Introdução: O trauma é um fenômeno que cursa com lesão tecidual, sendo que o trauma cirúrgico (TC) apresenta a referida lesão como consequência de um ato cirúrgico. A isquemia seguida de reperfusão (IR) é um evento comum em várias condições patológicas, bem como em diversos procedimentos cirúrgicos, principalmente transplantes. É frequente o desenvolvimento de lesões teciduais locais e remotas após trauma e após a I/R, parte de um fenômeno conhecido como síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SRIS), frequentemente seguida pela falência de múltiplos órgãos (FMO). Estudos provaram o envolvimento do neutrófilo em tais síndromes como resultado da ação de enzimas proteolíticas secretadas a partir de grânulos citoplasmáticos, radicais livres produzidos por explosão respiratória e citocinas liberadas após a infiltração nos tecidos. Nesse contexto, foi provado que o pré-condicionamento isquêmico (PCI), definido como curtos episódios de isquemia precedendo a IR, protege contra essas lesões, com menor ativação de neutrófilos. No entanto, o conhecimento a respeito dos mecanismos operantes nos neutrófilos após o trauma cirúrgico, a isquemia seguida de reperfusão ou o pré-condicionamento isquêmico, ainda são preliminares. Objetivo: Analisar com maior profundidade o impacto dessas condições (TC, IR e PCI) no proteoma e fosfoproteoma do neutrófilo. Métodos: Foi realizada a análise de parâmetros hematológicos juntamente com a análise proteômica e fosfoproteômica de neutrófilos de ratos submetidos a TC, IR e PCI, comparados ao grupo controle. A análise proteômica foi realizada em sistema de nLC-MS/MS orbitrap de alto desempenho, usando marcação com iTRAQ, enriquecimento de fosfopeptídios e pré-fracionamento por HILIC. A análise estatística baseada em clusters utilizando scripts em R mostrou proteínas com abundância relativa diferencial em todas as condições. Resultados: A avaliação dos parâmetros hematológicos antes e depois de TC, IR e IPC demonstrou alterações no número, forma e tamanho de linfócitos, hemácias, plaquetas e, principalmente, neutrófilos (granulócitos). Observou-se um claro aumento na contagem de neutrófilos após TC e IR, sendo que tal aumento foi prevenido pelo PCI. Um total de 393 proteínas foram determinadas como reguladas para abundância relativa entre o grupo controle e o grupo TC. A maioria das proteínas encontradas como reguladas em comum nos grupos TC e IR estão relacionadas à apoptose (caspase-3), motilidade celular (PAK2), transdução de sinal (IL-5, IL-6 e TNF) e degradação pelo sistema proteassoma no neutrófilo. Maior produção de espécies reativas de oxigênio e disfunção da migração direcional de neutrófilos (PKC-delta) com aumento do tempo de vida dos neutrófilos são eventos iniciais importantes que podem resultar em mais dano tecidual e em infecção. A análise proteômica de neutrófilos de ratos após PCI levou à identificação de 2437 grupos de proteínas atribuídos a 5 clusters diferentes, contendo proteínas de abundância relativa significativamente aumentada ou diminuída em IR e PCI. O estudo de vias desses clusters baseado no KEGG revelou aumento nas vias de fagocitose mediada por Fc-gama R, sinalização por quimiocinas, adesão focal e migração transendotelial, citoesqueleto de actina, metabolismo e diminuição nas vias ribossomais, de transporte de RNA, de processamento de proteínas. A regulação da fosforilação de proteínas após IR e PCI mostrou algumas vias como quimiocinas, Fc-gama, GPCR, migração celular e vias pró e antiapoptóticas, sendo que a via de splicing alternativo foi a que apresentou regulação mais evidente (p < 0.0001). A regulação da abundância, bem como da fosforilação, presença de motivos e de domínios levou à identificação de fosfatases, como Fgr, GRK2, PKC delta, ptpn6 e ptprc reguladas por IR, bem como stk38, pkn1, syk e inpp5d reguladas por PCI. A interação mais marcante entre proteínas foi demonstrada como sendo entre os receptores de Fgr e Ptp. Conclusão: Concluímos que as alterações causadas por TC, IR e PCI levaram a intenss alterações na abundância de algumas proteínas e em eventos de fosforilação em neutrófilos, levando ao efeito destrutivo observado após a IR e ao efeito protetor consequente ao PCI / Introduction: Trauma is a phenomenon that involves tissue injury, whereas the surgical trauma (ST) has such injury as a consequence of a surgery. Ischemia reperfusion is common event in many surgical procedures, especially in transplants, as well as in many pathological conditions. Local and remote tissue injuries usually develop after trauma and ischemic reperfusion, part of a phenomenon known as systemic inflammatory response syndrome, frequently followed by multiple organ failure (MOF). Studies have proven the involvement of the neutrophil in all these injuries as a result of proteolytic enzymes secreted from cytoplasmic granules, free radicals produced by respiratory burst, cytokines released after tissue infiltration. In that context, ischemic preconditioning (IPC), that are short episodes of ischemia before ischemia reperfusion, was proved to be protective against these injuries with less activation of neutrophils. However the knowledge about the underlying mechanism operating in the neutrophil after surgical trauma, ischemia reperfusion and preconditioning is preliminary. Objective: To deeply analyze the impact of these conditions (ST, IR and IPC) on the neutrophil proteome and phosphoproteome. Methodology: We did hematological analysis along proteomics and phospho proteomics through high throughput nLC-MS/MS analysis by orbitrap using iTRAQ labeling, phospho peptide enrichments, and HILIC pre-fractionation. Neutrophils from control, ST, IR and IPC conditions after extraction were processed for proteomic analysis. Statistical package using R based on cluster analysis led to the detection of differentially regulated proteins in all conditions. Results: The evaluation of the hematological parameters before and after ST, IR or IPC on blood cells stated alteration in size, number and shape of lymphocytes, RBCs, platelets and specially neutrophils (granulocytes). In the analysis, a clear increase in neutrophil count after ST and IR with such increase prevented by IPC. A total of 393 proteins were found differentially regulated between control and trauma groups. Most of the common proteins found regulated in trauma and IR seem to be related to apoptosis (caspase-3), cell motility (PAK2) and signal transduction in IL5, IL6 and TNF and proteasomal degradation in neutrophil. Higher oxygen species production and dysfunction of directional neutrophil migration (PKC delta) with increase in the life span of neutrophils are early important events that can finally result into more tissue damage and infection. The total proteomic analysis of rat neutrophils after IPC led to the identification of 2437 protein groups assigned to five different clusters with significantly up and downregulated proteins in IR and IPC. Cluster based KEGG pathways analysis revealed up-regulation of chemokine signaling, focal adhesion, leukocyte transendothelial migration, actin cytoskeleton, metabolism and Fc gamma R mediated phagocytosis, whereas downregulation in ribosome, spliceosome, RNA transport, protein processing in endoplasmic reticulum and proteasome, after intestinal ischemic preconditioning. The phosphoregulated proteins containing domains and motifs in the regulated peptides after IR and IPC led to the identification of some of important players such as chemokine, Fc gamma, GPCR, migration and pro/anti-apoptotic pathways. The phosphoproteins from alternative splicing was the pathway presenting the most remarkable regulation with a p-value of 0.0001. The regulation in expression as well as in phosphorylation, the presence of motifs and domains led to the identification of kinases and phosphatases including Fgr, GRK2, PKC delta, ptpn6 and ptprc in neutrophils after IR whereas stk38, pkn1, syk, and inpp5d in neutrophil due to IPC. The highest protein-protein interaction was shown by Fgr and Ptp receptors. Conclusion: We concluded that the changed stimulus produced after ST, IR and IPC led to the huge alteration in proteins expression and phosphorylation events in the neutrophil proteome as mentioned in our work, that leads to final destructive and protective phenotype of neutrophils respectively

Neutrophile Granulocyten wirken als einer der ersten Abwehrmechanismen gegen invasive Mikroorganismen im angeborenen Immunsystem von Mammalia. Aktiviert durch inflammatorische Signale verlassen diese Granulocyten das vaskuläre System und migrieren durch das Gewebe zum Infektionsherd. Dort binden sie die Mikroorganismen, phagozytieren und eliminieren diese schließlich mit hoher Effizienz. Humane Neutrophile Elastase (NE) ist Bestandteil der neutrophilen Granula und spielt eine entscheidende Rolle im Abbau von Virulenzfaktoren enteroinvasiver Bakterien, einschließlich der Shigella Virulenzfaktoren IpaB (invasion antigen plasmid B) und IcsA (intracellular spread A). NE gehört zu der Familie der Chymotrypsin-ähnlichen Serinproteasen, die sich durch Sequenz- und Strukurähnlichkeit auszeichnen, jedoch sehr unterschiedliche biologische Funktionen aufweisen. Cathepsin G (CG) ist wie NE eine Chymotrypsin-ähnliche Serinprotease und ebenfalls in neutrophilen Granula lokalisiert. Allerdings zeigt CG keine Aktivität gegenüber Virulenzfaktoren von Shigella. Obwohl die Kristallstrukturen von CG und NE fast identisch sind, konnten einzelne oder mehrere Aminosäuren in der Substratbindungsspalte identifiziert werden, die zwischen den beiden Enzymen differieren. Dies legte die Vermutung nahe, dass die Spezifität von NE gegenüber Virulenzfaktoren in diesen Unterschieden codiert sein könnte. Daher wurden diese Aminosäuren durch die analogen CG Aminosäuren oder durch Alanin ersetzt. Der Vergleich der funktionellen Eigenschaften der NE Mutanten mit wildtyp NE zeigte, dass die Aminosäuren an den Positionen 98 und 216-224 entscheidend für die Substratspezifität von NE sind. Die NE Mutanten N98A, 216-218 und 216-224 waren nicht mehr in der Lage, die Virulenzfaktoren IcsA und IpaB sowie das NE Peptidsubstrat abzubauen. Stattdessen haben diese Mutanten die Fähigkeit erlangt, das CG Peptidsubstrat abzubauen. Zusammenfassend konnten wir Aminosäuren in NE identifizieren, die sowohl die Spezifität von NE für das Peptidsubstrat als auch für die Virulenzfaktoren von Shigella flexneri determinieren. / Neutrophil granulocytes are one of the first lines of defense of the mammalian innate immune system against invading microorganisms. In response to inflammatory stimuli, neutrophils migrate from the blood stream to infected tissues where they bind, engulf and inactivate microorganisms efficiently. Human neutrophil elastase (NE), a neutrophil granule component, is a key host defense protein that rapidly destroys virulence factors of enteroinvasive pathogens including IpaB (invasion plasmid antigen B) and IcsA (intracellular spread A) from Shigella. NE belongs to the family of chymotrypsin-like serine proteases with sequence and structural similarity but with very different biological functions. Cathepsin G (CG) is another abundant chymotrypsin-like serine protease in neutrophil granules. However, in contrast to NE, CG does not cleave virulence factors of Shigella. The crystallographic structures of NE and CG are very similar but we identified single or multiple residues in the substrate-binding cleft to differ in these two enzymes. We hypothesized that NE specificity for bacterial virulence factors resides within these structural differences. Therefore these specific residues in NE were replaced with the analogous amino acids of CG or with alanine. By comparing the functional properties of these NE mutants to wildtype NE we were able to show that the amino acids at position 98 and 216-224 are crucial for the substrate specificity of NE. The NE mutants N98A, 216-218 and 216-224 did not cleave the virulence factors IcsA and IpaB as well as the NE peptide substrate but cleaved the CG peptide substrate. In summary, we identified residues in NE that determine the specificity of NE for the peptide substrate and for the Shigella flexneri virulence factors.

A determinação dos marcadores sorológicos P-ANCA (anticorpo perinuclear contra estruturas citoplasmáticas do neutrófilo) e ASCA (anticorpo anti-Saccharomyces cerevisiae) auxilia de forma menos invasiva no diagnóstico da doença inflamatória intestinal (DII). O padrão de associação mais relacionado à retocolite ulceratica inespecífica (RCUI) ocorre com ASCA- (negativo) e P-ANCA + (positivo). Na doença de Crohn (DC) ocorre o contrário, ou seja, ASCA+ e P-ANCA-. O P-ANCA é determinado por imunofluorescência indireta usando neutrófilos fixados em etanol, e o ASCA através de ELISA. De forma geral, a prevalência do P-ANCA em pacientes com RCUI tem variado entre 50 e 80% e em pacientes com DC entre 10 e 30%. Controles sadios têm revelado prevalência menor que 4% e controles patológicos em torno de 8%. Alguns trabalhos mostraram ampla variação nos resultados, sugerindo além de variação genéticas, variações metodológicas de acordo com a população estudada. Foram realizadas análises no soro de 200 pacientes para pesquisa de P-ANCA e ASCA, sendo 98 com RCUI e 102 com DC. O grupo controle foi representado por 54 indivíduos sadios. Os pacientes com DII foram oriundos do ambulatório de Gastroenterologia ? Grupo de Intestino do Hospital das Clínicas Faculdade da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP). A prevalência encontrada do P-ANCA na RCUI, DC e grupo controle correspondeu a 61,2%, 16,7% e 5,6% respectivamente, enquanto que a do ASCA para a DC, RCUI e grupo controle correspondeu a 52,9%, 27,6% e 5,6% respectivamente. A sensibilidade e especificidade encontrada com o padrão ASCA+/P-ANCA- para DC foi de 45,1% e 89,% respectivamente, enquanto que para o padrão P-ANCA+/ASCA- para RCUI foi de 43,9% e 91,2% respectivamente. No que diz respeito às características clínicas e demográficas, nenhuma associação com a presença dos anticorpos foi estabelecida no presente estudo, exceto quando avaliado o uso de drogas imunossupressoras e infliximab em pacientes com DC e ASCA+ , a qual se mostrou aumentada (p=0,008). Assim sendo, a determinação dos anticorpos P-ANCA e ASCA na DII possui baixa sensibilidade, mas níveis elevados de especificidade como demonstrado em outros estudos publicados. A correlação dos anticorpos P-ANCA e ASCA com características clínicas ainda permanece controversa. / The determination of serologic markers P-ANCA (perinuclear antineutrophil cytoplasmic autoantibodies) and ASCA (anti-Saccharomyces cerevisiae mannan antibodies) assists as non-invasive way on the inflammatory bowel disease (IBD) diagnosis. The most associated pattern to ulcerative colitis (UC) occurs with ASCA- (negative) and P-ANCA + (positive). In the Crohns disease (CD) is the opposite, that is, ASCA+ and P-ANCA-. Determination of P-ANCA is performed by an indirect immunofluorescence assay, using ethanol-fixed neutrophil slides and ASCA is measured by ELISA. Usually, the prevalence of P-ANCA in patients with UC has varied between 50 and 80% and in patients with CD between 10 and 30%. Healthy controls have disclosed lesser prevalence than 4% and pathological controls around 8%. Some studies had shown a wide variation in the results, suggesting both genetic and methodologic variations, according to the studied population. Serum samples were obtained from 200 patients for analysis of P-ANCA and ASCA, being 98 with UC and 102 with CD. The control group was represented by 54 healthy individuals. Patients with IBD were selected from the Department of Gastroenterology - Intestine Group of the Hospital das Clínicas of the University of São Paulo (HCFMUSP). P-ANCA prevalence found in UC, CD and control group were 61,2%, 16,7% e 5,6%, respectively, but ASCA prevalence in UC, CD and control group were 52,9%, 27,6% e 5,6%, respectively. Sensitivity and specificity achieved using ASCA+/P-ANCA- pattern for CD were 45,1% e 89,%, respectively, but P-ANCA+/ASCA- pattern for UC were 43,9% e 91,2% respectively. In this study, the current data did not support a relationship between the serological markers and clinical and demographic characteristics, except when evaluated the use of immunosuppresive drugs and infliximab in patients with CD and ASCA+, which were increased (p=0,008). Thus, the determination of antibodies P-ANCA and ASCA in the IBD gets low sensitivity, but high levels of especificity as demonstrated in other published reports. The correlation of antibodies P-ANCA and ASCA with clinical characteristics appears to be limited.

Background e objetivo. A reconstituição celular hematopoiética com o transplante de células tronco hematopoiéticas (TCTH) alogênicas é um método de tratamento estabelecido para uma variedade de doenças hematológicas, oncológicas e imunológicas. Entretanto, TCTH está associado a considerável morbimortalidade devido a fatores como recidiva da doença de base, grau de compatibilidade HLA, tipo de regime de condicionamento e infecções durante o período de neutropenia. Este estudo investigou a associação entre o aloantígenoneutrofílico humano (HNA) e o dia de pega, a ocorrência de DECH aguda e TRM em pacientes que foram submetidos a transplante de células tronco hematopoiéticas alogênico. Tipo de estudo e local. Estudo de coorte prospectivo realizado no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Métodos. Avaliamos 27 pacientes transplantados entre maio de 2013 e abril de 2014 e seus respectivos doadores. A tipagem HNA foi realizada, nas amostras dos doadores, por PCR-SSP e os anticorpos anti-HNA foram detectados nos pacientes utilizando o kit LABSCREEN MULTI (LSMUTR – One Lambda). Resultados. A idade variou entre 1 a 63 anos, com uma média de 20,4 ± 17,5 anos. Dezenove pacientes eram pediátricos (<21 anos) com média de idade de 10,05 ± 6,4 anos e entre os pacientes adultos a média foi 42,2 ± 12,6 anos. Houve um discreto predomínio do sexo masculino 16 (59,3%). As leucemias agudas foram frequentes em 19 (70,4%) dos pacientes, outras doenças oncohematológicas malignas (Linfoma Hodgkin e Linfoma não Hodgkin) estiveram em 3 (11,1%) e as não malignas (síndrome mielodisplásica, osteopetrose, hemoglobinúria paroxicística noturna, aplasia e doença granulomatosa) estiveram em 6 (22,2%) dos casos. A maioria dos pacientes 19 (70,4%), apresentavam a doença há menos de 12 meses na época do transplante e 24 (88,9%) deles foram totalmente compatível com seus doadores quanto ao sistema HLA. O regime de condicionamento mieloablativo foi utilizado em 16 (59,2%) dos pacientes e a profilaxia padrão para DECH (ciclosporina e metotrexate) foi utilizada em 15 (55,5%) dos pacientes. O dia de pega teve uma mediana de 19 e mínimo e máximo de 15 e 30, respectivamente. Quatro pacientes (14,8%) tiveram óbito antes da pega. Aproximadamente 63% (17 pacientes) apresentaram DECH aguda (em todos os estágios) e a taxa de mortalidade (TRM) foi de aproximadamente 44% dos casos (12 pacientes). Os pacientes que receberam TCTH de um doador aparentado tiveram TRM de aproximadamente 41% (7 pacientes) e os que receberam de um doador não aparentado foi de aproximadamente 45% (5 pacientes). A frequência dos antígenos HNA detectados nos doadores foi de 46,4% HNA-1a, 89,3% HNA-1b, 3,6% HNA-1c, 96,4% HNA-3a, 32,1% HNA-3b, 96,4% HNA-4a, 21,4% HNA-4b, 85,7% HNA-5a e 71,4% HNA-5b. A frequência dos anticorpos anti-HNA1a, anti-HNA1b, anti-HNA1c e anti-HNA2 no D0 foram respectivamente 46,4%, 42,9%, 42,9% e 53,6%. A associação entre a tipagem HNA dos doadores e anticorpos anti-HNAdos receptores com dia da pega, DECH aguda e TRM não mostrou correlação estatisticamente significativa. Conclusão. A frequência de HNA encontradanos doadores está de acordo com o descrito pela literatura. Contudo, a frequência dos anticorpos anti-HNAs foi bastante alta na população do estudo, embora a maioria apresentasse doença há menos de 12 meses até o transplante. Apesar de não encontrarmos uma correlação, novos estudos são necessários para melhor avaliar o papel do HNA no desfecho do TCTH. / Background and purpose. Hematopoietic cellular reconstruction with allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is an established method of treatment for a variety of hematological, oncologic and immunologic diseases. However, HSCT is associated with considerable morbidity and mortality due to recurrence of underlying disease, incomplete HLA compatibility, type of conditioning regimen and infection during the unavoidable period of neutropenia. This study investigates a surrogate cause of morbidity: compatibility of Human Neutrophil Antigens (HNA) between donors and receivers and its association with day of engraftment, incidence of acute graft versus host disease (GVHD) and total rate of mortality (TRM) in patients who underwent allogeneic HSCT. Type of study and location. Prospective cohort study carried out at the Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), Brazil. Methods. We have studied 27 patients who underwent HSCT between May, 2013 and April, 2014, and their respective donors. HNA typing in the donors was performed by PCR-SSP (One Lambda) and anti-HNA antibodies in receivers were detected using the LABSCREEN MULTI kit (LSMUTR-One Lambda). Results. The age ranged from 1 to 63 years, with an average of 20.4 ± 17.5 years. Nineteen were pediatric patients (<21 years) with an average age of 10.05 ± 6.4 years, and among adult patients the average was 42.2 ± 12.6 years. There was a discreet male prevalence, 16 (59,3%). The acute leukemias were frequent in 19 (70,3%) of patients, other malignant onco-hematological diseases (Hodgkin Lymphoma and non-Hodgkin's Lymphoma) in 3 (11,1%) and non-malignant (myelodysplastic syndrome, osteopetrosis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, aplasia and granulomatous disease) in 6 (22,2%). Nineteen (70,3%) of the patients, had the disease for less than 12 months at the time of the transplant and 24 (88,9%) were fully HLA compatible with their donors. Myeloablative conditioning regimen was used in 16 (59,3%) of the patients and the standard prophylaxis for GVHD (cyclosporine and methotrexate) was used in 15 (55,5%) of the patients. The day of engraftment had a median of 19 and minimum and maximum of 15 and 30, respectively. Four patients (14,8%) died before the engraftment. Approximately 17 patients (63%) showed acute GVHD (in all stages) and the total rate of mortality (TRM) was approximately 44% of the cases (12 patients). Patients who received HSCT from a related donor had TRM of approximately 41% (7 patients) and those who have received an unrelated donor was approximately 45% (5 patients). The frequency of HNA antigens detected in donors was 46,4% HNA-1a, 89,3% HNA-1b, 3,6% HNA-1c, 96,4% HNA-3a, 32,1% HNA-3b, 96,4% HNA-4a, 21,4% HNA-4b, 85,7% HNA-5a and 71,4% HNA-5b. The frequency of antibodies anti-HNA1a, anti-HNA1b, anti-HNA1c and anti-HNA2 at D0 were respectively 46,4%, 42,9%, 42,9% and 53,6%. The association between the HNA donor typing and anti-HNA antibodies of receivers with day of the engraftment, acute GVHD and TRM showed no statistically significant correlation. Conclusion. The HNA frequency found in our donors was close to the described in the literature. The frequency of anti-HNAs antibodies, however, was quite high in our study population; although the majority presented the disease for less than 12 months before the transplant. The association between HNA donor typing and anti-HNA antibodies of patients with day of engraftment, acute GVHD incidence and TRM showed no statistically significant correlation. As the number of cases was small, further studies with higher numbers and with antigen/antibodies assayed in both sides of transplantation pairs, are needed to better assess the role of the HNAs on the outcome of HSCT.

Os glicocorticóides endógenos (GCen) são moduladores importantes das reações inflamatórias, com papel em diferentes aspectos do processos. Neste contexto, tem sido demonstrado que os GCen controlam a migração de leucócitos para os focos de lesões, e um dos mecanismos propostos tem sido o efeito inibitório sobre os fenômenos de interação leucócito-endotélio. Uma vez que as moléculas de adesão medeiam os processos de interação celular, tem sido evidenciado que os GCen controlam, direta ou indiretamente, a expressão destes receptores nas membranas celulares na vigência de estresse de diferentes origens. No entanto, a literatura ainda é fragmentária e controversa quanto aos mecanismos exatos desta interferência. Desta forma, este trabalho tem por objetivo investigar o papel dos GCen sobre a expressão de moléculas de adesão envolvidas na interação leucócito-endotélio, e os possíveis mecanismos intracelulares responsáveis pelos efeitos. A deficiência de GCen foi induzida em ratos Wistar machos, adultos por adrenalectomia bilateral. A participação de receptores de glicocorticoides (GC) foi avaliada em ratos normais tratados com o antagonista RU 38486. Animais falso-operados (FO), ou normais (N) foram empregados como controles. A deficiência hormonal foi constatada pela dosagem de corticosterona plasmática por radioimunoensaio e demonstraram valores significativamente baixos em animais adrenalectomizados (ADR). Ensaios de microscopia intravital mostraram que aumento exacerbado de leucócitos em comportamento \"rolling\" em vênulas pós-capilares de animais adrenalectomizados (ADR) não reflete alterações hemodinâmicas, uma vez que a deficiência hormonal não provocou modificações no diâmetro ou fluxo sangüíneo de vasos da microcirculação do músculo cremaster. No entanto, a determinação da expressão de moléculas de adesão em leucócitos circulantes por citometria de fluxo mostrou que neutrófilos de animais ADR apresentaram maior expressão de L-selectina que células de animais controles. Por outro lado, a expressão de L-selectina em granulócitos maduros presentes na medula óssea de animais ADR estava diminuída em comparação com células de animais controles. Este efeito pode estar envolvido com a maturação acelerada destas células na medula e com a neutrofilia detectada em animais ADR. É importante salientar que a estimulação de polimorfonucleares (PMN), coletados tanto do sangue como da medula, com fMLP mostrou que estas células estavam aptas a aumentar a expressão da molécula, indicando que as alterações nas suas expressões em animais ADR não são dependentes de modificações na capacidade de síntese. Adicionalmente, a ação dos GCen sobre a expressão de L-selectina parece não depender do GC, já que animais normais tratados com RU 38486 não apresentaram o mesmo padrão de alteração observada em animais ADR. Com o intuito de identificar os efeitos dos GCen sobre a capacidade individual de aderência do endotélio e do neutrófilo, ensaio de aderência in vitro foram realizados com cultura primária de célula endotelial (CE) obtida do músculo cremaster e com neutrófilos coletados da aorta abdominal. Os dados obtidos mostraram que menor número de PMN provenientes de animais ADR aderiram à CE de animal normal, mas por outro lado, a maior número de PMN de animais controles aderiram à CE de animais ADR. Em conjunto, estes dados indicam um controle diferente dos GCen sobre as células envolvidas no processo: facilitam a aderência de PMN e diminuem a aderência da CE. A investigação do papel dos GCen sobre a expressão de moléculas de adesão envolvidas no processo mostrou que os hormônios não interferem com a expressão basal de &#946;2 integrina nos leucócitos, tanto nos circulantes quanto nos da medula. Adicionalmente, os dados de imunohistoquímica indicaram que os GCen modulam a expressão de moléculas responsáveis pela aderência. A expressão de ICAM-1 e PECAM-1 é significativamente maior no endotélio de vênulas de animais ADR que de animais controles. Associados, os dados aqui obtidos em animais ADR indicam um papel diferente dos CCen sobre a interação leucócito-endotélio. A modulação sobre a expressão de L-selectina pode estar envolvida na mobilização de neutrófilos para circulação e no comportamento rolling destas células. A subseqüente aderência dos leucócitos ao endotélio parece ser dependente de ações sobre a célula endotelial, através da modulação da expressão de moléculas da superfamília das imunoglobulinas. / The endogenous glucocorticoids (GCen) are important modulators of inflammatory reactions, acting in different aspects of the processes. In this context, it has been shown that GCen control leukocyte migration into focus of injuries, and one proposed mechanism of action is the modulation on leukocyte-endothelium interactions. Since adhesion molecules mediate cellular interactions, it has been evidenced that GCen control, direct or indirectly, the expression of these receptors on the cellular membranes during different stress conditions. However, data described in the literature are fragmentary and controversial. Then, the aim of this work was to investigate the role of the GCen on expressions of adhesion molecules involved in leukocyte-endothelium interactions and the possible intracellular mechanisms responsible for the effects. Adult male Wistar rats were submitted to bilateral adrenalectomy to induce adrenal hormone deficiency. The participation of glucocorticoid cytosolic receptor (GC) on the effects was evaluated in rats pre-treated with the glucocorticoid receptor antagonist RU 38 486. Sham-operated or normal rats were used as control. The hormone deficiency was assessed by quantification the plasmatic corticosterone by radioimmunoassay. Data showed marked lower values in adrenalectomized (ADR) than control rats. Intravital microscopy assays showed that the higher number of roller leukocytes in the postcapillary venules from cremaster muscle from ADR animals does not reflect hemodynamic alterations, given that hormonal deficiency did not modify the diameter or blood flow of microcirculation vessels. However, the determination of adhesion molecule expressions on circulating leukocytes by flow cytometry assay showed that neutrophils from ADR animals presented higher expression of L-selectin than cells from control animals. On the other hand, the expression of L-selectin on membranes of mature granulocytes in the bone marrow was decreased on cells from ADR rats. Together, these data suggest that modulation on L-selectin expression may be important target point of GE control and it may participate of the accelerated maturation of segmented cells in bone marrow, neutrophilia and in the elevated number of rolling leukocytes detected in ADR animals. It is important to emphasize that alterations on L-selectin expression on cells from ADR rats seem do not reflect an inability of its synthesis, since its expression after in vitro fMLP (formyl-Met-Leu-Phe) stimulation was not modified by hormonal deficiency. Additionally, the effect on L-selectin expression on circulating neutrophils may not be depend on the GC, since normal animal treated with RU 38486 presented expressions of L-selectin equivalent to those found in cells from control rats. To identify the effects of hormonal deficiency on individual ability of endothelium or neutrophils adherence, in vitro adherence assay was performed using both primary cultured endothelium from cremaster muscle and neutrophils collected from abdominal aorta. The results demonstrated that lesser number of PMN collected from ADR animals adhered to normal endothelium, while higher number of normal neutrophils adhered to endothelium from ADR rats. These latter results were corroborated by quantification of adhesion molecules expressions involved on adherence process by blood flow cytometer or by immunohistochemistry. The hormonal deficiency did not modify the &#946;2 integrin expression on leukocytes, but enhanced the ICAM-1 and PECAM-1 expression on endothelium membrane of cremaster muscle venules from ADR animals. Together data obtained in ADR animals may indicate a different role of the GE on cells during the leukocyte-endothelium interaction. The modulation on L-selectin may be involved on neutrophil delivery into circulation and on the rolling of circulating neutrophils. The subsequent adherence of leukocytes to endothelium seems to be dependent on actions on endothelial cells, through modulation of expressions of immunoglobulins superfamily molecules.

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes na circulação sanguínea, sendo recrutados rapidamente para os locais de infecção e inflamação. Em condições fisiológicas, os neutrófilos circulantes possuem tempo de vida curto, de cerca de 6 a 8 horas, mas a sua sobrevida pode aumentar em condições inflamatórias. O papel dos neutrófilos em diversas doenças foi negligenciado por muito tempo, em parte devido àsdificuldades em seu estudo e manipulação, pois os mesmos são facilmente ativados e difíceis de serem mantidos em cultura. Nos últimos anos, o advento de novas técnicas e o aprimoramento de condições laboratoriais têm possibilitado uma investigação mais ampla da fisiopatologia dos neutrófilos e revelado a diversidade de funções e interações dessas células. Para dar continuidade aos estudos visando o entendimento de como as funções efetoras dos neutrófilos podem ser moduladas por produtos naturais e sintéticos, e a aplicação desse conhecimento no tratamento de patologias nas quais tais leucócitos participam, o presente trabalho estabeleceu, primeiramente, as condições experimentais para a cultura de neutrófilos humanos. As células mantiveram-se viáveis e em estado de repouso por até 24 horas, tanto em solução balanceada de Hank\'s quanto em meio RPMI. A funcionalidade dos neutrófilos foi avaliada através da sua capacidade de produzir espécies reativas de oxigênio (ERO), medida por quimioluminescência dependente de luminol (QLlum). Diferentemente do meio RPMI, a solução balanceada de Hank\'s não interferiu no ensaio de QLlum, possibilitando a análise da funcionalidade das células. Durante o período de cultura celular de 24 horas, os neutrófilos mantiveram a sua capacidade de produzir ERO em quantidades suficientes para serem detectadas e permitirem a avaliação do efeito inibitório de substâncias antioxidantes. Em seguida, este trabalho avaliou o efeito de dois antioxidantes - a 3-fenilcumarina 6,7-diidroxi-3-(3\',4\'-metilenodioxifenil)-cumarina (C13) e o flavonol galangina - na produção de ERO pelos neutrófilos. Ambas as substâncias inibiram esta função efetora dos neutrófilos durante todo o período de cultura analisado, indicando que as mesmas não foram degradadas a ponto de perderem a sua atividade antioxidante. As condições de cultura padronizadas possibilitaram também a avaliação do efeito da galangina e da C13 na viabilidade celular. Na maior concentração analisada (20 ?M), ambas as substâncias não alteraram a porcentagem de células viáveis (aproximadamente 80%), mas modularam os estágios de sobrevivência dos neutrófilos, reduzindo a porcentagem de células em apoptose e aumentando a porcentagem de células em necrose, principalmente após 18 horas de cultura. Portanto, a solução balanceada de Hank´s é adequada para manter neutrófilos humanos em cultura por até 24 horas, possibilitando a avaliação do efeito de substâncias antioxidantes na produção de ERO por estas células e na sua viabilidade. / Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood, which are rapidly recruited to sites of infection and inflammation. Circulating neutrophils have a short lifetime of about 6 to 8 hours under physiological conditions, but their survival can be increased under inflammatory conditions. The role that neutrophils play in various diseases was long neglected, partially due to the difficulties to study and manipulate these cells, which are easy to activate and hard to maintain in culture. In recent years, the development of new techniques and improvement of laboratory conditions have broadened the investigation of neutrophil physiopathology and revealed the variety of functions and interactions of these cells. To continue the studies to understand how the effector functions of neutrophils can be modulated by natural and synthetic products, and to apply such knowledge to treat diseases in which these leukocytes participate, the first part of the present work established the experimental conditions to culture human neutrophils. Cells cultured in either Hank\'s balanced solution or RPMI medium remained viable and in the resting state for up to 24 hours. Neutrophil functionality was evaluated through its ability to produce reactive oxygen species (ROS), assessed by the luminol-enhanced chemiluminescence assay (CL-lum). In contrast to RPMI medium, Hank\'s balanced solution did not interfere in the CL-lum assay and thereby allowed analysis of neutrophil functionality. During the 24-hour cell culture period, neutrophils maintained their capacity to produce ROS in detectable amounts that were sufficient to assess the inhibitory effect of antioxidant compounds. Next, this work examined the effect of two antioxidants - the 3-phenylcoumarin 6,7-dihydroxy-3-[3\',4\'-methylenedioxyphenyl]-coumarin (C13) and the flavonol galangin - on ROS production by neutrophils. Both compounds suppressed this effector function of neutrophils during the whole culture period studied, indicating that they were not degraded to the point of losing their antioxidant activity. The standardized culture conditions also allowed assessing whether galangin and C13 affected cell viability. At the highest concentration tested (20 ?M), both compounds did not alter the cell viability percentage (around 80%) but modulated the neutrophil survival stages by reducing the percentage of apoptotic cells and increasing the percentage of necrotic cells, particularly after 18 hours of culture. Therefore, Hank\'s balanced solution is suitable to culture human neutrophils for up to 24 hours, and enables to assess the effect of antioxidant compounds on neutrophil ROS production and viability.

As leishmanioses constituem um complexo de doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania, as quais incluem diversas espécies responsáveis por desencadear formas clínicas distintas. A espécie Leishmania infantum, disseminada no Brasil e na América do Sul, está relacionada com comprometimento das vísceras, principalmente baço, fígado e medula óssea, apresentando alto índice de morbidade e mortalidade. É classicamente demonstrado que uma resposta mediada por linfócitos Th1 e Th17 conferem resistência na LV. Nesse sentido, as vias de sinalização ativadas, bem como os mediadores gerados durante a infecção, podem auxiliar no desenvolvimento da resposta imune protetora. Dentre as citocinas produzidas, destaca-se a IL-1 (IL-1? e IL- 1?) que possui papel importante na geração do processo inflamatório conferindo resistência às infecções fúngicas, bacterianas, e também na leishmaniose cutânea. No presente estudo, nosso objetivo foi determinar o papel da via de sinalização mediada por IL-1R durante a infecção experimental por Leishmania infantum. Nossos resultados demonstram que tanto IL-1? quanto IL-1? são produzidas durante a infecção in vivo por L. infantum, sugerindo sua participação na LV. De maneira interessante, a via de sinalização mediada por IL-1R parece estar envolvida na susceptibilidade ao protozoário, visto que animais geneticamente deficientes para IL-1R (IL-1R KO) são mais resistentes à infecção, apresentando menor número de parasitos no baço e fígado nas fases crônicas de infecção. Ainda, o fenômeno de susceptibilidade foi associado a uma regulação negativa da resposta inflamatória, principalmente acerca de células Th1 e também de Th17. A inflamação neutrofílica também foi alterada em animais IL-1R KO infectados. Foi observado aumento do número de neutrófilos bem como da produção de CXCL1 (KC), mediador quimioatraente para neutrófilos no baço de animais IL-1R KO, XVIII mas sem alterar o perfil de ativação dessas células. Ao determinar a citocina envolvida na regulação do processo inflamatório e consequentemente na susceptibilidade ao parasito, observamos que preferencialmente a IL-1? possui papel na progressão da doença, visto que a deleção gênica de enzimas essenciais para a liberação de IL-1? como Caspase 1/11 não alterou o número de parasitos no baço e fígado. Porém, na ausência de IL-1? foi observado um perfil de resistência associado ao aumento dos níveis de IFN-? e IL-17 nos órgãos alvos da doença. Confirmando o papel regulador, o tratamento com anticorpo monoclonal anti-IL1? em animais selvagens (do inglês wild type - WT) infectados reverteu o fenótipo de susceptibilidade e aumentou a resposta imune adaptativa na LV. Ao determinar o papel de IL-1?, macrófagos IL-1? KO diferenciados a partir de precursores de médula óssea, quando infectados com L. infantum, apresentaram concentrações elevadas de óxido nítrico no sobrenadante da cultura, quando comparados aos macrófagos IL-1R KO ou WT, confirmando um papel regulador da resposta imune efetora à infecção por L. infantum. Os efeitos reguladores de IL-1? parecem ser mediados por IL-10, visto que animais IL-1R KO possuem redução significativa dessa citocina mensurada no fígado durante a 6ª semana de infecção. Em conjunto, no presente trabalho demonstramos que a sinalização via IL-1R, com prevalência da IL-1?, regula negativamente a resposta imune efetora do perfil Th1 e Th17 . Consequentemente, há o comprometimento da migração de neutrófilos para o sítio de infecção e ativação de macrófagos permitindo o escape do parasito e estabelecimento da infecção. / The leishmaniases are a set of diseases caused by a protozoan of the genus Leishmania, which will lead to different clinical outcomes depending on the specific specie infecting the patient. The specie Leishmania infantum, already spread throughout Brazil and South America, is associated to visceral damage, mainly to the spleen, kidney and bone marrow, presenting high rates of morbidity and mortality. It is classically demonstrated that a response mediated by Th1 and Th17 lymphocytes promotes resistance to VL. Thus, the activated signaling pathways, as well as mediators generated during the infection, can assist in the development of a protective immune response. Among the expressed cytokines, the IL-1 (IL-1? e IL-1?) stands out for its important role in the inflammatory process and resistance to fungi and bacterial infections, and also in cutaneous leishmaniasis. In the present study, our aim was to determine the signaling role via IL-1R during experimental infection by L. infantum. Our results show IL-1? and IL-1? are produced in vivo infection by L. infantum, suggesting your participation in VL. Interestingly, the signaling pathway mediated by IL-1R appears to be involved in susceptibility to protozoal, since the animals genetically deficient for IL-1R (IL-1R KO) are more resistant to infection, presenting fewer parasites in the spleen and liver in chronic stages of infection. Additionally, the susceptibility phenomenon was associated with downregulation of the inflammatory response, mainly on Th1 cells and Th17. The neutrophilic inflammation has also been changed in IL-1R KO infected animals. Was observed an increase in neutrophils and production of CXCL1 (KC) in the spleen of IL- 1R KO animals, but without changing the activation profile of these cells. In determining the regulatory cytokine involved in the inflammatory process and therefore the susceptibility to the parasite, observed that IL-1? preferably has role in disease XX progression, since genic deletion of essential enzymes for IL-1? secretion (i.e.: Caspase 1/11) did not alter the number of parasites in the spleen and liver. However, in the absence of IL-1? was observed resistance profile associated with increased IFN-? and IL-17 in the target organ disease. Confirming the regulatory role, treatment with antiIL1? monoclonal antibody in WT mice infected reversed the susceptibility phenotype and increased adaptive immune response in LV. To determine the role of IL-1?, macrophages from IL-1? KO differentiated from bone marrow when infected with L. infantum showed high concentrations of nitric oxide in the culture supernatant when compared to macrophages from IL-1R KO and WT, confirming a regulatory role of the effector immune response to L. infantum infection. IL-1? regulatory effects appear to be mediated by IL-10, since IL-1R knockout animals have significant reduction of this cytokine measured in the liver during the 6th week of infection. Taken together, the present study demonstrated that IL-1R signaling pathway, with prevalence of IL-1?, negatively regulates effector immune response of Th1 and Th17 profile. Consequently, the impairment of neutrophil migration to the site of infection and activation of macrophages allowing the escape of the parasite and the establishment of infection.

Purpose: This study seeks to determine the incidence of vancomycin-resistant enterococci (VRE) infection in high-risk neutropenic fever patients colonized with VRE and to determine patient characteristics associated with VRE infection. Methods: We conducted a retrospective, single-center, unmatched case-control study. Fifty-three VRE-colonized, high-risk patients with neutropenic fever were identified between January 2006 and February 2009. The two most common diagnoses/conditions included acute myeloid leukemia and hematopoietic stem cell transplantation. Data collected included days of neutropenia, days of fever, demographic data, culture results, and antimicrobial therapy. Results: Twenty of the 53 patients (38%) with VRE colonization developed a VRE infection. The most common VRE infections were bacteremias (26%). The presence of neutropenia lasting longer than 7 days was associated with the development of VRE infection in this high-risk population colonized with VRE. The timeframe to develop VRE infection varied from 1 day to 2 weeks. Conclusion: For patients colonized with VRE, approximately 38% of high-risk neutropenic patients developed a VRE infection. This is the first study to specifically evaluate the incidence of VRE infections in febrile neutropenic patients colonized with VRE. Future research into the use and efficacy of empiric VRE coverage is needed.

<p>Nitric oxide (NO) is expressed in inflammatory tissues. However, NO effects are controversial in inflammation; NO is described as acting in a dose dependent manner and possess both pro-inflammatory and anti-inflammatory properties. </p><p>The present thesis explored the role of NO in relation to white blood cell (WBC) and protein system activation by foreign surfaces in simulated extracorporeal circulation (SECC) using human whole blood from volunteer donors. Three doses of NO, 40 ppm, 80 ppm and 500 ppm, were administered and an array of markers of WBC and protein activation were studied. Neutrophil degranulation was detected with myeloperoxidase (MPO), human neutrophil lipocalin (HNL) and lactoferrin (LF); eosinophil degranulation with eosinophil cationic protein (ECP) and eosinophil peroxidase (EPO); and basophil degranulation with histamine. Furthermore, whole blood and WBC capacity to produce reactive oxygen species (ROS) were studied and cytokine release was measured with IL-1 and IL-10. Complement activation was measured with C3a and C5b-9 complex and contact system activation with FXIIa-C1INH, FXIIa-AT, FXIa-C1INH and FXIa-AT.</p><p>NO increased neutrophil degranulation at all dose levels and 80 ppm NO increased basophil degranulation; whereas, NO exerted no effect on eosinophil degranulation, WBC subset counts, cytokine release or capacity to produce ROS. In addition, while increasing both specific and azurophil degranulation with 40 ppm, 80 ppm and 500 ppm, NO reversed the classical degranulation hierarchy with 500 ppm and azurophil degranulation became predominant. Furthermore, NO effect was greater with 500 ppm than with 80 ppm, indicating a dose response effect. The lack of iNOS mRNA expression in WBC and lack of L-NAME effect on degranulation and nitrite/nitrate production, together with absent increase in nitrite/nitrate in controls, excluded autocrine or paracrine regulation of degranulation. FXIIa-AT and FXIa-AT complexes increased and became predominant during early recirculation, whereas FXIIa-C1INH and FXIa-C1INH complexes were predominant at baseline but remained unaltered, suggesting contact system inhibition predominantly via AT. C3a and C5b-C9 increased. NO had no effect on either contact or complement system activation; however, 500 ppm NO shortened active clotting time.</p><p>In conclusion, the present data suggest that NO has a direct effect on neutrophil and basophil degranulation. Recognition of NO as an enhancer of degranulation may give access to new therapeutic tools for local and systemic inflammatory therapies; whereas, the identification of increased AT mediated inhibition of FXIIa and unchanged C1INH complexes presents new possibilities for therapeutic intervention in conditions such as hereditary angioedema and heart surgery.</p>

Nitric oxide (NO) is expressed in inflammatory tissues. However, NO effects are controversial in inflammation; NO is described as acting in a dose dependent manner and possess both pro-inflammatory and anti-inflammatory properties. The present thesis explored the role of NO in relation to white blood cell (WBC) and protein system activation by foreign surfaces in simulated extracorporeal circulation (SECC) using human whole blood from volunteer donors. Three doses of NO, 40 ppm, 80 ppm and 500 ppm, were administered and an array of markers of WBC and protein activation were studied. Neutrophil degranulation was detected with myeloperoxidase (MPO), human neutrophil lipocalin (HNL) and lactoferrin (LF); eosinophil degranulation with eosinophil cationic protein (ECP) and eosinophil peroxidase (EPO); and basophil degranulation with histamine. Furthermore, whole blood and WBC capacity to produce reactive oxygen species (ROS) were studied and cytokine release was measured with IL-1 and IL-10. Complement activation was measured with C3a and C5b-9 complex and contact system activation with FXIIa-C1INH, FXIIa-AT, FXIa-C1INH and FXIa-AT. NO increased neutrophil degranulation at all dose levels and 80 ppm NO increased basophil degranulation; whereas, NO exerted no effect on eosinophil degranulation, WBC subset counts, cytokine release or capacity to produce ROS. In addition, while increasing both specific and azurophil degranulation with 40 ppm, 80 ppm and 500 ppm, NO reversed the classical degranulation hierarchy with 500 ppm and azurophil degranulation became predominant. Furthermore, NO effect was greater with 500 ppm than with 80 ppm, indicating a dose response effect. The lack of iNOS mRNA expression in WBC and lack of L-NAME effect on degranulation and nitrite/nitrate production, together with absent increase in nitrite/nitrate in controls, excluded autocrine or paracrine regulation of degranulation. FXIIa-AT and FXIa-AT complexes increased and became predominant during early recirculation, whereas FXIIa-C1INH and FXIa-C1INH complexes were predominant at baseline but remained unaltered, suggesting contact system inhibition predominantly via AT. C3a and C5b-C9 increased. NO had no effect on either contact or complement system activation; however, 500 ppm NO shortened active clotting time. In conclusion, the present data suggest that NO has a direct effect on neutrophil and basophil degranulation. Recognition of NO as an enhancer of degranulation may give access to new therapeutic tools for local and systemic inflammatory therapies; whereas, the identification of increased AT mediated inhibition of FXIIa and unchanged C1INH complexes presents new possibilities for therapeutic intervention in conditions such as hereditary angioedema and heart surgery.