A fenilcetonuúia (PKU) é uma doença genética de caráter autossômico recessivo causada pela deficiência severa da enzima fenilalanina hidroxilase (PAH), que converte fenilalanina (Phe) em tirosina. O bloqueio desta reação resulta no acúmulo de fenilalanina e de seus metabolitos no plasma e tecidos (1 a 3 mM) e está relacionado com o retardo mental e convulsões apresentados pelos pacientes. A PKU é uma das mais frequentes e estudadas aminoacidopatias, porém a neurofisiopatologia da doença ainda é pouco conhecida. Estudos recentes tanto em pacientes quanto em animais mostraram que o estresse oxidativo pode estar envolvido na fisiopatologia da PKU devido ao acúmulo de metabólitos tóxicos, à excessiva produção de radicais livres e à influência de uma dieta restrita, que é o tratamento indicado para os pacientes fenilcetonúricos mas pode levar à carência de antioxidantes. O ácido lipóico (AL) é considerado um antioxidante ideal, pois interage com outros antioxidantes, induz expressão gênica e reage com espécies reativas específicas. Além disso, o AL pode ser adquirido na própria dieta e passa facilmente a barreira hematoencefálica, e por isso este composto vem sendo estudado no tratamento e prevenção de estresse oxidativo em diversas doenças neurodegenerativas. Assim, o objetivo do trabalho foi avaliar os efeitos do AL sobre a toxicidade da Phe em parâmetros de estresse oxidativo como atividade das enzimas catalase (CAT); superóxido dismutase (SOD); glutationa peroxidase (GSH-Px) e glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH), conteúdo de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), de tióis totais e de carbonilas formadas. Além disso, avaliar o potencial antioxidante total (TRAP) e a reatividade antioxidante total (TAR), a concentração de glutationa reduzida (GSH), o conteúdo de 2'7'diclorofluoresceína formado (DCF) e a capacidade de eliminar radicais hidroxilas em cérebro de ratos jovens. Para isso foram realizados experimentos com pré-tratamento do AL in vitro e in vivo em um modelo de experimental de PKU. Foi observado que o prétratamento proposto é eficaz para previnir lipoperoxidação, diminuir as defesas antioxidantes enzimáticas e não-enzimáticas, diminuir o coteúdo total de GSH e, ainda, previnir o aumento de radicais gerados pelo acúmulo de Phe no tecido. Mais experimentos precisam ser realizados, porém se os resultados deste trabalho forem observados em pacientes é possível que uma dieta suplementada com AL possa contribuir para o tratamento da PKU. / Phenylketonuria (PKU) is a genetic disease caused by autosomal recessive severe deficiency of phenylalanine hydroxylase (PAH), which converts phenylalanine (Phe) to tyrosine. The blocking of this reaction results in accumulation of phenylalanine and its metabolites in plasma and tissues (1 to 3 mM) and is linked to mental retardation and seizures in affected patients. PKU is one of the most frequent and studied inherited disorder, but the neuropathophysiology of the disease is still poorly known. Recent studies both in patients and in animals have shown that oxidative stress may be involved in the pathophysiology of PKU because of the accumulation of toxic metabolites, the overproduction of free radicals and the influence of a restricted diet, which is indicated for the treatment patients with PKU but may produce antioxidant deficiencies. Lipoic acid (LA) is considered an ideal antioxidant because it interacts with other antioxidants, induces gene expression and reacts with specific reactive species. Moreover, AL can be acquired in the diet and easily cross the blood brain barrier, and so this compound has been studied in the treatment and prevention of oxidative stress in several neurodegenerative diseases. The purpose of this study was to evaluate the effects of LA against the toxicity of Phe on oxidative stress parameters such as the activity of catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH), and the content of thiobarbituric acid reactive substances (TBA-RS), total thiol and carbonyl formed. Furthermore, to evaluate the total antioxidant potential (TRAP) and total antioxidant reactivity (TAR), the concentration of reduced glutathione (GSH), the content of 2'7'diclorofluorescein formed (DCF) and the ability to eliminate hydroxyl radical. So, experiments were performed with pre-treatment of AL in vitro and in vivo in brain of young rats subjected to a chemically-induced PKU. It was observed that the proposed pre-treatment is effective to prevent the increase of lipoperoxidation, the reduction of enzymatic and non-enzymatic antioxidant defenses (especially GSH), and also to prevent the increase of radicals generated by the accumulation of Phe in the tissue. More experiments need to be made, but if the results observed in this work were also seen in patients it is possible that a diet supplemented with AL may contribute to the current dietary treatment of PKU.

Uma vez que situações estressantes são consideradas fatores de risco para o desenvolvimento de depressão e que há poucos estudos avaliando terapias preventivas para o desenvolvimento dessa doença, no presente estudo avaliamos o efeito do exercício físico prévio em animais submetidos ao estresse crônico variado (ECV), um modelo animal de depressão, sobre tarefas comportamentais (campo aberto e esquiva inibitória) e alguns parâmetros bioquímicos e moleculares (estresse oxidativo e a atividade, o imunoconteúdo e a expressão gênica da enzima Na+, K+-ATPase) em amigdala e hipocampo de ratos. Adicionalmente avaliamos o peso corpóreo dos animais ao longo do experimento e parâmetros de estresse oxidativo em coração de ratos machos e fêmeas. Ratos jovens foram randomizados em 4 grupos de estudo (controle, exercitado, estressado, exercitado + estressado). Os animais foram submetidos ao exercício físico em esteira controlada durante 20 minutos, três vezes por semana, durante dois meses antes da submissão ao ECV (durante 40 dias). Os resultados mostraram que o ECV prejudicou a memoria aversiva, 24 horas e 7 dias após a sessão de treino. O ECV aumentou espécies reativas, lipoperoxidação, dano a proteínas e diminui a atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase e catalase, assim como diminuiu a atividade da Na+, K+-ATPase, mas não alterou o seu imunoconteúdo e a expressão gênica das subunidades catalíticas em estruturas cerebrais. O ECV prejudicou o ganho de peso corpóreo e aumentou a peroxidação lipídica em coração de ratos machos. O exercício físico prévio foi eficaz em melhorar o desempenho na tarefa de esquiva inibitória 24 horas após o treinamento; e preveniu o dano oxidativo, mas não preveniu completamente as alterações observadas nas atividades das enzimas superóxido dismutase, catalase e Na+, K+-ATPase em estruturas cerebrais. Não foi eficaz em prevenir o prejuízo no ganho de peso corpóreo e a peroxidação lipídica em coração de ratos machos. Nossos resultados sugerem que o exercício físico durante o período de desenvolvimento pode proteger os prejuízos na memoria aversiva e o dano oxidativo cerebral causado pela exposição ao estresse crônico ao longo da vida. / Since stressful situations are considered risk factors for the development of depression and there are few studies evaluating preventive therapies for the development of this disease, in the present study we evaluated the effect of previous physical exercise in animals submitted to varied chronic stress (CVS), an animal model of depression, on behavior tasks (open field and inhibitory avoidance tasks) and some biochemical and molecular parameters (oxidative stress and activity, immunocontent and gene expression of Na+, K+-ATPase enzyme) in amygdala and hippocampus of rats. Additionally we evaluate the body weight of the animals throughout the experiment and parameters of oxidative stress in heart of male and female rats. Young rats were randomized into 4 study groups (control, exercised, stressed, exercised + stressed). The animals were subjected to controlled exercise treadmill for 20 minutes, three times a week, for two months prior to submission to CVS (during 40 days). Results show that CVS impaired performance in inhibitory avoidance at 24 h and 7 days after the training session. CVS induced oxidative stress, increasing reactive species, lipoperoxidation and protein damage, and decreasing the activity of antioxidant enzymes superoxide dismutase and catalase, as well as decreased activity of Na+, K+-ATPase, but did not change immunocontents and gene expression of catalytic subunits in brain structures. CVS impair body weight gain and increased lipid peroxidation in heart of male rats. Previous physical exercise was able to improve performance in inhibitory avoidance task at 24 h after training; additionally, exercise prevented oxidative damage, but was unable to completely prevent the changes observed on activity of enzymes superoxide dismutase, catalase and Na+, K+-ATPase in brain structures. It was not effective in prevent decrease in body weight gain and lipid peroxidation in heart of male rats. Our findings suggest that physical exercise during the developmental period may protect against aversive memory impairment and brain oxidative damage caused by chronic stress exposure later in life.

A encefalopatia hepática é uma disfunção cerebral causada por insuficiência hepática que se manifesta através de um amplo espectro de anormalidades neurológicas e psiquiátricas, variando de alterações subclínicas à coma. Sua base fisiopatológica é complexa, envolvendo principalmente o aumento de amônia, glutamato, glutamina, estresse oxidativo e alteração no metabolismo cerebral. O nucleosídeo guanosina apresenta propriedades neuroprotetoras frente à excitotoxicidade glutamatérgica, estresse oxidativo e convulsão, tendo um potencial papel neuroprotetor em encefalopatia hepática e hiperamonemia. Nesta tese, apresentamos dois modelos experimentais. No primeiro, induzimos encefalopatia através da administração de acetato de amônia por via intraperitoneal em ratos. O grupo tratamento recebeu guanosina 20 minutos antes de receber acetato de amônia. Analisamos alterações hepáticas e sistêmicas, letalidade, análises neurológicas (normal, pré-coma, coma e morte) e eletroencefalográficas, níveis liquóricos de glutamato, glutamina, alanina e amônia, marcadores de estresse oxidativo no sistema nervoso central, captação de glutamato cortical, e atividade e imunoconteúdo cortical da enzima glutamina sintetase. A guanosina drasticamente reduziu a taxa de letalidade (50%) e duração de coma (30%). Outros desfechos foram melhora no traçado eletroencefalográfico, normalização de níveis liquóricos de glutamato, normalização na captação de glutamato e manutenção dos níveis normais de estresse oxidativo no sistema nervoso central. No segundo modelo, induzimos encefalopatia hepática em ratos através de hepatectomia subtotal (92%). Tivemos como objetivos aprofundar o conhecimento nos mecanismos da encefalopatia hepática e consequentes alterações no metabolismo cerebral. Avaliamos letalidade cirúrgica, alterações hepáticas e sistêmicas, atividade comportamental em teste de campo aberto, análise eletroencefalográfica, níveis liquóricos de aminoácidos, imunoconteúdo de transportadores glutamatérgicos, marcadores de estresse oxidativo, atividade das enzimas do ciclo dos ácidos tricarboxílicos e oxidação de glutamato, além de glutamina e glicose no sistema nervoso central. A cirurgia de hepatectomia subtotal provocou profundas alterações na análise eletroencefalográficas e no perfil comportamental dos animais, que apresentaram diminuição da locomoção. Também, houve alterações no metabolismo cerebral e em marcadores de estresse oxidativo compatíveis com aumento de proteólise cerebral (aumento de glutamina, glutamato e aminoácidos de cadeia ramificada), aumento de glicólise, aumento na oxidação cerebral de glutamato e diminuição na oxidação de glicose e lactato. Com dois modelos complementares, correlacionamos alterações neuroquímicas, metabólicas, eletroencefalográficas e comportamentais, aprofundando-nos na fisiopatologia da EH. Esta tese traz novas evidências para a utilização do nucleosídeo guanosina em tratamento de hiperamonemia e encefalopatia hepática. / Hepatic encephalopathy is a brain dysfunction caused by liver failure that manifests itself through a broad spectrum of neurological and psychiatric abnormalities, ranging from subclinical symptoms to coma. Its pathophysiological basis is complex, involving mainly the increase of ammonia, glutamate, glutamine, oxidative stress and alteration in cerebral metabolism. The nucleoside guanosine has neuroprotective properties against glutamatergic excitotoxicity, oxidative stress and convulsion, and has a potential neuroprotective role in hepatic encephalopathy and hyperammonemia. In this thesis, we present two experimental models. In the first, we induced encephalopathy through the administration of ammonia acetate intraperitoneally in rats. The treatment group received guanosine 20 minutes before receiving ammonia acetate. We analyzed hepatic and systemic changes, lethality, neurological scale (normal, pre-coma, coma and death) and electroencephalographic analyzes, cerebrospinal fluid level of glutamate, glutamine, alanine and ammonia, oxidative stress markers in the central nervous system, cortical glutamate uptake and, finally, activity and immunocontent of the enzyme glutamine synthetase. Guanosine dramatically reduced lethality rate (50%) and coma duration (30%). Other outcomes were: improvement in electroencephalographic tracing, normalization of glutamate levels, normalization of glutamate uptake and maintenance of normal levels of oxidative stress in the central nervous system. In the second model, we induced hepatic encephalopathy in rats through subtotal hepatectomy (92%). We aimed to better understand the mechanisms of hepatic encephalopathy and consequent alterations in cerebral metabolism. We evaluated surgical lethality, hepatic and systemic alterations, behavioralal activity in the open field test, electroencephalographic analysis, cerebrospinal fluid levels, immunocontent of glutamatergic transporters, oxidative stress markers, activity of tricarboxylic acid cycle enzymes and glutamate, glucose and lactate oxidation. Subtotal hepatectomy surgery caused profound alterations in the electroencephalographic analysis and in the behavioral profile of the animals, which showed a decrease in locomotion. Also, there were alterations in cerebral metabolism and markers of oxidative stress compatible with increased cerebral proteolysis (increase of glutamine, glutamate and branched-chain amino acids), increased glycolysis, increased cerebral oxidation of glutamate, and decreased glucose and lactate oxidation . With two complementary models, we correlate neurochemical, metabolic, electroencephalographic and behavioral changes, beeter comprehensing the physiopathology of hepatic encephalopathy. This thesis brings new evidence for the use of the nucleoside guanosine in the treatment of hyperammonemia and hepatic encephalopathy.

Pacientes que sobrevivem a uma parada cardíaca ou a um AVE demonstram uma alta incidência de prejuízos neurológicos como resultado do dano neuronal isquêmico tardio. Uma intervenção farmacológica apropriada durante a janela terapêutica entre o recomeço do fluxo sanguíneo normal e o início do dano neuronal seria de grande benefício, porém as abordagens experimentais atuais são limitadas neste sentido. Ao longo da última década, dados provenientes de muitos estudos apoiam a ideia que estrógenos promovem efeitos neuroprotetores em uma variedade de doenças neurodegenerativas, incluindo a isquemia cerebral global. O potente hormônio feminino 17-β-estradiol (E2) é neuroprotetor em uma variedade de modelos celulares e animais de isquemia, contudo os paraefeitos inerentes a sua terapêutica não permitem seu uso em larga escala. Considerando a estrutura e mecanismo de ação similares dos fitoestrogênios no SNC, o objetivo deste estudo foi verificar os efeitos neuroprotetores de coumestrol, um potente isoflavonóide com alta afinidade de ligação por ambos os receptores de estrogênio (ERs) e alto potencial antioxidante, contra a neurodegeneração geralmente encontrada em eventos isquêmicos. Nós demonstramos aqui que coumestrol foi hábil em resgatar a morte neuronal na subárea CA1 hipocampal induzida pela isquemia global em ratas fêmeas em uma avaliação de sobrevivência celular, incluindo 24h pós-isquemia, e que esta neuroproteção parece ser mediada através dos ERs. Em um próximo passo, avaliamos se a pré-administração de coumestrol poderia reverter a atividade da bomba de Na+/K+-ATPase, cuja atividade se encontra prejudicada após insultos isquêmicos, e se sua ação seria igualmente efetiva quando administrado em ratos machos. A análise demonstrou que coumestrol foi eficiente em restaurar a atividade da Na+/K+-ATPase em todos os tempos avaliados, incluindo 24h pós-isquemia. A efetividade em prevenir a morte neuronal em ratos machos foi igualmente observada em todos os tempos de administração, incluindo 24h pós-isquemia. As correspondências neuroprotetoras no tempo de 24h na neuroproteção sugerem um possível mecanismo pelo qual coumestrol possa estar agindo para promover neuroproteção em longo prazo. Sabendo que a morte neuronal tardia na isquemia global está associada com a redução na expressão de GluR2 na região CA1 pouco antes do início da morte celular, examinamos o possível papel de coumestrol na expressão de GluR2 em camundongos machos em três diferentes tempos pós-isquemia. O evento isquêmico reduziu os níveis proteicos de GluR2 hipocampais em todos os tempos avaliados e o tratamento com coumestrol foi efetivo em prevenir essa redução. Adicionalmente, estando consciente que a excitotoxicidade é um dos mecanismos celulares ligados à neurodegeneração associada à isquemia, buscou-se determinar se coumestrol poderia promover neuroproteção in vitro, contra a excitotoxicidade induzida por NMDA em culturas neuronais hipocampais. Nós observamos que coumestrol promoveu neuroproteção, porém somente quando sua administração foi perto do evento excitotóxico. Atribuímos esta inabilidade em conferir neuroproteção em longo prazo devido à presença do inibidor de células gliais presente na cultura neuronal, que limita a proliferação glial em 10% ou menos, sugerindo o sistema glial como um importante coadjuvante no contexto da neuroproteção em longo prazo conferida por coumestrol. Estendendo nossa investigação para uma avaliação comportamental, examinamos se coumestrol poderia ser igualmente eficaz em prevenir os déficits de memória presentes após um insulto isquêmico. A análise histológica confirmou a neuroproteção promovida pela administração de coumestrol como esperado, e sua terapêutica foi bem sucedida em reverter os déficits de memória promovidos pela isquemia global. Portanto, esses resultados coletivos indicam que coumestrol desperta novas perspectivas dentro da terapêutica da isquemia global e abre novas possibilidades na investigação no contexto dos acidentes vasculares encefálicos. / Patients who survive cardiac arrest or stroke demonstrate a high incidence of neurological impairment as a result of delayed ischemic neuronal damage. Proper pharmacological intervention during the therapeutic window between the resumption of normal blood flow and the onset of neuronal damage would be of great benefit, but the current experimental approaches have yielded only limited success. Over the last decade, data from many studies support the idea that estrogens provide neuroprotective effects in a variety of neurodegenerative diseases, including cerebral global ischemia. The potent feminizing hormone 17-β-estradiol (E2) is neuroprotective in a host of cell and animal models of stroke, however the side effects inherent its therapeutics doesn’t allow its use in a large scale. Considering the similar structure of phytoestrogens and its similar actions within the CNS, the aim of this study was verify the neuroprotective effects of coumestrol, a potent isoflavonoid with high binding affinities for both estrogen receptors (ERs) and significant antioxidant activity, against neurodegeneration usually observed in global ischemic events. We demonstrate here that coumestrol was able to rescue neuronal death in the hippocampal CA1 subfield induced by global ischemia in female rats in a cell survival evaluation, including 24h after ischemia, and its neuroprotective actions seems to be through the ERs. In a next step, we evaluated if coumestrol pre-administration could rescue the Na+/K+-ATPase activity that is found severely impaired after ischemic insults, and if its administration would be equally neuroprotective in male rats. The analysis showed that coumestrol was able to reverse the Na+/K+-ATPase activity in all times of evaluation, including 24h after ischemia. The effectiveness in preventing neuronal death in male rats was also observed in all time-points evaluated, including 24h after ischemia. These two 24h correspondence in neuroprotection suggests one possible mechanism by which coumestrol could be acting to afford neuroprotection in a long term. Knowing that the delayed neuronal death in global ischemia is associated with a reduced GluR2 expression in CA1 hippocampal field just before the cell death onset, we examined the possible role of coumestrol at the level of GluR2 expression of male mice in three different time-points after ischemia. The ischemic event induced high suppression of GluR2 in all evaluated times and coumestrol pre-treatment was able in preventing this reduction. In addition, being aware that excitotoxicity is one of the cellular mechanisms linked to cerebral ischemic neurodegeneration, we sought to determine if coumestrol could be neuroprotective in vitro as well, against a NMDA-induced excitotoxicity in hippocampal neuronal culture. We observed that coumestrol was skilled to afford neuroprotection only when its administration was next to the excitotoxic event. We attribute this longest reach inability of neuroprotection due the glial inhibitor present in the neuronal culture, which limits the glial cells proliferation in 10% or less, suggesting the glial system as an important adjuvant in the context of the coumestrol longer therapeutic window. Extending our investigation in a behavior assessment, we examined if the coumestrol could be also virtuous in preventing the memory deficits present after an ischemic insult. The histological analysis confirmed the reduction in neuronal loss afforded by coumestrol administration as expected, and its pre ischemic administration was able to rescue the memory impairment promoted by the global ischemia. Therefore, our collective results indicate that coumestrol spread new perspectives in the context of global ischemia therapeutics and unlock new possibilities for the stroke investigation.

Muitas similaridades existem entre isquemia cerebral e epilepsia a respeito de dano cerebral e mecanismos de autoproteção que são ativados próximos à lesão. Oxcarbazepina (OXC), droga anticonvulsivante, atua bloqueando os canais de sódio voltagem-dependentes, aumentando a condutância de potássio e modulando os canais de cálcio voltagem-dependentes. Nosso objetivo nesse trabalho foi analisar o perfil de neuroproteção da OXC e investigar o possível envolvimento da via de sinalização celular PI3-K (fosfatidil inositol 3-cinase), uma via conhecida por seus efeitos proliferativos e antiapoptótico. Para mimetizar uma isquemia, culturas organotípicas de fatias hipocampais de ratos Wistar de 6-8 dias foram expostas à privação de oxigênio e glicose (POG). A adição da OXC (30μM) antes da indução da lesão aumentou a sobrevivência neuronal no hipocampo de culturas organotípicas expostas a POG por 60 minutos, observado pela diminuição da incorporação de IP.Este efeito neuroprotetor foi prevenido por LY294002 (inibidor de PI3-K). Este resultado indica um possível envolvimento da via Akt na neuroproteção. Para investigar se a proteína Akt, uma cinase ativada pela PI3-K, estava envolvida na neuroproteção das células as condições de POG, analisamos a fosforilação e o imunoconteúdo dessa cinase em 1, 6 e 24 horas depois da reperfusão. Nenhuma alteração foi observada nesses parâmetros, sugerindo que, nesse caso, a fosforilação da Akt não está envolvida na neuroproteção mediada pela OXC. Da mesma maneira não foi observada alteração em 1, 6 e 24 horas na GSK-3β, uma cinase logo abaixo na via Akt, e pró-apoptótica, sugerindo que, nesse caso, a fosforilação da GSK-3β não está envolvida na neuroproteção mediada pela OXC. Juntos, os resultados deste trabalho mostram um claro efeito neuroprotetor da OXC contra a lesão isquêmica, que entretanto, não envolve a via de sinalização da Akt/GSK-3β. Embora a reversão da proteção ao tratamento, com o inibidor da PI3-K, seja um indício de que uma via possa ser ativada pela PI3-K e estar envolvida na neuroproteção. Os dados suportam a idéia que a OXC poderia ser utilizada na profilaxia e/ou tratamento da isquemia cerebral.

Esta tese foi desenvolvida para investigar os mecanismos envolvidos nos efeitos protetores do tratamento com lítio sobre a memória espacial de ratos submetidos a um modelo de estresse crônico variado, bem como verificar os efeitos destes tratamentos em alguns parâmetros relacionados com depressão. Foram utilizados ratos Wistar (Rattus norvegicus), divididos em 4 grupos experimentais: controles, controles tratados com lítio, estressados e estressados tratados com lítio. Observamos que em 21 dias de tratamentos com estresse e lítio não há alteração na memória espacial, e que aos 30 dias o tratamento com lítio induz um efeito facilitador sobre a memória. A partir disso, os tratamentos tiveram duração de quarenta dias, após os quais as medidas comportamentais e bioquímicas foram desenvolvidas. Observamos que o estresse diminui a atividade da enzima Na+, K+-ATPase em membranas sinápticas hipocampais, e este efeito é prevenido pelo tratamento com lítio, bem como revertido tanto pela interrupção do estresse quanto pelo tratamento pós-estresse com lítio. A interrupção do estresse por um período de trinta dias também reverte os seus efeitos sobre a memória, assim como o faz o tratamento pós-estresse com lítio. Estes dados indicam que o déficit cognitivo induzido pelo estresse crônico é mediado por alterações plásticas, e a similaridade temporal com os efeitos sobre a atividade da enzima Na+, K+-ATPase sugere que ela esteja envolvida no prejuízo observado na memória espacial. Também avaliamos os efeitos destes tratamentos sobre a transmissão glutamatérgica hipocampal, e observamos que o estresse aumenta a liberação basal de glutamato e diminui a captação deste neurotransmissor por fatias hipocampais. Este efeito pode induzir excitotoxicidade glutamatérgica e colaborar no agravamento de outros insultos, como o aumento na morte celular observado após a privação de oxigênio e glicose. Por sua vez, o lítio aumentou a captação de glutamato por sinaptossomas, o que pode ser uma ferramenta adicional na neuroproteção após diversos tipos de insulto. Também houve um aumento na liberação de glutamato após estímulo, e este efeito pode, por um lado, estar facilitando os mecanismos de plasticidade sináptica, por outro, ter contribuído para o aumento na morte celular observado após privação de oxigênio e glicose. Foram realizadas medidas de estresse oxidativo, onde o tratamento com lítio induziu um relativo efeito antioxidante, demonstrado pela diminuição na formação de espécies oxidantes no hipocampo e pelo aumento da reatividade antioxidante total em hipocampo e hipotálamo, bem como pelo aumento na atividade da superóxido dismutase (SOD) e da glutationa peroxidase (GPX) em hipotálamo e hipocampo, respectivamente. Contudo, este efeito antioxidante não foi eficiente na prevenção da peroxidação lipídica hipocampal provocada pelo estresse, e o aumento desproporcional na atividade da SOD em animais estressados e estressados + lítio é um possível causador da peroxidação dos lipídeos de membrana em hipocampo. Os tratamentos com estresse e lítio induziram aumento no consumo de alimentos doces, sem, contudo, alterar o consumo de ração padrão pelos animais. No entanto, somente animais tratados com lítio apresentaram aumento também no consumo de alimentos salgados, e o aumento no consumo de doces por este grupo foi muito mais acentuado do que nos animais estressados. Estes efeitos não parecem ser devidos a uma maior ansiedade, visto que não houve efeito ansiogênico dos tratamentos no labirinto em cruz elevado. Animais estressados não apresentaram a analgesia característica após exposição a um sabor doce agradável (leite condensado) na medida de latência de retirada da cauda; contudo, mostraram analgesia induzida por um sabor ácido e desagradável, o que caracteriza alguns dos efeitos clássicos da depressão. Já animais tratados com lítio apresentaram analgesia tanto após o sabor agradável quanto o aversivo, sugerindo uma maior sensibilidade a estímulos gustativos nestes animais, e o lítio preveniu a ausência de analgesia induzida por doce em animais estressados, o que pode ser tomado como um efeito antidepressivo deste tratamento. Por fim, observamos uma diminuição na atividade dopaminérgica ventro-estriatal de animais estressados, que pode estar envolvida na ausência de comportamento apetitivo condicionado por um estímulo palatável. Por outro lado, animais tratados com lítio apresentaram um aumento no tônus dopaminérgico, demonstrado pela aquisição de comportamento apetitivo e pela sensibilização cruzada com dietilpropiona, sem, contudo, apresentarem alteração no conteúdo total de dopamina no núcleo accumbens. Pode-se sugerir que o tratamento com lítio induza um aumento na liberação fásica de dopamina ou alteração em seus receptores, e estes efeitos podem estar envolvidos no aumentado interesse de animais tratados com lítio por alimentos novos / These studies were undertaken to investigate the mechanisms involved in the protective effects of lithium treatment on spatial memory of rats submitted to chronic variate stress paradigm, and to verify the effects of these treatments in some depression related parameters. Adult male Wistar rats (Rattus norvegicus) were divided into 4 groups: control, control treated with lithium, stressed and stressed treated with lithium. We observed that 21 days of stress and lithium treatments did not alter spatial memory, and that 30 days of lithium treatment had a facilitative effect on memory. From these results on, all treatments lasted 40 days, and after that behavioral and biochemical measurements were performed. We observed that stress decreases Na+, K+-ATPase activity in hippocampal synaptic membranes and this effect is prevented by lithium treatment, as well as it is reversed by stress interruption and post-stress lithium treatment. Thirty days of stress interruption also reversed its effects on spatial memory, as well as does a post-stress lithium treatment. These data suggest that the cognitive deficit induced by chronic stress is mediated by plastic alterations, and the parallelism between the effects on spatial memory and on Na+, K+-ATPase activity suggests that this enzyme may be involved in the spatial memory damage observed in stressed animals. We also evaluated the effects of stress and lithium on hippocampal glutamatergic transmission, and we observed that stress increases basal synaptosomal release and decreases glutamate uptake in slices of hippocampus. These effects may favor glutamatergic excitotoxicity and contribute to neuronal loss after other kinds of insults, as it was observed after oxygen and glucose deprivation. Lithium increased synaptosomal glutamate uptake, what can represent an additional tool in neuroprotection against several kinds of insults. Lithium also increased stimulated glutamate release, what can be benefic for neuronal plasticity but can also contribute to neuroendangerment after oxygen and glucose deprivation. We performed some oxidative stress measurements, and lithium treatment induced an antioxidant effect, evidenced by a decreased formation of oxidative agents in hippocampus and an increased on total antioxidant reactivity in hippocampus and hypothalamus, as well as an increased activity of superoxide dismuthase (SOD) and gluthathione peroxidase (GPx) in hippocampus and hypothalamus, respectively. However, this antioxidant effect was not enough to prevent the hippocampal lipid peroxidation induced by stress, and the disproportional increase on SOD activity in stressed and stressed + lithium is a possible mediator for the lipid peroxidation observed in this structure. Stress and lithium treatments induced an increased consumption of sweet foods, not altering standard chow consumption. However, just lithium-treated animals presented an increase in intake of savory foods, and their intake of sweet foods was notably higher than in stressed animals. These effects do not seem to be related to higher anxiety levels, since there was no anxiogenic effects of stress and lithium in the Plus Maze test. Stressed animals did not present sweet-induced analgesia, as evaluated by the tail-flick measurement, but they presented analgesia induced by an unpleasant flavor, characterizing some effects observed in depression. Conversely, lithiumtreated animals presented analgesia after pleasant and unpleasant tastes, suggesting an increased sensibility to gustative stimuli in these animals, and lithium prevented the absence of sweet-induced analgesia observed in stressed animals, what can be taken as an antidepressive effect of this treatment. Finally, we observed a decreased ventral-striatal dopaminergic activity in stressed animals that can be involved in the absence of a palatableconditioned appetitive behavior. On the other hand, lithium-treated animals presented an increased dopaminergic tonus, as showed by the acquired appetitive behavior and by the cross-sensitization with diethylpropione, without presenting any alteration in the total amount of dopamine in the nucleus accumbens. We can suggest that lithium treatment induces an increase on phasic dopamine release or an alteration in its receptors, and these effects can be involved in the increased interest of lithium-treated animals by new palatable foods.

Evidências sugerem que o exercício físico pode ajudar a manter a saúde cerebral e suas funções. Os mecanismos moleculares pelos quais o exercício afeta a função cerebral ainda não estão estabelecidos, porém sugere-se que ocorra ativação de vias celulares e moleculares que contribuam a neuroproteção. Nosso objetivo foi avaliar o efeito do exercício físico regular moderado em diferentes frequências/intensidades sobre a integridade hipocampal após uma injúria isquêmica in vitro, e investigar seu possível mecanismo de neuroproteção atrvés da quantificação do BDNF. O trabalho foi dividido em duas etapas. No primeiro trabalho um grupo de animais foi treinado durante 3 semanas, 2 vezes ao dia e outro grupo treinado cronicamente (12 semanas, durante 20 minutos), contudo com diferentes freqüências na realização da atividade física, que ocorreram 1 ou 3 vezes por semana. O grupo sedentário foi submetido à esteira sem movimento durante 3 minutos. Os animais foram decapitados cerca de 16 horas após a última sessão de treino. Os cérebros forma dissecados, o hipocampo imediatamente fatiado em “chopper” e s fatias randomizadas em duas placas controle (NPOG) e privada de oxigênio e glicose (POG). Após 3 h de reoxigenação, foram realizados os ensaios de avaliação da viabilidade celular, através da atividade mitocondrial, e de lise celular, pela determinação da liberação da enzima citosólica lactato desidrogenase. A POG significativamente reduziu a viabilidade celular em aproximadamente 40%, mas não houve diferença entre os grupos exercitados e o grupo sedentário. A POG aumentou a lise celular, não havendo diferença significativa entre o grupo sedentário e os exercitados uma vez por semana. Por outro lado, o exercício realizado 3 vezes por semana reverteu parcialmente o aumento do dano celular causado pela isquemia. No segundo trabalho, o hipocampo não utilizado para o ensaio da POG, foi utilizado para a quantificação do BDNF(Kit ELISA - BDNF Emax® ImmunoAssay System), a fim de relacionar o possível mecanismo de ação deste protocolo. Também, realizamos outro tipo de treino com diferente freqüência (2 semanas, com treinos diários de 20 minutos), o qual já demonstrou seu efeito neuroprotetor em outro trabalho realizado em nosso laboratório (Scopel et al., 2006), portanto, também realizamos o ensaio do BDNF neste protocolo nas estruturas: hipocampo, estriado, córtex e cerebelo. Surpreendentemente, tanto o exercício realizado cronicamente (1 e 3 vezes por semana), quanto o realizado diariamente durante 2 semanas, não alteraram os níveis de BDNF. Corroborando achados da literatura, o BDNF está presente em altas concentrações no hipocampo quando comparados a outras estruturas estudadas. Nossos dados demonstram que as células hipocampais frente ao exercício moderado apresentam baixa susceptibilidade ao dano isquêmico, e que o exercício com intensidade moderada realizado três vezes por semana reduz o dano produzido pela isquemia in vitro. Em relação ao possível mecanismo de ação envolvido neste processo, nossos dados sugerem que possivelmente o BDNF não está diretamente envolvido com o efeito neuroprotetor deste protocolo.

Nanopartículas de polímeros biodegradáveis têm atraído um intenso interesse nos últimos anos, pois esses sistemas podem prover vetorização de forma sustentada, controlada e atuar como carreadores de fármacos aumentando a eficácia terapêutica e diminuindo os efeitos adversos. Doenças degenerativas do sistema nervoso central têm sido vistas como um problema pela complexa patogênese e pela dificuldade na vetorização de fármacos. Dentre essas, estão os gliomas e os insultos isquêmicos, os quais são pobremente responsivos às intervenções terapêuticas. Atualmente, o tratamento com indometacina em doenças inflamatórias tem sido relacionado com diversos efeitos adversos gastrointestinais. Neste contexto, o presente estudo avaliou os efeitos do tratamento com indometacina em nanocápsulas em modelos experimentais de gliomas, isquemia cerebral, inflamações aguda e crônica em ratos. O tratamento com indometacina em nanocápsulas foi mais potente do que indometacina em solução em diminuir a viabilidade e a proliferação celular de linhagens de gliomas. Esse efeito citotóxico foi seletivo para as células tumorais. Adicionalmente, nós observamos em um modelo in vivo de gliomas que nanocápsulas poliméricas foram capazes de vetorizar a indometacina ao cérebro. Essa vetorização reduziu o crescimento de glioblastoma e aumentou a sobrevida dos animais. Estes efeitos foram mediados, pelo menos em parte, por mecanismos antiproliferativos e anti-angiogêncos. Além disso, o tratamento com indometacina em nanocápsulas apresentou efeitos neuroprotetores em culturas organotípicas de hipocampo expostas à privação de oxigênio e glicose. Esses efeitos foram mediados pela redução dos níveis de fosforilação de ERK1/2 e JNK, redução na iNOS e na ativação glial. Adicionalmente, a indometacina em nanocápsulas reduziu os níveis de citocinas pró-inflamatórias, sugerindo que o bloqueio da neuroinflamação está envolvido no efeito neuroprotetor observado. Em modelos de inflamação crônica em ratos (modelo de artrite), o tratamento sistêmico com indometacina em nanocápsulas produziu simultaneamente uma redução nos níveis de citocinas pró-inflamatórias e um aumento da citocina anti-inflamatória IL- 10. A maior eficácia anti-inflamatória foi associada a uma redução da toxicidade gastrointestinal. Juntos, nossos resultados sugerem que a indometacina em nanocápsulas pode ser considerada uma alternativa terapêutica promissora para o tratamento de gliomas, de isquemia cerebral e de inflamação crônica. / Nanoparticles of biodegradable polymers have attracted intensive interest in recent years because these systems can provide a sustained, controlled, and targeted delivery acting as drug carriers thus leading to high therapeutic efficiency and low side effects. Degenerative diseases of the central nervous system have long been viewed as a problem due to the complex pathogenesis of these disorders and the difficulty in drug delivery. Among these diseases, are the gliomas and the ischemic insults, which are poorly responsive to therapeutic interventions. Actually, indomethacin treatments for inflammatory diseases are related with several gastrointestinal side effects. Within this context, the present study was designed to evaluate the effects of indomethacin-loaded nanocapsules treatment in experimental models of gliomas, cerebral ischemia, acute and chronic inflammation in rats. Indomethacin-loaded nanocapsules treatment was more potent that indomethacin in solution in decreasing the viability and the cell proliferation of glioma lines. This cytotoxic effect was selective for tumoral cells. In addition, we have observed in an in vivo model of gliomas that polymeric nanocapsules are able to successfully carry indomethacin into the brain tumor. Local delivery of indomethacin reduced glioblastoma growth and improved the animals' survival. These effects were mediated, at least in part, by antiproliferative and antiangiogenic mechanisms of indomethacin-loaded nanocapsules. Also, indomethacin-loaded nanocapsules treatment presented neuroprotective effects in organotypic hippocampal cultures exposed to oxygen-glucose deprivation. These effects were mediated by the reduction in the levels of ERK1/2 and JNK phosphorylation, reduction in iNOS and glial activation. Additionally, indomethacin-loaded nanocapsules decreased the levels of the pro-inflammatory cytokines, suggesting that the blockage of neuroinflammation is involved in the neuroprotective effect observed. In models of chronic inflammatory in rats (arthritis model), the systemic treatment with indomethacin loaded nanocapsules produced simultaneity a reduction of the levels of pro-inflammatory cytokines and an increased in the levels of anti-inflammatory cytokine IL-10. The antiinflammatory efficacy increase was allied to an improved gastrointestinal safety. Taken together, our results imply that nanocapsule formulations containing indomethacin might be considered as promising alternative therapeutic for gliomas, cerebral ischemia and chronic inflammation treatment.

Submitted by Pós Imunologia (ppgimicsufba@gmail.com) on 2017-03-14T18:18:14Z No. of bitstreams: 1 Cleonice Creuza.pdf: 2460625 bytes, checksum: 893afe600ef298af83303b91d5023108 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-04-24T12:58:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Cleonice Creuza.pdf: 2460625 bytes, checksum: 893afe600ef298af83303b91d5023108 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-24T12:58:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cleonice Creuza.pdf: 2460625 bytes, checksum: 893afe600ef298af83303b91d5023108 (MD5) / Capes / A doença de Parkinson (DP) é caracterizada pela perda de neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo. No entanto, mecanismos molecular responsável pelo processo degenerativo no sistema dopaminérgico nigroestriatal durante a doença de Parkinson permanecem desconhecidos. Atualmente, concorda-se que disfunção mitocondrial, agregação de α- sinucleína, estresse oxidativo, neuroinflamação e degradação protéica são causas envolvidas. Estudos farmacológicos têm focado no uso de metabolitos secundários de plantas e, entre estes, os flavonoides têm mostrado atividade biológica com efeitos neuroprotetores, antiinflamatórios e antioxidantes. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos neuroprotetores e imunomodulatórios de flavonoides bioativos usando modelos in vitro de DP. Foram usados diferentes modelos de culturas neuronais, avaliadas pelo testes de MTT e análises morfológicas para avaliar os efeitos citotóxicos ou neuroprotetores da rutina e quercetina. Em seguida, foram usados diferentes modelos de cultura primária de células gliais e neuronais e testes de MTT, exclusão ao azul de tripan, Fluoro-Jade B, Western Blot ou imunocitoquímica para β-III-Tubulina, Western Blot para tirosina hidroxilase ou para GFAP para investigar o efeito citotóxico induzido por aminocromo e/ou o efeito neuroprotetor induzido por rutina. Também investigamos a resposta imunoinflamatória ou imunomodulatória dosando citocinas (IL6, IL10, TNF-alpha) usando o método de ELISA. Nossos resultados demonstraram que rutina e quercetina (10-50μM) não induziram decréscimo no metabolismo mitocondrial em linhagens celulares SHSY-5Y ou co-cultura primária de neurônios/células gliais, contudo estes aumentaram o metabolismo mitocondrial nas concentrações de 50 e 100 μM em células da linhagem PC12. Além disso, rutina (10μM) induziu alterações morfológicas em células PC12. Também foi visto que aminocromo (250- 500μM) induziu uma redução na viabilidade celular em co-cultura de mesencéfalo e em cultura de microglia, cultura de células gliais e cultura de neurônios corticais. Ainda, a exposição ao aminocromo reduziu a expressão de β-III-tubulina, tirosina hidroxilase e GFAP em co-culturas de mesencéfalo e cultura de células gliais. Nossos resultados demonstram que a rutina protege células neurais frente a dano induzido por aminocromo, aumenta a expressão de β-III-tubulina e protege a rede de neuritos. Além do mais, aminocromo induziu redução de níveis de citocinas IL-6, IL-10 e TNF-alfa que foram reguladas a níveis basais quando a cocultura de mesencéfalo foi tratada com rutina. Concluímos então que a rutina protege células PC12 contra danos celulares induzidos por MPTP, co-culturas de mesencéfalo e células gliais contra danos induzidos por aminocromo. Podemos sugerir que a redução no nível de citocinas é conseqüência da perda de células gliais induzidas por aminocromo e que o retorno a níveis basais podem ser resultado de glioproteção e neuroproteção induzida pela rutina. / Parkinson's disease (PD) is characterized by the loss of dopaminergic neurons in the midbrain. The molecular mechanism responsible for degenerative process in the nigrostriatal dopaminergic system in PD remains unknown. Currently, there is a general agreement that mitochondrial dysfunction, α-synuclein aggregation, oxidative stress, neuroinflammation and impaired protein degradation are involved. Pharmacological studies have been focusing in using plant secondary metabolites and, among these, flavonoids have shown biological activity such neuroprotective, anti-inflammatory and antioxidant. In this sense, the objective of this work was to study the neuroprotective and immunomodulatory effects of a bioactive flavonoid using in vitro models of PD. We used different models of neuronal culture and MTT test and morphological analysis to make a screening of cytotoxic and/or neuroprotection by rutin and quercetin. After we used different models of primary culture of neuronal and glial cells and MTT test, Tripan Blue, Fluoro-Jade B, western blot or immunocytochemistry of β-III-Tubulin, tyrosine hydroxylase or GFAP in order to investigate the cytotoxic effect induced by aminochrome and/or neuroprotection induced by rutin. We also investigated immunoinflamatory response or immunomodulation by measuring cytokines (IL6, IL10, TNF-alpha) using ELISA. Our results demonstrated that rutin and quercetin (10-50μM) did not induce decrease in mitochondrial metabolism on SHSY-5Y cells line, or primary coculture of neuron/glial cells, however it increased the mitochondrial metabolism at concentrations 50 and 100μM on PC12 cells line. Moreover rutin (10μM) induce alterations on PC12 cells morphology. We also saw that aminocrhome (250-500μM) induced a decrease on cell viability at midbrain co-culture and microglia culture, glial cells culture, cortical neurons culture. In addition, the exposure to aminocrhome decreased expression of β-IIItubulin, tyrosine hydroxylase and GFAP on midbrain co-cultures and glial cells culture. Our results demonstrate that rutin protects neural cells from damage induced by aminocrhome, increases β-III-tubulin expression and protects neurite network. Furthermore, aminocrhome induced reduction of cytokines IL-6, IL-10 and TNF-alpha levels that were regulated to basal levels when the midbrain co-culture was treated with rutin. We concluded that rutin protects against PC12 cells cell against death induced by MPTP and neuronal and glial cells against death induced by aminocrhome. We can suggest that the reduction in cytokine levels are consequence of the loss of glial cells induced by aminocrhome and that the return to baseline levels may result from glioprotection and neuroprotection induced by rutin.

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