L'adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est une maladie agressive dans le monde. En raison du manque d'outils de détection hautement sensibles et spécifiques à un stade précoce de la maladie et de traitements peu curatifs, la plupart des patients sont diagnostiqués à un stade incurable avec une mortalité élevée. Comprendre la pathologie moléculaire, en particulier le stade précoce de cette maladie mortelle, est d’une importance capitale pour améliorer les bons pronostics de ces patients. La première et principale partie de mes travaux reposait sur une analyse de profilage génétique dans laquelle ils mettaient en évidence le rôle de la signalisation TGFβ / Activine et du récepteur ALK4 au cours du développement de la PDAC, en plus des quatre gènes oncogéniques courants (KRAS, CDKN2A, TP53 et SMAD4). ). D'autre part, INHBA (codant pour ActivinA) en tant que membre clé des ligands de la superfamille TGFβ est une cible de l'activation oncogénique de Kras dans les cellules du canal pancréatique et a été désigné comme composant potentiel de la SASP par une analyse au sécrétome de cellules subissant une sénescence induite par Kras. . Le but de mes travaux est donc d’étudier l’impact de la signalisation ActivinA lors de l’initiation de la PDAC. Dans la première partie de mon projet, j'ai démontré qu'ActivinA était un facteur SASP protecteur de la tumeur, produit par les cellules sénescentes d'ADM / PanIN, qui limitent leur prolifération et leur expansion dans les lésions hautement prolifératives via son récepteur ALK4 lors de l'initiation du PDAC. De plus, nos travaux ont révélé que les cellules sénescentes Dclk1 + limitent l'expansion des lésions prénéoplasiques et ont un impact partiel sur le composant stromal soutenu par la signalisation ActivinA. En outre, j'ai également exploré les fonctions autocrines et paracrines de la signalisation ActivinA au dernier stade de la PDAC. Nous avons constaté que le manque de signalisation ActivinA-ALK4 chez la souris entraînait une augmentation de la capacité de prolifération des cellules tumorales et une accumulation réduite de cellules stromales, ce qui pourrait aider à expliquer leurs métastases variées et un temps de survie relativement plus long. En conclusion, mon travail donne un autre aperçu de la signalisation ActivinA et Dclk1 dans l'initiation de la PDAC et leur existence dans des cellules sénescentes au sein de lésions précurseurs pancréatiques de bas grade devrait être considérée comme une étape cruciale pour développer de nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques pour les patients atteints de PDAC / Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is an aggressive disease worldwide and remains the ranking of 7th leading cause of cancer related death in the past 5 years. Because of the lack of highly sensitive and specific detective tools in an early stage of this disease and low curative treatments, most of the patients are diagnosed in an incurable stage and end up with a high mortality. Understanding the molecular pathology especially the early stage of this lethal disease is of great importance to improve the outcome of these patients. The first and major part of my work was based on gene profiling analysis in which they emphasized the role of TGFβ/Activin signalling and ALK4-receptor during the development of PDAC in addition to the four common oncogenic genes (KRAS, CDKN2A, TP53 and SMAD4). On the other hand, INHBA(encoding for ActivinA) as a key member of TGFβ-superfamily ligands is a target of Kras oncogenic activation in pancreatic duct cell and has been pointed a potential SASP candidate component through a secretome analysis of cells undergoing Kras induced senescence. Therefore, the aim of my work is to investigate the impact of ActivinA-signalling during PDAC initiation. In the first part of my project, I demonstrated that ActivinA as a tumour-protecting SASP factor, produced by ADM/PanINs senescent cells, that limit their proliferation and expansion into highly proliferative lesions through its ALK4 receptor in the initiation of PDAC. Furthermore, our work revealed that senescent Dclk1+ cells limit the expansion of preneoplastic lesions and partly impact the stromal component which is sustained by ActivinA-signalling. Besides, I also explored the autocrine and paracrine functions of ActivinA-signalling in the late stage of PDAC. We found that lack of ActivinA-ALK4 signalling in mice leads to an increased proliferative capacity in tumor cells and a reduced accumulation of stromal cells, which might help to explain their diverse metastasis and a relative longer survival time. To conclude, my work gives another insight of ActivinA-signalling and Dclk1 in the onset of pancreatic cancer and their existence in senescent cells within low grade pancreatic precursor lesions should be considered a crucial step for developing novel diagnostic and therapeutic strategies for PDAC patients

Chacune de nos cellules possède l’information génétique nécessaire à la constitution de l’organisme entier, mais les cellules différenciées n’expriment qu’un répertoire restreint de gènes. Le contrôle des expressions des gènes apparaît fondamental dans la mise en place et le maintien de l’identité cellulaire. Le contrôle transcriptionnel, premier niveau de régulation de l’expression des gènes, est basé sur l’intégrité de la séquence génique et sur son accessibilité, elle-même conditionnée par les mécanismes épigénétiques contrôlant la dynamique chromatinienne. Dans un contexte pathologique, des altérations génétiques et/ou épigénétiques pourront alors être à l’origine de dérégulations géniques et mener à des fonctions cellulaires altérées. Lors du développement d’un carcinome bronchique, les cellules pulmonaires acquièrent une capacité de prolifération incontrôlée et une résistance accrue à l’apoptose. Ces caractéristiques phénotypiques, bases de la croissance tumorale, sont le reflet des anomalies qui s’accumulent dans le génome des cellules cancéreuses. Aux altérations génétiques somatiques (mutations ponctuelles, remaniements chromosomiques) s’ajoute un bouleversement global du paysage épigénétique, le tout conduisant une crise de l’identité cellulaire et à des dérégulations massives des expressions géniques. Alors que la répression aberrante de gènes (notamment des gènes suppresseurs de tumeur) a été largement étudiée, l’activation ectopique de gènes normalement silencieux demeure un aspect plus méconnu. Notre hypothèse de travail est que les expressions hors-contexte de gènes tissu-spécifiques puissent être non seulement impliquées dans le phénomène de cancérogenèse, mais également constituer des biomarqueurs tumoraux ou cibles thérapeutiques innovantes. Dans cette thèse, notre attention s’est portée sur le gène PRL codant la prolactine, normalement exprimée dans l’hypophyse et absente du poumon non tumoral. Nous avons détecté une activation ectopique du gène PRL dans 10% des tumeurs pulmonaires, principalement des tumeurs neuroendocrines. Nous avons observé que l’expression de PRL est associée à des tumeurs particulièrement agressives et à un pronostic sombre pour les patients. Nous avons également démontré que l’expression de PRL confère aux cellules cancéreuses pulmonaires une résistance accrue à un stress génotoxique. De manière inattendue, nos résultats suggèrent que l’effet oncogène de l’expression de PRL ne repose pas sur les mécanismes d’action classique de la prolactine et nous avons dû remettre en question l’hypothèse initiale d’une sécrétion de l’hormone par les cellules cancéreuses pulmonaires et d’une action autocrine/paracrine au sein de la tumeur via l’activation du récepteur à la prolactine. Le récepteur est en effet absent des cellules cancéreuses pulmonaires et le transcrit PRL exprimé est dépourvu de ses premiers exons, ce qui pourrait conduire à la production d’une protéine tronquée de son peptide signal, incapable d’emprunter la voie de sécrétion classique, et par conséquent retenue à l’intérieur de la cellule cancéreuse pulmonaire. Même si les mécanismes d’action in cellulo de la prolactine restent à décrypter, nos données suggèrent que l’expression ectopique de PRL pourrait constituer une nouvelle cible thérapeutique dans le traitement des tumeurs pulmonaires agressives. Ce travail de thèse, incluant également des résultats complémentaires obtenus sur trois gènes spécifiques du testicule exprimés de manière aberrante dans les tumeurs pulmonaires (BRDT, SOX30 et SPATA22) met en lumière l’intérêt des expressions ectopiques. Celles-ci peuvent en effet fournir de nouveaux outils de diagnostic et de pronostic aux cliniciens, mais également de nouvelles approches ciblées en complément des thérapies classiques qui ne suffisent pas à limiter la mortalité importante due aux néoplasies pulmonaires. / Each human cell contains a genome carrying all the genetic information necessary for the constitution of the whole organism. However, differentiated cells express only a restricted repertoire of genes. The control of gene expressions is fundamental for the establishment and maintenance of cell identity. The first level of gene expression regulation, the transcriptional control, is based on the integrity of the gene sequence but also on its accessibility, itself dependent on a set of epigenetic mechanisms that control chromatin dynamics. In a pathological context, genetic and epigenetic alterations can lead to gene deregulations and altered cellular functions. During the bronchial carcinogenesis, lung cancer cells acquire a capacity of uncontrolled proliferation and an increased resistance to cell death. These phenotypic characteristics, favoring tumor growth, result from abnormalities that accumulate in the genome of cancer cells. These are somatic genetic alterations, from point mutations to large-scale chromosomal rearrangements, but also a global disruption of the epigenetic landscape – both leading to an identity crisis and to gene deregulations. While the phenomenon of aberrant gene repression (including repression of tumor suppressor genes) has been extensively studied, ectopic activation of normally silent genes remains poorly understood. Our hypothesis is that the “out of context” expression of tissue-specific genes not only could be involved in carcinogenesis, but could also be of high interest as tumor biomarkers or novel therapeutic targets. In this work, we focused on the prolactin-encoding PRL gene, normally mainly expressed in the pituitary gland and absent from non-tumor lung. We detected an ectopic PRL gene activation in 10% of lung tumors, mainly neuroendocrine tumors. We observed that PRL expression is associated with aggressive tumors and a poor prognosis for patients. We also found that the expression of PRL is associated with an increased resistance of lung cancer cells to a genotoxic stress. Unexpectedly, our data suggest that the oncogenic action of PRL expression is not based on the conventional mechanisms of prolactin action, and we did not confirm the initial hypothesis of a secretion by lung cancer cells of the prolactin hormone, and its action in an autocrine/paracrine loop within the tumor through the activation of the prolactin receptor. Indeed, the receptor is absent in lung cancer cells and the transcribed PRL mRNA is missing its first exons, possibly leading to the production of a truncated prolactin protein, without a functional signal peptide, therefore unable to follow the classical secretion pathway and retained inside the cancer cell. Although the detailed mechanisms of prolactin action in lung cancer remain to be deciphered, our study suggests that the ectopic expression of PRL could be used as a new therapeutic target in the treatment of aggressive lung tumors. This work, also including additional results on three testis-specific genes aberrantly expressed in lung tumors (BRDT, SOX30 and SPATA22) highlights the interest of studying ectopic gene expressions in tumor cells, which can provide new diagnosis and prognosis tools for clinicians as well as new targeted approaches that could be used in addition to conventional lung cancer therapies, which are presently insufficient to limit the high mortality due to lung neoplasms.

L’oncogène v-erbA transforme les progéniteurs érythrocytaires primaires aviaires (T2EC) en bloquantleur engagement d’un programme d’auto-renouvellement vers un programme de différenciation. Unecomparaison trancriptomique de T2EC exprimant soit v-erbA, soit une forme non transformante de verbAa été réalisée par SAGE et RT-qPCR. Seuls quelques uns, mais pas tous les messagers codant lesprotéines ribosomiques sont réprimés. Ces résultats suggèrent que v-erbA pourrait moduler lacomposition des ribosomes et/ou moduler les fonctions extra-ribosomiques de protéines ribosomiquesspécifiques. Ainsi, nous avons décidé d’analyser le taux des protéines ribosomiques associées auxribosomes par 2D-DIGE à partir des ribosomes purifiés. L’analyse statistique effectuée sur 4expériences indépendantes avec des marquages inversées a montré de manière significative que letaux de RPL11 est inférieur dans les T2EC exprimant v-erbA comparé à ceux exprimant la forme nontransformante de v-erbA. Ces données indiquent l’existence de ribosomes dépourvus de RPL11 dansles T2EC sous l’effet de v-erbA. Les résultats des expériences d’immunoprécipitation ont conforté cettehypothèse. L’ensemble des résultats obtenus suggèrent l’implication des protéines ribosomiques, etspécialement celle de RPL11, dans les processus de transformation induite par l’oncogène v-erbA, à lafois au niveau de la traduction, et probablement par sa fonction extra-ribosomique. L’analyse de lafonction biologique de RPL11 a montré qu’une sur-expression de RPL11 dans les T2EC retarderait laprolifération cellulaire. / The v-erbA oncogene transforms chicken erythroid progenitors by blocking their differentiation andpreventing them to exit a state of self-renewal. The transcriptome of primary avian erythroidprogenitors cells (T2EC) expressing either v-erbA or a non-transforming form of v-erbA werecompared by SAGE. Only some, but not all, mRNAs encoding ribosomal proteins were shown to beaffected. These results suggest that v-erbA could modulate the composition of ribosomes and/ormodulate the extraribosomal functions of specific ribosomal proteins. We therefore decided to analyzethe level of ribosomal proteins associated to ribosomes by 2D-DIGE performed on purified ribosomes.A statistical analysis performed on 4 independent flip-flop experiments demonstrated that the level ofRPL11 is significantly lower in T2EC expressing v-erbA as compared to the non-transforming form ofv-erbA. These data suggest the presence of ribosomes without RPL11 in T2EC expressing v-ErbA.Results obtained from immunoprecipitation experiments were strengthened this hypothesis. The set ofthese data evoke the involvement of ribosomal proteins, and specially RPL11, in the v-erbAtransformation process both at the translational level and possibly in its extra-ribosomal function.Overexpression of RPL11 in T2EC showed a decrease of cell proliferation.

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La protéine tyrosine kinase c-Src est surexprimée et activée dans de nombreux cancers. De manière remarquable, Src est activé dans plus de 80% des adénocarcinomes coliques où il joue un rôle dans la carcinogenèse et la progression vers un phénotype métastatique. c-Src et son homologue viral v-Src activent un grand nombre de voies cellulaires permettant à la tumeur de proliférer, de résister à la mort cellulaire et d’acquérir des capacités accrues de migration et d’angiogenèse. Au cours de ma thèse nous avons mis en évidence un mécanisme inattendu d’échappement à l’apoptose de fibroblastes murins surexprimant de manière stable v-Src et de plusieurs lignées tumorales humaines (coliques en particulier) présentant une activité c-Src dérégulée. Nous avons montré que Src stimule la dégradation protéasomedépendantede la protéine Bik, un membre pro-apoptotique de la famille Bcl-2, connu pour être un suppresseur de tumeurs. Cette régulation post-traductionnelle du niveau d’expression de Bik est à l’origine d’une forte résistance de la voie mitochondriale de l’apoptose. L’inhibition de l’activité kinase de Src ou le blocage de la dégradation de Bik par le protéasome permettent de restaurer des concentrations normales de la protéine Bik dans les cellules transformées et de les restaurer efficacement l’apoptose. En revanche, l’inhibition des protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 par l’ABT-737 semble moins efficace. Par ailleurs, nous avons également contribué à mettre en évidence le rôle anti-migratoire et anti-invasif du lithium sur des cellules transformées par Src. Le mécanisme moléculaire mis en jeu implique l’activation redox des protéines tyrosine phosphatases cellulaires. Enfin, nous avons participé à l’étude de peptides mimant les hélices centrales d’insertion de Bax, Bcl-xL et Bid, représentant les trois sous-groupes de protéines de la famille Bcl-2. Nous avons comparé leur comportement vis-à-vis d’une monocouche lipidique mimant la membrane mitochondriale externe ainsi que leur capacité à perméabiliser des mitochondries isolées. Nos résultats nous ont permis de proposer que les fragments centraux d’insertion membranaire des protéines Bcl-2 seraient directement impliqués dans la divergence fonctionnelle des différents sous groupes qui composent la famille / C-Src tyrosine kinase is overexpressed and activated in a number of cancers. Remarkably, Src is deregulated in more than 80% of colorectal adenocarcinoma, playing a role in carcinogenesis and progression toward a metastatic phenotype. c-Src and v-Src activate a large number of intracellular pathways which allow the tumor to proliferate, to evade the cell death machinery and to acquired enhanced migratory and angiogenic abilities. During my PhD, we discovered an unknown mechanism to evade apoptosis developed by murine fibroblasts stably overexpressing v-Src and by some human tumor cell lines with c-Srcb deregulation. We have shown that Src stimulate the proteasomal degradation of the Bik protein, a proapoptotic member of the Bcl-2 family proteins known to act as a tumor suppressor. This post-translationnal regulation of the Bik protein expression level leads to a strong resistance of the mitochondrial pathway of apoptosis. Inhibition of the Src kinase activity or of the Bik proteasome-dependent degradation restore normal levels of the Bik protein and efficiently resensitize these cells to apoptosis. Inhibition of the antiapoptotic Bcl-2 proteins by ABT737 seems to be less efficient in these cells. We also contribute to show that lithium suppresses motility and invasivity of v-Src transformed cells. The molecular mechanism involve a redox activation of the protein tyrosine phosphatases. Finally, we compared the membrane behavior and the ability to permeabilize mitochondria of synthetic peptides derived from the central helical hairpin of Bax,Bcl-xL and Bid. We showed that these structurally analogous domains have distinct membrane behavior which could account for the functional divergence between the Bcl-2 family members

L'apoptose lymphocytaire joue un rôle essentiel dans le contrôle de la réponse immunitaire et de la prolifération cellulaire. De nombreuses voies interviennent dans sa régulation, dont certaines dépendantes de l’oncogène RAS. Un défaut d'apoptose lymphocytaire induit l'apparition de maladies auto-immunes et lympho-prolifératives comme l'Autoimmune LymphoProliferative Syndrome (ALPS). L'ALPS fait suite à des anomalies du principal récepteur membranaire de mort FAS, pivot de l'apoptose lymphocytaire. Le RAS-Associated Lymphoproliferative Disease (RALD) est une entité décrite récemment, se rapprochant de l'ALPS par la symptomatologie et la physiopathologie sous-jacente. Cependant, dans le RALD, le défaut d'apoptose lymphocytaire n’est pas lié à des mutations de FAS mais à une hyperactivation de la voie RAS, mettant ainsi en lumière le rôle essentiel de cette voie dans la régulation du processus en question. Dans les Leucémies Myélo-Monocytaires Juvéniles Chroniques (JMML), les mêmes mutations que celles observées dans les RALD sont trouvées, sur les mêmes populations cellulaires. Il existe une hétérogénéité clinique et biologique au sein des JMML, certaines étant indolentes (LS-JMML) et d'autres sévères (S-JMML). A cette hétérogénéité au sein même des JMML s'ajoute celle observée entre JMML et RALD. L'objectif de ce travail a été de comprendre les tenants des différences phénotypiques observées, au travers du scope de l'apoptose des lymphocytes T activés, en comparant les trois entités résultant de mutations activatrices de RAS dans des cellules pluripotentes hématopoïétiques : RALD, LS-JMML et S-JMML. Nous rapportons des conséquences distinctes pour des mutations identiques ou équivalentes, avec différentes voies de l'apoptose touchées, différenciant les phénotypes induits. Ce travail a permis de démontrer que l’hyperactivation de la voie RAS seule n’entraîne pas nécessairement une dérégulation de la réponse immunitaire T. Des événements additionnels aux mutations présentes sont nécessaires au développement des symptômes. Ces événements ont bien des conséquences sur l'apoptose lymphocytaire, au niveau post-traductionnel, qu’ils concernent la voie RAS ou non. Les différences observées entre les trois phénotypes sur le plan expérimental pourraient être une aide au pronostic. De plus, ce travail ouvre la voie à l'identification en détails des facteurs additionnels et voies défaillantes et permettrait ainsi d'obtenir des thérapeutiques spécifiques actuellement inexistantes. / Lymphocytes apoptosis is essential in maintaining homeostasis and avoiding abnormal proliferation. When defective, autoimmune diseases as the Autoimmune LymphoProliferative Syndrome (ALPS), due to mutations of the death receptor FAS, can occur. Several pathways are important actors influencing the apoptosis cascade, including the RAS proto-oncogene signaling. The RAS Associated Lymphoproliferative Disease (RALD) is a newly described entity, similar to ALPS but with RAS mutations instead of FAS mutations, enlightening the primary role of RAS in apoptosis regulation. Interestingly, the same RAS mutations as observed in RALD are also the cause of a malignant proliferation, the Juvenile Myelo Monocytic Leukemia (JMML). In the case of JMML, RAS mutations can lead either to a mild (LS-JMML) or a severe (S-JMML) phenotype. Thus, three different phenotypes can be caused by the same oncogenic RAS mutations. In order to better understand and characterize the influence of oncogenic RAS mutations in lymphocytes’ apoptosis we studied it in patients presenting with RALD, LS-JMML and JMML. We showed that isolated RAS hyperactivity is not sufficient to induce an immune deregulation. Additional factors are required to do so. These factors influence both mitochondrial and extrinsic apoptosis pathways at a post-transcriptional level. They are due to probable genetic events, and their identification can lead to new therapeutic strategies. Furthermore, activated lymphocytes’ in vitro apoptosis assessment can help differentiating the three phenotypes and thus facilitate prognosis prediction.

Les glycosides cardiotoniques sont des inhibiteurs des pompes sodium / potassium utilisés pour le traitements des insuffisances cardiaques, qui détiennent également des activités anticancéreuses et épigénétiques récemment caractérisées. Toutefois, dans l’objectif de repositionner ces médicaments comme traitement anticancéreux, les mécanismes sousjacents aux activités anticancéreuses et épigénétiques des glycosides cardiotoniques restent à être déterminés. Dans nos travaux, nous révélons que la proscillaridine A est le glycoside cardiotonique qui détient des activités anticancéreuses et épigénétiques les plus puissantes dans des lignées de cancer du côlon, de leucémies et de sarcomes pédiatrique. De plus, nous avons identifié que l’activité anticancéreuse de la proscillaridine A corrèle positivement avec le niveau d’expression protéique du proto-oncogène MYC dans un panel de 14 lignées cellulaires cancéreuses. Dans les lignées cellulaires exprimants un haut niveau de MYC telles que les lignées leucémiques, la proscillaridine A agit comme un inhibiteur de MYC et module sa stabilité protéique ainsi que la régulation transcriptionnelle et translationnelle de ces cibles. Cette inhibition est induite par la baisse significative de l’expression des enzymes épigénétiques les lysines acétyltransférases (KATs), qui contrôlent l’ajout des résidus d’acétylcoenzyme A sur les histones et sur d'autres protéines dont MYC. La baisse d’expression des KATs résultent à une baisse de l’acétylation des résidus de l’histone 3 et à une reprogrammation de l’acétylome des cellules cancéreuses surexprimant MYC. Ces changements au niveau de la chromatine induisent une reprogrammation transcriptionnelle et phénotypique des cellules surexprimant MYC, qui se traduit par une perte de la transcription des programmes oncogéniques et l’induction des programmes associés à la différenciation cellulaire. Pour finir, nous avons évalué le potentiel synergique anticancéreux et épigénétique de la proscillaridine A avec le médicament épigénétique la décitabine dans des lignées cancéreuses exprimants des niveaux différentiels de MYC. Dans une lignée résistante à la proscillaridine A et exprimant de faible niveau de MYC (lignée de cancer de côlon), la décitabine et la proscillaridine A démontrent des activités épigénétiques synergiques tandis que dans une lignée sensible à la proscillaridine A et surexprimant MYC (lignée de sarcome pédiatrique), la décitabine et la proscillaridine A démontrent des activités antiprolifératives synergiques. Dans ces travaux, nous avons donc démontré le potentiel de repositionner la proscillaridine A dans les cancers surexprimant MYC. Également, nous démontrons le potentiel synergique anticancéreux et épigénétique de la proscillaridine A avec la décitabine et nous suggérons d’étudier cette combinaison de médicaments dans les cancers plus résistants à la proscillaridine A. / Cardiac glycosides are sodium/potassium pomps’ inhibitors used for the treatment of heart failure, and whose anticancer and epigenetic activities have been recently characterized. However, in order to repurpose cardiac glycosides as anticancer drugs, mechanistic studies are required to identify the anticancer and epigenetic mechanism of actions. In our experiments, proscillaridin A exhibited the most powerful anticancer and epigenetic activities in colon cancer, leukemia, and sarcoma cell lines. Moreover, we demonstrated that in a panel of 14 cancer cell lines, proscillaridin A anticancer activities positively correlated with MYC protooncogene expression level. In high MYC expressing cell lines such as leukemia, proscillaridin A inhibited MYC expression through protein destabilization and through transcriptomic and translational regulation of MYC targets. Theses inhibitions are induced by the loss of lysine acetylatransferase (KAT) expressions, which are epigenetic enzymes controlling the addition of acetyl-coenzyme A on histones and other proteins such as MYC. KAT inhibitions are responsible for the global loss of histone 3 acetylation and acetylome reprogrammation in high MYC expressing cancer cells. These chromatin changes induced transcriptomic and phenotypic reprogrammation, defined by a loss of the transcription of oncogenic programs and the induction of cell differentiation. To finish, we evaluated the anticancer and epigenetic synergic potential of proscillaridin A in combination with the epigenetic drug the decitabine in cancer cell lines expressing different MYC levels. In a cancer cell line resistant to proscillaridin A treatments and expressing low MYC level (colon cancer cell line), the combination of decitabine and proscillaridin A demonstrated synergistic epigenetic activity although, in a cell line sensitive to proscillaridin A treatments and expressing high MYC level (sarcoma cell line), the combination of decitabine and proscillaridin A exhibited synergistic anti-proliferative activity. To conclude, we highlighted the potential of repurposing proscillaridin A as an anticancer treatment in high MYC expressing cells. Furthermore, we demonstrated the anticancer and epigenetic synergistic potential of proscillaridin A in combination with decitabine and we propose to study the drug combination in cancers that are resistant to proscillaridin A treatment.

Le suppresseur de tumeurs BAP1 est la déubiquitinase la plus fréquemment mutée dans le cancer humain. Ce dernier est impliqué dans la régulation des gènes cibles des facteurs de transcription E2Fs, qui sont des régulateurs centraux de la prolifération cellulaire en contrôlant, les points de contrôle du cycle cellulaire, la mitose, la réparation de l'ADN et l'apoptose. Dans le complexe BAP1, nous notons plusieurs protéines liant la chromatine, telles que les facteurs de transcription FOXKs (FOXK1 et FOXK2), qui sont connues pour recruter BAP1 sur ses gènes cibles. En effet, le complexe BAP1 est recruté à la chromatine pour assurer sa fonction de déubiquitination de la marque d’histone répressive H2AK119ub, et ainsi, réguler l'expression des gènes. Dans cette étude, nous avons cherché à étudier l'axe BAP1-FOXKs dans la régulation des fonctions cellulaires associées à ce complexe. Fait intéressant, FOXK1, mais pas FOXK2, est connue pour avoir des propriétés oncogéniques, car des niveaux d'expression plus élevés de FOXK1 ont été observés dans une variété de cancers et sont corrélés avec la progression tumorale, l'invasion et les métastases. Ce fait soulève de nombreuses questions sur la nature de la régulation entre ces protéines dont la question suivante : s’agit-il d’une relation de coopération ou antagonisme, entre le suppresseur de tumeurs BAP1 et l’oncogène FOXK1 ? De façon intéressante, nous avons découvert que les protéines FOXK1 et FOXK2 forment deux complexes mutuellement exclusifs avec le complexe BAP1, ce qui suggère qu'elles ont des fonctions moléculaires et cellulaires distinctes à travers ce complexe. Nos études phénotypiques en utilisant des fibroblastes primaires humains montrent que FOXK1 et FOXK2 régulent différemment la prolifération cellulaire, la sénescence cellulaire et la transformation oncogénique. En effet, FOXK1, mais pas FOXK2, favorise la prolifération cellulaire via l’activation de l'expression d'E2F1 et de ses gènes cibles. En conséquence, FOXK1 retarde la sénescence cellulaire et favorise une réplication prolongée des fibroblastes primaires. De plus, la surexpression de FOXK1 favorise la transformation oncogénique des fibroblastes primaires transduits par les oncoprotéines E1A et RAS V12G en augmentant la pénétrance et en diminuant le temps de latence de formation des tumeurs. Ces résultats confirment que ces facteurs disposent de fonctions de signalisation cellulaire distinctes et suggèrent qu'ils sont régulés de manière différentielle au niveau moléculaire. Afin d’investiguer davantage le mécanisme moléculaire qui pourrait distinguer entre les fonctions cellulaires de FOXK1 et FOXK2, nous avons cherché à étudier les modifications post-traductionnelles de ces facteurs. Fait intéressant, nos données de spectrométrie de masse ont révélé que seul FOXK1, mais pas FOXK2, est modifié par O-GlcNAcylation, une modification post-traductionnelle catalysée par l'enzyme OGT. Nos essaies in-vitro montrent que cette modification régule la fonction de FOXK1 dans la prolifération cellulaire car le mutant de la O-GlcNAcylation réduit l'impact prolifératif de FOXK1 sur des cellules. Nos essaies in-vivo, en utilisant un modèle de xénogreffe de cellules cancéreuses humaines chez la souris, confirment que la O-GlcNAcylation de FOXK1 favorise la croissance tumorale. Plus intéressant, le mutant de la O-GlcNAcylation de FOXK1 affecte la transformation oncogénique des fibroblastes primaires transduits par E1A et RAS V12G, en augmentant le temps de latence tumorale et diminuant la taille finale de la tumeur. Au niveau de la chromatine, la O-GlcNAcylation de FOXK1 favorise le recrutement de BAP1 sur les gènes cibles des facteurs E2Fs afin deubiquitiner H2AK119Ub et permettre leur expression. En conclusion, la O-GlcNAcylation est un mécanisme clé qui régule la fonction de FOXK1 dans la prolifération cellulaire, et qui contribue à son activité oncogénique. Dans une autre perspective de cette étude, et afin d'investiguer l'importance de l'axe de signalisation BAP1-FOXKs dans la fonction de suppression tumorale de BAP1, nous avons étudié le rôle fonctionnel de l’interaction BAP1-FOXKs dans un modèle murin. Nous avons généré un modèle de souris en utilisant le système d'édition de gènes CRISPR/Cas9 pour muter la thréonine 492 du gène bap1, en alanine et ainsi perturber l'interaction entre les FOXKs et BAP1 chez la souris. Des descendants hétérozygotes de Bap1T492A/+ ont été croisés pour générer des individus homozygotes et étudier leur phénotype. Fait intéressant, nos résultats montrent que les souris homozygotes Bap1T492A/T492A meurent au stade embryonnaire. De plus, les quelques souris homozygotes Bap1T492A/T492A viables échappant à la barrière de létalité (qui représentent seulement 4.7 % au lieu de 25%) sont remarquablement plus petites et certaines d'entre elles ont présenté des anomalies de développement. De plus, lors de l'analyse du système immunitaire des souris adultes homozygotes Bap1T492A/T492A, nous avons constaté une réduction importante dans les proportions des cellules NKT qui sont des combattants du système immunitaire pouvant éliminer les cellules cancéreuses. Ensemble, ces données montrent que l'axe BAP1-FOXKs est important pour le développement et fournissent de nouvelles informations sur la manière dont les événements de signalisation entre le suppresseur de tumeurs BAP1 et les facteurs FOXKs doivent être étroitement contrôlés pour maintenir une homéostasie cellulaire normale et prévenir le cancer. / The tumor suppressor BAP1 is one of the most frequently mutated deubiquitinase in human cancer. This latter is involved in the regulation of the E2F target genes, which are central regulators of cellular proliferation by controlling, cell cycle checkpoints, mitosis, DNA repair, and apoptosis. Importantly, in the BAP1 complex, we note several chromatin-binding proteins, such as FOXKs transcription factors, which are known to recruit BAP1 to its target genes. Indeed, the BAP1 complex is recruited to chromatin to ensure its deubiquitinating function of the repressive histone mark H2AK119ub and thus regulating gene expression. In this study, we sought to investigate the BAP1-FOXKs axis in regulating associated cellular functions. Interestingly, FOXK1 but not FOXK2, is known to have oncogenic properties as higher expression levels of FOXK1 has been observed in a variety of cancers and is correlated with tumor progression, invasion, and metastasis. These results raise many questions about the nature of the regulation between these proteins, including whether there is a cooperative or antagonistic relationship between the tumor suppressor BAP1 and the oncogene FOXK1? Interestingly, we found that FOXK1 and FOXK2 proteins are mutually exclusive for their interactions with the BAP1 complex, which suggests that they have distinct molecular and cellular functions within this complex. Our functional studies using human primary fibroblasts show that FOXK1 and FOXK2 regulate differentially cell proliferation, cellular senescence, and oncogenic transformation. Indeed, FOXK1, but not FOXK2, promotes cellular proliferation through the activation of the expression of E2F1 and its target genes. As a consequence, FOXK1 delays cellular senescence and promotes prolonged primary cell replication. In addition, overexpression of FOXK1 promotes oncogenic transformation of primary fibroblasts transduced by E1A and RAS V12G oncogenes, by increasing tumor penetrance and decreasing latency of tumor formation. These results confirm that these factors have distinct cellular signalling functions and suggest that they are regulated differentially on the molecular level. To further investigate the molecular mechanism, which could distinguish FOXK1 and FOXK2 cellular functions, we sought to study posttranslational modifications of these factors. Interestingly, our mass spectrometry data revealed that only FOXK1, but not FOXK2, is modified by O-GlcNAcylation, a protein posttranslational modification catalyzed by the enzyme OGT. Our in vitro data shows that this modification regulates FOXK1 function in cellular proliferation as the expression of the O-GlcNAc mutant reduces the proliferative potential of FOXK1. Our in-vivo data, using human cancer cell xenografts on mice, confirms that FOXK1 O-GlcNAcylation promotes tumor growth. More interestingly, FOXK1 O-GlcNAcylation mutants affect the oncogenic transformation of primary fibroblasts expressing E1A and RAS V12G by increasing tumor latency and decreasing tumor size. At the chromatin level, O-GlcNAcylation of FOXK1 promotes the recruitment of BAP1 to target genes of E2Fs factors in order to deubiquitinate H2AK119Ub and allow their expression. In conclusion, O-GlcNAcylation is a key mechanism that regulates the function of FOXK1 in cell proliferation, which contributes to its oncogenic activity. In another perspective of this study, and in order to investigate the importance of BAP1- FOXKs signaling axis in the tumor suppression function of BAP1, we sought to study the functional role of BAP1-FOXKs interaction in a murine model. We generated a mouse model using the CRISPR/Cas9 gene-editing system by mutating BAP1-threonine 492 into alanine and thus disrupting the interaction between FOXKs and BAP1. Heterozygous offspring of Bap1T492A/+ were crossed to generate homozygous litters to study their phenotypes. Interestingly, our results show that homozygous Bap1T492A/T492A mice are embryonic lethal. Moreover, a few homozygous Bap1T492A/T492A mice can escape the embryonic lethality (representing only 4.7% instead of 25%), are remarkably smaller, and some of them showed developmental abnormalities. Moreover, when analyzing the immune system of adult homozygous Bap1T492A/T492A mice, we found a significant reduction of NKT cells proportions, which could be central fighters against cancer cell development. Altogether, these data show that BAP1-FOXKs axis is important for development and provide novel insights into how signaling events between the tumor suppressor BAP1 and FOXKs should be tightly controlled to maintain normal cellular homeostasis and prevent cancer.