 30 min respectively). The crioprotective solution did not have any toxic effects on the spermatozoa, on the contrary, it rather had an activating effect on motility. Moreover, the crioprotective solution provided protection during the freezing thawing process, which is a critical process in cryopreservation in which spermatozoa suffer of decreased motility. The crioprotective solution did not have a significant effect on the external morphology of the spermatozoa. Hence, again the freezing thawing process is causing the injuries. The heads destroyed of the spermatozoa would be consequence of the accumulation of ice crystals. The tails could be rigid due to alterations in the axonomic structure. Possibly the acrosome reaction could be by the bipolarity changes due to the process of freezing-thawing. As a rule, the injury in any structure of the spermatozoa is related to the cell membrane.